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Manuale delle operazioni per l’analisi della ricettività endometriale ERA®

L_I_001_ERA_GHQ_EN_v1.0Data di pubblicazione: 21 agosto 2017Autore: Alejandro Rincón BertolínAutorizzato da: María Ruiz Alonso // Dipartimento per la Qualità di IgenomixProssima revisione: 21 agosto 2019

Contatto:www.igenomix.it

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1. Sommario del processo diagnostico dell’analisi della ricettività endometriale (ERA®)

2. Il protocollo di biopsia endometriale

3. Procedura standard per l'invio e la ricezione di campioni

4. Interpretazione dei risultati

Appendici:

I. Prove scientifiche II. Domande frequenti su ERA®

Indice:

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PIONEERS IN REPRODUCTIVE GENETICS

L’analisi della ricettività endometriale (ERA®) è uno strumento molecolare brevettato che analizza tramite Next Generation Sequencing (NGS) il trascrittoma di 236 geni correlati allo stato di ricettività dell'endometrio, fornendo così un ulteriore parametro sulla salute riproduttiva. Lo scopo del test ERA® è quello di identificare il giorno ottimale di ricettività, anche quando si ha una finestra di impianto (WOI) spostata, al fine di eseguire un trasferimento embrionale personalizzato (pET).

L’ ERA® può essere eseguito in cicli naturali o di terapia ormonale sostitutiva (TOS), secondo il tipo di ciclo in cui verrà eseguito il successivo trasferimento degli embrioni (esclusi i cicli “freschi” di stimolazione ovarica controllata). Per garantire risultati riproducibili è necessario il prelievo di una biopsia endometriale che riproduca esattamente le stesse condizioni che saranno utilizzate nel ciclo di trasferimento degli embrioni (ad esempio tipo di ciclo, farmaci, modo di somministrazione, ecc.).

Idealmente, la prima biopsia sarà eseguita dopo 5 giorni interi (cioè 120 ore) di somministrazione di progesterone (P4) (indicato come P+5) in TOS, o dopo 7 giorni (cioè 168 ore) dopo attivazione della gonadotropina corionica umana (hCG) (indicato come hCG + 7) nei cicli naturali. Anche se l’intenzione è quella di trasferire gli embrioni del 3º giorno, la biopsia deve esser realizzata P+5 o hCG+7 poiché l'ERA® controlla l'endometrio al momento dell'impianto. In questo modo, se si ha un risultato ricettivo a P+5, si trasferirà la blastocisti a P+5 o un embrione al 3º giorno due giorni prima (cioè P+3). Quando si preleva la biopsia endometriale, è molto importante prelevare una quantità su�ciente di tessuto (30-50 mg), assicurandosi che sia tutto tessuto e non sangue o muco. Il tessuto prelevato non deve superare la linea bianca del criotubo, in quanto ciò potrebbe causare un degrado dell’RNA e influenzare l'esattezza dei risultati del test.

Il risultato ERA® si basa sull’analisi del livello di espressione di 236 geni con un programma di calcolo predittivo progettato, sviluppato e brevettato nel 2009 (PCT/ES2009/000386) da IGENOMIX dopo più di 10 anni di ricerca. Dopo aver analizzato tramite NGS il materiale genetico (RNA) estratto dalla biopsia endometriale, è possibile valutare se l’endometrio della paziente è ricettivo o non-ricettivo in un dato momento del suo ciclo mestruale. Se una paziente ha un risultato non ricettivo dopo la prima biopsia, è possibile confermare uno spostamento della finestra di impianto (WOI) analizzando una seconda biopsia eseguita nel giorno specificato dal primo risultato ERA®.

Consultare l'Appendice I per ulteriori dettagli sul test ERA® e sulle prove scientifiche che lo supportano.

La documentazione completa relativa a questo servizio è disponibile all'indirizzo www.igenomix.com/era-docs

Sommario del processo diagnostico dell’analisi della ricettività endometriale (ERA®)

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Consenso informato

La paziente deve ricevere una consulenza adeguata e le informazioni necessarie sull’intero processo ERA®. La paziente e il medico dovranno entrambi firmare il modulo di richiesta del test ERA® prima del prelievo della biopsia.

