lucrare de licenta- lupu loredana

8/11/2019 Lucrare de Licenta- Lupu Loredana

1/59

UNIVERSITATEA DE VEST DIN TIMIOARA

FACULTATEA DE FIZIC

LUCRARE DE LICEN

COORDONATOR,

Prof.univ.dr.ALINA ZAMFIR

L!".dr.DANIELA SUSAN#RESI$A

A%SOLVENT,

LOREDANA LUPU

Ti&i'o(r(


2/59

)*+

UNIVERSITATEA DE VEST DIN TIMIOARA

FACULTATEA DE FIZIC

DETERMINAREA MAR-ERILOR

MOLECULARI AI CREIERULUI

UMAN SNTOS I PATOLO$IC

PRIN METODE MODERNE

%AZATE PE SPECTROMETRIE

DE MAS

COORDONATOR,Prof.univ.dr.ALINA ZAMFIR

L!".dr.DANIELA SUSAN#RESI$A

A%SOLVENT,

Lord(n( Luu

FIZIC MEDICAL

Ti&i'o(r(2


3/59

)*+

3


4/59

Referat,

asupra lucrrii de LICEN / DIER!AIE cu te"a #

DETERMINAREA MAR-ERILOR MOLECULARI AI CREIERULUI UMAN

SNTOS I PATOLO$IC PRIN METODE MODERNE %AZATE PE

SPECTROMETRIE DE MAS

ela$%rat de L&'& L(REDANA

Facultatea de Fi)ic, peciali)area# FIZIC MEDICAL

*+ ur"a a+ali)ei lucrrii "ai sus preci)ate specific" ur"t%arele#

- C%+.i+ut tii+.ific

2- Re)ultate e0peri"e+tale / te%retice pr%prii

3-

'r%pu+ +%ta 11111111111 pe+tru lucrare i ca aceast s fie sus.i+ut + fa.a c%"isiei-

C%%rd%+at%r tii+.ific,


5/59

Cupri+s #

I- Aspecte te%retice / C%+sidera.ii te%retice-------------------------------------------------------------------pa4- 56

I-- M%ti7a.ia lucrrii------------------------------------------------------------------------------------------------ pa4-56

I-2- Ca+cerul la creier / 8li%$last%"a "ultif%r"-----------------------------------------------------pa4-59

I-3- pectr%"etria de "as---------------------------------------------------------------------------------------- pa4-5

I-- Met%de "%der+e $a)ate pe spectr%"etria de "as pe+tru a+ali)a $i%"ar:eril%r

ca+cerului la creier ---------------------------------------------------------- -----------------------------------pa4-3

I---8a+4li%)idele---------------------------------------------------------- -------------------------------------pa4-I--2-pectr%"etria de "as aplicat pe 4a+4li%)ide--------------------------------------------pa4-6

II- Materiale i "et%de f%l%site--------------------------------------------------- ------------------------------------pa4-;

II-- Reacti7i i "ateriale---------------------------------------------------------- ----------------------------------pa4-;

II-2- 'r%$ele de 4a+4li%)ide a+ali)ate------------------------------------- ------------------------------------pa4-25

II-3- pectr%"etrul de "as---------------------------------------------------- ------------------------------------pa4-22

II--iste"ul de i+fu)ie cu i%+i)are c%"plet aut%"ati)at pri+ c r%$%tul

Na+%?Mate@ ---------------------------------------------------------- ----------------------------------------------pa4-2;II-- N%"e+clatura---------------------------------------------------------- --------------------------------------------pa4-35

II--- N%"e+clatura 4a+4li%)idel%r------------------------------- ------------------------------------pa4-35

II--2- N%"e+clatura i%+il%r fra4"e+t>4lic%c%+Bu4a.il%r@ --------------------------------- pa4-32

II--3- CuplaBul r%$%tului------------------------------- -----------------------------------------------------pa4-33

III- Re)ultate i discu.ii ----------------------------------------------------------------------------------------------------pa4-36

III-E0peri"e+te de %pti"i)are a spectr%"etrului de "as cu c


6/59

III-2-2- A+ali)a de scree+i+4 pe+tru c


7/59

I. A/!" "or"i! 0 Con/idr(1ii "or"i!

I.+ Mo"iv(1i( 2u!r3rii

Desc%perirea cere$r%)idel%r fcut de !


