llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllLucrare de laborator:DIFUZIUNEA ŞI OSMOZA

A. Studiul influenţei unor factori fizici asupra ratei difuziunii

A.1 Definirea şi explicarea fenomenelor de agitaţia termică, difuziune şi

osmoză

A.2 Legile osmozei. Soluţii false şi soluţii adevărate

A.3 Osmolalitate şi osmolaritate. Calculul presiunii osmotice

A.4 Aplicaţii medicale

B. Noţiuni generale despre microscopia optică

B1. Metode de măsurare a dimensiunilor celulare

C. Evaluarea cantitativă a fenomenului de osmoză

C1. Osmoza la celulele vegetale

C2. Osmoza la nivelul hematiei

La nivelul membranelor naturale se petrec schimburi de substanţă fără de care celulele vii nu ar putea supravieţui. Acestea implică fenomene de transport ale solventului sau/şi ale solvenţilor intra şi extracelulari.

Lucrarea prezentată vă permite să puneţi în evidenţă fenomenul de transport membranar al solventului, osmoza, în cazul celulelor vegetale şi animale.

Microscopul optic este utilizat pentru a observa şi măsura variaţiile dimensiunilor celulare

A. Studiul influenţei unor factori fizici asupra ratei difuziunii

A.1 Definirea şi explicarea fenomenelor de agitaţia termică, difuziune şi osmoză

Difuzie:

Datorită energiei lor cinetice, moleculele unui fluid se găsesc intr-o continuă mişcare, numită agitaţie termică; aceasta încetează doar la temperatura de zero absolut.

Difuzia este fenomenul de pătrundere a moleculelor unei substanţe (lichide sau gazoase) printre moleculele altei substanţe (lichide, gazoase sau solide). Difuzia se produce ca urmare a tendinţei fluidelor de a ocupa întreg volumul aflat la dispoziţie, datorită agitaţiei termice. Acest proces conduce la egalizarea diferenţelor de concentraţie, presiune sau temperatură, fiind o expresie a tendinţei naturale a sistemelor de a tinde spre starea de echilibru. Fenomenul de difuzie este caracterizat de două legi, cunoscute sub numele de legile Fick. În cazul difuziunii, prezenţa unei membrane prin porii căreia să se realizeze fenomenul este facultativă.

Fig 1 Difuzia [www.williamsclass.com/SeventhScienceWork/ImagesCellBricks/Diffusion]

Difuziunea prin intermediul unei membrane este guvernată de prima lege a lui Fick:

Φ=−DSdcdx

Definiţii:

Soluţie = Lichid mixt omogen, ce conţine două sau mai multe substanţe

Solvent = Agentul de dizolvare a unei soluţii. Apa este cel mai versatil solvent cunoscut.

Solvit = Substanţa ce se dizolvă într-o soluţie

Unde Φ=¿fluxul moleculelor transportate pasiv (moli/s) în sensul gradientului de concentraţie dc/dx, printr-o suprafaţă S a membranei. Constanta de proporţionalitate, D, poartă numele de coeficient de difuziune. Semnul minus sugerează că difuziunea are loc întotdeauna de la zonele de concentraţie mare spre zonele de concentraţie mai mică.

Coeficientul de difuzie depinde de natura substanţei, de temperatură şi de forma şi dimensiunea particulelor ce difuzează. Pentru particule sferice de mici dimensiuni, coeficientul de difuzie se scrie sub forma:

D= kT6 πη r

unde T este temperatura absolută, k este constanta lui Boltzmann, η este vâscozitatea şi r este raza particulelor.

Fenomenul de difuzie stă la baza a numeroase schimburi de substanţă care au loc în natură între organisme sau în interiorul unui organism. În toate aceste cazuri însă, substanţele care difuzează nu sunt în contact direct, ci sunt despărţite printr-o membrană. Această membrană poate fi permeabilă în mod diferit pentru substanţe diferite, caz în care se numeşte selectiv permeabilă. Un caz important este acela al membranelor care sunt permeabile pentru solventul unei soluţii, dar nu sunt permeabile pentru solvit, numite membrane semipermeabile.

Osmoză:

Fenomenul de difuzie selectivă care are loc în cazul a două soluţii de concentraţii diferite, despărţite printr-o membrană semipermeabilă, poartă numele de osmoză. Efectul osmozei este egalizarea concentraţiilor celor două soluţii, atâta timp cât osmoza nu este împiedicată de alte cauze externe.

În cazul unei membrane strict semipermeabile, osmoza este singurul fenomen de transport transmembranar.

Fig. 2 Membrana celulară [www.philadelphia.edu.jo/courses/biology/diffusion.ppt]

Pentru o membrană permeabilă sau selectiv permeabilă fenomenele de osmoză şi de dializă au loc concomitent, în sensuri opuse.