Biopsia endometriale

La biopsia endometriale può essere prelevata in un ciclo TOS o in un ciclo naturale. La biopsia dell’endometrio verrà prelevata dal fondo uterino utilizzando un catetere Pipelle (Genetica, Hamont-Achel, Belgio) o simile. Quando si preleva la biopsia endometriale, è molto importante prelevare una quantità su�ciente di tessuto (30-50 mg), assicurandosi che sia tutto tessuto e non sangue o muco. Il tessuto prelevato non deve superare la linea bianca del criotubo, in quanto ciò potrebbe causare un degrado dell’RNA. La diagnosi di ricettività è valida per il tipo di ciclo in cui si è eseguito il test e pertanto l’embrione dovrà essere trasferito nello stesso tipo di ciclo e nella finestra di impianto personalizzata entro cui è stata ottenuta una diagnosi “ricettiva".a) Ciclo di terapia ormonale sostitutiva: implica il trattamento con estrogeni e progesterone per inibire la produzione endogena di questi ormoni, seguendo i protocolli TOS standard della clinica (o a richiesta si potrà fornire anche protocollo standard IGENOMIX TOS).

Il giorno della biopsia endometriale in un ciclo TOS è determinato come segue:

· L’ecografia viene eseguita 7-10 giorni dopo l’iniezione di estradiolo. Quando si ottiene un endometrio trilaminare ≥ 6 mm insieme a un livello di progesterone sierico <1 ng/ml (da misurare), si inizia il trattamento con progesterone. Il giorno in cui si inizia il trattamento con progesterone viene indicato come P+0 e la biopsia viene prelevata nel giorno P+5, ossia dopo cinque giorni interi (circa 120 ore) di somministrazione del progesterone. Ad esempio, se la somministrazione del progesterone inizia il mercoledì, la paziente verrà chiamata per la biopsia endometriale il lunedì successivo.

Nei cicli TOS è molto importante misurare il livello di progesterone endogeno un giorno prima del primo giorno di somministrazione del progesterone per garantire che non ci sia ovulazione. Il livello deve essere <1 ng/ml, altrimenti si raccomanda di annullare il ciclo e ricominciare.

Il protocollo di biopsia endometriale

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P+0 P+1 P+2 P+3 P+4 P+5

BIOPSIAECOGRAFIA: 6 mm; Livello P endogeno triplo strato <1ng/ml

E2Days

P4Days

b) Ciclo naturale con attivazione di hCG: Il giorno della biopsia in un ciclo naturale dopo l’iniezione di hCG è determinato come segue:

· Si somministrerà l’hCG secondo i parametri di routine in un ciclo naturale (dimensione del follicolo > 17 mm). Il giorno della somministrazione di hCG è indicato come giorno hCG+0 e la biopsia endometriale viene prelevata sette giorni (circa 168 ore) dopo (hCG+7). Ad esempio, se l’iniezione hCG è lunedì, la paziente verrà chiamata per la biopsia endometriale il lunedì successivo.

Se l’intenzione è quella di trasferire gli embrioni del 3º giorno, la biopsia deve esser realizzata P+5 o hCG+7 poiché l'ERA® controlla l'endometrio al momento dell'impianto. In questo modo, se si ha un risultato ricettivo a P+5, si trasferirà una blastocisti a P+5 o un embrione al 3º giorno due giorni prima (cioè P+3).

Preparazione dei campioni

- IGENOMIX fornirà un kit ERA® che include un criotubo per ogni biopsia. Il criotubo IGENOMIX contiene 1,5 ml di una soluzione di stabilizzazione trasparente per l'RNA nel tessuto. Apporre un’etichetta sul criotubo recante le iniziali della paziente, la sua data di nascita e la data della biopsia oppure le iniziali della paziente e il suo numero identificativo unico.

