manual monitorizacao ambiental esac parte 1

5/17/2018 Manual Monitorizacao Ambiental ESAC Parte 1 - slidepdf.com

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29-09-2010

Curso de Especialização Tecnológica em Qualidade Ambiental

Manual de monitorizaçãomicrobiológica ambiental1.Qualidade microbiológica do ar e de superfícies

Unidade de formação:

Monitorização ambiental | microbiologia

Manuela Abelho



Manuela Abelho

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Manual de monitorização

microbiológica ambiental1.Qualidade microbiológica do ar e de superfícies

Índice

1.Noções básicas de microbiologia prática ..................................................................... 4

Esterilização e assepsia ............................................................................................... 4

Meios de cultura .......................................................................................................... 5

Protocolo 1.1 Preparação e distribuição de um meio de cultura ...................................................... 5

Observação de células microbianas ............................................................................ 6

Protocolo 1.2 Elaboração de um esfregaço fresco .............................................................................. 7

Protocolo 1.3 Elaboração de um esfregaço seco e coloração de Gram ............................................. 7

Cultura e isolamento de microrganismos ................................................................... 8

Protocolo 1.4 Diluições decimais sucessivas ...................................................................................... 9

Protocolo 1.5 Sementeira por incorporação ..................................................................................... 10

Protocolo 1.6 Sementeira por espalhamento em placa .................................................................... 11

Protocolo 1.7 Isolamento por riscado em placa ................................................................................ 11

Avaliação quantitativa de populações ....................................................................... 12

Protocolo 1.8 Contagem de células viáveis em placas ..................................................................... 12

2.Qualidade microbiológica do ar ................................................................................. 13

Ar ambiente e ar interior ........................................................................................... 13

Microrganismos no ar interior................................................................................... 13

Legislação aplicável .................................................................................................... 14

Bactérias ................................................................................................................................................ 14

Fungos ................................................................................................................................................... 14

Legionella ............................................................................................................................................. 15

Procedimentos gerais .................................................................................................16

3.Qualidade microbiológica de superfícies ................................................................... 17



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Procedimentos gerais ................................................................................................. 17

4.Métodos específicos ................................................................................................... 18

Ar ............................................................................................................................... 18

Protocolo 1.9 Amostragem do ar por sedimentação ........................................................................ 18

Material e métodos ............................................................................................................................... 18

Protocolo 1.10 Amostragem do ar por filtração ................................................................................ 19

Material e métodos ............................................................................................................................... 19

Superfícies ..................................................................................................................19

Protocolo 1.11 Amostragem por zaragatoa ...................................................................................... 19

Referências citadas ....................................................................................................... 20



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1.Noções básicas de microbiologia prática

Esterilização e assepsiaPara a preparação e cultura de microrganismos em laboratório deve utilizar-se

material e meios de cultura estéreis. Para efectuar a esterilização1 existem váriosmétodos, que devem ser utilizados de acordo com o tipo de material a esterilizar. Paraa esterilização de materiais resistentes a altas temperaturas (e.g., vidro) utiliza-se ocalor seco, recorrendo a estufas que atingem temperaturas de 160-180ºC. Outro tipode calor seco consiste na incineração ou queima directa pelo fogo e utiliza-se porexemplo para esterilizar ansas no bico de Bunsen, assim como para a eliminação delixos sólidos dos hospitais (Alcântara et al ., 1996).

Os materiais como os meios de cultura, ricos em humidade, não podem seresterilizados pelo calor seco. Para esterilizar meios de cultura e outros líquidos

resistentes ao calor utiliza-se o calor húmido recorrendo a um aparelho denominadoautoclave. O calor húmido destrói rapidamente os microrganismos por coagulaçãodas suas proteínas. O tempo de morte térmica, i.e., o intervalo de tempo necessáriopara destruir células vegetativas ou esporos até ao nível pretendido é inversamenteproporcional à temperatura. A conjugação dos factores tempo-temperatura dependedas características do produto a esterilizar e da sua estabilidade térmica. Nosautoclaves desenvolve-se uma atmosfera de vapor que permite a subida datemperatura a valores superiores a 100ºC e portanto a rápida esterilização demateriais. O calor húmido evita a evaporação excessiva quando se trata de meios

líquidos e soluções, pelo que é o método de esterilização mais adequado a estesmateriais. O tempo de tratamento térmico está relacionado com a temperatura mastambém com o volume a esterilizar, i.e., com o tempo de penetração do calor nointerior do material. Para a mesma temperatura os tempos de tratamento térmicoaumentam com o aumento do volume a esterilizar (Alcântara et al ., 1996).

