Universidade do Estado do Rio de Janeiro

Centro Biomédico

Faculdade de Ciências Médicas

Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental

Mabel Carneiro Fraga Marques

Alterações neuro-comportamentais em ratos machos adultos em modelos de

programação pela hiperleptinemia na lactação

Rio de Janeiro

2009

Mabel Carneiro Fraga Marques

Alterações neuro-comportamentais em ratos machos adultos em modelos de

programação pela hiperleptinemia na lactação

Tese apresentada como requisito para obtenção do título

de Doutor ao Programa de Pós-Graduação em

Fisiopatologia Clínica e Experimental da Universidade do

Estado do Rio de Janeiro.

Orientador: Prof. Dr. Alex Christian Manhães

Co-orientador: Prof. Dr. Egberto Gaspar de Moura

Rio de Janeiro

2009

Mabel Carneiro Fraga Marques

Alterações neuro-comportamentais em ratos machos adultos em modelos de

programação pela hiperleptinemia na lactação

Tese apresentada, como requisito para obtenção do título

de Doutor ao Programa de Pós-Graduação em

Fisiopatologia Clínica e Experimental da Universidade do

Estado do Rio de Janeiro.

Banca Examinadora:

_________________________________________________ Prof Dr. Alex Christian Manhães (Orientador) Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes da UERJ _________________________________________________ Prof. Dr. Cláudio Carneiro FilgueirasInstituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes da UERJ _________________________________________________ Prof. Dr. Jesus Landeira Fernandez Departamento de Psicologia da PUC _________________________________________________ Profa. Dra. Patricia Cristina. LisboaInstituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes da UERJ _________________________________________________ Prof a. Dra. Regina Célia Cussa KubruslyInstituto Biomédico da UFF

Rio de Janeiro

2009

CATALOGAÇÃO NA FONTE

UERJ/REDE SIRIUS/BIBLIOTECA CB-A

Autorizo apenas para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta tese. _____________________________________________ _____________________

Assinatura Data

M357 Marques, Mabel Carneiro Fraga.

Alterações neuro-comportamentais em ratos machos adultos em modelos de programação pela hiperleptinemia na lactação / Alessandro Rodrigues do Nascimento - 2009.

xvii, 75f. : il.

Orientador : Alex C. Manhães. Co-orientador : Egberto Gaspar de Moura. Tese (Doutorado) – Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Faculdade de Ciências Médicas.Pós-Graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental. Bibliografia: f. 66-90.

1. Cognição nos animais - Teses. 2. Leptina -Teses. 3. Lactação - Teses. 4. Memória - Teses. 5. Aprendizagem - Teses. 6. Ansiedade - Teses.7. Manifestações neurocomportamentais - Teses. 8. Hiperfagia - Teses.I. Manhães, Alex C. II. Moura, Egberto Gaspar de. III. Universidade do Estado do Rio de Janeiro.Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.

CDU 591.5

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Neurofisiologia (LN) e no

Laboratório de Fisiologia Endócrina (LFE) do Depto. de Ciências Fisiológicas do Instituto de

Biologia Roberto Alcantara Gomes, sob a orientação dos professores Alex Christian Manhães

e Egberto Gaspar de Moura, na vigência dos auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela Coordenação de Aperfeiçoamento

de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e pela Fundação Carlos Chagas de Amparo à Pesquisa

do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).

DEDICATÓRIA

À minha família, em especial a minha mãe, pelo exemplo

de vida, amor, dedicação e incentivo sempre.

AGRADECIMENTOS

Ao Professor Alex Christian Manhães – agradeço por ter me aceitado como orientanda

e confiado no meu trabalho, mesmo antes de conhecê-lo. Agradeço a orientação, reflexões

críticas e conhecimentos transmitidos durante o desenvolvimento deste trabalho. Muito

obrigada pela confiança e pela força!

Ao professor Egberto Gaspar de Moura – pelo incentivo e apoio sempre concedido,

antes mesmo de ser sua aluna de doutorado, e pelo exemplo de dedicação à pesquisa.

À Professora Patrícia Lisboa – pela constante participação na elaboração de resumos,

artigos, tese, projetos, mesmo não sendo oficialmente minha co-orientadora, e também pela

revisão da tese.

Aos professores Yael de Abreu Villaça e Cláudio Carneiro Filgueiras – pelo exemplo

de amor à pesquisa, e a todos os alunos do laboratório de Neurofisiologia: Fernanda, Andréia,

Ulisses, Carla, Monique, Danielle, Anderson, André, Ana Heloisa, Ana “do flúor” e Ana “da

Carla” e Juliana “da Fé”, pelo apoio e amizade, em especial aos meus GRANDES AMIGOS

E COLABORADORES: Juliana “da Mabel” e Sylvio.

À professora Magna Cottini da Fonseca Passos, a Elaine Oliveira, e a todos os alunos

e ex-alunos do laboratório de Fisiologia Endócrina: Isis, Mariana, Juliana, Isabela, Luciane,

Nathália, Ellen, Cíntia, Paula, Ana Paula, Aline Rios, Aline Troina e Stepham – pela

colaboração e amizade.

À Coordenação de Pós-Graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental – pelo

auxílio financeiro, imprescindível na participação em eventos científicos que muito

contribuíram para minha formação.

À secretária da Pós-Graduação Amélia Gomes – por sua eficiência e também pela

amizade ao longo destes anos.

À minha família querida, Mami, Painho, Deborah, Gilcene e Júnior – que mesmo

geograficamente distante são as pessoas mais presentes em minha vida, e a todos os meus

queridos e amigos: Fred, Eloíza, Roberta Leão, Denise, Xênia, Louise e Júlia que sempre me

incentivaram a seguir em frente e me deram força e amor.

Àquele em quem me apoio e que me dá sonhos e meios para realizá-los – DEUS.

Porque Dele e por Ele são todas as coisas.

“É melhor tentar e falhar, que preocupar-se e ver a

vida passar. É melhor tentar, ainda que em vão que sentar-

se, fazendo nada até o final. Eu prefiro na chuva caminhar,

que em dias frios em casa me esconder. Prefiro ser feliz

embora louco, que em conformidade viver”

Martin Luther King

RESUMO

FRAGA-MARQUES, Mabel Carneiro. Alterações neuro-comportamentais em ratos machos adultos em modelos de programação pela hiperleptinemia na lactação. Brasil. 2009. 92 f. Tese (Doutorado em Fisiopatologia Clínica e Experimental) - Faculdade de Ciências Médicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, RJ, 2009.

Existe uma grande associação entre alterações em parâmetros nutricionais, hormonais ou ambientais durante estágios iniciais da vida, particularmente durante os períodos gestacional e de lactação, e o surgimento de doenças crônicas na vida adulta tais como obesidade, diabetes, doenças cardiovasculares, ansiedade e depressão. Neste trabalho, foram avaliados os efeitos cognitivo-comportamentais, em ratos Wistar adultos, da administração de leptina (8µg/100g, dia, sc) durante os primeiros 10 dias de lactação: 1) diretamente nos filhotes; 2) nas progenitoras. A memória e o aprendizado, os níveis de comportamento associados à ansiedade e à busca pela novidade foram avaliados em animais adultos através, respectivamente, dos seguintes testes comportamentais: labirinto aquático radial de 8 braços, labirinto em cruz elevado e campo vazado. No primeiro modelo (injeção nos filhotes), foram observados altos níveis de ansiedade e de busca por novos estímulos, enquanto que a memória e aprendizagem e atividade locomotora não foram afetados. No segundo modelo (injeção nas progenitoras), foram detectados redução dos níveis de ansiedade e melhora no desempenho associado à memória e ao aprendizado. Porém, não houve diferença nos níveis de busca por novos estímulos e no nível de atividade locomotora. Também são observadas diferenças em parâmetros somáticos, endócrinos e metabólicos entre modelos. O primeiro modelo resulta em hiperfagia, maior peso corporal por aumento de massa magra, hiperleptinemia, hipertireoidismo, hipertrigliceridemia, hiperinsulinemia e hipoadiponectinemia, hipertensão, aumento de catecolamina e de corticosterona, além de resistência hipotalâmica à leptina. O segundo modelo induz hiperfagia e maior peso corporal por acúmulo de gordura, hiperleptinemia, hiperglicemia, eutireoidismo, normoinsulinemia e resistência central à leptina. As seguintes possibilidades podem explicar as diferenças cognitivos-comportamentais observadas entre os modelos estudados: 1) diferentes perfis somáticos, endócrinos e metabólicos; 2) modificações na relação mãe-prole, já que a leptina injetada na mãe pode reduzir seu nível de ansiedade; 3) diferenças entre as vias de administração da leptina, já que sua transferência pelo leite pode causar alterações secundárias. Palavras-chave: Hiperleptinemia, lactação, programação, memória, aprendizagem, ansiedade, busca pela novidade.

ABSTRACT

A considerable association exists between variations in nutritional, hormonal and environmental parameters during early life, particularly in the gestational and lactation periods, and the appearance of chronic diseases in adult life, such as obesity, diabetes, cardiovascular diseases, anxiety and depression. In the present study, the cognitive and behavioral effects of leptin injection (8µg/100g/day, sc) during the first 10 days of lactation were evaluated in adult male Wistar rats. In the first part of the study, leptin was injected directly in the offspring. In the second part of the study, leptin was injected in the lactation dams. Memory and learning, levels of anxiety-like behavior and levels of novelty-seeking behavior were evaluated by testing animals in, respectively, the radial-arm water maze, the elevated plus maze and the hole board arena. In the first model (offspring injection), high levels of anxiety and of novelty-seeking behavior were observed. Memory/learning and locomotor activity were unaffected. In the second model (dam injection), reduced levels of anxiety and better memory/learning performance were observed. Conversely, novelty-seeking and locomotor behavior were unaffected. Differences between models regarding somatic, endocrine and metabolic parameters are also observed. The first model presents hyperphagia, higher lean body mass, hyperleptinemia, hyperthyroidism, hipertrigliceridemia, hiperinsulinemia and hypoadiponectinemia, hypertension, increased levels of catecholamines and corticosterone, and hypothalamic leptin resistance. The second model induces hyperphagia, higher body mass, thou by accumulation of fat, hyperleptinemia, hyperglycemia, euthyroidism, normoinsulinemia and central mechanism of leptin resistance. The following possibilities may explain the cognitive-behavioral differences observed between models in the present study: 1) differences in somatic, endocrine and metabolic parameters; 2) modifications of the relationship between dams and their offspring, since leptin injection in the dams may reduce their anxiety levels; 3) different routes of leptin injection, since leptin transfer via milk may cause secondary alterations. Keywords: Hyperleptinaemia, lactation, programming, memory, learning, anxiety, novelty-seeking.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