8/59

fu+c.iile specifice a fiecrei structuri specifice i s l f%l%seasc, + c%+seci+., ca a4e+.i

terapeutici + trata"e+tul $%lil%r i / sau ca "ar:eri de dia4+%sticare specifici-

*+ lucrarea pre)e+tat 4a+4li%)idele ur"ea) s fie a+ali)ate pe+tru caracteri)areac%"p%)i.iei l%r pri7i+d car$%


9/59

!u"%ri de 4rad sc)ut, atu+ci cJ+d de)7%ltarea celulel%r este le+t, de %$icei

tu"%ri $e+i+4+e

!u"%ri de 4rad "are, celulele au % pr%$a$ilitate "ai "are de a se de)7%lta-

E0ist d%u tipuri de creteri a+%r"ale ale celulel%r + c%rpul u"a+- Acestea su+tdefi+ite ca fii+d tu"%ri $e+i4+e sau "ali4+e-

!u"%rile $e+i4+e au + 4e+eral ur"t%arele caracteristici #

!u"%ra se de)7%lt relati7 le+t

Este "ai pu.i+ pr%$a$il s se refac atu+ci cJ+d a f%st eli"i+at, de %$icei pri+

re)ec.ie c 4li%"uri, "e+i+4i%a"e, tu"%ri ale 4la+dei


10/59

&+ pr%ce+t de di+ t%ate tu"%rile cere$rale pri"are su+t 4li%a"e- E0ista 3 tipuri

pri+cipale de 4li%"G9H#

- Astr%cit%"

2- (i4%de+dr%4li%"

3- Epe+di"%"ul

Mai e0ist u+ alt tip de 4li%" +u"it 4li%" +especificat, acesta este tipul de tu"%are +

ca)ul + care tipul +u este clar sau este u+ a"estec de tipuri de celule-

&+ studiu a artat c + tatele &+ite ale A"erici, 6 di+ fiecare 55-555 de a"erica+i

su+t dia4+%stica.i cu u+ tip de tu"%are pri"ar la creier- *+ fiecare a+, apr%0i"ati7 2-555 de

pers%a+e "%r di+ cau)a u+ei tu"%riG;H-

'ra4ul cel "ai frec7e+t de apari.ie a u+ei tu"%rii cere$rale pri"are este de peste 5 de

a+i, +s acestea apar i la c%pii, di+ fiecare 3555 de c%pii "%r a+ual di+ cau)a u+ui astfel de

ca+cer- Aceste tu"%ri su+t % cau) pri+cipal de deces la adul.ii pJ+ + 3 de a+i i la c%pii

su$ a+iGH-

&+ studiu asupra ist%ricului acest%r pacie+.i arat ca ei au a7ut + fa"ilie ca)uri de

ca+cer la creier, u+e%ri c


11/59

Dat%rit faptului c aceast tu"%are se rspJ+dete i se de)7%lt rapid, i du$lea)

di"e+siu+ea la fiecare 6?; )ile, pri"ul si"t%" este presiu+ea i+tercra+ia+ a tu"%rii asupra

.esutului cere$ral- *+trucJt cra+iul +u se p%ate e0pa+da, aceast presiu+e pr%7%ac durere de

cap, care este i+te+sificat di"i+ea.a i este as%ciat cu 7%"itturi- 'ri+tre si"pt%"urile

secu+dare se p%t +u"ara sl$irea "uc


12/59

Dup "ai $i+e de 5 de a+i, + a+ul 3 %lf4a+4 'aul a i+7e+tat capca+a

cuadrup%lar i cuadrup%lar?i%+- Acesta fii+d pre"iat cu 're"iul N%$el + fi)ic- Dup aceat

desc%perire spectr%"etria de "as a luat a"pl%are, desc%periri fii+d fcute "ult "ai rapid-