Existem outros métodos de esterilização que não utilizam calor e que devem serutilizados quando o material a esterilizar não resiste ou é alterado por temperaturas

1 Esterilização é a destruição ou remoção de todos os microrganismos, patogénicos ounão, de um dado material. Não confundir com desinfecção, que consiste na remoção ouna inactivação de parte ou de todos os microrganismos patogénicos presentes num dadomaterial (Ferreira et al ., 2010).



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elevadas: filtração, radiações e compostos químicos. A filtração é utilizadaprincipalmente para a esterilização de antibióticos e vitaminas e também para aesterilização do ar. Neste processo, os microrganismos são removidos por passagemdo líquido ou do ar através de uma membrana filtrante de poro inferior ao tamanho

mais vulgar dos microrganismos mais pequenos, i.e., 0.2 m2. As radiações, como osraios gama, os raios x e a radiação ultra-violeta, são utilizadas para a esterilização demateriais sensíveis ao calor. Os principais compostos químicos (e.g., sabões, sais

biliares, fenóis, álcoois, cloro, …) normalmente utilizados na esterilização eliminamas células vegetativas mas não são eficazes sobre as formas esporuladas (i.e., formasde resistência) dos microrganismos.

Mesmo utilizando materiais estéreis, é necessário manter o local de trabalho isentode contaminações. A assepsia é um conjunto de medidas que permitem manter umser vivo ou um material inerte isento de contaminações por microrganismos. Ascondições mínimas de assepsia incluem a limpeza e desinfecção da bancada, uso de

bata limpa (por vezes estéril), lavagem e desinfecção das mãos, cabelos presos (por vezes cobertos) e máscara quando necessário. Durante a manipulação de materialmicrobiológico, as condições de assepsia podem ser mantidas utilizando uma

bancada com fluxo e/ou uma chama de um bico de Bunsen. Para as condições deassepsia contribuem também a rapidez da execução sob a zona de influência dachama, evitar correntes de ar e contaminações pelo operador (Alcântara et al ., 1996).

Meios de cultura

Para cultivar microrganismos em laboratório é necessário fornecer-lhes as condiçõesmais adequadas para o seu crescimento. Existem diversos tipos de meios de cultura,que contêm diferentes quantidades e tipos de nutrientes e que, sólidos ou líquidos,tornam possível a multiplicação de diferentes tipos de microrganismos emlaboratório.

Protocolo 1.1 Preparação e distribuição de um meio de cultura

1. Seguindo as instruções da embalagem, pesar a quantidade de pó necessária parapreparar o volume indicado pelo docente;

2 O micrómetro (m) é a milionésima parte do milímetro (mm), i.e., 1 mm=1000 m e1 m=0.001 mm.



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2. Medir o volume necessário de água destilada numa proveta e transferir para umErlenmeyer (ou para um frasco próprio com tampa de enroscar) o pó pesado e aágua destilada;

3. Colocar um magnete dentro do Erlenmeyer/frasco e agitar numa placa deaquecimento até obter uma solução límpida;

4. Ajustar o pH de acordo com as instruções da embalagem, adicionando gota a gotaas soluções ácida ou alcalina;

5. Tapar o Erlenmeyer com a rolha de algodão e papel de alumínio (ou enroscarparcialmente a tampa do frasco);

6. Colocar o Erlenmeyer/frasco com o meio de cultura a esterilizar no autoclave(121ºC durante 15- 20 minutos);

7. Retirar o Erlenmeyer/frasco da autoclave e deixar arrefecer até atingir uma

temperatura que permita o seu manuseamento, mas superior a 42ºC (a estatemperatura o agar solidifica);

8. Desembrulhar as caixas de Petri esterilizadas e identificar com o nome do meiode cultura e a data da sua elaboração;

9. Verter o meio de cultura nas caixas de Petri em condições de assepsia, fazendouma camada de aproximadamente 5 mm;

10. Deixar solidificar, inverter e guardar a 4ºC.

Observação de células microbianasPara a observação de microrganismos vivos pode recorrer-se a preparações a fresco.Este tipo de preparações deve ser efectuado imediatamente antes da sua observação epermite por exemplo observar a existência ou não de mobilidade, o tipo delocomoção, etc. Existem objectivos que tornam conveniente a coloração daspreparações, por exemplo:

Aumento do contraste entre as células e o meio (o índice de refracção doprotoplasma bacteriano é muito semelhante ao do meio circundante, sendodifícil o exame das bactérias em preparações não coradas, a não ser que se

usem métodos especiais de iluminação como por exemplo a microscopia decontraste de fase);

Diferenciação de organismos que reagem de modo diferente ao mesmo corante(colorações diferenciais);

Observação de estruturas particulares (e.g., parede celular, material nucleico,esporos, cápsula, etc.).