FIGURA 1: Via de sinalização da leptina no hipotálamo 22

FIGURA 2: Neurônios hipotalâmicos responsivos à leptina, NPY e α-MSH 24

FIGURA 3: Vista superior do labirinto aquático radial de 8 braços 91

FIGURA 4: Vista superior do labirinto em cruz elevado 92

FIGURA 5: Vista superior do campo vazado 92

LISTA DE TABELAS

TABELA 1: Via de sinalização da leptina no hipotálamo 19

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

Aβ Peptídeo beta-amilóide

ACTH Hormônio adrenocorticotrófico

AgRP Proteína agouti

α-MSH Hormônio estimulador de alfa-melanócito

AMPA Ácido a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico

ARC Núcleo arqueado do hipotálamo

BA Braço aberto

Ca2+ Cálcio

CA1 Neurônios hipocampais

CaMKII Miosina-V e Ca2+/calmodulina quinase

CART Fator de transcrição celular regulado por cocaína e anfetamina

CCK Colecistoquinina

CRH Hormônio liberador de corticotropina

CV Campo vazado

db/db Camundongos com deleção do gene lepr

DNA Ácido desoxirribonucléico

DMN Núcleo dorsomedial do hipotálamo

GHS-R Receptor do secretagogo de hormônio de crescimento

GLP Peptídeo semelhante ao glucagon

HD Head dipping

HLA Hipotálamo lateral

HHA Eixo hipotálamo-hipófise-adrenal

HHT Eixo hipotálamo-hipófise-tireóide

HTs Hormônios tireoideanos

i.c.v Intracerebroventricular

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

IMC Índice de massa corporal

IP3 Fosfatidilinositol trifosfato

JAK Janus-kinase

LAROB Labirinto aquático de 8 braços

LCE Labirinto em cruz elevado

Lepr Gene do receptor de leptina

LTD Depressão de longa duração

LTP Potenciação de longa duração

MCH Hormônio concentrador de melanina

MSH Hormônio estimulador de alfa-melanócito

mRNA Ácido ribonucléico mensageiro

NMDA N-metil-D-aspartato

NPY Neuropeptídeo Y

NR Subunidade dos receptores de NMDA

Ob Gene da obesidade (leptina)

ob/ob Camundongos com deleção do gene ob

ObR Receptor de leptina

ORX Orexinas

NMDA N-metil-D-aspartato

PI3K Fosfatidilinositol 3-kinase

POMC Pró-ópiomelanocortina

PVN Núcleo paraventricular do hipotálamo

PYY Peptídeo YY

RNAi Ácido ribonucleico de interferência

RNAm Ácido ribonucleico mensageiro

SM Síndrome metabólica

SN Sistema nervoso

SNC Sistema nervoso central

SNS Sistema nervoso simpático

SOCS Supressores de sinalização de citocinas

SAP Stretched attend posture

STAT Proteína do sinal de transdução e transcrição

TDAH Transtorno do déficit de atenção e hiperatividade

TRH Hormônio liberador de tireotrofina

TSH Tireotrofina

VTA Área tegumentar ventral

VMH Hipotálamo ventromedial

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO........................................................................................................ 18

1.1 Leptina.......................................................................................................................18

1.1.1 Leptina e sistemas neuroendócrinos........................................................................... 19

1.1.2 Receptores de leptina................................................................................................. 20

1.1.3 Sinalização intracelular da leptina.............................................................................. 22

1.1.4 Efeitos da leptina no hipotálamo................................................................................ 23

1.1.5 Efeitos da leptina em outras estruturas....................................................................... 24

1.1.6 Resistência à leptina................................................................................................... 25

1.2 Efeitos cognitivos e comportamentais da leptina.................................................. 26

1.2.1 Leptina, memória e aprendizado................................................................................ 27

1.2.2 Leptina e ansiedade.................................................................................................... 29

1.2.3 Leptina e atividade exploratória................................................................................. 31

1.3 Programação metabólica......................................................................................... 32

1.3.1 Programação metabólica pela leptina......................................................................... 34

1.4 Modelos experimentais em animais........................................................................ 34

1.4.1 Modelo de aprendizagem e memória......................................................................... 34

1.4.2 Modelo de ansiedade.................................................................................................. 35

1.4.3 Modelo de busca pela novidade................................................................................. 36

2. OBJETIVOS............................................................................................................. 37

3. ARTIGOS................................................................................................................. 38

3.1 Artigo 1...................................................................................................................... 38

Mabel C. Fraga-Marques, Egberto G. Moura, Sylvio Claudio-Neto,

Isis H. Trevenzoli, Fabiane P. Toste, Magna C.F. Passos, Patrícia C.

Lisboa, Alex C. Manhães. Neonatal hyperleptinaemia programmes

anxiety-like and novelty seeking behaviours but not memory/learning

in adult rats. Hormones and Behavior 55 (2009) 272–279.

3.2 Artigo 2...................................................................................................................... 47

Mabel C. Fraga-Marques, Egberto G. Moura, Juliana Oliveira-Silva;

Sylvio Claudio-Neto, Fernanda Pereira-Toste, Magna C F Passos,

Patricia C Lisboa, Alex C. Manhães. Effects of maternal

hyperleptinaemia during lactation on memory/learning, anxiety-like

and novelty-seeking behavioral traits of adult male rats. Behavioural

Brain Research, submetido, 2009.

4. DISCUSSÃO............................................................................................................. 58

5. CONCLUSÕES........................................................................................................ 65

6. REFERÊNCIAS....................................................................................................... 66

7. ANEXO..................................................................................................................... 91

18

1. INTRODUÇÃO

A obesidade é um dos maiores problemas de saúde pública na sociedade moderna e

seus efeitos deletérios têm se tornado mais frequentes e intensos tendo em vista o constante

aumento no número de indivíduos que apresentam esta característica (Kopelman, 2000;

Friedman, 2009). Segundo pesquisa realizada pelo IBGE, sobre a análise da disponibilidade

domiciliar de alimentos e do estado nutricional no Brasil de 2002 a 2003, cerca de 40% dos

adultos brasileiros de ambos os sexos apresentam sobrepeso (IMC igual ou maior que 25

kg/m2). Sabe-se que a obesidade pode ser condicionada por fatores genéticos, diminuição da

prática de atividade física, como também por alterações nutricionais ou ambientais durante a

fase de desenvolvimento do indivíduo, particularmente nos períodos fetal e perinatal (Rogers,

2003; Gluckman e Hanson, 2004; Cripps et al., 2005).

Entre os aspectos da fisiologia humana que são afetados na obesidade, mesmo quando

esta é considerada como um dos componentes de um conjunto de fatores (tal como na

síndrome metabólica), podemos citar os cognitivos, os emocionais e os comportamentais

(Van der Merwe, 2007; Brook et al., 2009). A associação entre obesidade e alterações do

funcionamento do sistema nervoso (SN) levou ao estudo sistemático das bases biológicas

desta relação (Sena et al., 1995; Bereiter e Jeanrenaud, 1979, 1980; Steppan e Swick, 1999;

Jagust et al., 2005). Tendo em vista a grande diversidade de fatores que levam à obesidade, é

esperado que múltiplos mecanismos possam explicar a existência desta relação (Rogers, 2003;

Gluckman e Hanson, 2004; Cripps et al., 2005; Zheng e Berthoud, 2008). O presente estudo

procura abordar um dos aspectos da fisiologia que está alterada no obeso e que cada vez mais

frequentemente tem sido associado às alterações na função do SN: os níveis séricos de leptina

(Banks, 2003; Figlewicz, 2003; Blüher e Mantzoros, 2009; Leinninger, 2009).

1.1. Leptina

A leptina, produto do gene ob, é um hormônio peptídico de 16kDa secretado

principalmente por adipócitos maduros. Este hormônio também foi detectado, em menor

concentração, nas seguintes estruturas: estômago, intestino, placenta, músculo esquelético,

glândula mamária e cérebro (Ahima, 2005). A descoberta da leptina, por Zhang e

colaboradores em 1994, representou um marco para os avanços no entendimento de processos

moleculares envolvidos com o controle da ingestão e do peso corporal.

19

A produção de leptina pelo adipócito é regulada pelo tamanho dos estoques de gordura

corporal e por hormônios envolvidos na homeostase energética, como insulina,

glicocorticóides e hormônios contra-reguladores. No indivíduo saciado (alimentado), há

aumento na produção de insulina. Ao contrário, no jejum prolongado, quando há uma redução

nos estoques de gordura, ocorre aumento na secreção de glucagon e de catecolaminas e

diminuição na secreção de leptina pelos adipócitos (MacDougald et al., 1995; Rentsch e

Chiesi, 1996; Slieker et al., 1996).

A concentração sérica de leptina reflete o estado das reservas energéticas do

organismo e o balanço energético entre a ingestão e o gasto calórico. Está diretamente

relacionada com o índice de massa corporal (IMC) e o conteúdo corporal total de gordura de

um indivíduo (Lustig, 2001). A tabela 1 reúne os principais fatores envolvidos no controle da

secreção de leptina. Tabela 1. Fatores envolvidos na regulação da leptina Aumento de leptina Redução de leptinaTecido adiposo Tecido adiposo Superalimentação Jejum Obesidade Exposição ao frio Insulina Agonistas β-adrenérgicos Glicocorticóides Testosterona Infecção aguda Citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1) Estômago

AlimentaçãoPlacenta Grelina Insulina Colestocinina Glicocorticóides Hipóxia/eclampsia

Músculo esquelético Glicose Glicosamina Lipídeos

1.1.1. Leptina e sistemas neuroendócrinos

Diversos estudos em animais e intervenções farmacológicas em seres humanos têm

proposto uma ação inibitória do sistema nervoso simpático (SNS) sobre a secreção de leptina

e esta, por sua vez, altera a resposta do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) ao estresse.

A exposição ao frio aumenta a noradrenalina plasmática e reduz a concentração de leptina em

humanos (Ricci et al., 2000) e a expressão do mRNA para a leptina em camundongos

(Trayhurn et al., 1995). A exposição ao frio também reduziu as concentrações séricas de

20

leptina e aumentou os seus receptores no hipotálamo (Dutra et al., 2007). Indivíduos expostos

à baixas temperaturas têm aumento da atividade simpática, principalmente no tecido adiposo

marrom. Isso sugere que o mecanismo pelo qual a leptinemia cai no frio seja a inibição da

secreção do hormônio via aumento da atividade simpática em geral. Inversamente, foi

relatado que a leptina tem efeito estimulatório sobre o sistema simpatoadrenal (Tang-

Christensen et al., 1999), demonstrando que existe uma interação entre tecido adiposo e o

cérebro pela qual a leptina estimula as vias simpáticas que por sua vez inibem a sua secreção.

Algumas evidências sugerem uma relação entre o eixo HHA e a secreção de leptina,

mas a interação entre esses sistemas ainda não é bem compreendida e os achados

experimentais frequentemente são divergentes. Em seres humanos, o cortisol sérico no

período pós-cirúrgico aumenta e a leptinemia é reduzida quase à metade (Kain et al., 1999),

mostrando uma relação inversa entre esses hormônios. Pacientes com Síndrome de Cushing

(hipercortisolismo) apresentam hiperleptinemia em concentrações similares as que ocorrem na

obesidade (Masuzaki et al., 1997). Além disso, a administração de dexametasona em

indivíduos saudáveis e em cultura de adipócitos humanos aumenta a expressão do mRNA e a

secreção de leptina (Masuzaki et al., 1997), evidenciando um efeito direto dos

glicocorticóides sobre a síntese e secreção deste hormônio. Portanto, embora a relação entre

glicocorticóides e leptina ainda não seja bem definida, existem fortes evidências de uma

correlação positiva entre eles, quando o hipercortisolismo está associado a aumento na

adiposidade, pelo menos central. Alguns trabalhos mostram uma relação inversa entre leptina

e glicocorticóides (Stephens et al., 1995; Huang et al., 1998; Ahima e Flier, 2000). A leptina

regula o eixo HHA, inibindo a secreção do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) via

inibição do hormônio liberador da corticotrofina (CRH) (Heiman et al., 1997; Oates et al.,

2000). Ainda, parece que a leptina suprime diretamente a produção e secreção de

glicocorticóides no córtex de adrenais de porcos (Malendowicz et al., 2007).