Difuziunea solventului (apa în sistemele vii) are loc din compartimentul în care soluţia este mai diluată (număr de molecule ale solventului mare, molecule de solvit puţine) înspre compartimentul în care soluţia este mai concentrată, are un număr mai mic de molecule ale solventului şi un număr mai mare de molecule de solvit, diluând-o. Datorită procesului de egalizare a concentraţiei prin difuzia solventului, osmoza redă tendinţa generală pe care o are sistemul de a-şi mări entropia.

Fig 3.1 Osmoza în cazul unei membrane strict permeabile. Soluţii hipotonice şi hipertonice

Mecanismele osmozei

Explicarea molecular-cinetică a fenomenului este următoarea: trebuie să vedeţi soluţia ca fiind un amestec de două substanţe, apă (solvent) şi solvit (sau solviţi), ambele formate din molecule, dar de dimensiuni diferite; moleculele solventului vor fi întotdeauna mai mici decât cele ale solvitului. În acest fel va fi mai evident pentru dumneavoastră faptul că ambele specii moleculare se supun aceloraşi legi, nici una nefiind privilegiată. De exemplu, într-o soluţie de sare (NaCl) în apă, solventul este reprezentat de moleculele de apă, iar solvitul este reprezentat de particule de N a+¿ ¿ şi de C l−¿ ¿.

Să considerăm două compartimente separate de o membrană strict semipermeabilă şi să ne reprezentăm situaţia printr-o schemă simplă (fig.1). Molecula de solvent, fiind sufucient de mică, poate trece prin membrană, pe când molecula de solvit nu. Numărul moleculelor de apă ce ajung în unitatea de timp la membrana semipermeabilă este mai mic în compartimentul II decât în compartimentul I, ca urmare a concentraţiei scăzute a apei în II. În intervalul de timp în care din I trec în II trei molecule de apă, din II în I trece doar o moleculă de apă.

I II

F Fig. 3.2 Osmoza

Mb. Semipermeabilă

= moleculă de apă = moleculă de solvitI= compartiment cu solvent purII= compartiment cu soluţieF= flux net de solvent

Acest fenomen apare numai în condiţiile existenţei membranei. Solventul difuzează prin membrană în cele două sensuri, dar viteza de trecere a solventului pur spre soluţie este mai mare decât trecerea în sens contrar. Această diferenţă de flux este singura responsabilă de fenomenul de osmoză.

Fluxul net rezultant face ca nivelul lichidului din II să crească, dezvoltându-se în acest compartiment o presiune; în momentul în care această presiune; va fi echilibrată de presiunea hidrostatică ρgh ascensiunea în II se opreşte.

Dacă s-ar exercita o presiune statică asupra soluţiei din compartimentul II, numărul moleculelor de solvent care ar ajunge în unitatea de timp la faţa membranei dinspre acest vas ar creşte. Când numărul acestora egalează numărul moleculelor de solvent ce ajung în unitatea de timp la membrană în vasul I, se stabileşte un echilibru dinamic între cele două compartimente. Această presiune ar reprezenta presiunea osmotică a soluţiei din I.

Presiunea osmotică (p0), este presiunea ce ar trebui exercitată asupra soluţiei pentru a aduce în echilibru cu solvent pur, separat de ea printr-o membrană semipermeabilă, adică pentru a împiedica orice flux de solvent între cele două compartimente. În exemplul menţionat anterior:

p0= ρgh

Valoarea numerică a presiunii osmotice a unei soluţii poate fi măsurată experimental prin diverse tehnici. De asemenea, ea poate fi calculată teoretic în cazul soluţiilor pentru care poate fi aplicat un model asemănător celui al gazelor ideale.

A.2 Legile osmozei. Soluţii false şi soluţii adevărate

Botanistul Pfeffer, cu ajutorul osmometrului care îi poartă numele a stabilit următoarea lege cantitativă a osmozei, pentru soluţii diluate:

p0=kCM

T

unde,k= constantăC= concentraţia ponderală a soluţiei (g/l)M= masa molară a solvituluiT= temperatura absolută

Dacă notăm cu n numărul de moli dizolvaţi în volumul de soluţie V, vom avea:CM

= nV

=m

m reprezintă concentraţia molară (număr de moli/ unitate de volum)Dacă înlocuim în relaţia iniţială, obţinem:

p0 V=nRT

Unde:

p0 = presiunea osmotică a soluţiei

V= volumul soluţiein= numărul de moli de substanţă dizolvată

R= constanta universală a gazelorT= temperatura absolutăEa este, pentru soluţiile foarte diluate, identică cu legea gazelor perfecte.Se numeşte presiune osmotică presiunea care se exercită asupra unei soluţii pentru a o menţine în echilibru cu solventul, separat de ea printr-o membrană semipermeabilă.Legile osmozei

Legea concentraţiilor: la temperatură constantă, presiunea osmotică este proporţională cu concentraţia molară a corpului dizolvat: p0~ C

Legea temperaturii: pentru o soluţie dată, presiunea osmotică creşte proporţional cu coeficientul (1+αt), valoarea lui α fiind aceeaşi ca la gaze, iar t fiind temepratura (lege valabilă până în 40oC): p0~ (1+αt)

Legea lui Van’t Hoff: p0 este independentă de natura solventului şi de substanţa dizolvantă, ea nu depinde decât de numărul particule prezente în volumul ocupat de soluţie: p0* V=n * R* T

Legea amestecurilor: p0 a unei soluţii în care faza dispersată este alcătuită din substanţe diferite este egală cu suma presiunilor osmotice determinată de fiecare substanţă în parte.