A coloração de Gram baseia-se no facto de que quando as bactérias são coradas comcertos corantes básicos, as células de Gram-negativo podem ser facilmente



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descoradas com solventes orgânicos (e.g., etanol, acetona), enquanto as células dasespécies Gram-positivo resistem a esta descoloração. A capacidade das célulasreterem ou perderem o corante reflecte diferenças na estrutura fundamental daparede celular, pelo que a resposta à coloração de Gram é uma característica

taxonómica importante, usada numa fase inicial da identificação das bactérias.

Protocolo 1.2 Elaboração de um esfregaço fresco

1. Retirar com a pinça uma lâmina de vidro do recipiente e inflamar à chama;

2. Colocar uma gota de água destilada esterilizada na lâmina;

3. Esterilizar uma ansa à chama e deixar arrefecer;

4. Tocar na colónia com a ansa e suspender o material na gota de água;

5. Espalhar o líquido numa área de aproximadamente 1 cm2, esfregando bem deforma a separar a massa de células;

6. Colocar uma lamela, pressionar ligeiramente e observar ao microscópio.

Protocolo 1.3 Elaboração de um esfregaço seco e coloração de Gram

1. Retirar com a pinça uma lâmina de vidro do recipiente e inflamar à chama;

2. Colocar uma gota de água destilada esterilizada na lâmina;

3. Esterilizar uma ansa à chama e deixar arrefecer;

4. Tocar na colónia com a ansa e suspender o material na gota de água;

5. Espalhar o líquido numa área de aproximadamente 1 cm2, esfregando bem de

forma a separar a massa de células;6. Segurar a lâmina com uma pinça e passar rapidamente sobre a chama até toda a

água evaporar para fixar o material;

7. Realizar uma coloração de Gram das diferentes colónias (Figura 1.1), da seguinteforma:

8. Inundar o esfregaço fixado com violeta de cristal (corante primário) agitandosuavemente durante 60 segundos;

9. Lavar com água corrente, começando na extremidade da lâmina e deixandoescorrer por cima do material fixado;

10. Inundar o esfregaço com solução de Lugol, deixando actuar durante 60 segundos(vai formar um complexo com o violeta de cristal);

11. Lavar com água corrente e secar com papel de filtro, pressionando suavemente opapel contra a preparação;

12. Inundar o esfregaço com álcool iodado (agente descolorante), agitandosuavemente durante 60 segundos;

13. Inundar com corante vermelho safranina durante 30 segundos, lavar e secar compapel de filtro;



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14. Observar ao microscópio, verificando se as células são Gram-positivas ou Gram-negativas e registando a sua forma e a sua dimensão.

Figura 1.1 A coloração de Gram. Nas bactérias Gram-negativas, o álcool remove oslípidos da membrana externa da parede celular, aumentando a sua permeabilidade; ocomplexo violeta de cristal-iodo pode assim ser extraído, descorando as bactérias. Nas bactérias Gram-positivas, o tratamento com álcool resulta na sua desidratação, comredução da permeabilidade da parede e consequente retenção do complexo violeta decristal-iodo. Fonte: http://www.livronline.com/servicos/gratuitos/mb1504/(consultado em 29Junho 2007).

Cultura e isolamento de microrganismosOs microrganismos estão presentes na natureza em comunidades mais ou menoscomplexas. No entanto, o estudo das propriedades e características dosmicrorganismos tornou necessário o desenvolvimento de técnicas que permitissem aobtenção de organismos separados (ou isolados) dessas comunidades, em culturaspuras. A cultura e o isolamento de microrganismos são duas operações básicas emMicrobiologia. O crescimento de populações microbianas em meios de cultura nolaboratório, permite a obtenção de culturas puras – culturas que contêm apenas umtipo de microrganismo – ou de culturas mistas – culturas que têm mais do que um

tipo de microrganismo. O isolamento promove a separação de um microrganismo apartir de populações mistas. As culturas puras podem ser obtidas através dosseguintes métodos:

Método das estrias ou de riscado em placa: é um método de isolamento bastante rápido. Consiste na diluição de uma pequena porção de inóculo,colhida com uma ansa, a qual é sucessivamente riscada na superfície de ummeio de cultura sólido. A execução do riscado pode ser feita por váriosprocessos.

http://www.livronline.com/servicos/gratuitos/mb1504/

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Método das diluições sucessivas: consiste na realização de diluiçõessucessivas da amostra, em condições de esterilidade, e posterior sementeira dequantidades conhecidas das mesmas em caixas de Petri. A sementeira(operação que consiste em distribuir uniformemente o inóculo em meio de

cultura apropriado) pode ser feita à superfície (pelo método do espalhamentoem placa), em camada dupla e por incorporação.