1.1.2. Receptores de leptina

O receptor de leptina (ObR) foi descrito pela primeira vez em camundongos e

caracterizado como um membro da família das citocinas da classe 1 (Tartaglia et al., 1995).

Pelo menos seis isoformas já foram identificadas em roedores: ObRa, ObRb, ObRc, ObRd,

ObRe e ObRf (Tartaglia et al., 1995; Lee et al., 1996; Wang et al., 1996).

21

As isoformas ObRa-ObRd e ObRf contêm um domínio transmembrana e podem ser

subdivididas em duas classes: formas curta e longa. A forma longa do receptor (ObRb) é

altamente conservada entre as espécies e muito expressa em mamíferos, possuindo o maior

domínio intracelular desta família de receptores, com 300 resíduos de aminoácidos. As outras

isoformas são consideradas curtas devido ao pequeno domínio intracelular e somente o ObRa

é conservado entre as espécies de mamíferos, com uma cadeia intracelular formada por 32-40

resíduos em roedores. O ObRe contém somente um domínio extracelular e é definido como a

forma livre ou secretada do receptor de leptina. Em geral, a isoforma longa do receptor é a

considerada crítica para a ação da leptina em diversos tecidos, por possuir maior domínio

intracelular e desencadear mecanismos de sinalização que vão resultar efetivamente nas ações

hormonais (Chua et al., 1997; Tartaglia, 1997).

A maior densidade de ObR é encontrada em regiões do hipotálamo, incluindo núcleos

arqueado, ventromedial, paraventricular, dorsomedial e hipotálamo lateral, que são

reconhecidos centros de regulação da ingestão alimentar e homeostase energética (Sahu,

2004). No entanto, recentemente foram descritos receptores para o hormônio em tecidos

periféricos tais como glândula tireóide (Nowak et al., 2002; Vicente et al., 2004), glândula

mamária, glândula supra-renal, hipófise, fígado, tecido adiposo e músculo esquelético,

evidenciando que a leptina, além de suas funções centrais, também regula perifericamente o

metabolismo (Bjorbaek e Kahn, 2004).

O surgimento de animais obesos mutantes espontâneos, que através de experiências

com parabiose propiciaram a hipótese da existência de um hormônio lipostático, denominado

de leptina, o qual anos depois foi associado com os genes ob e lepr através de técnicas de

mutagênese in situ, representou um grande avanço nos estudos a respeito da regulação

hormonal do apetite (Halaas et al., 1995; Maffei et al., 1995). A perda da sinalização da

leptina em camundongos ob/ob (deleção do gene ob) e em camundongos db/db (deleção do

gene lepr) resulta em obesidade secundária a hiperfagia e redução do gasto energético

(Clement et al., 1998; Friedman e Halaas, 1998). Além disso, esses animais apresentam outras

disfunções tais como hipotireoidismo, retardo de crescimento, infertilidade e

imunodeficiência. A reposição de leptina na restrição alimentar restaura cada uma dessas

funções e diminui o apetite (Ahima et al., 1996). Todavia, somente uma pequena porcentagem

dos seres humanos obesos são hipoleptinêmicos por apresentarem algum tipo de deficiência

genética, sendo mais frequente a obesidade associada à resistência à leptina, o principal fator

envolvido no desenvolvimento da doença (Considine et al., 1996).

22

1.1.3. Sinalização intracelular da leptina

A leptina entra no cérebro por um mecanismo de transporte saturável (Banks et al.,

1996), possivelmente através da barreira hematoencefálica por um transporte mediado por

receptor (ObRa, ObRc) ou pelo líquido cefalospinal (Schwartz et al., 1996). A leptina se liga

ao ObRb no hipotálamo e ativa sistemas de sinalização intracelular dependentes

principalmente da ativação da via JAK-STAT, que está ilustrada na figura 1 (Myers, 2004).

As proteínas JAK pertencem à família janus-kinase e são encontradas associadas

constitutivamente ao domínio intracelular do ObRb. A ligação leptina-ObRb resulta em

autofosforilação de JAK2 em resíduos de tirosina presentes no domínio intracelular do

receptor, com consequente ativação de STAT3 (transdutor do sinal e ativador da transcrição-

3). A proteína STAT3 ativada sofre dimerização e se transloca para o núcleo, onde regula a

transcrição de diversos genes, entre eles, o da proteína SOCS3 (supressor da sinalização de

citocinas tipo 3), um inibidor da via de sinalização que atua por retroalimentação negativa

(Ahima, 2005). O aumento na expressão de SOCS3 inibe a fosforilação em tirosina de JAK2

(Bjorbaek et al., 1999; Emilsson et al., 1999). Os altos níveis de SOCS3 vêm sendo

correlacionados com resistência à ação do hormônio tanto no hipotálamo quanto em tecidos

extra-hipotalâmicos (Bjorbaek et al., 1998; Steinberg et al., 2004; Velloso et al., 2008).

Figura 1. Via de sinalização da leptina no hipotálamo (adaptado de Sahu, 2003).

23

1.1.4. Efeitos da leptina no hipotálamo

A leptina regula direta ou indiretamente grupos de neurônios específicos no

hipotálamo e em outras regiões do cérebro (Tartaglia et al., 1995; Fruhbeck, 2001). Algumas

dessas regiões são ricas em ObRs, mostrando o efeito direto do hormônio na regulação

neuronal e, em outras, o receptor é pouco expresso, mesmo que nestes casos a resposta à

leptina seja acentuada, evidenciando uma regulação indireta. ObRs são altamente expressos

nos núcleos arqueado e ventromedial do hipotálamo, áreas envolvidas com o controle da

termogênese, regulação hormonal e comportamento alimentar (Hakansson e Meister, 1998;

Elmquist et al., 1999). Por outro lado, neurônios presentes no núcleo paraventricular do

hipotálamo (PVN) e no hipotálamo lateral (LHA) são praticamente desprovidos de receptores

para a leptina (Elmquist et al., 1998) sendo, no entanto, importantes reguladores das funções

neuroendócrinas mediadas pelo hormônio. Essa regulação é realizada de forma indireta,

através de projeções de neurônios sensíveis à leptina presentes no núcleo arqueado, núcleo

dorsomedial (DMN) e tronco cerebral (Elmquist et al., 1999; Ahima et al., 2000).

Diversos neuropeptídeos hipotalâmicos estão envolvidos na sinalização mediada pela

leptina. Essas moléculas sinalizadoras podem ser classificadas em dois grandes grupos:

peptídeos orexígenos, que estimulam o apetite, e peptídeos anorexígenos, que reduzem a

ingestão alimentar (Sahu, 2004). A leptina inibe a atividade de centros hipotalâmicos

contendo neurônios que expressam neuropeptídeos orexígenos – NPY (neuropeptídeo Y),

AGRP (peptídeo relacionado à proteína agouti), MCH (hormônio concentrador de melanina) e

ORX (orexinas) – e estimula aqueles responsáveis pela produção de neuropeptídeos

anorexígenos – α-MSH (hormônio estimulador de alfa-melanócito), CART (transcrito

regulado por cocaína e anfetamina) e CRH (hormônio liberador da corticotrofina) (figura 2).

Portanto, a leptina age como um fator de saciedade no SNC (Sahu, 2002; Ahima e Osei,

2004).

A leptina estimula a biossíntese de TRH (hormônio liberador de tireotrofina) por

mecanismos diretos sobre os neurônios do PVN que expressam TRH, pois já foi demonstrado

que a injeção de leptina em ratos em jejum reverte a supressão do RNAm para pró-TRH

(Legradi et al., 1997). Reforçando essa idéia, em ratos com lesões no PVN, onde o ObR é

altamente expresso, nem o jejum nem a administração de leptina no jejum alteraram os níveis

plasmáticos de HTs (hormônios tireoideanos) e TSH (tireotrofina) ou a expressão do pró-TRH

(Legradi et al., 1998).

24

Figura 2: Neurônios hipotalâmicos responsivos à leptina, NPY e α-MSH. Leptina regula diretamente neurônios NPY/AGRP e POMC/CART presentes no núcleo arqueado. NPY estimula a fome via receptores Y1 e Y5. O receptor Y2 age pré-sinapticamente regulando a liberação de NPY nos neurônios POMC (α-MSH). O efeito do NPY é modulado pela grelina circulante ou produzida localmente no hipotálamo. AGRP antagoniza a ação do α-MSH em receptores MC4/3, estimulando o apetite, reduzindo o gasto energético e ganho de peso. GHS-R: growth hormone secretagogue receptor ou receptor de grelina (Adaptado de Ahima e Osei, 2004).

1.1.5. Efeitos da leptina em outras estruturas

Foi demonstrado que a leptina, além da sua ação central sobre o metabolismo

energético, controle de peso corporal e ingestão, também possui ação direta sobre tecidos

periféricos. Em hepatócitos isolados de ratos Wistar, a leptina estimula a incorporação de

glicose e a deposição do glicogênio, aumentando os estoques intracelulares de maneira dose-

dependente e aditiva ao efeito da insulina (Berti et al., 1997; Kellerer et al., 1997; Ceddia et

al., 1998). A deposição de glicogênio reflete as taxas de síntese e degradação do polímero.

Além disso, a leptina inibe a atividade da fosforilase α, enzima limitante para a produção

hepática de glicose a partir da degradação do glicogênio (Aiston e Agius, 1999).

Camundongos ob/ob apresentam diminuição na incorporação de glicose ao glicogênio em

músculo sóleo, demonstrando o efeito da leptina também sobre os estoques de glicogênio

muscular (Liu et al., 1997). Além dos efeitos sobre o metabolismo de carboidratos, a leptina

também aumenta agudamente a oxidação de ácidos graxos e reduz a síntese de triacilglicerol

em músculo esquelético (Steinberg et al., 2002).

Receptores de leptina estão presentes na hipófise (Vicente et al., 2004) e na tireóide de

ratos (Nowak et al., 2002; Dutra et al., 2007; Rodrigues et al., 2009), sugerindo uma

regulação direta deste hormônio sobre o eixo hipotálamo-hipófise-tireóide (HHT).