- Dopo l’esecuzione della biopsia, il campione viene trasferito immediatamente nel criotubo fornito. Il criotubo con il campione deve essere agitato energicamente per alcuni secondi. L’immagine sottostante è un esempio di una biopsia endometriale nel criotubo. Assicurarsi che il criotubo contenga e�ettivamente del tessuto endometriale prima di inviarlo.

- Il criotubo con il campione deve essere conservato in un frigorifero (4-8 ºC / 39-46 ºF) subito dopo il prelievo per almeno 4 ore. Dopo questo tempo, i campioni possono essere inviati a IGENOMIX a temperatura ambiente (<35 ºC / 95 ºF) all’interno di un contenitore di plastica (fornito nel kit ERA) utilizzando un corriere di trasporto. I campioni possono essere conservati all’interno di un frigorifero fino a 3 settimane o possono essere congelati a -20 ºC / -4 ºF (dopo le prime 4 ore in un frigorifero) se non devono essere inviati immediatamente a IGENOMIX. In ogni caso, la spedizione a IGENOMIX (a temperatura ambiente) non dovrebbe durare mai più di 5 giorni. Se la temperatura esterna supera i 35 °C, includere una borsa del ghiaccio insieme al contenitore di plastica (contenente il campione) o contattare il laboratorio per ulteriori istruzioni su come inviare il campione.

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Esempio di campione di tessuto endometriale nella soluzione di stabilizzazione


Campioni e documentazione: - Campione: Il campione preparato nel criotubo ERA® viene trasportato a

temperatura ambiente (<35 ºC / 95 ºF) (controllare la sezione precedente per la preparazione del campione). Assicurarsi che il criotubo sia ben chiuso e adeguatamente sigillato con pellicola per evitare perdite e collocarlo nel contenitore di plastica (fornito con il kit ERA®).

- Documentazione: Il modulo di richiesta del test ERA® deve essere completato e incluso con la spedizione di ogni campione.

Spedizione:

- Igenomix Italia organizzerà la spedizione. Visitare il sito www.igenomix.it per i recapiti.

- Se la temperatura esterna supera i 35 °C, includere una borsa del ghiaccio insieme al contenitore di plastica (contenente il campione) o contattare il laboratorio per ulteriori istruzioni su come inviare il campione.

Recapiti IGENOMIX:

www.igenomix.it

3. Procedura standard per l'invio di campioni al laboratorio

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Interpretazione dei risultati:

Una volta analizzato il campione, sono possibili diversi risultati:

Ricettivo: Il profilo di espressione genica coincide con quello di un endometrio ricettivo normale.

Pre-ricettivo: Il profilo di espressione genica coincide con quello di un endometrio in fase pre-ricettiva. Può essere dovuto allo spostamento della finestra di impianto e, per confermarlo, occorre analizzare una seconda biopsia nel giorno raccomandato.

Post-ricettivo: Il profilo di espressione genica coincide con quello di un endometrio in fase post-ricettiva. Può essere dovuto allo spostamento della finestra di impianto e, per confermarlo, occorre analizzare una seconda biopsia nel giorno raccomandato.

Proliferativo: Il profilo di espressione genica coincide con quello di un endometrio in fase proliferativa. Si consiglia di contattare il laboratorio ERA® per discutere il tipo di ciclo in cui è stata prelevata la biopsia.

Non rilevante: Il profilo analizzato non corrisponde ai profili di espressione genica di controllo presenti nel programma di calcolo predittivo ERA®.Si consiglia di contattare il laboratorio ERA® per discutere il protocollo e ripetere la biopsia.

RNA insu�ciente: Non è stato possibile determinare il profilo di espressione genica del campione perché non c'era su�ciente materiale bioptico. Ciò avviene in circa il 2,5% dei campioni ricevuti. Si consiglia di realizzare una seconda biopsia.

RNA non valido: Non è stato possibile determinare il profilo di espressione genica del campione a causa della scarsa qualità del materiale genetico ottenuto. Ciò avviene in circa il 3% dei campioni ricevuti. Si raccomanda di eseguire una seconda biopsia seguendo le istruzioni di stabilizzazione del campione.