Em qualquer dos casos visa-se o desenvolvimento de uma população a partir de umaúnica célula inicial e será importante fazer subculturas a partir de uma colóniaisolada, para certificação da pureza das culturas.

O crescimento dos microrganismos em meio sólido dá origem à formação de colónias(crescimento macroscopicamente visível resultante da multiplicação celular). Se ascélulas microbianas estiverem completamente dispersas, cada colónia corresponde a

uma bactéria inicial em estado viável e cultivável. Se os microrganismos estiveremagregados ou aderentes a pequenas partículas não há correspondência entre onúmero de colónias obtido e o número inicial de microrganismos. Desta forma,relativamente à origem de uma colónia, ou ao teor de microrganismos determinadopor contagem de colónias, fala-se em Unidades Formadoras de Colónias (UFC).

Após a obtenção de uma cultura pura, a sua manutenção em laboratório deve garantirque os microrganismos permaneçam viáveis, geneticamente homogéneos eprotegidos de posteriores contaminações. As culturas podem ser mantidas porrefrigeração (4ºC), congelação (-20ºC, -70ºC ou em azoto líquido: -180ºC) ouliofilizadas. Para conservação a longo prazo deverão usar-se substânciascrioprotectoras (e.g., glicerol).

Protocolo 1.4 Diluições decimais sucessivas

1. Identificar os tubos de ensaio, com as referências 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, …;

2. Com uma pipeta esterilizada retirar em assepsia 1 ml da amostra da populaçãofornecida;

3. Introduzir a aliquota de 1 ml no primeiro tubo de diluição (tubo com sorofisiológico);

4. Homogeneizar a suspensão por agitação (vórtex), segurando a rolha para que nãosalte;

5. Com outra pipeta esterilizada retirar 1 ml da diluição do primeiro tubo (diluição10-1) e introduzir num segundo tubo de diluição, para obtenção da diluição 10-2;

6. Proceder de igual modo até à última diluição, seguindo o esquema da Figura 1.2;



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7. Semear imediatamente, de acordo com os métodos indicados nos pontosseguintes, seguindo a ordem decrescente das diluições e utilizando uma só pipetapara todas as sementeiras da mesma amostra.

Figura 1.2 O método das diluições decimais sucessivas

Protocolo 1.5 Sementeira por incorporação

1. Manter um meio de cultura (sólido) liquefeito num banho a 45ºC (o agar começaa solidificar a 42ºC);

2. Identificar 5 caixas de Petri esterilizadas com a data, turma e nº de aluno ediluição respectiva e marcar uma caixa de Petri extra com a letra C (controlo);

3. Seguindo a ordem decrescente das diluições, retirar 1 ml de cada uma das

diluições com uma pipeta esterilizada, depois de a ter enchido e esvaziado pelomenos 6 vezes na suspensão de microrganismos;

4. Entreabrindo apenas o suficiente a tampa da caixa de Petri, colocar o conteúdo dapipeta no fundo da caixa;

5. Tirar a rolha do tubo de meio sólido liquefeito, passar a boca do tubo pela chamae verter, de uma só vez, o seu conteúdo na caixa de Petri;

6. Incorporar o inóculo no meio de cultura: mantendo a caixa assente sobre o tampona bancada, agite-a (descrever cinco círculos no sentido dos ponteiros do relógio,



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cinco outros em sentido contrário e movimentos rectilíneos segundo duasdirecções cruzadas, cinco vezes cada também) evitando que o agar toque a tampada placa e deixe repousar até solidificar;

7.

Na caixa controlo não se deposita inóculo: verter o conteúdo de um tubo de meioda mesma maneira que anteriormente;

8. Após solidificação do meio, identificar as caixas com a data de inoculação,diluição e microrganismo inoculados, inverter e incubar a 25ºC durante dois dias.

Protocolo 1.6 Sementeira por espalhamento em placa

1. Identificar convenientemente o material a inocular;

2. A partir de cada uma das diluições pipetar 0.1 ml para a superfície do meio decultura solidificado;

3. Com um espalhador de vidro estéril espalhar o inóculo por toda a superfície dacaixa semeada, rodando-a simultaneamente;

4. Identificar as caixas, colocar em posição invertida e incubar a 25ºC durante doisdias.

Protocolo 1.7 Isolamento por riscado em placa

1. Com uma ansa esterilizada e arrefecida tocar numa colónia isolada;

2. Riscar com a ansa a superfície do agar, de acordo com um esquema que viseesgotar completamente o material contido na ansa (Figura 1.3);

3. Identificar e colocar a caixa de Petri em posição invertida a incubar a 25ºCdurante uma semana.

Figura 1.3 Exemplo de um riscado em placa, mostrando as quatro direcções doriscado. O objectivo do riscado é o esgotamento do inóculo e a obtenção de colóniasderivadas de uma única célula inicial. Para maior eficácia no processo de esgotamentodo inóculo, pode esterilizar-se a ansa entre os riscados 1, 2, 3 e 4, esperando quearrefeça em assepsia antes de iniciar o riscado seguinte.