25

A presença de ObRs em células cromafins na medula adrenal foi determinada em

diversas espécies, como porcos, ratos, bois e seres humanos (Cao et al., 1997; Glasow et al.,

1998; Takekoshi et al., 1999; Yanagihara et al., 2000). Contudo, os dados sobre qual ou quais

isoformas destes receptores encontram-se neste tipo celular ainda são conflitantes na literatura

e parecem ser dependentes da espécie estudada. Porém, o efeito estimulatório da leptina sobre

a função adrenomedular parece ser conservado entre as espécies (Takekoshi et al., 1999,

2001a, 2001b; Utsunomiya et al., 2001). Estudos demonstraram a presença de mRNA para

ObRb em medulas adrenais de porcos, roedores e seres humanos (Hoggard et al., 1997;

Glasow et al., 1998; Takekoshi et al., 1999). Outros estudos mostraram que o mRNA para

ObRa é altamente expresso em medulas adrenais e é a isoforma predominante no tecido,

embora traços de ObRb tenham sido identificados (Cao et al., 1997; Yanagihara et al., 2000).

Essas divergências podem ocorrer simplesmente por um caráter espécie-específico ou pelo

fato dos receptores de leptina serem pouco expressos em tecidos periféricos, dificultando a

detecção. Recentemente, em nosso laboratório (dados ainda não publicados), detectamos o

conteúdo de OB-R em medula adrenal por Western Blotting em ratos adultos que receberam

injeção de leptina nos primeiros 10 dias de vida.

1.1.6. Resistência à leptina

O potencial da leptina em inibir a fome, reduzir o peso corporal e a massa de

adipócitos tem contribuído para que este hormônio seja visto como um fator anti-obesidade

(Sahu, 2002; Zhang et al., 2004). Ratos e seres humanos com deficiência ou anormalidades no

receptor de leptina apresentam hiperfagia e obesidade mórbida (Jéquier, 2002). A

hiperleptinemia associada à hiperfagia e obesidade indica resistência à leptina, fato que pode

ter papel na patogênese da obesidade (Maffei et al., 1995; Considine et al., 1996; Ahima e

Hileman, 2000; Ahima e Osei, 2004). Os prováveis mecanismos responsáveis por esta

resistência podem ser: prejuízo no transporte de leptina pela barreira hemato-encefálica,

anormalidades nos receptores de leptina e/ou na sinalização pós-receptor (Jéquier, 2002;

Munzberg e Myers, 2005). Halaas et al. (1997) demonstraram que camundongos obesos são

resistentes à administração periférica de leptina, mas respondem à injeção via i.c.v., o que

sugere que a resistência à leptina pode ser mediada pelo seu transporte prejudicado pela

barreira hemato-encefálica. Outros tipos de resistência à leptina ocorrem como resultado da

mutação do receptor de leptina. Há vários tipos de mutação em receptores de leptina que

26

podem resultar em obesidade nos ratos (Flier e Elmquist, 1997) e em seres humanos (Clement

et al., 1998). Outro exemplo é a resistência que pode ocorrer de maneira farmacocinética,

como por problema na distribuição, liberação, no metabolismo e/ou eliminação (Halaas et al.,

1997). Dietas com alto teor de lipídeos também podem levar a resistência à leptina através de

vários mecanismos, dentre eles a presença de um antagonista circulante ou uma proteína

acoplada, aumento na depuração de leptina, alteração no transporte no cérebro, redução do

receptor de leptina, inibição da via JAK-STAT ou ativação da SOCS-3 (Friedman e Halaas,

1998).

1.2. Efeitos cognitivos e comportamentais da leptina

Embora o hipotálamo seja o mais bem conhecido sítio de ação central da leptina,

trabalhos recentes têm atribuído à leptina um papel importante na cognição, memória,

motivação, emoção, humor e respostas ao estresse (Fruhbeck, 2001; Funahashi et al., 2003;

Sandoval e Davis, 2003; Harvey et al., 2005, 2007; Lu et al., 2006; Morrison, 2009).

Evidências mostram que as concentrações de leptina podem estar associadas à função

cognitiva, principalmente com os componentes associados à memória, ao aprendizado e ao

raciocínio visuo-espacial, em seres humanos (Ble et al., 2005; Huang et al., 2007; Gunstad et

al., 2008; Paz- Filho et al., 2008). Foi demonstrado que os receptores de leptina são

amplamente expressos em numerosas regiões extra-hipotalâmicas que atuam sobre respostas

comportamentais (Elmquist et al., 1998; Hakansson et al., 1998; Shanley et al., 2002;

Morrison, 2009), como por exemplo, neocórtex, hipocampo e amígdala (Hâkansson et al.,

1998; Shanley et al., 2002; Funahashi et al., 2003; Harvey et al., 2005, 2007; Lu et al., 2006).

Diversos trabalhos identificaram alta expressão do receptor ObRb em regiões corticais e

hipocampo (Huang et al., 1996; Couce et al., 1997; Shioda et al., 1998; Burguera et al., 2000;

Ur et al., 2002). Além disso, o RNAm, a proteína e a imunorreatividade da leptina são

altamente expressos em outras regiões cerebrais (Morash et al., 1999; Ur et al., 2002),

sugerindo que a leptina pode ser utilizada, por sua liberação local, para modular a atividade de

circuitos neuronais específicos.

Diversas evidências mostram que a leptina está relacionada com a função cognitiva.

Isso pode ser justificado, primeiramente, por trabalhos os quais demonstram que a

hipoleptinemia está associada a prejuízos cognitivos (Ble et al., 2005; Huang et al., 2007;

Gunstad et al., 2008; Paz-Filho et al., 2008; Holden et al., 2009), enquanto que indivíduos

27

idosos que apresentam altos níveis de leptina obtiveram melhor desempenho cognitivo

(Gunstad et al., 2008). Mudanças na leptinemia encontradas em doenças relacionadas à idade

são consideradas fatores importantes para a origem dos déficits cognitivos. Indivíduos com

Mal de Alzheimer e demência vascular associada à anorexia também apresentam

hipoleptinemia (Power et al., 2001). Além disso, tem sido observado que a leptina diminui a

quantidade de proteína beta-amilóide (Aβ) em ratos transgênicos com elevados níveis de Aβ

(Fewlass et al., 2004). Portanto, estes resultados sugerem que a redução de leptina, talvez

ocasionada por disfunções neuroendócrinas, pode estar associada à níveis elevados de Aβ e

demência, já que esta proteína é considerada o maior contribuinte para a demência do Mal de

Alzheimer (Farr et al., 2006). A segunda justificativa para explicar a relação da leptina com a

cognição em seres humanos pode ser observada em modelos genéticos que relacionam leptina

com déficit cognitivo (Li et al., 2002; Ohta et al., 2003; Winocur et al., 2005). Além disto, o

tratamento com leptina melhora o desempenho cognitivo em indivíduos (Paz-Filho et al.,

2008). Por último, há evidência direta que o tratamento com leptina em animais aumenta o

desempenho cognitivo (Oomura et al., 2006). Tendo em vista que o presente estudo procura

abordar os efeitos, em animais adultos, da hiperleptinemia neonatal sobre a memória e o

aprendizado, sobre os níveis de ansiedade e, finalmente, sobre a busca por novos estímulos,

passamos, a seguir, a uma descrição dos efeitos conhecidos da leptina sobre estes

componentes cognitivos e comportamentais, bem como sobre as estruturas associadas.

1.2.1. Leptina, memória e aprendizado

Em áreas extra-hipotalâmicas, a leptina atua, em parte, por uma regulação direta da

função neural, incluindo efeitos locais na sinapse (Harvey, 2007). Foi observado em animais

ob/ob ou db/db que os neurônios hipocampais (CA1) apresentam atraso na potenciação de

longa duração (LTP) e depressão de longa duração (LTD), associada a menor atividade de

miosina-V e Ca2+/calmodulina quinase II (CaMKII) (Li et al., 2002; Wayner et al., 2004).

Estes animais apresentaram déficit na memória espacial, quando submetidos ao labirinto

aquático de Morris (Li et al., 2002), e de memória emocional quando submetidos ao labirinto

em T elevado (Farr et al., 2008). Estudos mostraram que a administração de leptina em

neurônios hipocampais promoveu a LTP e, consequentemente, o processo de aprendizagem

(Wayner et al., 2004; Farr et al., 2006; Oomura et al., 2006) através da estimulação da

fosforilação da CaMKII (Oomura et al., 2006). A LTP hipocampal é considerada um sinal

28

específico da plasticidade sináptica e um correlato neurofisiológico da aprendizagem e

memória (Malenka e Bear, 2004). As mudanças no LTP e LTD são dependentes da ação da

leptina sobre os receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) (Shanley et al., 2001; Durakoglugil

et al., 2005). Além disso, os animais ob/ob apresentaram retardo no processo de mielinização

(Sena et al., 1995), corpo neuronal reduzido (Bereiter e Jeanrenaud, 1979) e orientação

dendrítica alterada (Bereiter e Jeanrenaud, 1980), corroborando os achados de que a leptina é

importante no desenvolvimento de SNC.

Estudos mostram que a exposição de neurônios hipocampais à leptina facilita a

plasticidade sináptica via aumento seletivo de receptores de NMDA (Shanley et al., 2001;

Durakoglugil et al., 2005; Harvey et al., 2005), o qual promove a entrada de Ca2+ em culturas

de células hipocampais (Harvey et al., 2005). A aplicação de leptina causa uma discreta

redução da transmissão sináptica mediada pelo receptor ácido a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-

isoxazolpropiônico (AMPA) que pode ser rapidamente revertida. Foi observado que ratos

tratados com leptina no período neonatal sofreram alterações na expressão de NR1, NR2B

(subunidade dos receptores de NMDA), sinapsina 2A, que é uma proteína pré-sináptica, e

sinaptofisina, que é uma proteína importante na biogênese da vesícula sináptica (Walker et al.,

2007). Diversas pesquisas têm demonstrado que a ativação da sinalização PI3K depende da

leptina. A PI3K está relacionada com a regulação de LTP e LTD e receptores NMDA

(Shanley et al., 2001, 2002; Durakoglugil et al., 2005; O'Malley et al., 2007).

A leptina melhora a aprendizagem e a memória (Farr et al., 2006; Oomura et al., 2006)

não só por seus efeitos diretos sobre a função neuronal/sináptica, mas também por sua

capacidade de influenciar a estrutura neuronal e sua plasticidade em roedores (Oomura et al.,

2006; O’Malley et al., 2007). Estes estudos surgiram a partir da observação de que roedores

com deficiência de leptina apresentavam cérebros com menor volume e peso cortical (Steppan

e Swick, 1999), e que o tratamento destes animais com leptina resultava não somente no

crescimento do crânio como também no aumento da quantidade de proteína e de DNA

(Ahima et al., 1999; Steppan e Swick, 1999; Udagawa et al., 2006a, 2006b). Foi demonstrado

que os níveis normais de leptina em seres humanos normais têm relação com o volume da

substância cinzenta em várias áreas cerebrais (Pannacciulli et al., 2007) e que a reposição com

leptina em seres humanos deficientes resulta em grandes mudanças na estrutura cerebral

(Matochik et al., 2005). Todavia, foi observado que a hiperleptinemia está associada a

menores volumes das estruturas cerebrais (Pannacciulli et al., 2007). Outros trabalhos também

observaram que altos níveis de leptina associados à obesidade, tanto em adultos jovens quanto

29

em idosos, frequentemente resulta em um pobre desempenho cognitivo (Considine, 2005;

Gunstad et al., 2006a,b, 2007; Whitmer et al., 2007; Wolf et al., 2007).