Lo scopo di questo test è fornire ai medici una diagnosi molecolare oggettiva della salute riproduttiva dell’endometrio della paziente. A seconda del risultato di questa analisi, il medico può orientare il trasferimento di embrioni personalizzato (pET).

Seguire le raccomandazioni del referto ERA® non garantisce l'impianto.Il fallimento dell’impianto può essere causato da altri fattori, tra cui, per esempio, la scarsa qualità degli embrioni, anomalie genetiche o patologie precedenti.

Contatto: www.igenomix.it

4. Interpretazione dei risultati


Lo sviluppo di questo test molecolare è stato il risultato di un progetto di ricerca traslazionale Pubblicato in Fertility&Sterility:

- A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Diaz-Gimeno. et al. 2011. Fertil. Steril., 9S:50-60, 60.el-15

L'accuratezza e la riproducibilità del test ERA® sono stati dimostrati in:

- The accuracy and reproducibility of the endometrial receptivity array is superior to histology as a diagnostic method for endometrial receptivity. Díaz-Gimeno, et al. 2013. Fertil Steril. 99(2):508-17

L’applicabilità clinica in pazienti con fallimenti ricorrenti dell’impianto è stata dimostrata in:

- The endometrial receptivity array for diagnosis and personalized embryo transfer as a treatment for patients with repeated implantation failure. Ruiz-Alonso, et al. 2013. Fertil Steril. 100(3):818-24

- What a di�erence two days make: "personalized" embryo transfer (pET) paradigm: a case report and pilot study. Ruiz-Alonso, et al. 2014. Hum Reprod. 29(6):1244-7.

Attualmente è in corso uno studio prospettico randomizzato sull’e�cacia del test ERA® in pazienti che non hanno ricevuto precedenti trattamenti di riproduzione assistita (codice ClinicalTrials.gov: NCT01954758). I risultati provvisori di questo studio sono stati presentati presso la Società americana di medicina riproduttiva (ASRM) durante il congresso scientifico del 2016 (Fertil Steril. Settembre 2016;106(3):e46-e47). Questo abstract ha ricevuto il premio Prize Paper dalla Società di Riproduzione, Endocrinologia e Infertilità (SREI).

Appendice I. Prove cliniche

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1) Quali sono le indicazioni cliniche per il test ERA®?

L’ERA® è stato testato in pazienti che hanno avuto fallimenti dell’impianto con embrioni di buona qualità morfologica.

Questo test è raccomandato per le pazienti con un utero morfologicamente normale e uno spessore endometriale normale (≥ 6 mm), dove l’utero e l’endometrio non sono probabilmente alla base del problema.

L'uso di altre indicazioni deve essere deciso dal ginecologo. Non abbiamo ancora dati clinici su�cienti sull’utero/endometrio con problemi precedentemente diagnosticati; la diagnosi del test ERA® potrebbe riflettere queste condizioni. 2) In quale tipo di ciclo può essere eseguita la prova? Il test ERA® può essere realizzato in un ciclo TOS o in un ciclo naturale. La diagnosi di ricettività è valida per il tipo di ciclo in cui si è eseguito il test e pertanto l’embrione dovrà essere trasferito nello stesso tipo di ciclo (e nella finestra di impianto in caso di personalizzazione) in cui è stata ottenuta una diagnosi “ricettiva".

Il test ERA® diagnostica la ricettività endometriale di una donna sottoposta a un ciclo ormonale definito, TOS o naturale. Abbiamo osservato che alcune pazienti possono essere sensibili a queste di�erenze ormonali e il tempo di ricettività varia a seconda del tipo di ciclo.

Il trasferimento degli embrioni può essere eseguito nel ciclo successivo al completamento del test ERA® o in qualsiasi ciclo successivo ritenuto idoneo dalla paziente e dal suo medico. La validità del risultato è stata verificata fino a due anni dopo l'esecuzione del test.

