Lucrarea nr. 8

Refractometrie. Metode fizice de evaluare a proteinelor din serul sanguin

Această lucrare practică îşi propune să vă prezinte o metodă de rutină care se pot aplica în orice laborator medical în scopul obţinerii unor date esenţiale asupra proteinelor.

1. Date teoretice: refractometrie

Refracţia luminii este fenomenul de schimbare bruscă a direcţiei de propagare a luminii la limita de separare a două medii transparente cu indice de refracţie diferit.

Dacă unghiul de refracţie este mai mic decât unghiul de incidenţă, spunem că mediul al doilea este refrigent decât primul.

Legile care stau la baza fenomenului de refracţie vă sunt cunoscute. Reamintim doar formularea matematică a legii a doua a refracţiei:

unde = indicele de refracţie relativ al celui de-al doilea mediu faţă de primul

(fig.1).

Fig.1. Refracţia luminii la trecerea dintr-un mediu cu indice de refracţie mai mic în unul cu indice de refracţie mai mare

Se consideră cazul în care lumina trece dintr-un mediu optic mai dens în unul mai puţin dens, ca în figura 2. Se observă că mărind progresiv valoarea unghiului de incidenţă, se ajunge la situaţia în care unghiul de refracţie are

valoarea maximă de . Valoarea unghiului de incidenţă pentru care unghiul de

refracţie este de se numeşte unghi limită (l). Pentru orice valoare a

unghiului de incidenţă mai mare decât unghiul limită, l, lumina nu mai trece în mediul al doilea, ci se reflectă în punctul de incidenţă, fenomen denumit reflexie totală. În acest caz legea refracţiei se poate scrie:

cum =1, se obţine:

ceea ce arată că unghiul limită depinde numai de indicii de refracţie ai celor două medii aflate în contact.

Fig.2. Refracţia luminii la trecerea dintr-un mediu cu indice de refracţie mai mare în unul cu indice de refracţie mai mic

Valoarea indicelui de refracţie al unui mediu depinde de mai mulţi parametri:

Temperatura: creşterea temperaturii produce la multe lichide organice scăderea indicelui de refracţie;

Lungimea de undă a radiaţiei care suferă fenomenului de refracţie; Concentraţia substanţei respective în lichidul de cercetat; Variaţiile obişnuite ale presiunii atmosferice influenţează foarte puţin

valoarea indicelui de refracţie, încât ea poate fi neglijată. Starea de agregare şi densitatea mediului: creşterea densităţii produce o

creştere a indicelui de refracţie, după o relaţie de forma:

unde r este un coeficient caracteristic pentru o substanţă dată şi se numeşte refracţie specifică. Ea nu depinde de condiţiile exterioare şi nici de starea de agregare a substanţei.

Înmulţind refracţia specifică cu densitatea unui corp obţinem puterea refringentă a corpului respectiv.

Produsul dintre refracţia specifică a unei substanţe şi greutatea sa moleculară se numeşte putere refrigentă moleculară.

Puterea refrigentă moleculară a unui compus chimic este egală cu suma puterilor refringente atomice ale elementelor din care este formată molecula lui, înmulţite respectiv cu numărul de atomi de acelaşi fel. În cazul compuşilor organici, legăturile duble sau triple modifică puterea refringentă moleculară, deci această mărime depinde de structura chimică.

Măsurarea prin refractometrie a concentraţiei proteinelor totale din serul sanguin

Partea practică

Scopul refractometriei este măsurarea concentraţiei unei substanţe. De exemplu, de interes medical este determinarea concentraţiei proteinelor totale din serul sanguin.

Metoda se bazează pe faptul că indicele de refracţie variază în funcţie de concentraţia moleculelor din mediul refringent considerat, după o ecuaţie de forma:

În exemplul de mai sus, dacă în sângele integral îndepărtăm prin coagulare elementele figurate, vom obţine serul sanguin. Indicele său de refracţie depinde numai de conţinutul în proteine, deoarece ionii au o putere refringentă foarte mică. Aceasta înseamnă că evaluarea concentraţiei proteinelor din serul sanguin se poate face măsurând fie indicele de refracţie al lichidului biologic, fie unghiul limită corespunzător. Ca urmare, există două tipuri de refractometre:

I. Refractometrul Abbe- a cărui scală gradată permite citirea directă a indicelui de refracţie al lichidului de cercetat;

II. Refractometrul Pulfrich- pe scala căruia se citeşte unghiul limită, care va fi apoi transformat în indicele de refracţie şi concentraţie de substanţă.