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Avaliação quantitativa de populações A avaliação quantitativa do crescimento microbiano pode ser feita de diversas formas,dependendo das características do material e da informação pretendida. Osparâmetros medidos são normalmente os seguintes:

Actividade dos microrganismos que constituem a população em estudo,por exemplo, redução de corantes (medida pelo grau de redução emdeterminado tempo ou pelo tempo necessário à redução), libertação de CO2 (pelo volume ou pela massa perdida), consumo de O2 (pela chamada “Carência

Biológica de Oxigénio”, CBO).

Massa celular , uma vez fixadas as condições de observação e conhecida afunção que relaciona a massa celular com o número de microrganismospresentes.

Número de células: contagem dos microrganismos, directa ou total (ex.câmaras de contagem e método de Breed) e indirecta ou de viáveis (ex.contagem em placas e método do Número Mais Provável - NMP).

O número de células viáveis (células com capacidade para se multiplicar) presentesnuma população microbiana pode ser estimado usando técnicas de contagem emplacas. Neste método um volume conhecido de uma suspensão de microrganismos,convenientemente diluída, é espalhado na superfície de um meio de culturasolidificado (sementeira por espalhamento em placa) ou incorporado nesse meio(sementeira por incorporação). As colónias que se desenvolvem, após incubaçãoadequada, são contadas. Assume-se que cada colónia é originada a partir de umaúnica célula, o que nem sempre é verdade, pelo que os resultados são normalmenteexpressos em termos de unidades formadoras de colónias (UFC). Para que osresultados sejam significativos as placas contáveis deverão ter entre 30 a 300colónias. O número total de microrganismos obtém-se multiplicando o número decolónias pelo factor de diluição.

Protocolo 1.8 Contagem de células viáveis em placas

1. Observar as caixas de Petri inoculadas, seleccionar apenas as que permitam

contar entre 30 a 300 colónias e contar as colónias nas placas seleccionadas;2. Calcular o número médio das diversas repetições;

3. Calcular o número de células viáveis presentes na suspensão original(UFC/ml), i.e., a abundância de microrganismos cultiváveis.



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2.Qualidade microbiológica do ar

Ar ambiente e ar interior A qualidade do ar é o termo que se usa, normalmente, para traduzir o grau de

poluição no ar que respiramos. A poluição do ar é provocada por uma mistura desubstâncias químicas, lançadas no ar ou resultantes de reacções químicas, quealteram o que seria a constituição natural da atmosfera. Estas substâncias poluentespodem ter maior ou menor impacte na qualidade do ar, consoante a sua composiçãoquímica, concentração na massa de ar em causa e condições meteorológicas. Assim,por exemplo, a existência de ventos fortes ou chuvas poderão dispersar os poluentes,ao passo que a presença de luz solar poderá acentuar os seus efeitos negativos. Nalegislação não está contemplado o uso de parâmetros microbiológicos na avaliação daqualidade do ar ambiente.

A qualidade do ar no interior dos edifícios é um dos factores básicos noconforto dos utilizadores e também influencia a sua saúde, bem como o rendimento eduração do equipamento e maquinaria existentes na área de tratamento do ar. A qualidade do ar interior (QAI) deve, assim, ser avaliada periódica e sistematicamente,com o objectivo de garantir níveis mínimos de qualidade. Para além de várioscompostos considerados poluentes, na legislação está prevista a monitorização daqualidade microbiológica do ar interior.

Microrganismos no ar interior

Além das partículas poluentes não biológicas, o ar contém bioaerossóis, quecorrespondem a material biológico transmitido pelo ar. Os contaminantes biológicosincluem microrganismos (bactérias, fungos, vírus), ácaros, pólen, traças, pêlo e fezesde animais. As bactérias (e.g., Staphylococcus spp. e Micrococcus spp.) e fungos (e.g.,

Penicillium spp., Aspergillus spp. e Cladosporium spp.) são os mais frequentementeassociados com biocontaminantes e com queixas quanto à qualidade de ar deinteriores. Entre as principais fontes de contaminação fúngica estão os sistemas de

ventilação mecânica, em função do seu funcionamento deficiente e de misturar arfiltrado externo com ar reciclado (Filho et al ., 2000). A quantidade e o tipo demicrorganismos existentes dentro de um espaço fechado estão directamente

relacionados com:

A existência de suspensões orgânicas e minerais no ar; A temperatura e a humidade relativa As condições de manutenção dos sistemas de climatização existentes A higiene das instalações O número e o nível de higiene dos seus ocupantes.