*+ 6; Malc%l" D%le de)7%lta i%+i)area pri+ electr%spra= c%+te"p%ra+>EI@-

Crearea u+ui aer%s%l + 7id a c%+dus la u+ a$ur, care a f%st c%+siderat prea 4reu pe+tru a fi

practic- Acest desc%perire a f%st ur"at de i%+i)area cA'CI@

di+ 9, "et%d de)7%ltat de O%r+i+4 care se $a)ea) + "are parte pe cr%"at%4rafia +

fa) 4a)%as>8C@, dar aceast "et%d +u a f%st ad%ptat pe scar lar4-

!er"%pul7eri)area a ur"at + a+ul ;3, desc%prire fcut de estal i la:el= pri+

+cl)irea u+ui flu0 de lic


13/59

*+ fi4ura este pre)e+tat u+ e0e"plu de spectru +aite de a +cepe a+ali)a, cele 2 a0e

ale spectrului i cJte7a 7al%ri pe care le p%t lua i+te+sitatea i rap%rtul "/)-

*+ cadrul spectr%"etriei de "as, " este defi+it ca fii+d "as relati7 i ) +u"rul de

particule +crcate- *+trucJt +ici u+a di+tre aceste di"e+siu+i +u are u+itate de "sur, rap%rul

c%+st di+tr?% ca+titate adi"e+si%+alGH-

Calcularea "asel%r diferitel%r "%lecule, at%"i sau i%+i, se p%ate reali)a pri+ diferite

"et%de- Met%da care se f%l%sete cel "ai des este cea care utili)ea) "as +%"i+al sau "as

"%+%i)%t%pic-

'e+tru a calcula "as +%"i+al se calculea) "as i)%t%%pului prep%+dere+t di+

fiecare ele"e+t i se r%tu+Bete la 7al%area apr%piat c%respu+)at%are +u"rului de "as-

!%tui fiecare i)%t%p are u+ defect de "as ec


14/59

I%+i)area pri+ electr%spra= este % "et%d u%ar de i%+i)areG9H, fra4"eatarea pe care

% pr%duce + surs este destul de fi+, astfel +cJt se p%ate f%l%si pe+tru a a+ali)a "%lecule

+e7%latile, i%+ice/+ei%+ice, c%"pui %r4a+ici i a+%r4a+ici- Acestea tre$uie s fie di)%l7ate

e7ide+t +tr?u+ s%l7e+t c%respu+)t%r-

I.. M"od &odrn 4(6(" /!"ro&"ri( &(/3 n"ru (n(2i6( 4io&(r7ri2or

!(n!ru2ui 2( !rir

&+ i"pas + studiul 4a+4li%)idel%r a repre)e+tat a$se+.a u+ei "et%de repr%ducti$ile

pe+tru a putea i%+i)a c%"p%+e.i puri di+ a"estecuri- De?a lu+4ul ti"pului au f%st "ai "ulte

+cercri de a e0tra4e 4a+4li%)ide di+ .esuturi, dar acestea se c%+ta"i+ea) u%r cu i"purit.i

sau lipide-

( pri" "et%d de i%+i)are a 4a+4li%)idel%r di+ creier a f%st reali)ata de Ple+: +

a+ul 2- Acesta a i)%lat % clasa +%u de 4lic%lipide $%4ate + car$%


15/59

Aceste pr%$e de 4a+4li%)ide le?a" pri"it de la Facultatea de Medici+ i Far"acie di+

Za4re$ pri+ a"a$ilitatea pr%f- dr- ZelB:a u:elic-

*+ La$%rat%rul de pectr%"etrie de Mas de la I+stitutul de Materie C%+de+sata di+

!i"is%ara, pr%$ele au f%st pstrate + fri4ider la te"peratura de ?29QC-

4.1 Gangliozidele

a7a+tul 4er"a+ Er+st Ple+: a f%l%sit pe+tru pri"a dat +u"ele de 4a+4li%)id +

a+ul 2- El a i)%lat lipidele celulel%r 4a+4li%+are di+ creierul u"a+, care s?au d%7edid a fi