Il test ERA® non viene eseguito in cicli di stimolazione ovarica perché è noto che il processo di stimolazione ha degli e�etti sull'endometrio. Il profilo di espressione dell'endometrio non è stato studiato utilizzando ERA® nei cicli di stimolazione ovarica controllata (COS) l'esecuzione del test. 3) Qual è la gestione clinica di un trasferimento embrionale dopo il test ERA®? Per eseguire una diagnosi di ricettività tramite il test ERA®, la biopsia endometriale deve essere prelevata in un ciclo TOS o in un ciclo naturale.

Appendice II. Domande frequenti su ERA® (FAQ)

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L’elaborazione dei campioni da analizzare richiede diversi giorni. Se si desidera eseguire il trasferimento di embrioni in base al risultato ERA®, è necessario attendere un ciclo successivo.

Risultato RicettivoSe la paziente ha ovuli o embrioni congelati o ovuli freschi o embrioni provenienti da una donazione: trasferire gli embrioni nello stesso tipo di ciclo (TOS o naturale) in cui è stato ottenuto il risultato Ricettivo nel test ERA®.

Se la paziente NON ha ovuli o embrioni congelati e vuole utilizzare i suoi ovuli: è necessario eseguire un ciclo di stimolazione ovarica per la crioconservazione dell’ovulo o dell'embrione.

Trasferire gli embrioni in un ciclo successivo, nello stesso tipo di ciclo (TOS o naturale) in cui è stato ottenuto il risultato Ricettivo nel test ERA®. È possibile trasferire gli embrioni nel ciclo COS, tuttavia il risultato del test ERA® NON si applica ai cicli COS, come descritto al punto precedente:'Tipo di ciclo in cui può essere eseguito il test'.

Risultato Non ricettivo con la raccomandazione di una nuova finestra di impianto (WOI)Se il risultato di un primo test ERA® è Non ricettivo e l’analisi del profilo di espressione suggerisce che la finestra di impianto può essere spostata, è necessario confermare la WOI personalizzata (pWOI).

Per confermarlo, prelevare una biopsia endometriale nella pWOI suggerita. Se il risultato del secondo ERA® è Ricettivo, è necessario programmare lo scongelamento degli ovuli o dell’embrione e il successivo trasferimento in modo che coincida con il giorno della pWOI confermata. La pWOI è valida anche per i successivi trasferimenti embrionali in caso di fallimento del primo.


4) Come si esegue una biopsia endometriale? La biopsia del fondo uterino si esegue secondo le procedure standard con un catetere Pipelle o simili.

Quando si preleva la biopsia endometriale, è molto importante prelevare una quantità su�ciente di tessuto (30-50 mg), assicurandosi che sia tutto tessuto e non sangue o muco. Il tessuto prelevato non deve superare la linea bianca del criotubo, in quanto ciò potrebbe causare un degrado dell’RNA. Per quanto possibile, evitare di introdurre altri liquidi o fluidi (vaginale o uterino / muco o sangue) nel criotubo ERA®. Ciò non provoca una contaminazione significativa del campione, ma può influire sulla conservazione del campione e ridurre la qualità del materiale genetico, e quindi l'esattezza del risultato che si può ottenere.

5) Quali sono i requisiti di manipolazione, conservazione e spedizione per i campioni bioptici?

Dopo il prelievo di una biopsia, il tessuto deve essere trasferito nel criotubo ERA®, fornito da IGENOMIX, che contiene una soluzione trasparente per stabilizzare l’RNA. Il criotubo ERA® contenente il campione va riposto immediatamente in frigorifero (4-8 ºC / 39-46 ºF) per almeno quattro ore. Dopo questo periodo di refrigerazione il campione può essere inviato alle nostre strutture a temperatura ambiente con il servizio di corriere scelto dal cliente.

Per comodità, una volta collocato nel criotubo ERA® e rispettando il periodo di refrigerazione obbligatorio di quattro ore, il campione può essere conservato in frigorifero (4-8 ºC / 39-46 ºF) per un massimo di tre settimane o congelato a -20 ºC. La durata della spedizione alla nostra struttura, a temperatura ambiente, non deve superare i 5 giorni (120 ore).

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