A deficiência de leptina parece reduzir a densidade de projeções axonais de neurônios

sensíveis a leptina e que esta alteração estrutural pode ser revertida pelo tratamento com

leptina na lactação (Bouret et al., 2004). Além disso, Oldreive et al (2008) observaram que a

leptina leva a expansão da arborização dendrítica no hipocampo, córtex e cerebelo. Ainda, foi

demonstrado um aumento na mobilidade e densidade da filopodia dendrítica de células

hipocampais (O'Malley et al., 2007) e estimulação da formação e o crescimento do cone

axonal de neurônios corticais (Valerio et al., 2006).

Outros dois aspectos interessantes em que a leptina parece atuar são a neuroproteção e

a neuroproliferação, fato que pode ser particularmente relevante quando se considera que o

hipocampo é uma das poucas estruturas do encéfalo em que ocorre neurogênese no animal

adulto (Imayoshi et al., 2009; Li et al., 2009). Diversos fatores de crescimento agem sobre os

neurônios para protegê-los da neurodegeneração e da morte celular (Signore et al., 2008). A

leptina, por exemplo, tem sido considerada como um sinal de neuroproteção (Tang, 2008;

Morrison, 2009). Além da observação de que a leptina inibe a apoptose de diversas células

não neuronais (Shimabukuro et al., 1998; Howard et al., 1999; Fujita et al., 2002; Somasundar

et al., 2003; Hoda et al., 2007), já se verificou que, em neurônios in vitro, a leptina promove

neuroproteção em modelos de isquemia cerebral (Zhang et al., 2007; Zhang e Chen, 2008),

protege da excitotoxidade glutamatérgica (Dicou et al., 2001; Russo et al., 2004; Zhang et al.,

2007; Guo et al., 2008; Zhang e Chen, 2008), e do estresse oxidativo (Guo et al., 2008), e

promove a proliferação de células progenitoras hipocampais (Garza et al., 2008).

Experimentos in vitro e in vivo mostraram que a leptina reduziu a perda de neurônios

dopaminérgicos em modelo de Parkinson quimicamente induzido (Weng et al., 2007).

1.2.2. Leptina e ansiedade

Além dos seus efeitos sobre memória e aprendizagem, estudos recentes têm observado

que a leptina age sobre as respostas ao estresse (Fruhbeck, 2001; Sandoval e Davis, 2003;

Harvey, 2007) e que tem ação antidepressiva (Harvey, 2007). De uma maneira geral, os

peptídeos inibidores da ingestão alimentar facilitam respostas a situações aversivas (Kask et

al., 2002). De fato, baixos níveis de leptina são observados quando roedores são expostos ao

estresse crônico e a uma derrota social crônica (comportamento de submissão), os quais

30

induzem respostas comportamentais semelhantes às observadas em humanos depressivos. A

administração sistêmica de leptina reverteu a anedonia (perda de motivação, geralmente

associada à depressão), induzido pelo estresse crônico e melhorou a resposta comportamental

a situações estressantes e aversivas, sendo estes efeitos dose-dependentes (Lu et al., 2006).

Asakawa e colaboradores (2003) mostraram que camundongos ob/ob tratados com leptina

tiveram redução do peso corporal e também dos níveis de ansiedade. Outros estudos mostram

baixos níveis de leptina em pacientes com depressão e esquizofrenia que não apresentam

alterações na massa corporal (Kraus et al., 2001), mesmo quando estes pacientes são tratados

com psicotrópicos, sugerindo uma ação da leptina em condições psiquiátricas (Farr et al.,

2006).

Acredita-se que os receptores de leptina hipocampais sejam um dos sítios de ação para

seu efeito antidepressivo (Santarelli et al., 2003; Duman, 2004), já que foi observado que a

administração i.c.v de leptina reduziu as respostas observadas quando os animais são

submetidos a situações estressantes e aversivas (Lu et al., 2006; Harvey, 2007), como também

resultou no aumento da expressão de RNAm de c-fos na formação hipocampal, giro denteado,

e núcleo basolateral da amígdala, indicando que a leptina tem ação específica em estruturas

límbicas (Lu et al., 2006). Este achado é corroborado por trabalhos que observaram uma alta

expressão de receptores de leptina no hipocampo e na amígdala (Hâkansson et al., 1998;

Shanley et al., 2002; Funahashi et al., 2003). Sabe-se que o hipocampo exerce um papel

fundamental não só na memória e na aprendizagem, mas também sobre a atividade

exploratória e ansiedade (McNaughton, 1996; Bast e Feldon, 2003; Bannerman et al., 2004),

assim como a amígdala está essencialmente envolvida nas reações inatas e condicionada ao

medo (Blanchard e Blanchard, 1972; LeDoux, 1990; Rizvi et al., 1991; Davis et al., 1994;

Vazdarjanova et al., 2001). A leptina pode também interferir nas respostas comportamentais

através de sua ação sobre o NPY em regiões extra-hipotalâmicas, uma vez que injeções de

leptina causaram rápida infra-regulação dos genes que são responsáveis pela expressão de

NPY (Asakawa et al., 2003). Sabe-se que a expressão de NPY na amígdala é fortemente

influenciada por situações de estresse (Thorsell et al., 1998, 1999).

Além disso, Lu e colaboradores (2006) mostraram que a administração de leptina no

hipocampo produz um efeito anti-estresse semelhante ao observado na sua administração

sistêmica. Isto pode explicar o fato de que a estimulação do eixo HHA pelo estresse é inibido

pela leptina, a qual bloqueia a secreção do ACTH via inibição do CRH (Heiman et al., 1997;

Oates et al., 2000). A detecção de receptores da leptina no córtex de adrenais de porcos

31

também sugere que ela pode inibir diretamente a produção e secreção de glicocorticóides

(Malendowicz et al., 2007) e muitos trabalhos mostram uma relação inversa entre leptina e

glicocorticóides (Stephens et al., 1995; Huang et al., 1998; Ahima e Flier, 2000).

1.2.3. Leptina e atividade exploratória

Diversos trabalhos mostram uma relação entre a leptina e a atividade exploratória.

Russell e colaboradores (1987) observaram que ratos e outras espécies apresentam aumento

de sua atividade quando submetidos à restrição alimentar. Contrariamente, estudos mostram

que a leptina diminui o comportamento exploratório em animais com restrição alimentar

(Exner et al., 2000; Buyse et al., 2001). A hiperatividade induzida pela inanição parcial é um

fenômeno bem caracterizado em estudos em animais (Russell et al., 1987; Morse et al., 1995).

O aumento da atividade é proporcional à restrição alimentar e a privação total de comida

altera o padrão de atividade noturna (Morse et al., 1995). O rápido declínio da secreção de

leptina associada à restrição calórica e à perda de peso (Ahima et al., 1996; Kolaczynski et al.,

1996) poderia representar o fato desencadeador da hiperatividade observada na inanição

parcial e na anorexia nervosa (Exner et al., 2000).

A leptina pode modificar a atividade locomotora de ratos através de vários sistemas

cerebrais como, por exemplo, via núcleo arqueado do hipotálamo (ARC) (Coppari et al.,

2005). Foi observado que a atividade locomotora é regulada, em parte, pelo fator de

transcrição Bsx específico do encéfalo, o qual é predominantemente expresso no ARC. Outros

estudos sugerem que a leptina exerce um papel sobre a motivação via sistema dopaminérgico

mesolímbico, incluindo a área tegumentar ventral (VTA) e o núcleo accumbens (Choi et al.,

2008). Por exemplo, a redução da função de receptores mediada pelo RNAi na VTA resulta

em aumento de ingestão alimentar e atividade locomotora (Hommel et al., 2006), enquanto

que a administração crônica de leptina em camundongos ob/ob diminui a atividade

locomotora em resposta à anfetamina (Fulton et al., 2006). Outra região relacionada com

atividade locomotora é o hipotálamo ventromedial (VMH). Estudos mostram que lesões no

VMH resultam em mudanças na atividade locomotora observada em diversos modelos

experimentais (Challet et al., 1995, 1997; Iwamoto et al., 1999). Além disso, o núcleo

paraventricular do hipotálamo (PVN) age sobre esta atividade, pois quando

orexina/hipocretina é injetada no PVN há um aumento, dose-dependente, da atividade física

espontânea (Kiwaki et al., 2004; Novak et al., 2006). Crawley e Corwin (1994) atribuem o

32

efeito da leptina sobre a atividade exploratória via receptores da colecistoquinina tipo 1

(CCK1).

Buyse e colaboradores (2001) observaram que a administração de leptina diminui o

número de orifícios explorados e a duração da exploração destes quando os animais foram

submetidos ao teste de campo vazado (CV), o que está mais relacionado à diminuição da

motivação do que a uma alteração propriamente dita do seu comportamento exploratório,

justificada pelo aumento da atividade locomotora observada quando estes foram submetidos

ao teste do labirinto em Y. Segundo Morrison (2009), esta diminuição pode estar relacionada

com a redução da motivação para adquirir recompensa, já que a leptina reduz o consumo

alimentar. Embora as áreas hipotalâmicas estejam associadas com estas respostas, regiões

extra-hipotalâmicas também estão envolvidas. O sistema dopaminérgico mesolímbico é

essencial na motivação para a obtenção de estímulos prazerosos (Berridge, 1996; Berridge e

Robinson, 2003). As projeções dopaminérgicas da área VTA e do núcleo accumbens são

particularmente influentes no consumo de comida e de drogas (Wyvell e Berridge, 2000;

Cannon e Palmiter, 2003; Pecina et al., 2003). A leptina atua sobre este sistema, inibindo a

ingestão alimentar e modulando os neurônios dopaminérgicos (Figlewicz et al., 2003; Fulton

et al., 2006; Hommel et al., 2006), e também pode influenciar indiretamente este sistema via

efeitos hipotalâmicos. Portanto, a ação da leptina sobre a inibição do consumo alimentar

envolve áreas cerebrais relacionadas com antecipação, memória e motivação (Fulton et al.,

2000; Shalev et al., 2001; Fulton et al., 2006; Getchell et al., 2006).