Soluţii izo-, hipo-, hipertone:Se impun câteva definiţii: două soluţii A şi B care au aceeaşi presiune osmotică, deci

între ele nu ar exista flux de solvent în prezenţa unei membrane semipermeabile, se numesc izoosmotice (izo=egal). Dacă A are p0 mai mare decât B spunem că A este hiperosmotică faţă de B iar B este hipoosmotică faţă de A. În mod asemănător, expresia membrană semipermeabilă se referă la un anumit solvent; dacă acesta nu este precizat, se subînţelege că este vorba despre apă.

Termenii hipoton şi hiperton sunt folosiţi prin raportare la plasma sanguină, la temperatura organismului (izoton =izoosmetic cu plasma, hipoton= hipoosmetic faţă de plasmă, hiperton= hiperosmotic faţă de plasmă).

Soluţii false şi soluţii adevărate:Legile osmozei nu se aplică riguros la toate categoriile de soluţii. Pentru soluţiile

concentrate presiunea osmotică mai mare decât cea calculată conform legilor osmozei. Aceasta se datorează faptului că volumul moleculelor încetează de a mai fi neglijabil în raport cu volumul soluţiei şi distanţa intermoleculară.

Ca urmare a fenomenului de disociaţie electrolitică sărurile, acizii, bazele au în soluţii apoase o presiune osmotică superioară celei care ar corespunde numărului de molecule prezente în volumul de soluţie dat. De exemplu o soluţie de NaCl va avea o presiune dublă, o soluţie de Na2 So4va avea o presiune triplă.

În cazul soluţiilor coloidale, formate din agregate moleculare, presiunea osmotică este mai mică decât cea calculată teoretic, doarece fiecare agregat se comportă ca o singură particulă.

Având în vedere consideraţiile de mai sus, soluţiile se pot clasifica în adevărate şi false, după cum se supun sau nu legilor osmozei. Soluţiile adevărate sunt cele cristaloide neelectrolite

diluate, la care numărul de particule corespunde exact cu numărul de molecule dizolvate. Soluţiile false sunt cele cristaloide şi cele coloidale.

A.3 Osmolalitate şi osmolaritate. Calculul presiunii osmotice

Să considerăm o soluţie conţinând:N0 moli de solvent de masă molară M 0 n1 , n2 ,…ni moli de solviţi de masă molară M 1 ,M 2 , …M i

V= volumul soluţieiV 0 = volumul molar (al solventului)V i = volumul molar al solvitului

Pentru o soluţie electrolitică sau neelectrolitică, se pot defini:a) Concentraţia molară (c) (molaritatea sau osmolaritatea). Reprezintă numărul de

soluţie/litru:

c i=ni

V=

ni

∑ niV i

Concentraţiile molare sunt aditive; ele sunt aplicabile atât pentru solvent, cât şi pentru solvit.Osmolaritatea se exprimă în miliosmoli/ litru de soluţie.

b) Molalitatea (m) sau osmolalitate. Reprezintă numărul de moli de solvit considerat per unitate de masă (în general pe kg) de solvent.

mi=ni

n0 M 0

∗1000

unde,n0 M 0 reprezintă masa solventului, în grame.

Molalităţile sunt aditive; ele sunt aplicabile decât solvenţilor.

În cazul soluţiilor apoase foarte diluate, volumul particulelor din soluţie este neglijabil în raport cu volumul solventului, iar molaritatea şi molalitatea pot fi confundate. În acest caz un litru de apă cântăreşte aproape 1 kg. Această aproximaţie nu este corectă în cazul plasmei sanguine, deoarece volumul proteinelor nu este neglijabil.Osmolalităţile se exprimă în miliosmoli/kg de solvent.

c) Concentraţia ponderală (p). Reprezintă masa de solvit per volul de soluţie:

pi=ni M i

VConcentraţiile ponderale nu sunt aditive. Relaţia între concentraţia molară (moli/litru) şi concentraţia ponderală (grame/litru) va fi:

c i=ni

V=

n i

ni

M i

pi

=p i

M i

Osmol- explicaţie şi definiţie

Deoarece osmoza depinde doar de numărul total de particule de solvit din soluţie, indiferent de natura acestora, în scop de uniformizare a termenilor cu referire atât la soluţiile care conţin ioni cât şi la cele care conţin molecule s-a introdus noţiunea de osmol, aceasta reprezentând o particulă oarecare din soluţie (Osm)- particulă gram cinetică, adică o particulă a cărei mişcare liberă şi dezordonată este asimilabilă unei molecule de gaz. Pentru neelectroliţi sau electroliţi nedisociaţi, osmolul corespune molului; pentru soluţiile de electroliţi, osmolul corespunde ionului-gram; pentru ionii monovalenţi, osmolul corespunde şi echivalentului gram.