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Legislação aplicável

Decreto-Lei 79/2006 |

http://www.dre.pt/pdf1sdip/2006/04/067A00/24162468.PDF

Aprova o Regulamento dos Sistemas Energéticos de Climatização em Edifícios,publicado em anexo. Transpõe parcialmente para a ordem jurídica nacional aDirectiva nº 2002/91/CE, do Parlamento Europeu e do Conselho de 16 de Dezembro,relativa ao desempenho energético dos edifícios. Define os parâmetrosmicrobiológicos a avaliar e os valores máximos admissíveis para cada parâmetro(Tabela 1.1).

Tabela 1.1 Parâmetros microbiológicos e valores máximos admissíveis aconsiderar na determinação da qualidade do ar interior (Decreto-Lei 79/2006)

NºUFC/m

Bactérias 500Fungos 500Legionella3 100

Bactérias

Grupo muito vasto de microrganismos (organismos microscópicos) composto porseres procariotas (i.e., sem núcleo individualizado e sem organelos intra-celulares) eunicelulares. Podem ter a forma de esferas (i.e., cocos) ou de bastonetes (i.e., bacilos).

Fungos

Grupo de organismos que inclui as leveduras, os bolores, os cogumelos, etc. Os bolores são fungos filamentosos e as leveduras são fungos unicelulares. As suascélulas são eucariotas (i.e., têm núcleo individualizado e organelos intra-celulares).

3 Em edifícios com sistemas de climatização em que haja produção de aerossóis (e.g., torresde arrefecimento ou humidificadores por água líquida), ou com sistemas de água quentepara chuveiros onde a temperatura de armazenamento seja inferior a 60ºC. Pesquisa emamostras de água recolhidas nos locais de maior risco (e.g., tanques das torres dearrefecimento, depósitos de água quente e tabuleiros de condensação).








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Legionella

É uma bactéria Gram-negativa4, móvel, com forma de bastonete (Figura 1.4). Podecausar pneumonia (doença dos legionários) ou uma doença semelhante à gripe(doença de Pontiac). Foi pela primeira vez identificada e reconhecida como causadora

de doenças numa convenção da American Legion Convention que teve lugar emFiladélfia (EUA) em 1976. Existem mais de 40 espécies de Legionella, das quais 18podem causar doenças. Pensa-se que a maioria das infecções é devida a à espécie

Legionella pneumophila. A Legionella é um microrganismo fastidioso, i.e., temnecessidades muito específicas para que possa sobreviver e crescer: (1) temperatura >20ºC; (2) presença de ferro; (3) presença de cisteína5; (4) presença de biofilme6 (principalmente protozoários). Ao contrário de outras bactérias, pode sobreviver com

baixos níveis de oxigénio dissolvido e é, pelo menos parcialmente, resistente àdesinfecção com cloro.

4 A técnica de Gram ou coloração de Gram é uma técnica de coloração de preparaçõeshistológicas para observação ao microscópio óptico, utilizada para corar diferencialmente bactérias com base na composição química e na integridade da sua parede celular.Consoante a cor que adquirem, são classificadas em Gram-positivas (roxo) ou Gram-negativas (vermelho). O método se deve ao médico dinamarquês Hans Christian Joachim

Gram (1853-1938). Geralmente as bactérias Gram-negativas são mais patogénicas que asGram-positivas.5 Cisteína é um dos aminoácidos codificados pelo código genético, sendo portanto um dos

componentes das proteínas dos seres vivos.6 Os biofilmes são comunidades biológicas com um elevado grau de organização, onde os

microrganismos formam comunidades estruturadas, coordenadas e funcionais. Estascomunidades biológicas encontram-se embebidas em matrizes poliméricas produzidas porelas próprias. Os biofilmes podem desenvolver-se em qualquer superfície húmida, seja ela biótica ou abiótica. A associação dos organismos em biofilmes constitui uma forma deprotecção ao seu desenvolvimento, favorecendo relações simbióticas e permitindo asobrevivência em ambientes hostis.



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Figura 1.4 Fotografia de Legionella sp., mostrando o tamanho do bastonete e oflagelo que lhe permite mobilidade. Fonte: https://reader003.{domain}/reader003/html5/0217/5a87856c1a9d

Procedimentos geraisExistem dois métodos principais para a monitorização dos microrganismos do ar,monitorização passiva e monitorização ou amostragem activa. A monitorizaçãopassiva é levada a cabo por sedimentação do ar em caixas de Petri standard com meiode cultura generalista, abertas e expostas ao ar durante um período de tempo

conhecido. Este método não permite, pelo menos directamente, a contabilização donúmero de colónias por unidade de volume de ar. Para além disso, as caixas de Petripodem ser contaminadas por microrganismos proveniente de outras fontes decontaminação que não o ar. Por outro lado, é um método fácil de usar e com baixoscustos. A monitorização activa necessita de um amostrador de ar, que filtra volumesconhecidos através de um filtro que depois é incubado em meio apropriado.