de fapt cera"ide %li4%4l=c%s=l pr%7e+ite di+ lact%s=cera"ide-

( 4a+4li%)id este u+ c%"pus f%r"at di+tr?% 4lic%sfi+4%lipid>cera"ide i

%li4%)a!LC@, pri+ "et%de i"u+%c


16/59

*+ creierul u"a+ 4a+4li%)idele repre)i+t apr%0i"ati7 5?2 di+ c%+.i+utul t%tal de

lipide- Ele p%t repre)e+ta "a0i" 6 di+ 4reutatea de lipide di+ creier- *+ plus ele su+t

pre)e+te + t%ate .esuturile a+i"ale +tr?u+ stadiu sc)ut, si"ilar cu %li4i4licis%


17/59

8a+4li%)idele particip direct la i+de+tificarea i le4tura direct di+tre celule i la

recu+%terea acest%ra + t%ate i+tera+c.iu+ile "%leculare- De ase"e+ea, 4a+4li%)idele, p%t

"%difica se"+alul de tra+sduc.ie- A+u"ite tipuri de 4a+4li%)ide p%t i+


18/59


19/59

II. M("ri(2 'i &"od fo2o/i"

II.+.R(!"ivi 'i &("ri(2

%l7e+tul f%l%sit, "et


20/59

+cJt s se p%at adau4a s%l7e+t pe+tru a %$.i+e % c%+ce+tra.ie de 25 pic%"%li/ TL- Aceasta a

de7e+it s%lu.ia st%c di+ care ap%i s?a e0tras % ca+titate de 5 TL pe+tu a % dilua- Dilu.ia fi+al

a a7ut pic%"%li/ TL-

Fi4ura # Ce+trifu4

Fi4ura # 'ipet25


21/59

%lu.ia st%c a f%st 7%rte0at pe+tru a eli"i+a prtile de su$sta+. care ar fi putut i+fuda

cer+%+ Oills, Illi+%is, &A@- ite)a

de ce+trifu4are este fi0, 6555 rp"-

'e+tru %$.i+erea s%lu.iil%r pr%$el%r i pe+tru aplicarea acest%ra + plcile de

"icr%titrare s?a utili)at pipete aut%"ate de 5-?5, ?5, 25?255 i 55?555 TL- I%+i)area

c%"plet aut%"ati)at pri+ cAd7i%+ i%scie+ces, It


22/59

*+ c%+ti+uare s?a cart%4rafiat 4a+4li%)idele di+ creierul u"a+ s+t%s i pe cele di+

4li%$last%"a "ultif%r"- *+ ur"a c%"para.iei s?au putut deduce structuri c%"ple0e i

a$era+te + creierul cu 4li%$last%"a "ultif%r" c%"parati7 cu creierul s+t%s-

Fi4ura 6 # I"a4i+e pri+ re)%+a+. "a4+etic +uclear a u+ui creier u"a+ s+t%s pri+

a"a+$ilitatea pr%f-dr- ul:elici

Fi4ura 9 # I"a4i+e pri+ re)%+a+. "a4+etic +uclear a u+ui creier cu 4li%$last%"a

"ultif%r" pri+ a"a+$ilitatea pr%f-dr- ul:elici-

*+ i"a4i+ea di+ fi4ura 6 este pre)e+tat creierul u"a+ s+t%s pri+ i"a4istic

+uclear, + ti"p ce + i"a4i+ea di+ fi4ura ; se p%ate 7edea 4li%$last%"ul, el este difu), aflat

+ l%$ul stJ+4 al creierului u"a+ s+t%s-

22


23/59

II.5 S!"ro&"ru2 d &(/3

-

De)7%ltarea c%+ti+u a aparatel%r "edicale duce la a+ali)a "ai rapid a tutur%r

si"pt%"el%r- i+4ura pr%$le"a cu aceste aparate este c, se p%ate a+ali)a % $%ala, % tu"%are,

a$ia dup ce i?a facut si".it pre)e+.a, cJ+d ,frec7e+t, e prea tJr)iu-

pectr%"etria de "as,fii+d % "et%d pri+ care s?ar putea deduce p%te+.ialul apari.iei