Osmolaritatea totală a unei soluţii este, deci, suma numărului de moli nedisociaţi şi a numărului de ioni-gram per litru de soluţie.

Osmolul fiind o unitate prea mare pentru soluţiile biologice, se utilizează un submultiplu al acestuia- moliosmolul (mOsm): 1 mOsm= 10−3Osm.

Pentru soluţiile complexe, osmolalitatea se calculează prin sumarea tuturor concentraţiilor molare ale constituenţilor, ţinând cont de gradul lor de dizociere. De exemplu, pentru lichidul extracelular, se consideră constituenţi principali: Na+¿ , Cl−¿ ¿¿, glucoză, uree; există formule de

calcul pentru fiecare lichid în parte.

Osmolalitatea plastică se exprimă în număr de miliOsmoli/ litru de plasmă; se determină prin măsurarea punctului crioscopic al unei soluţii.

A.4 Aplicaţii medicale

În organism, sectoarele celulare, interstiţiale şi intravasculare sunt tot atâtea compartimente separate prin membrane biologice, cu permeabilitate selectivă, prin care transportul apei se face prin mecanisme total diferite decât în cazul membranelor biologice pot exista proteine cu rol de canale pentru molecule de apă. Fiecare celulă sau compartiment subcelular delimitat (nucleu, vacuolă, lizozomi etc.) reprezintă compartimente microscopice în care intervin fenomenele osmotice. Se poate vorbi, deci, de presiunea osmotică a oricărui compartiment lichidian delimitat de o membrană. Osmoza intervine şi în realizarea funcţiei normale a glomerulului renal.

Cea mai mare parte a lichidelor din organism sunt soluţii complexe. Pentru această osmolaritate se calculează prin sumarea tuturor concentraţiilor molare ale constituenţilor, aşa cum s-a menţionat deja.

Atât variaţiile în plus cât şi cele în minus ale osmolarităţii diferitelor sectoare lichidiene ale organismului pot ameninţa însăşi existenţa individului. Exemplu: o deshidratare celulară produsă ca urmare a unei evaporări masive a apei prin transpiraţie abundentă. Pierderea unei cantităţi mari de apă va fi urmată de creşterea presiunii osmotice a lichidelor extracelulare. În aceste condiţii apa intracelulară se va deplasa extracelular-osmoză la nivelul membranei celulare, selectiv permeabile. Diminuarea volumului lichidian intracelular va altera metabolismul celular. Intensitatea şi durata unei astfel de deshidratări condiţionează reversibilitatea sau ireversibilitatea alterărilor proceselor celulare.

Este sugestiv de menţionat că la un deficit de peste 15 % apă din greutatea corporală, pentru un interval de timp de 6-7 zile, survine încetarea funcţiilor vitale ale organismului- moartea.

Stările hipo- şi hiperosmolare, în perioada de reversibilitate, pot fi corectate prin aport sau eliminări lichidiene controlate, dar aceasta necesită în prealabil avaluarea osmolarităţii diferitelor comportimente lichidiene.

Stările hipo- şi hiperosmolare:

Osmolalitatea lichidului intra- şi extracelular sunt menţinute în echilibru deşi compoziţia electrolitică este diferită. Variaţii mai mari de 2% ale osmalităţii plasmatice sunt cunoscute sub numele de stări de hiperosmolare, respectiv hiperoosmolare, în cazul variaţiilor sub această valoare.

Stările hiperosmolare pot fi produse de creşterea cantităţii unor substanţe solvite în sânge : Na+¿¿, glucoză sau ureea şi alcoolul care nu au acest efect; în aceste cazuri osmolaritatea determinată este mai mare decât osmolaritatea totală calculată pentru Na+¿¿, glucoză, uree. Stările hiperosmolare se pot datora: creşterii cantităţii de solvit; scăderii cantităţii de solvent; unui aport exogen de solvent şi solvit. Tratamentul implică rehidratare prin indigestie sau prin perfuzie cu soluţii fiziologice hipotone.

Stările hipoosmolare sunt definite de scăderea osmolalităţii sub 235-300mOsm/kg apă şi de scăderea N a+¿ ¿, concomitent. Tratamentul implică perfuzii cu soluţii hipertone, până la revenirea, la osmolaritatea plasmatică normală.

Izoosmolaritatea lichidelor biologice:

În condiţiile normale, lichidele biologice sunt izoosmolare. Menţinearea acestei izoosmolarităţi este asigurată prin schimburi de solvent dar mai ales de solvit. Expresia analitică a osmolarităţii unui lichid bilogic, stabilită cu ajutorul dozărilor chimice, consideră electroliţii ca fiind total disociaţi, acestea explicând lipsa unei corespondenţe riguroase între rezultatele obţinute prin crioscopie (300 mOsm) şi prin calcul.