Embora ambos os métodos sejam utilizados, na legislação portuguesa está indicado ométodo da filtração para a quantificação das bactérias e dos fungos do ar. Para adistinção de fungos e leveduras pode recorrer-se à observação macroscópica dascolónias e à observação microscópica das suas células. A determinação de Legionella é efectuada nas águas e não no ar, pelo que os métodos de análise serão abordadosnoutra secção.

http://mcb.berkeley.edu/labs/vance/legionella.jpg





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3.Qualidade microbiológica de superfícies

A amostragem e a análise dos microrganismos presentes em superfíciespermitem determinar se os métodos de limpeza e desinfecção utilizados são eficazes.

Tabela 1.2 Parâmetros microbiológicos e valores máximos admissíveis aconsiderar na determinação da qualidade de superfícies.

NºUFC/cm

Bactérias aeróbias7

mesófilas8

totais 100

Procedimentos geraisPara a determinação de bactérias aeróbias mesófilas totais utiliza-se o método dazaragatoa (objecto semelhante a um cotonete gigante). Utiliza-se a zaragatoa

humedecida para limpar uma superfície com área conhecida e inocula-se meio decultura apropriado em caixa de Petri recorrendo ao método do riscado.

7 Classificação quanto às necessidades de oxigénio. Os microrganismos podem ser aeróbiosou anaeróbios. Dentro dos aeróbios existem os aeróbios obrigatórios ou estritos (sóconseguem sobreviver na presença de oxigénio na concentração atmosférica – cerca de20%) e os microaerófilos (necessitam de oxigénio mas não toleram a concentraçãoatmosférica; necessitam de 2-10%). Dentro dos anaeróbios existem os anaeróbiosobrigatórios ou estritos (morrem na presença de oxigénio), os anaeróbios facultativos (não

necessitam de oxigénio para sobreviver mas crescem melhor na sua presença) e osaerotolerantes (crescem igualmente bem na presença ou na ausência de oxigénio; nãousam oxigénio, ignoram-no).

8 Classificação quanto às necessidades de temperatura. Os microrganismos mesofilos vivemnuma gama de temperaturas amenas (a nossa temperatura ambiente); a temperaturamáxima que toleram é menor que 50ºC, a temperatura mínima deve ser maior que 15ºC ea temperatura óptima é 35ºC. Os microrganismos psicrófilos (que vivem a baixastemperaturas) têm temperatura máxima menor que 20ºC, a temperatura mínima pode sermenor que 0ºC e a temperatura óptima é 5-10ºC. Os microrganismos termófilos vivem atemperaturas elevadas; temperatura mínima de 45ºC, temperatura máxima podeultrapassar 80ºC e a temperatura óptima é 55-65ºC.



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4.Métodos específicos

ArProtocolo 1.9 Amostragem do ar por sedimentação

Os microrganismos presentes no ar sedimentam a taxas variadas dependendodo tipo/tamanho das partículas em suspensão e do movimento do ar da sala. A amostragem por sedimentação não determina directamente o número demicrorganismos presentes num dado volume de ar, mas é possível transformar osresultados deste método (nº de UFC/unidade de área) em nº de UFC/unidade de

volume. Para isso, é necessário conhecer a área da caixa de Petri exposta ao ar e arazão entre o número de células na superfície e número de células no ar (SAR). A SAR para ambientes com sedimentação espontânea, i.e., sem aparelhos que forcem o ar, é23:1 (Morais et al ., 2010). O número de UFC em cada metro cúbico de ar calcula-se

de acordo com a seguinte equação (Friberg et al ., 1999a; Friberg et al ., 1999b):

Existem caixas de Petri de vários tamanhos. As caixas de Petri utilizadas nonosso laboratório têm diâmetro de 8 cm, pelo que a sua área é aproximadamente50 cm2 ou seja, 0.0050 m2.

Para calcular a área de uma caixa de Petri, medir o seu diâmetro (cm), dividirpor 2 para obter o raio (R) e aplicar a fórmula para determinar a área (área = ×R 2).

Para transformar o resultado obtido (cm2) em m2, dividir por 10000.