$%lii, tu"%rii, este i ea + c%+ti+u de)7%ltare- *+ ulti"ul dece+iu, u+ pr%4res de%se$it l?a

a7ut desc%perirea siste"el%r "icr%fluidice care duc la a7a+taBe atJt la pacie+.i cJt i la cei

care a+ali)ea) pr%$ele- e reduc c%sturile de a+ali), este +ecesar % ca+titae f%arte "ic de

pr%$ pe+tru a+ali)a i se reduce ti"pul de a+ali)-

Mai "ult decJt atat, acu" t%ate pr%cedurile de la$%rat%r, pre4atirea pr%$el%r,

separarea, purificarea i detectarea, au f%st i+te4rate +tr?u+ si+4ur "icr%ccl%r, de e0e"plu@ saufar s f%r"e)e i%+i >ar4%+, de e0e"plu@- pectr%"etrele de "as fu+c.i%+ea) +t%tdeau+a cu

i%+i p%)iti7i-

Etapa 2# Accelera.ie

I%+ii su+t accelera.i, astfel +cJt t%.i s ai$ aceeai e+er4ie ci+etic-

Etapa 3# De7ia.ia

I%+ii su+t ap%i de7ia.i de u+ cJ"p "a4+etic + fu+c.ie de "asele l%r- Cu cJt su+t "ai

u%ri, cu atJt "ai "ult su+t de7ia.i-23


24/59

Mri"ea s4e.ii depi+de i de +u"rul de sarci+i p%)iti7e pe i%+ ? cu alte cu7i+te, cJ.i

electr%+i au f%st d%$%rJ.i + pri"a etap- Cu cJt se +carc i%+ul "ai "ult, cu atJt "ai "ult

acesta este de7iat-

Etapa # Detectarea

Fasciculul de i%+i trece pri+ detect%r u+de este detectat electric-

Este i"p%rta+t ca i%+ii pr%dui + ca"era de i%+i)are s ai$ % "icare li$er pri+

"ai+, fr a l%7i "%leculele de aer-

'ractic, aceti pai pri+ care trece particula de i%+i)are trece pri+ ur"at%arele etape#

'r%$a 7ap%ri)at trece + ca"era de i%+i)are- %$i+a de "etal +cl)it electric e"ite

electr%+i care su+t atrai la capca+a de electr%+i, care este % plac +crcat p%)iti7-

'r.iculele di+ ea+ti%+ >at%"i sau "%lecule@ su+t, pri+ ur"are, $%"$arda.i cu u+ flu0

de electr%+i, iar u+ele di+tre c%li)iu+i au suficie+t e+er4ie pe+tru a sc%ate u+ul sau "ai "ul.i

electr%+i di+ pr.icule de pr%$ pe+tru a?i face i%+i p%)iti7i-

Cei "ai "ul.i di+tre i%+ii p%)iti7i f%r"a.i 7%r purta % sarci+ de , de%arece este "ult

"ai dificil s sc%te" electr%+i supli"e+tari di+tr?u+ i%+ deBa p%)iti7-

Aceti i%+ii p%)iti7i su+t i"pi+i afar, + restul aparatului de placa care respi+4e i%+i,

care este % alt plac de "etal, care tra+sp%rt % sarci+ p%)iti7 u%ar-

I%+ii p%)iti7i su+t respi+i di+ ca"era de i%+i)are p%)iti7 i tra7ersea) trei fa+te, cea

fi+al fii+d de la 5 7%l.i- Fa+ta de "iBl%c p%art u+ele te+siu+i i+ter"ediare- !%.i i%+ii su+t

accelera.i +tr?u+ fascicul fi+ c%+ce+trat-

I%+i diferi.i su+t de7ia.i de cJ"pul "a4+etic de 7al%ri diferite- Mri"ea s4e.ii

depi+de de#

?"as i%+ului- I%+ii "ai u%ri su+t de7ia.i "ai "ult decJt cei "ai 4rei-

?sarci+a pe i%+- I%+i cu d%u >sau "ai "ulte@ sarci+i p%)iti7e su+t de7ia.i "ai "ult decJt cei