Contribuţia diverşilor constituenţi plasmatici la osmolaritatea totală a plasmei este prezentată în tabelul 1.

Tabelul 1. Compoziţia plasmei în mEq

Ioni mEq/lplasmă

mEq/l apă plasmatică

CationiNa+¿¿

K+¿ ¿

Ca++¿¿

Mg++¿¿

143552

151,75,45,42,2

Total 155 164,7Anioni :

Cl−¿¿

CO3 H−¿¿

Fosfaţi şi sulfaţiAcizi organici

proteine

103273

6 16

109293,2

6,417,1

Total 155 164,7

Lichidele organismului nu sunt soluţii ideale, şi deşi disocierea electroliţilor puternici este completă, numărul particulelor libere care pot să exercite o presiune osmotică este redus, ca urmare a interacţiunilor dintre ioni. De aceea efectul osmotic al unui electrolit în soluţie depinde de concentraţia sa efectivă mai mult decât de numărul de echivalenţi.

Na+¿¿ şi anionii ce îl însoţesc în mod obişnuit reprezintă 20 mOsm/l. Ceilalţi cationi şi anioni au contribuţii mici. Glucoza contribuie cu 5 mOsm/l, deoarece nu disociază şi are greutatea moleculară 180. Proteinele, deşi se găsesc în concentraţie mare, având greutatea moleculară mare, aduc o contribuţie redusă la osmolaritatea totală a plasmei.

Să considerăm acum o membrană poroasă care separă două soluţii biologice complexe, conţinând molecule de diferite tipuri şi dimensiuni. Datorită faptului că diametrul mediu al porilor membranei are o anumită valoare, moleculele cu diametru mai mic decât acesta vor difuza uşor, iar pe măsură ce diametrul moleculelor creşte, difuzia se va face din ce în ce mai greu. Când diametrul moleculei este egal sau mai mare cu cel al porilor, difuzia nu mai are loc. Acest efect de difuziune selectivă poartă numele de dializă. Acest fenomen permite purificarea sau prepararea soluţiilor care conţin macromolecule şi stă la baza funcţionării rinichiului artificial.

PARTEA PRACTICĂ

Materiale necesare:

3 eprubete cu agar

Soluţii 5mM de:

Metil orange

Bicromat de potasiu

Sulfat de cupru

Difuziunea poate fi influenţată de greutatea moleculară şi de concentraţia moleculelor:

a) Efectul greutăţii moleculareMod de lucru:

1. Luaţi trei eprubete conţinând deja o coloană de agar (10 ml gel polizaharidic, în stare semifluidă)

2. Adăugaţi 3ml din soluţiile de aceeaşi concentraţie a unor compuşi coloraţi, cu masa moleculară diferită.

3. Notaţi nivelul la care se găseşte limita de separaţie a celor două medii, pentru fiecare eprubetă

4. La sfârşitul orelor de lucrări practice: notaţi nivelul la care a ajuns soluţia colorată şi măsuraţi distanţa pe care a difuzat.

Datele se notează în tabelul de rezultate

Substanţa Distanţa (timp: 2 ore)Metil orangeBicromat de potasiuSulfat de cupru

Materiale necesare:

3 eprubete cu agar Soluţii de 5 mM de:

o Metil orange

o Bicromat de potasiu

o Sulfat de cupru

b) Efectul gradientului de concentraţie1. Luaţi alte eprubete cu agar.2. Adăugaţi în fiecare eprubetă 3 ml din soluţia aceluiaşi compus (metil orange) dar de

concentraţii diferite.3. Realizaţi aceleaşi măsurători ca şi la puctul a) şi notaţi rezultatele în tabelul de

rezultate:

Soluţie metil orange Distanţa (timp:2 ore)1 mmol5 mmol10 mmol

Materiale necesare:

3 eprubete cu agar Soluţii de metil orange de concentraţii: 1 mmol, 5 mmol, 10 mmol.

B. Noţiuni generale despre microscopia optică

B1. Metode de măsurare a dimensiunilor celulare

Participarea fenomenului de osmoză la schimbul de substanţă dintre celulă şi mediul înconjurător poate fi observată prin experienţe simple, utilizând microscopul optic.

Descrierea microscopului optic

Microscopul optic obişnuit este un sistem de lentile convergente astfel realizat încât să poată fi folosit pentru observarea unor structuri cu dimensiuni în general de ordinul micrometrilor format din:

Partea optică, care se compune dintr-un sistem centrat de iluminare şi două sisteme de lentile convergente: obiectivul cu distanţă focală de câţiva milimetri şi ocularul, cu distanţă focală de ordinul centimetrilor.

Sistemul obiectiv este alcătuit dintr-un sistem centrat de lentile aşezate într-o anumită ordine într-un tub metalic montat direct sau prin intermediul sistemului revolver la partea inferioară a tubului microscopului. Obiectivele au notată puterea măritoare care variază între x10 şi x90.

Sistemul ocular este alcătuit dintr-un sistem de lentile situate la partea superioară a tubului microscopului. Puterea măritoare a ocularelor care variază între x5 şi x15. Există microscoape monoculare şi binoculare.