Material e métodos

1. Elaborar meio de cultura para bactérias (Plate Count Agar, PCA) e para fungos(agar nutritivo);

2. Identificar as caixas com o nome do meio de cultura e a data de elaboração;

3. Deitar o meio nas caixas de Petri, deixar arrefecer e solidificar;

4. Abrir as caixas ao ar no local desejado, tendo o cuidado de utilizar pelo menosduas repetições para cada um dos tipos de microrganismo;

5. Deixar em exposição durante 30 minutos;6. Fechar as caixas, inverter, identificar e colocar na estufa (30ºC para as bactérias e

25ºC para os fungos);

7. Deixar incubar durante 24-48 horas e contabilizar o número de UFC em cadacaixa;

8. Calcular o número de UFC por m3 do ar da sala;

9. Comparar o resultado obtido com a legislação e concluir.



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Protocolo 1.10 Amostragem do ar por filtração

A forma correcta de aplicação deste método consiste na utilização de umamostrador que permite determinar com exactidão o volume de ar filtrado. O métodoaqui descrito pretende ultrapassar a limitação imposta pela não existência de um

amostrador.

Material e métodos

1. Ligar a bomba de vácuo ao aparelho de filtração, colocar uma membrana ecronometrar o tempo que o aparelho demora a filtrar um volume conhecido deágua. Utilizar este resultado para fazer uma estimativa do ar filtrado peloaparelho durante um dado período de tempo;

2. Elaborar meio de cultura para bactérias (Plate Count Agar, PCA) e para fungos(agar nutritivo);

3. Identificar as caixas com o nome do meio de cultura e a data de elaboração;4. Deitar o meio nas caixas de Petri, deixar arrefecer e solidificar;

5. Com uma pinça estéril, colocar uma membrana estéril no aparelho de filtração,ligar a bomba de vácuo e cronometrar o tempo necessário para filtrar o volume dear pretendido;

6. Desligar a bomba de vácuo e, em condições de assepsia, retirar o filtro com umapinça estéril, colocar sobre o meio de cultura;

7. Em condições de assepsia e utilizando a pinça estéril, colocar o filtro sobre o meiode cultura na caixa de Petri;

8. Fazer pelo menos duas repetições para cada um dos tipos de microrganismo;

9. Fechar as caixas, inverter, identificar e colocar na estufa (30ºC para as bactérias e25ºC para os fungos);

10. Deixar incubar durante 24-48 horas e contabilizar o número de UFC em cadacaixa;

11. Calcular o número de UFC por m3 do ar da sala;


SuperfíciesProtocolo 1.11 Amostragem por zaragatoa

1. Elaborar meio de cultura Plate Count Agar (PCA);

2. Identificar as caixas com o nome do meio de cultura e a data de elaboração;

3. Deitar o meio nas caixas de Petri, deixar arrefecer e solidificar;

4. Utilizando uma zaragatoa estéril, percorrer uma área de tamanho conhecido nazona a monitorizar;



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5. Em condições de assepsia, riscar todo o meio de cultura com a zaragatoa;

6. Fechar as caixas, inverter, identificar e colocar na estufa a 30ºC;

7. Deixar incubar durante 24-48 horas e contabilizar o número de UFC em cada

caixa;8. Calcular o número de UFC por cm2 da superfície estudada;


Referências citadas

Alcântara, F., Cunha, M.A. & Almeida, M.A. (1996). Microbiologia: práticaslaboratoriais. Edições Universidade de Aveiro. 298 páginas. ISBN 972-8021-17-8.

Ferreira, W.F.C., Sousa, J.C.F. & Lima, N. (2010). Microbiologia. Lidel-Ediçõestécnicas, Lda. Lisboa. 622 páginas. ISBN 978-972-757-515-2.

Filho, P.P.G., Silva, C.R.M. & Kritski, A.L. ( 2000). Ambientes climatizados, portaria3.523 de 28/8/98 do Ministério da Saúde e padrões de qualidade do ar deinteriores do Brasil. Jornal de Pneumologia, 26 (5). doi: 10.1590/S0102-35862000000500006. Disponível emhttp://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0102-35862000000500006&lng=pt&nrm=iso&tlng=pt.

Friberg, B., Friberg, S. & Burman, L.G. (1999a). Correlation between surface and aircount of particles carrying aerobic bacteria in operating rooms with turbulent

ventilation. Journal of Hospital Infection, 42: 61-68.

Friberg, B., Friberg, S. & Burman, L.G. (1999b). Inconsistent correlation betweenaerobic bacterial surface and air counts in operating rooms with ultra cleanlaminar air flows: proposal of a new bacteriological standard for surface

contamination. Journal of Hospital Infection, 42: 287-293.

Morais, G.R., Silva, M.A., Carvalho, M.V. Santos, J.G.S., von Dolinger, E.J.O. & Brito,D.D. (2010). Qualidade do ar interno em uma instituição de ensino superior

brasileira. Bioscience Journal , 26 (2): 305-310.

manual monitorizacao ambiental esac parte 1

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