1.3. Programação metabólica

Diversos distúrbios crônicos que se manifestam na vida adulta, como por exemplo,

obesidade, diabetes, doenças cardiovasculares, asma, ansiedade e depressão, podem ter suas

origens no início da vida (Barker, 1995; Charney e Bremner, 1999). Estudos experimentais,

clínicos e epidemiológicos têm demonstrado que influências hormonais, nutricionais e

ambientais em períodos críticos do desenvolvimento do indivíduo podem alterar

permanentemente parâmetros fisiológicos e comportamentais na idade adulta (Lucas, 1994;

Barker, 2003). A hipótese da “origem fetal” baseia-se em estudos epidemiológicos e clínicos,

nos quais o peso ao nascer foi relacionado a desordens metabólicas na idade adulta (Lucas,

1994; Barker, 2004; De Moura e Passos, 2005; De Moura et al., 2008). A gestação e a

lactação são períodos de intenso crescimento, replicação e diferenciação celular. Estes

33

processos são sensíveis às alterações do meio na vida intra-uterino e neonatal, resultando em

distúrbios estruturais e funcionais que podem se tornar permanentes na idade adulta. A

hipótese do “fenótipo de poupança” propõe que o feto se adapta às condições adversas no

meio intra-uterino otimizando a utilização do menor aporte de nutrientes, garantindo a sua

sobrevivência. No entanto, essas condições resultam em prioridade no desenvolvimento de

alguns órgãos em detrimento de outros, levando a alterações permanentes no crescimento e na

função de diversos tecidos (Simmons, 2005). Também é observado que durante o período de

lactação o cérebro passa por mudanças importantes no seu desenvolvimento (Spencer et al.,

2006), sendo que nesta fase ocorre um significativo desenvolvimento neurológico e cognitivo

(De Moura e Passos 2005; Miñana-Solis e Escobar, 2006, De Moura et al., 2008). Assim,

condições nutricionais adequadas são essenciais para o crescimento saudável da prole, pois

atuam como um fator de imprinting para respostas fisiológicas futuras. Em algumas situações,

tanto na gestação quanto na lactação, mesmo depois que as condições do meio são restauradas

aos padrões normais, algumas funções permanecem alteradas, deixando de ser uma vantagem

adaptativa para se tornarem deletérias para o organismo. Este fenômeno é conhecido como

programação metabólica (Barker, 1995, 2003, 2004; Gordon, 1997) e o período em que o

organismo é susceptível a intervenções é denominado período crítico de programação (Lucas,

1994).

Têm sido realizados diversos estudos experimentais para testar a hipótese da “origem

fetal” ou “programação”, perturbações tais como desnutrição materna moderada ou severa ou

exposição hormonal na gestação e/ou lactação têm sido impostas (De Moura e Passos, 2005;

De Moura et al., 2008). A grande maioria destes estudos confirma que estas perturbações

levam ao desenvolvimento de excesso de peso (Passos et al., 2000), diminuição da

sensibilidade à insulina (Holemans et al., 1996), aumento da pressão arterial (Langley-Evans

et al., 1996; Woodall et al., 1996; Tonkiss et al. 1998) disfunções no eixo HHT (Lisboa et al.,

2008; Teixeira et al., 2003; De Moura et al., 2008) e resistência à ação anorexigênica da

leptina (Passos et al., 2004, Toste et al., 2006b; Bonomo et al., 2007; Pereira-Toste et 2009).

A desnutrição neonatal produz alterações nas concentrações séricas de leptina da

prole, com hipoleptinemia do início aos meados da lactação e hiperleptinemia ao desmame

(Teixeira et al., 2002). Da mesma forma, a desnutrição causada pelo bloqueio da prolactina ao

final da lactação, produz aumento da passagem de leptina pelo leite e hiperleptinemia na prole

(Bonomo et al., 2005). Baseado nisto, nos questionamos se a leptina nesta fase poderia ser um

fator de impressão hormonal para a programação decorrente da desnutrição neonatal.

34

1.3.1. Programação metabólica pela leptina

Diversos trabalhos do nosso laboratório têm observado que a programação pela

hiperleptinemia na lactação programa o peso corporal, a ingestão alimentar e disfunções

endócrino-metabólicas das proles adultas (De Oliveira Cravo et al., 2002, Teixeira et al.,

2003, Toste et al., 2006a,b; Trevenzoli et al, 2007). A programação pela injeção de leptina em

ratos nos 10 primeiros dias da lactação resulta em hiperleptinemia, maior peso corporal, o

qual foi relacionado a maior massa magra e hiperfagia na idade adulta (De Oliveira Cravo et

al., 2002; Toste et al., 2006b), resistência à ação anorexigênica da leptina, menor expressão de

seu receptor hipotalâmico (Toste et al., 2006b), hipertireoidismo (Toste et al., 2006a),

hipertensão e hiperfunção adrenal (Trevenzoli et al, 2007). Em outro modelo, onde as mães

foram tratadas com leptina nos 3 últimos dias da lactação, as suas proles adultas apresentaram

sobrepeso por acúmulo de gordura (Lins et al., 2005), sugerindo que a leptina é transferida via

leite materno e programa para maior peso corporal e hiperfagia. No modelo de

hiperleptinemia materna, onde as ratas lactantes receberam leptina nos 10 primeiros dias da

lactação (Pereira-Toste et al., 2009), as proles também exibiram um fenótipo de maior

adiposidade central e total na vida adulta.

É interessante que tanto o estímulo com leptina, quanto o seu bloqueio através do uso

de antagonista específico (muteína) produzem programações semelhantes (Attig et al., 2008).

1.4. Modelos experimentais em animais

1.4.1. Modelo de aprendizagem e memória

Dentre os diversos procedimentos e aparelhos desenvolvidos para avaliar memória e

aprendizagem em modelos experimentais, o labirinto aquático desenvolvido em 1981, por

Richard Morris, vem se destacando nos estudos sobre a neurobiologia da memória (Gallagher

et al., 1993). O teste de Morris baseia-se no fato de que roedores apresentam aversão à

imersão em água (Filgueiras e Manhães, 2004, 2005), de modo que estes procuram sair da

água o mais rápido possível. Uma adaptação deste equipamento é o labirinto aquático de 8

braços (LAROB), em que se avalia a aprendizagem e memória espacial (Olton, 1987). O

animal deve aprender a localização do braço que apresenta uma plataforma de escape

baseando-se nas pistas externas ao aparelho, já que ele não pode ver, ouvir ou cheirar a

35

plataforma. A orientação espacial deve ser aprendida e armazenada por períodos variáveis de

tempo. A aprendizagem sobre locais pode envolver diferentes estratégias. Pode-se, por

exemplo, aprender as relações espaciais que existem entre os objetos do ambiente e utilizar

essas relações para formar um mapa alocêntrico (ou mapa cognitivo) que será utilizado para

encontrar o local desejado (O’Keefe e Nadel, 1978). A exclusão das pistas proximais e ênfase

nas pistas distais força o uso de estratégias de mapeamento espacial. Uma das principais

vantagens do LAROB é a velocidade de treinamento: animais como o rato, nadadores natos

(Whishaw, 1995), normalmente demoram menos que 15 tentativas para aprender a tarefa

(Morris, 1984).

1.4.2. Modelo de ansiedade

Modelos animais de ansiedade são amplamente utilizados para pesquisas de drogas

ansiolíticas assim como dos mecanismos cerebrais envolvidos na ansiedade (Graeff et al.,

1998). Dentre os testes comportamentais para se quantificar os níveis de ansiedade em

animais experimentais, o labirinto em cruz elevado (LCE) é um dos mais populares testes em

uso atualmente (Pellow et al., 1985; Carobrez e Bertoglio, 2005; Marco et al., 2006). A

popularidade do teste, com mais de 3100 artigos publicados (Web of Science, 2009) se deve a

numerosas vantagens: é um teste econômico, rápido, além da simplicidade de desenho e

sensibilidade bidirecional a drogas (sensível a efeitos ansiolíticos ou ansiogênicos) e do fato

de não requerer procedimentos de teste muito cansativos, privação de comida/água ou uso de

choques elétricos (Pellow et al., 1985; Rodgers et al., 1997). O LCE foi validado em espécies

como ratos (Pellow et al., 1985) e camundongos (Lister, 1987), e mais recentemente espécies

como porquinhos da índia (Rex et al., 1994), cobaias (Hendrie et al., 1997) e hamsters sírios

(Yannielli et al., 1996). Os roedores de forma geral evitam as áreas abertas do labirinto, as

quais se presumem sejam as mais aversivas, ou seja, ansiogênicas, e mostram preferência

pelas partes fechadas e protegidas pelas paredes do aparelho (Pellow et al., 1985; Marco et al.,

2006). O tempo no braço aberto (BA) e o número de entradas no BA são utilizados como

medidas de ansiedade (Hogg, 1996; Rodgers e Dalvi, 1997; Stead et al., 2006; Abreu-Villaça

et al., 2008; Manhães et al., 2008; Fraga-Marques et al., 2009a). Também é comum a

avaliação de parâmetros etológicos durante um teste no LCE tais como: rearing (movimentos

verticais sobre as patas traseiras), stretched attend posture (SAP: o animal estica-se para fazer

exploração sem dar passos) e head dipping (HD: movimentos com a cabeça ou ombros de

36

exploração), os quais têm sido utilizados, respectivamente, como medidas de atividade

vertical, avaliação de risco e exploração (Rodgers et al., 1997).

1.4.3. Modelo de busca pela novidade

A busca pela novidade, representada pelo aumento da exploração de objetos ou

estímulos desconhecidos, é um dos comportamentos mais estudados como fator predisponente

para o uso drogas. Diversos trabalhos têm sugerido que a busca pela novidade em roedores

pode ser utilizada para avaliar alguns aspectos da “busca por sensações estimulantes” em

humanos (Dellu-Hagerdon, 2006; Kliethermes et al., 2007). Modelos experimentais em

animais têm mostrado que a busca por drogas é mais frequente na presença deste

comportamento (Piazza et al., 1989; Wills et al., 1994; Bardo et al., 1996; Bardo e Dwoskin,

2004; Abreu-Villaça et al., 2006; Pelloux et al., 2006). De acordo com estes achados, a busca

pela novidade, assim como o uso de drogas psicoestimulantes, compartilham um substrato

neurobiológico similar, que é a ativação de estruturas e vias mesolímbicas. A exploração a um

novo ambiente tem sido associada, em ratos, com o aumento dos níveis de dopamina no

núcleo accumbens, o qual é freqüentemente associado com o fenômeno de recompensa

(Hoebel et al., 1983; Robbins e Everitt, 1996; Wise, 1996; Ikemoto e Wise, 2004). Diversos

estudos em animais avaliam este comportamento submetendo-os ao teste de campo vazado

(CV) (Escorihuela et al., 1999; Vaglenova et al., 2004). O CV foi padronizado por Boissier e

Simon (1962) como medida geral da atividade motora e de exploração (File e Wardill, 1975;

Durcan e Lister, 1989; File, 2001). O número de orifícios explorados no CV é utilizado como

medida da atividade exploratória (Escorihuela et al., 1999; Abreu-Villaça et al., 2006; Fraga-

Marques et al., 2009a).

37

2. OBJETIVOS

Considerando-se que alterações nos níveis de leptina na vida adulta estão associadas a

alterações em funções cognitivas e no comportamento, e considerando-se adicionalmente que

a hiperleptinemia neonatal causa alterações metabólicas que se manifestaram ao longo da vida

do indivíduo, através de programação, inclusive com hiperleptinemia e resistência a este

hormônio, no presente trabalho procuramos avaliar se esta programação também se manifesta

em parâmetros cognitivos e comportamentais.

Neste sentido, os objetivos específicos deste trabalho foram o de estudar o

desempenho de memória e aprendizado, os níveis de comportamento associado à ansiedade e

os níveis de comportamento associado à busca por novos estímulos em ratos adultos

submetidos a dois modelos experimentais de hiperleptinemia neonatal, quais sejam:

1) Hiperleptinemia induzida por injeção de leptina em ratos neonatos durante os dez

primeiros dias de vida;

2) Hiperleptinemia induzida por injeção de leptina em ratas lactentes durante os dez

primeiros dias de lactação.

