Testarea calcifierii in vitro

LUCRAREA 3. - PIBTTestarea calcifierii in vitro. In vederea stabilirii capacitatii unor biomateriale de a calcifia in organism, dupa implantare, intr-o prima faza se investigheaza comportamentul acestora prin bai alternante de clorura de calciu si fosfat de sodiu.Retetele pentru prepararea solutiilor de testare si modul de lucru sunt descrise in sectiunea I. In acest fluide se pot incuba materialele ale caror potentiale de calcifiere sunt investigate. Detaliile acestei metode sunt prezentate in sectiunea II. Procedura de testare a capacitatii de formare a apatitei.

Probele polimerice se imerseaza timp de 48 de ore in apa bidistilata (ddw) in scopul atingerii gradului maxim de gonflare inainte de incubarea in solutiile de testare a calcifierii.

I. Prepararea solutiilor1. Materii prime Clorura de calciu CaCl2 Fosfat de sodiu Na2HPO4 Apa bidistilata

2. Procedura de preparare a SBF

Pe toata durata prepararii solutiilor, aceastea trebuie sa fie incolora si limpede, iar pe suprafata sticlei sa nu existe precipitate. In cazul in care apare o precipitare, prepararea solutiei trebuie oprita si reluata.

Solutia de CaCl2 (200mL) se prepara avand o concentratie de 0,5 M. Solutia de Na2HPO4 (200mL) se prepara avand o concentratie de 0,3 M.Pentru a prepara 200 mL din fiecare solutie se folosesc pahare Berzelius de sticla foarte curat si care nu prezinta zgarieturi pe pereti, prevazute cu un agitator magnetic. In paharul Berzelius se dizolva reactivii sub agitare.

Masa moleculara a CaCl2 este 110,99 g/mol, iar masa moleculara a Na2HPO4 este 141,96 g/mol.Observatii: CaCl2 are o mare influenta asupra precipitarii apatitei. In general acesta se prezinta sub forma granulara si este recomandat sa fie dizolvat cate putin.

Cantarirea reactivilor hidroscopici se va face cat mai repede, pentru a evita absorbtia apei din atmosfera.

II. Procedura de testare a capacitatii de formare a apatitei

Esentioanele destinate testarii capacitatii de calcifiere se incubeaza pe rand in solutiile de CaCl2 si Na2HPO4 (in triplicat). Timpul de incubare este de 15 minute pentru fiecare solutie.

III. Analiza probelor dupa incubare in SBF

Aceasta analiza este etapa in urma careia se concluzioneaza asupra capacitatii de calcifiere in vitro a materialelor testate.

Analiza cuprinde un set de investigatii prin care se verifica daca a avut loc formare de faza minerala fosfo-calcica in timpul incubarii in baile alternante.

Alegerea metodelor de apreciere a calcifierii este de maxima importanta, deoarece trebuie verificata masura in care metoda respectiva este adaptata materialului pe care il caracterizam.

In general, aprecierea calcifierii se face prin metodele descrise in tabelul urmator:

Metoda Tipul informatieiObservatii

FTIR cu ATR (spectrometrie in infrarosu cu transformata Fourier, cu dispozitiv de reflexie totala atenuata)Identifica aparitia grupelor fosfat pe suprafata materialului1. Este relevanta pentru materiale care nu contin in structura lor grupe fosfat.

2. Materialul trebuie spalat eficient si cu mare atentie dupa terminarea incubarii in SBF, pentru a nu prezenta faza minerala nelegata pe suprafata sa, dar si pentru a nu distruge mineralul format.

3. Analiza materialului se face dupa uscare; manevrarea esantioanelor se face cu atentie, evitand contaminarea si zgarierea suprafetei. (De ce?)

4. Analiza este una calitativa.

Microscopie electronica de baleiaj (SEM) si de transmisieAnalize morfo-structuraleCele doua metode sunt complementare si ofera informatii despre morfologia si distributia fazei minerale formate in urma incubarii in SBF.

Coloratie Von KossaPrezenta sarurilor de calciuRelevanta numai pentru anumite materiale, care nu contin saruri de calciu in compozitie inainte de testare.

III.1. Coloratia Von Kossa este o tehnica colorimetrica preluata din histologie. Aceasta coloratie permite evidentierea depozitelor de calciu din tesuturi (argint metalic - culoare neagra).Metoda: Materialul se hidrateaza in apa distilata. Dupa hidratare se incubeaza in solutie de azotat de argint 1%, pentru 30 minute, prin expunere la lumina puternica.Se spala cu apa distilata.

Aparitia unor depozite de culoare brun-neagra indica prezenta sarurilor de calciu. Se foloseste ca martor xenogrefa bovina nedecalcifiata.1% solutie apoasa de azotat de argint: Azotat de argint ------------------------- 1 g

Apa distilata ---------------------- 100 ml