Fig.3. Refrectometrul Pulfrich (1921)

Conform principiului reversibilităţii razelor de lumină, considerăm un fascicul de radiaţii monocromatice care pătrunde în mediul mai puţin dens sub

un unghi de aproximativ de . În acest caz, unghiul de refracţie va avea

valoarea corespunzătoare unghiului limită (l).

Legea a doua a refracţiei se poate scrie:

Dar i= , iar r va fi înlocuit cu l; în acest caz relaţia se va scrie:

Dar sin =1 şi atunci relaţia devine:

Aceasta este relaţia fundamentală pe care se bazează construcţia şi folosirea refractometrelor. Din relaţia precedentă se observă că, măsurând valoarea

unghiului limită (l) şi cunoscând valoarea indicelui de refracţie al sticlei ( ),

putem afla care este valoarea indicelui de refracţie al mediului mai puţin dens(

).

Refractometrul Abbe (fig.10) permite măsurarea indicelui de refracţie al

lichidelor cu precizie de ordinul .

Fig. 10. Refractometrul Abbe (AR3- Kruss Optronic)

Părţile componente are refractometrului (fig.11) sunt următoarele:

Fig. 11. Schema refractometrului Abbe

1-ocular; 2,3- racorduri pentru termostatarea prismei de iluminare; 4- şurub pentru reglarea compensatorului; 5,11- racorduri pentru termostatarea prismei de

iluminare; 6- şurub pentru manevrarea scalei; 7- luneta; 8- tambur pentru deschiderea blocului de prisme; 9- sursa de iluminare a scalei; 10- termometru;

12- prisma de iluminare; 13- lampa de sodiu; 14- oglindă

a)Sistemul de prisme reprezintă partea principală a aparatului, fiind alcătuit dintr-o prismă de măsură situată în partea inferioară şi o prismă de iluminare. Ambele prisme sunt confecţionate din sticlă flint (n=1,75), au două feţe de contact şi formează un bloc paralelipipedic. Fiecare prismă este fixată într-o montură metalică prin care circulă un curent de apă cu temperatură constantă, de la un termometru (10) ataşat la sistemul de prisme.

Între planele prismelor se introduc 1-2 picături din lichidul de cercetat, al cărui indice de refracţie este mai mic decât indicele de refracţie al prismelor. Valoarea indicelui de refracţie al prismelor reprezintă limita superioară a scalei de măsură a aparatului. Sursa de lumină utilizată este o lampă de sodiu situată în

faţa prismei de iluminare, făcând corp comun cu aceasta. Razele de lumină ce provin de la sursă sunt reflectate cu ajutorul oglinzii situată la partea inferioară a prismelor. Faţa de contact a prismei de iluminare este mată şi difuzează lumina care o străbate în toate direcţiile. Datorită reflexiei totale, razele care pătrund în prisma de măsură vor face cu normala la faţa de contact a acesteia un unghi mai mic sau egal cu unghiul limită.

b)Luneta este alcătuită dintr-un sistem de lentile convergente având rolul de a capta razele care emerg din prisma de măsură. În câmpul vizual al lunetei se observă o zonă luminoasă şi una întunecată (fig.12). limita de separaţie între cele două zone corespunde razelor cu înclinare maximă faţă de normala la suprafaţa prismei. Poziţia acestei limite de separaţie poate fi modificată rotind şurubul (6).