38

3. ARTIGOS

3.1. Artigo 1

Mabel C. Fraga-Marques, Egberto G. Moura, Sylvio Claudio-Neto, Isis H. Trevenzoli,

Fabiane P. Toste, Magna C.F. Passos, Patrícia C. Lisboa, Alex C. Manhães. Neonatal

hyperleptinaemia programmes anxiety-like and novelty seeking behaviours but not

memory/learning in adult rats. Hormones and Behavior 55 (2009) 272–279.

Hormones and Behavior: JCR2008 = 3.876

58

4. DISCUSSÃO

Um dos aspectos mais peculiares do presente estudo é o fato de que os resultados

cognitivo-comportamentais divergiram entre os dois modelos de programação a despeito dos

seguintes fatos: 1) o período da hiperleptinemia neonatal foi o mesmo em ambos os estudos:

os 10 primeiros dias da lactação; 2) o nível de hiperleptinemia observado nos animais adultos

foi similar nos dois modelos: aproximadamente 2 vezes o normal; 3) foram utilizados os

mesmos procedimentos de manutenção dos animais e os mesmos equipamentos de avaliação

cognitivo-comportamentais em ambos os estudos.

Na programação pela hiperleptinemia induzida pela injeção de leptina diretamente nos

filhotes observamos que os ratos programados apresentaram, do ponto de vista cognitivo-

comportamental, níveis elevados de comportamentos associados à ansiedade e à busca por

novos estímulos, enquanto que a memória e aprendizagem não foram afetadas.

Adicionalmente, indicando que os efeitos da programação neste modelo eram específicos, não

foram observadas alterações no nível de atividade locomotora nem no processo de tomada de

decisões (Fraga-Marques et al., 2009a). Na programação pela hiperleptinemia induzida pela

injeção de leptina nas progenitoras durante a lactação observamos que a prole programada

exibiu redução dos níveis de comportamentos associados à ansiedade e melhor desempenho

de memória e aprendizado. Também se encontravam elevados os níveis dos comportamentos

associados à avaliação de risco e de exploração. Por outro, não foram observadas alterações

nos níveis de comportamento de busca por novos estímulos, no nível de atividade locomotora

nem no processo de tomada de decisões (Fraga-Marques et al., 2009b).

Além das diferenças e similaridades cognitivo-comportamentais descritas acima, as

seguintes comparações entre parâmetros somáticos, endócrinos e metabólicos entre os dois

modelos podem ser realizadas:

Na programação pela hiperleptinemia induzida pela injeção de leptina diretamente nos

filhotes observamos que os ratos programados apresentaram aumento da ingestão alimentar e

da massa corporal quando adultos, embora o aumento do peso deste modelo tenha sido

associado a maior massa magra (Toste et al., 2006b). Estes animais também apresentaram na

idade adulta hipertrigliceridemia, hiperleptinemia hiperinsulinemia (Toste et al, 2006b),

hipertireoidismo, (Toste et al., 2006a), hipertensão, aumento de catecolamina (Trevenzoli et

al., 2007) e de corticosterona (Fraga-Marques et al., 2009a), e baixos níveis de adiponectina.

Na programação pela hiperleptinemia materna na lactação observamos que os ratos

59

programados, quando adultos, apresentaram hiperfagia, aumento da massa corporal

relacionado ao aumento de tecido adiposo (Pereira-Toste et al., 2009). Quanto ao seu perfil

endócrino e metabólico também foram observadas alterações, como a hiperleptinemia e

hiperglicemia, porém estes animais apresentaram normoinsulinemia (Pereira-Toste et al.,

2009), triglicerídeos normais e eutireoidismo.

Na programação pela hiperleptinemia induzida pela injeção de leptina diretamente nos

filhotes observamos achados cognitivo-comportamentais que diferem dos descritos na

literatura (Fraga-Marques et al., 2009a). Sabe-se, por exemplo, que a administração aguda de

leptina, no animal adulto, melhora a aprendizagem e memória tanto em modelos

experimentais (Shanley et al., 2001; Li et al., 2002; Harvey et al., 2005; Farr et al., 2008)

quanto em seres humanos (Paz-Filho et al., 2008). Os níveis elevados de ansiedade e de busca

pela novidade que observamos na prole programada (Fraga-Marques et al., 2009a) também

divergem dos diversos trabalhos que afirmam que a leptina tem efeito ansiolítico (Wahlestedt

et al., 1989; Heilig et al., 1993; Sajdyk et al., 1999; Asakawa et al., 2003) e que diminui a

motivação como uma forma de inibir a busca por recompensa, o que está possivelmente

associado ao fato de que a leptina reduz o consumo alimentar (Buyse et al., 2001; Fulton et

al., 2006; Morrison, 2009). Além disso, a leptina não alterou a atividade locomotora dos

animais tratados (Fraga-Marques et al., 2009a), dado também inesperado já que trabalhos

mostram que a leptina reduz a atividade locomotora (Crawley e Corwin, 1994; Coppari et al.,

2005). As diferenças entre os nossos achados cognitivo-comportamentais (Fraga-Marques et

al., 2009a) e os resultados descritos na literatura podem ser explicadas por uma provável

resistência central a leptina (Toste et al., 2006b). Esta hipótese é corroborada por estudos

prévios do nosso laboratório, os quais observaram que, apesar destes animais apresentarem

hiperleptinemia, eles apresentam aumento da ingestão alimentar (De Oliveira Cravo et al.,

2002, Toste et al., 2006b) e redução da expressão do Ob-Rb hipotalâmico (Toste et al.,

2006b), indicando resistência ao efeito anorexigênico da leptina.

Em contraste ao modelo anterior, observamos que os animais adultos programados

pela injeção de leptina nas progenitoras mostraram achados cognitivo-comportamentais mais

típicos da ação da leptina. No entanto, verificamos que alguns comportamentos não sofreram

os efeitos esperados, sugerindo que, também neste modelo, um mecanismo de resistência

central a leptina também está presente. De fato, Pereira-Toste et al (2009) demonstraram que

estes animais adultos (obesos, hiperfágicos e hiperleptinêmicos) não respondem a injeção

aguda e sistêmica de leptina com a redução esperada do consumo alimentar, evidenciando

60

então o desenvolvimento da resistência ao efeito anorexigênico da leptina neste modelo de

programação. Nossos dados com este modelo mostraram que a leptina melhorou a memória e

aprendizagem e reduziu os níveis de ansiedade, sem afetar a atividade locomotora, a busca

por novos estímulos e a tomada de decisões (Fraga-Marques et al., 2009b). Por outro lado,

pesquisas mostram que a leptina reduz a atividade locomotora (Crawley e Corwin, 1994;

Coppari et al., 2005) e a busca por novos estímulos (Crawley e Corwin, 1994; Buyse et al.,

2001). Além disso, neste modelo, os animais apresentaram aumento da atividade exploratória

(Fraga-Marques et al., 2009b), efeito oposto ao observado na literatura (Exner et al., 2000;

Buyse et al., 2001). Outro efeito inesperado foi o fato da leptina elevar os níveis dos

comportamentos associados à avaliação de risco. Trabalhos experimentais em animais

sugerem que apenas os neuropeptídeos orexigênicos atuam aumentando os níveis desta

atividade (Kiwaki et al., 2004; Novak et al., 2006). A ausência de diferenças entre os grupos

na atividade locomotora, busca pela novidade e tomada de decisões indica que os efeitos

comportamentais da programação neonatal são seletivos (Fraga-Marques et al., 2009a).

Assim, pode haver uma resistência hipotalâmica, porém em outras estruturas extra-

hipotalâmicas, a leptina pode estar funcionando normalmente.

Embora os dois modelos apresentem praticamente os mesmos níveis de

hiperleptinemia na idade adulta (124% e 110%) e resistência central à leptina, as diferenças

entre seus comportamentos podem ser justificadas pela presença de perfis metabólicos

diferentes. Associação de hipertensão, hipertrigliceridemia, hiperinsulinemia e obesidade são

típicas da síndrome metabólica (SM). Deste modo, sugerimos que o aumento dos níveis de

ansiedade e atividade exploratória e a ausência de melhora da aprendizagem/memória, no

modelo de hiperleptinemia neonatal induzida pela administração de leptina nos filhotes,

podem estar ligados à SM. Diversos trabalhos têm demonstrado uma associação entre SM, ou

entre seus componentes isoladamente, e prejuízos cognitivos (Vanhanen et al., 2006; Yaffe,

2007; Razay et al., 2007; Taylor e MaccQueen, 2007; Lee et al., 2009). Recentemente, foi

reconhecido que a presença concomitante de hipertrigliceridemia, hipertensão e diabetes pode

exercer efeitos negativos sobre o desempenho cognitivo em humanos (Yaffe et al., 2004;

Taylor e MacQueen, 2007). Também foi observado déficit cognitivo em camundongos que

apresentavam obesidade associada à hipertrigliceridemia (Farr et al., 2008). Diversos

trabalhos mostram que modelos animais de diabetes apresentam prejuízos na memória

espacial, concomitantemente a mudanças na plasticidade hipocampal (Biessels et al., 1996;

Kamal et al., 1999; Shanley et al., 2001), e que estes achados estão associados à deficiência

61

ou resistência a insulina (Shanley et al., 2001; Harvey et al., 2003; Lu, 2007), ou ainda à

resistência a leptina, quando há presença de hiperleptinemia (Sinha et al., 1996). Estudos

também em humanos têm observado que pacientes diabéticos apresentam déficits cognitivos

(Gispen e Biessels, 2000; Harvey et al., 2003). O mecanismo pelo qual a síndrome metabólica

está associada com déficits cognitivos não está totalmente elucidado, mas existem hipóteses

plausíveis. Uma das hipóteses é o aumento na freqüência de doenças cerebrovasculres em

diabéticos, as quais são fatores de risco para a doença de Alzheimer e demência (Launer et al.,

2000, 2002). Outro mecanismo possível é que pacientes hipertensos apresentam uma

agregação acelerada de β-amilóide e o aparecimento de resistência à insulina (Gasparini et al.,

2001; Razay et al., 2007). Além disso, também é observado aumento da degradação neuronal

e atrofia cerebral em pacientes obesos (Jagust et al., 2005; Whitmer et al., 2005). Outro

mecanismo plausível é o fenômeno inflamatório observado na SM, pois sabe-se que a

presença de marcadores inflamatórios está associada com maior risco de demência e déficits

cognitivos (Yaffe et al., 2004). Ainda em relação aos mecanismos de controle da glicemia, foi

encontrada uma diferença entre os modelos no que diz respeito à resistência à insulina: no

primeiro, a manutenção da glicemia normal estava associada à presença de hiperinsulinemia,

enquanto que no segundo modelo é provável que a secreção de insulina esteja inadequada,

face à hiperglicemia. A insulina sabidamente afeta o comportamento de ratos. Por exemplo, a

injeção intraventricular deste hormônio diminui os níveis de comportamento associados à

ansiedade (Shestakova et al., 2009).