Sistemul de iluminare serveşte pentru a aduce la obiectul examinat lumina de la o sursă naturală sau artificială. Este situat sub platina microscopului şi se compune din sursă de lumină, oglindă, diafragmă şi condensor. Unele microscoape au un sistem de iluminare cu bec situat în piciorul microscopului şi oglinda detaşabilă.

Partea mecanică serveşte la susţinerea părţii optice şi a obiectului examinat. Ea se compune din picior, coloană, platină şi un dispozitiv de punere la punct format din şurubul macrometric şi cel micrometric.

Puterea măritoare a microscopului este dată de produsul dintre puterea măritoare a obiectivului şi cea a ocularului. Microscoapele optice actuale ating o putere măritoare de x2000.

Fig. 4 Microscop optic [Media/Science/Microscopy /Optical Microscope Diagram freeinfosociety.com]

Principalele mărimi caracteristice unui microscop optic

Puterea de rezoluţie reprezintă calitatea cea mai importantă a unui microscop. Ea reprezintă capacitatea unui sistem optic de a separa două puncte să fie percepute distinct la nivelul imaginii finale. Prin termenul general de rezoluţie se înţelege abilitatea unui sistem optic de a detecta detaliile unui obiect. Puterea de rezoluţie este invers proporţioanală cu sitanţa minimă (ε) între două puncte luminoase ale obiectului, percepute separat. Prin urmare, dacă se notează puterea de rezoluţie cu

P (P=1ε

). Cu cât ε este mai mic cu atât puterea de rezoluţie P este mai mare. Distanţa minimă ε,

denumită şi distanţa minimă rezolutivă sau minimum separabil este dată de formula lui Abbe:

ε= 1,22 λ2n sin u

unde:λ = lungimea de undă a luminii utilizate la microscopn= indicele de refracţie al mediului prin care trece luminau= jumătatea unghiului de deschidere a conului luminos ce cade pe obiectivSe observă că ε este cu atât mai mic cu cât n şi u sunt mai mari. Mărimea (n x sinu) se numeşte apertură numerică şi poate fi mărită în două moduri:

1. Mărind indicele de refracţie al mediului existent între obiectiv şi lama ce conţine preparatul: astfel, obiectivele sunt de două feluri: uscate şi umede, după cum între ele şi lamelă există aer sau un mediu cu indicele de refracţie mai mare decât 1.

2. Mărind unghiul u, prin construcţiePuterea separatoare a unui microscop optic este, deci, limitată de lungimea de undă a radiaţiei utilizate, de indicele de refracţie al mediului şi de construcţia obiectivului, care impune o valoare maximă a unghiului u.

Puterea de mărire este mărimea numeric egală cu raportul dintre unghiul u’ sub care se vede imaginea la microscop şi mărimea obiectului AB.

P= u ,

ABPuterea de mărire se exprimă în dioptrii şi este invers proporţională cu distanţele focale

ale obiectivului şi ocularului.

Puterea de pătrundere este o calitate ce aparţine obiectivelor cu putere de mărire mică. Datorită acestei calităţi se poate vedea în profunzime obiectul examinat. Ea variază în raport invers cu mărimea unghiului de deschidere a obiectivului.

PARTEA PRACTICĂ

Principiul metodeiSe suprapune imaginea microscopică a obiectului de măsurat peste imaginea unei scări

gradate etalonată în prealabil.Se utilizează două tipuri de micrometre: ocular şi obiectiv. Micrometrul obiectiv este o

lamă de sticlă pe care sunt marcate diviziuni echidistante cu valoare cunoscută de 10μm. El serveşte la etalonarea micrometrului ocular acesta este un disc de sticlă introdus în sistemul ocular şi la rândul lui are marcate diviziuni echidistante. Imaginea lui este dată numai de lentila ocular, îm timp ce micrometrul obiectiv este mărit de întreaga putere măritoare a microscopului.

A etalona micrometrul ocular inseamnă a stabili o corespondenţă între o diviziune ale micrometrului obiectiv. În acest fel, diviziunile micrometrului ocular pot fi exprimate în unităţi de lungime.

Mod de lucru:1. Se aşează pe platina microscopului lama micrometru obiectiv. Aceasta se fixează

cu ajutorul celor doi cavaleri.2. Realizaţi acum imaginea la microscop: se aduce în axul microscopului obiectivul

x10 prin rotirea sistemului revolver. Privind din lateral, se roteşte viza macrometrică spre înainte şi se coboară tubul microscopic până ce obiectivul se apropie de preparat. Viza macrometrică se mişcă foarte încet. Apoi, privind prin ocular, cu ajutorul aceluiaşi şurub macrometric, rotit în sens invers, se ridică încet tubul până ce apare imaginea în câmpul microscopului. În continuare se procedează la completarea punerii la punct a imaginii cu ajutorul şurubului micrometric care va fi mişcat în ambele sensuri.