Fig. 12. Limita de separaţie între zona luminoasă şi cea întunecată

În ocularul lunetei sunt fixate două fire reticulare, perpendiculare între ele. Pentru determinarea indicelui de refracţie, limita dintre zona întunecată şi cea luminoasă se aduce exact la punctul de intersecţie al firelor reticulare. În partea inferioară a câmpului vizual al lunetei se află un fir reticular vertical în faţa căruia se deplasează o scală gradată în indici de refracţie şi o scală în procente Brix (fig.13). Scala Brix este în directă corelaţie cu indicele de refracţie si exprimă procentual cantitatea de substanţă solidă dizolvată în 100 ml de apă. Cele două scale sunt iluminate cu ajutorul unei surse de lumină albă(9);

Fig. 13. Scala refractometrului Abbe

a) Compensatorul este situat între blocul de prisme şi lunetă şi este alcătuit din două prisme Amici identice. Compensatorul are rol de a recombina lumina dispersată în prisma de măsură, obţinându-se o limită de separaţie netă între zona întunecoasă şi cea luminoasă. Compensatorul se reglează în poziţia corectă rotind şurubul (4).

Mod de lucru

Se parcurg următoarele etape:

Verificarea exactităţii refractometrului Abbe -se face cu apă distilată al

cărei indice de refracţie la temperatura de este 1,3329.

Cu ajutorul şurubului (8) se deschide sistemul de prisme. Feţele de contact ale celor două prisme. Feţele de contact ale celor două prisme se curăţă cu o bucată de tifon umezită cu alcool şi se lasă să se usuce;

Cu o pipetă Pasteur se aşează pe suprafaţa lucioasă a prismei de măsură 1-2 picături de apă distilată;

Privind în ocularul lunetei se observă o zonă întunecată, una luminoasă şi imaginea scalei. Se reglează poziţia ocularului astfel încât imaginea să fie clară;

Cu ajutorul şurubului (6) se aduce limita de separaţie dintre cele două zone la punctul de intersecţie al firelor reticulare.

Se roteşte şurubul (4) până ce limita de separaţie între cele două zone devine netă;

Se citeşte valoarea indicelui de refracţie de pe scală, în dreptul firului vertical. Pentru temperatura de lucru, valoarea indicelui de refracţie măsurată cu refractometrul Abbe trebuie să coincidă cu cea din tabelul 2.

1. Se şterg prismele şi se trece la măsurarea indicelui de refracţie al unui fluid biologic, parcurgându-se aceleaşi etape ca în cazul apei distilate. Valorile indicelui de refracţie citite pe scala refractometrului Abbe sunt convertite în valori ale concentraţiei proteinelor din ser (g/l) cu ajutorul tab.2. Datele obţinute se trec într-un tabel asemănător celui de mai jos:

Nr. Det. Indice de refracţie Concentraţia proteinelor (g/l)123

Refractometrul clinic portabil (fig.14) permite măsurarea directă a

concentraţiei de albumine din serul sanguin (g/dl) şi a densităţii urinii (g/ ).

Fig. 14. Refractometrul clinic portabil1- Prismă de măsură2- Lamă transparentă pentru protecţie prismei3- şurub pentru reglajul scalei4- tub optic5- ocular.

Mod de lucru:1. Verificarea exactităţii refractometrului :

se îndreaptă refractometrul cu prisma spre o sursă de lumină, astfel încât, rotind şurubul ocularului (5) să obţinem o imagine clară a scalei refractometrului;

Se ridică lama de protecţie (2) şi se depun cu o pipetă din plastic 1- 2 picături de apă distilată pe suprafaţa prismei;

Cu ajutorul şurubului (3) se reglează scala astfel încât linia de separaţie între zona luminoasă şi cea întunecată să coincidă cu reperul W (fig. 15);

Fig. 15. Scala refractometrului portabil

2. Se ridică lama de protecţie (2), se şterge uşor suprafaţa prismei cu hârtie de filtru şi se trece la măsurarea concentraţiei de albumine din serul sanguin, parcurgându-se aceleaşi etape ca în cazul apei distilate. Limita de separaţie între zona luminoasă şi cea întunecată va indica concentraţia de albumine din ser. În acelaşi mod se procedează pentru măsurarea densităţii urinii.

Scala pentru măsurarea concentraţiei de albumine este gradată pentru

temperaturi între 5- C, în diviziuni cu valoarea de 0,2 g/dl, iar pentru

densitatea urinii diviziunea are valoarea de 0,002 g/ .