Além das diferenças metabólicas e endócrinas supracitadas entre os modelos de

programação, a presença de perfis endócrinos diferenciados também pode ser responsável

pelos diferentes achados cognitivo-comportamentais. Na programação com hiperleptinemia

induzida pela injeção de leptina diretamente nos filhotes, os animais tratados também

apresentaram hipotireoidismo aos 30 dias de vida e hipertireoidismo na idade adulta (Toste et

al., 2006a), o que não é observado no modelo de programação pela hiperleptinemia materna.

Foi demonstrado que no hipotireoidismo neonatal, a baixa biodisponibilidade de tiroxina pode

prejudicar a maturação cerebral em estágios iniciais do desenvolvimento e afetar as funções

cerebrais superiores e os processos metabólicos na idade adulta (Tucker et al., 1984; Hetzel et

al., 1988, 1994; Stein et al., 1991). Diversos trabalhos têm avaliado os efeitos

comportamentais em longo prazo induzido pelo hipotireoidismo pós-natal (Tamasy et al.,

1986), neonatal (Schalock et al., 1977, 1979; Tamasy et al., 1986) e perinatal (MacNabb et al.,

1999, 2000; Sala-Roca et al., 2002; Darbra et al., 2003). Nestes, foram observadas redução na

62

capacidade de aprendizagem e de habituação, aumento nos níveis de ansiedade e da atividade

exploratória. Estes achados foram similares aos encontrados no nosso modelo de

hiperleptinemia induzida pela injeção de leptina diretamente nos filhotes. Outros trabalhos

também observaram relação entre distúrbios da tireóide e déficits cognitivos, particularmente,

dificuldades de aprendizagem e memória (Erlanger et al., 1999). Recentemente, Nishimura et

al. (2003) observaram que alterações na tireóide no período neonatal são fatores de risco para

o surgimento do transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH). Alguns trabalhos

têm encontrado uma relação entre disfunção tireiodeana e distúrbios neuropsiquiátricos

(Monzani et al., 1993), dentre eles, distúrbios compulsivos, pânico, fobias (Placidi et al.,

1998), distúrbios de humor (Hendrick et al., 1998), e principalmente depressão e ansiedade

(Darbra, 1994; Stern et al., 1996; Placidi et al., 1998; Sala, 1999). No hipertireoidismo, há

presença de sintomas psiquiátricos semelhantes ao da síndrome depressiva e da ansiedade

(Rodewig, 1993), além de insônia, hiperatividade (Eayrs, 1960; Maletzky e Blachly, 1971),

respostas exageradas a estímulos ambientais e a instabilidades emocionais (Eayrs, 1960).

Estudos mostram que os hormônios tireoideanos provavelmente afetam as funções

neuropsiquiátricas aumentando os níveis de catecolaminas (Rastogi et al., 1976; Sulser, 1987;

Howland, 1993), particularmente aumentando o número e atividade dos receptores dos

receptores β-adrenérgicos a noradrenalina, servindo como um mecanismo neuromodulador

adaptativo (Whybrow e Prange, 1981; Dratman e Gordon, 1996). Acredita-se que estas

alterações sejam responsáveis pelo prejuízo na aprendizagem e pelo surgimento dos distúrbios

comportamentais encontrados no hipertireoidismo (Rastogi e Singhal, 1974a,b; Rastogi et al.,

1975a,b, 1976). Sendo assim, o hipertireoidismo (Toste et al, 2006a) e o aumento da secreção

de catecolaminas (Trevenzoli et al, 2007) demonstrados no modelo de hiperleptinemia

induzida por injeções na prole podem estar agindo de forma sinérgica, contribuindo para as

alterações cognitivo-comportamentais, representadas pela inexistência de uma melhora na

memória e aprendizagem, e o aumento dos níveis da ansiedade e de atividade exploratória

(Fraga-Marques et al, 2009a).

A divergência nos resultados obtidos nos dois modelos estudados também pode estar

associada ao fato de que a aplicação de leptina, com seu efeito ansiolítico (Asakawa et al.,

2003; Stoving et al., 2009), tenha reduzido os níveis de ansiedade das mães afetando, por

consequência, o padrão de cuidados destas em relação às proles. Além disso, é possível que

animais que apresentem mães menos ansiosas mamem mais. Assim, podemos sugerir que as

diferenças comportamentais entre os modelos sejam ocasionadas por alterações no

63

desenvolvimento destes filhotes. Acredita-se que uma boa e estável relação entre mãe e filho,

particularmente em mamíferos, seja uma das maiores garantias para um bom desenvolvimento

do filhote (Walker et al., 2004). Esta relação foi primeiramente estabelecida em trabalhos que

observaram as influências ambientais, como cuidados da prole, podem promovem mudanças

comportamentais e hormonais frente a situações de estresse destes animais quando adultos

(Levine, 1960; Denenberg et al., 1966; Levine et al., 1967; Ader e Grota, 1969). Durante

décadas, diversos trabalhos têm estudado como as variações comportamentais e nutricionais

maternas no período de lactação podem alterar o eixo HHA dos seus filhos e assim, ocasionar

mudanças nas respostas de estresse no longo prazo. Sugere-se que os cuidados maternos,

como a lambida e limpeza dos filhotes no período neonatal, é essencial para o bom

desenvolvimento e equilíbrio do eixo HHA, reduzindo assim as respostas neuroendócrinas e

comportamentais ao estresse na idade adulta (Van Oers et al., 1999; Champagne e Meaney,

2001; Walker et al., 2004). Além destes achados, também foi observado que a repetida

separação da prole da mãe, a exposição da mãe ao estresse e à mudanças nos cuidados da sua

prole e uma relação mãe-filho negativa no período neonatal estão associadas a diversos

prejuízos comportamentais e ao maior risco de doenças na idade adulta (Canetti et al., 1997;

McCauley et al., 1997; Kaufman et al., 2000; Repetti et al., 2002; Widom et al., 2007) e a

mudanças moleculares no SNC (Yi e Baram, 1994; Shalev et al., 1998; Lehmann et al., 1999;

Caldji et al., 2000; Ladd et al., 2000; Levine, 2001).

Finalmente, as diferenças comportamentais, somáticas, endócrinas e metabólicas

observadas em nossos estudos poderiam ser atribuídas à via de administração de leptina nestes

modelos. A leptina pode modificar alguns componentes do leite, o que por sua vez, poderia

agir como um fator de imprinting metabólico. Estudos mostram que a leptina é transferida

pelo leite (Casabiell et al., 1997; Houseknecht et al., 1997; Bonomo et al, 2005; Lins et al.,

2005; Stocker et al., 2007). Casabiell et al. (1997) que demonstraram que quando a leptina é

administrada em ratas lactantes, esta é transferida da circulação materna para o leite, sendo

detectada no estômago dos filhotes de 4 dias de idade, sendo que, nestes, os níveis sanguíneos

aumentam entre 4 e 8 h após a injeção materna. A leptina então pode induzir algum fator de

regulação no sistema gastrointestinal da prole, como por exemplo, a grelina (orexigênico),

CCK (anorexigênico), peptídeo YY (PYY – anorexigênico) ou peptídeo semelhante ao

glucagon (GLP – anorexigênico), os quais poderiam ocasionar mudanças comportamentais

(Daugé et al., 1989; Crawley e Corwin, 1994; Carlini et al 2008; Carvajal et al, 2009) na idade

64

adulta. Portanto, os efeitos da programação têm uma dependência maior da via de

administração que do período em que ela foi administrada.

Tendo em vista o espectro de possibilidades para explicar as diferenças observadas

entre os estudos apresentados nesta Tese, será necessário dar continuidade aos estudos com

ambos os modelos no sentido de esclarecer quais são os mecanismos determinantes destas

diferenças. Também está implícito que os efeitos observados nos diferentes modelos podem

ser resultado de efeitos indiretos das alterações nos níveis plasmáticos de leptina, uma vez que

a leptina afeta não só neurônios ligados diretamente a funções cognitivas como também

neurônios e outros tipos celulares associados à regulação e atividade de sistemas

neuroendócrinos que, por sua vez, sabidamente interferem com estas funções.

Independentemente dos mecanismos que geram os padrões comportamentais observados neste

trabalho, mostramos que a hiperleptinemia durante os dez primeiros dias de lactação é capaz

de afetar padrões cognitivo/comportamentais na vida adulta.

65

5. CONCLUSÃO

• A hiperleptinemia neonatal, induzida tanto pela injeção de leptina diretamente nos

filhotes quanto pela injeção de leptina nas progenitoras durante os dez primeiros

dias de vida pós-natal, altera o comportamento da prole na idade adulta;

• Na programação pela hiperleptinemia induzida pela injeção de leptina diretamente

nos filhotes, verificamos aumento dos níveis de comportamentos associados à

ansiedade e à busca por novos estímulos, sem alterações de funções associadas à

memória e ao aprendizado visuo-espacial e a atividade locomotora;

• Na programação pela hiperleptinemia induzida pela injeção de leptina nas

progenitoras, observamos melhora do desempenho associado à memória e ao

aprendizado visuo-espacial e diminuição dos níveis de ansiedade da prole adulta,

apesar de não alterar os níveis de comportamentos associados à busca por novos

estímulos e a atividade locomotora.

66

6. REFERÊNCIAS

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6. ANEXO

6.1. Descrição dos testes comportamentais

6.1.1. Labirinto aquático radial de 8 braços (LAROB – fig. 3)

O LAROB é composto por uma arena central em formato octogonal e oito braços

retangulares (braços: 29 cm de comprimento × 13 cm largura × 40 cm altura) radialmente

dispostos em relação a arena central (41 cm diâmetro). Na extremidade final de um de seus

braços existe uma plataforma (8 cm de comprimento × 10 cm de largura) localizada 1 cm

abaixo da superfície da água a qual permite o animal escapar do labirinto. O LAROB é

reenchido com água (26 ± 1°C) com uma profundidade de 34 cm para que os ratos não

toquem a cauda e as patas no chão enquanto nadam. Tinta atóxica foi utilizada para deixar a

água opaca, não permitindo que o animal visse a plataforma. Pistas espaciais externas eram

utilizadas na sala de teste e suas posições permaneciam inalteradas durante todos os

experimentos para que os animais utilizassem estratégias de mapeamento espacial na

localização da plataforma de escape.

Figura 3. Vista superior do labirinto aquático radial de 8 braços.

6.1.2. Labirinto em cruz elevado (LCE – fig. 4)

O LCE tem formato em cruz, elevado 50 cm acima do chão, e consiste em 2 braços

abertos (sem paredes, 50 cm de comprimento × 10 cm de largura), dois braços fechados (50

cm de comprimento × 10 cm de largura × 40 cm de altura), e uma área central entre os braços.

92

Figura 4. Vista superior do labirinto em cruz elevado.

6.1.3. Campo vazado (CV – fig. 5)

O CV tem formato de uma arena retangular (80 cm de comprimento × 60 cm de

largura × 40 cm de altura). A arena apresenta 16 orifícios (4 cm de diâmetro) distribuídos de

forma regular onde o animal pode inserir a face para explorar.

Figura 5. Vista superior do campo vazado.