3. Se introduce micrometrul ocular intr-unul dintre ocularele microscopului prin scoaterea acestuia din tub şi deşurubarea lentilei superioare a ocularului. Sistemul ocular se introduce apoi în tub. Se observă suprapunerea celor două imagini ale scalelor micrometrice. Notaţi câte diviziuni ale micrometrului obiectiv corespund laturii unui pătrat al micrometrului ocular.

4. Cunoscând valoarea unei diviziuni ale micrometrului obiectiv puteţi uşor afla câţi mm reprezintă latura unui pătrat din reţeaua micrometrului ocular. Acum, înlocuind lama micrometru obiectiv cu o lamă având un preparat, puteţi măsura dimensiunile obiectivelor de pe acestea.

5. Dacă se utilizează un obiect liniar de lungime d cunoscută (etalon), aşezat într-un plan bine determinat, perpendicular pe axa optică a microscopului şi se măsoară lungimea imaginii reale i=n diviziuni a obiectului cu ajutorul micrometrului ocular pentru un obiectiv dat se poate determina un factor de transformare Mr definit prin relaţia:

6. Factorul de transformare Mr este o mărime caracteristică microscopului şi poate fi utilizat pentru etalonare astfel încât el să poată fi folosit pentru determinarea lungimii unor obiecte microscopice. Dacă în locul obiectului etalon se aşează preparatul ce con’ine celule de dimensiuni necunoscute d’ şi se măsoară lungimea corespunzătoare imaginii n’, în conformitate cu relaţia anterioară se obţine:

Evaluarea cantitativă a fenomenului de osmoză

1. La nivelul celulelor vegetaleCelulele vegetale prezintă o membrană citoplasmatică(care include plasmalema şi

tonoplastul); la exteriorul membranei citoplasmatice există o altă membrană sau perete celulozic rigid, inextensibil, aflat la o oarecare distanţă de membrana citoplasmatică. Tonoplastul este considerat o membrană semipermeabilă, sediul principal al fenomenului de osmoză.

După păstrarea în mediu izoosmotic celule îşi conservă volumul, deoarece nu are loc nici un flux rezultant de solvent, spre interiorul sau exteriorul celulei.În mediul hipoosmotic apa intră în celulă, traversând peretele celulozic şi membrana citoplasmatică; celula se măreşte de volum, dar această mărire este limitată prin existenţa peretului celulozic, rigid. Fenomenul poartă numele de turgescenţă. Turgescenţa este starea fiziologică normală, de hidratare optimă a celulei vegetale.

În mediul hiperosmotic, apa celulară este extravazată prin membrană, în scopul restabilirii izotoniei între mediul intra- şi extracelular. Celula îşî micşorează volumul,

fenomenul fiind denumit plasmoliză. Membrana citoplasmatică urmăreşte plasma care se restrânge în volumul celular mic, îndepărtându-se de peretele celulozic. Plasmoliza are loc în trei faze:

1. Plasmoliza incipientă, care constă în deprinderea citoplasmei de peretele celulozic numai la colţurile acesteia;

2. Plasmoliza concavă, care constă în desprinderea parţială a citoplasmei de perete;3. Plasmoliza convexă, care constă în desprinderea totală a citoplasmei de perete.

Plasmoliza poate fi un fenomen reversibil şi apare doar celula viabilă, semipermeabilitatea protoplasmei fiind un fenomen caracteristic doar protoplasmei vii; prin moarte celulară protoplasma devine permeabilă.

Presiunea osmotică a celulei vegetale este numită şi potenţial osmotic şi este dată de concentraţia sucului vacuular în glucide şi săruri minerale.

2. La nivelul celulelor animaleLa celulele animale, lipsa unui perete rigid,care să limiteze mărirea de volum a celulei în

mediul hipoton, duce la ruperea membranei celulare. În cazul particular al hematiei fenomenul se numeşte hemoliză. În mediul hiperosmotic apa iese prin exosmoză din celule, membrana citoplasmaticăse retrage împreună cu conţinutul celular spre nucleu, celula micşorându-şi volumul; fenomenul este denumit ratatinare. Modificările de volum ale hematiei depind, deci,de modificările de presiune osmotică, astfel încât eritrocitul poate fi considerat un veritabil osmometru natural. Presiunea osmotică totală în interiorul hematiei depinde, la rândul său, de concentraţia ionică şi de concentraţia glucozei, precum şi de conţinutul său în hemoglobină.

Membrana eritrocitară este permeabilă la apă şi molecule mici, dar este total impermeabilă la hemoglobină, astfel încât determinantul principal al comportamentului de osmometru al hematiei rămâne hemoglobina.

Eritrocitul reprezinta însa mecanisme de control ce tind să readucă rapid celula la starea de echilibru iniţial. Astfel trecerea masivă de K+¿ ¿ spre exterior poate compensa parţial creşterea volumului. Dacă însa gradientul transmembranar de presiune osmotică este prea mare, aceste mecanisme devin insuficiente. În plus hemoglobina care nu poate părăsi celula menţine o presiune care atrage în continuare volumul iar dacă presiunea osmotică a mediului extracelular scade în continuare, la un moment dat, fiind depăşită rezistenţa mecanică a membranei, hemoglobina va fi extravazată prin intermediul unor false orificii, fără a se produce o veritabilă rupere. Membrana eritrocitară, de aspect modificat, va include un conţinut electrolitic, lipsit de hemoglobină, această nouă structură poartă numele de fantoma eritrocitară.

În mecanismul hemolizei şi în refacerea integrităţii membranare după eliminarea hemoglobinei un rol important revine şi citoscheletului eritrocitar.

Dacă introducem hematii normale în soluţie de NaCl, hemoliza apare la concentraţii de NaCl de 5g/l şi este totală la o concentraţie de 3 g/l.

În unele stări patologice hemoliza poate apare chiar şi în vivo; de exemplu într-o maladie ereditară, în care hematiile sunt mult mai sensibile la variaţii de presiune osmotică.

PARTE PRACTICA

Materiale necesare:

Microscop binocular

Lame şi lamele de sticlă

3 vase Petri

Soluţii cu osmolarităţi diferite:

NaCl 9g/l (mediu izoton)

NaCl 20g/l (mediu hiperton)

Apă distilată (mediu hipoton)

Pipete Pasteur

3 frunze de …

Lamele microscopice

http://www.linkpublishing.com/video-transport.htm

a. Osmoza la alga …..Utilizând microscopul optic, veţi observa modificările unor celule vegetale puse în medii izoosmotice, hipoosmotice şi hiperosmotice.Cele mai evidente modificări apar în privinţa volumului şi formei celulare. Pentru a le observa aveţi nevoie de a măsura dimensiunile unei celule prin metoda descrisă anterior, micrometria.Mod de lucru1. Se pun în cele 3 vase Petri respectiv cca 20 ml mediu hipoton, mediu izoton şi mediu

hiperton şi în fiecare câteva frunzuliţe de plantă.2. Se lasă astfel 20 minute după care se examinează la microscop câte o frunză din fiecare

mediu. Pentru a fi examinată la microscop, frunza, aşezată pe lama de sticlă, se secţionează în grosime. Se aşează fragmentul de frunză pe lama de sticlă, apoi se aşează

pe platina microscopului în aşa fel încât frunza să se afle în dreptul orificiului central al platinei. Se foloseşte obiectivul x10.

3. Se roteşte dispozitivul revolver şi se formează imaginea cu obiectivul x20, care a fost folosit şi pentru etalonarea micrometrului ocular.

4. Se măsoară diametrul longitudinal şi transversal pentru un numar de 10 celule; datele se trec în tabel, în care:

I= mediu izo-osmotic;II= mediu hipoosmotic;III=mediu hiperosmotic;L=diametru longitudinal;T=diametru transversal;m=media aritmetică.

I

L T

II

L T

III

L T12345678910

b. Osmoza la hematiiPentru a pune în evidenţă fenomenul de osmoză la nivelul biomembranelor, se poate realiza un experiment asemănător, dar de data asta utilizând eritrocitele; acestea reprezinta un model de studiu deosebit de accesibil în raport cu alte celule animale.Protocolul de izolare celulara (pentru obţinerea eritrocitelor )consta in centrifugarea sangelui integral urmata de indepartarea plasmei si a stratului superior ( in care se gasesc tromboci tele si leucocitele) . Dupa centrifugarea sangelui , eritrocitele se resuspenda in soluţie de mani tol 0,3M si se spală. Spalarea consta dint r -o serie de centrifugări si resuspendări in manitol .Stocarea eritrocitelor s-a facut prin tinerea lor la frigider. ( temperatura fiind cupr insa intre 4-80 C) , in HBSS (Hanks’Balanced Salt Solution) continand saruri , glucoza, bicarbonat de sodium si fosfati .

Mod de lucru

Veţi observa dimensiunea transversală celulelor. Se va lucra cu 5 recipiente: în A aveţi o suspensie de eritrocite în mediu izoosmotic lor (NaCl 9g/l); în B şi B1 aveţi soluţii hipoosmotice de concentraţii diferite (NaCl 3g/l); în C aveţi soluţie izoosmotică (NaCl 9g/l); în D aveţi soluţie hiperosmotică (NaCl 40g/l).

1. Puneţi cu o pipetă Pasteur câte 1 ml suspensie din recipientul A în fiecare dintre recipienetele B, C,D.

2. În continuarea la anumite intervale de timp, veţi lua câte o picătură din conţinutul recipientelor B, C si D şi o veţi examina la microscop.

Veţi remarca că celulele puse în C nu-şi modifică dimensiunile. Celulele puse în D se ratatinează. Celulele puse în B1 şi scoase după primul interval de timp sunt turgescente iar cele puse în B sunt parţial sau total distruse.

Intervale de timp:Pentru B- 35 minutePentru B1- 35 minutePentru C- 20 minutePentru D- 30 minute

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ:1. Lucrări practice Iasi….