cu d%ar % sarci+ p%)iti7-

Nu"ai i%+i de flu0 aBu+4 la detect%rul de i%+i- Celelal.i i%+i se ci%c+esc cu pere.ii,de u+de se ridic electr%+i i su+t +eutrali)a.i- *+ cele di+ ur", ei 7%r fi sc%i di+

spectr%"etrul de "as de p%"pa de 7id-

Atu+ci cJ+d u+ i%+ l%7ete cutia de "etal, sarci+a sa este +eutrali)at de ctre u+

electr%+ de pe "etal- Acest fe+%"e+ las u+ spa.iu +tre electr%+ii di+ "etal, iar electr%+ii di+

fir se a"estec "preu+ pe+tru a?l u"ple-

&+ flu0 de electr%+i este detectat ase"+t%r u+ui cure+t electric care p%ate fi

a"plificat i +re4istrat- Cu cJt s%sesc "ai "ul.i i%+ii, cu atJt "ai "are este cure+tul-2


25/59

*+ sc%pul a+ali)ei caracteristicil%r "%leculare i+di7iduale, u+ spectr%"etru de "as

tra+sf%r" aceste "%lecule + i%+i, astfel +cJt ele p%t fi "a+ipulate de cJ"puri electrice i

"a4+etice e0teri%are-

F%l%si" acest "et%d dat%rit caracteristicil%r f%arte $u+e a+alitice de "sur i de

%$.i+erea re)ultatel%r %ferite#

@( si"plificare 4e+eral a "surt%ril%r cu EI M

2@ *+ rit" rapid aut%"ati)at

3@ 'erf%r"a+. ridicat

@ ite) f%arte "are de a+ali) i repr%ducti$ilitate

@ e+si$ilitate crescut c%+sidera$il

6@ '%te+.ialul de a desc%peri c%"p%+e+te "i+%re + a"estecuri c%"ple0e >cu" su+t cele

e0trase di+ creier@

9@ Date de calitate ridicat

;@ Eficie+. de i%+i)are crescut

@ Fra4"e+tare + surs redus

5@ Fle0i$ilitate i d%"e+iu "are de aplica$ilitate

@ C%sturi reduse de i"ple"e+tare i a+ali)

2@ '%si$ilitate pe+tru e0peri"e+te +esupra7e4


26/59

Fi4ura ; # Electr%spra= "icr%fluidic +epla+ar cu i+fu)ie r%$%ti)at>R%$%tul Na+%Mate@

'ri+cipiul de fu+c.i%+are al u+ul spectr%"etru de "as G2Heste pre)e+tat + sc


27/59

Dup ce este tri"is + 4a)ul de dis%l7atrare, i%+ul "%lecular sufer fra4"etri- *+

ur"a fra4"e+trii p%ate re)ulta, fie u+ radical i u+ i%+ cu +u"r par de electr%+i, sau %

"%lecul i u+ +%u cati%+ radical- Acest lucru se +tJ"pl de%arece se fra4"e+tea) u+

radical care are u+ +u"ar i+par de electr%+i-

e p%ate f%r"a u+ ciclu de fra4"e+tare, de%arece fiecare i%+ pri"ar deri7at di+ i%+ul

"%lecular p%ate fii supus fra4"e+trii, dar aceste d%u tipuri de i%+i au pr%piet.i c


28/59

"/e ] F2r2/2

*+ c%+seci+., dac 7arie" p%te+.ialul i i+te+sitatea cJ"pului "a4+etic, i%+ii 7%r

satisface aceast ecua.ie i 7%r putea aBu+4e la detect%r, astfel se pr%duce u+ cure+t de i%+i-

al%area acestui cure+t este f%arte "ic, + c%+seci+. aceasta tre$uie a"plificat-

'e+tru a a"plifica cure+tul i%+ic se f%l%sete detect%rul care i +re4istrea) aceti

cure+.ii + %rdi+e cresct%are a rap%rtului "as pe sarci+-

Fi4ura 5# c


29/59

II..Si/"&u2 d infu6i !u ioni6(r !o&2" (u"o&("i6(" rin !9i2!"ro/r(:

; ro4o"u2 N(no#M("stJ+4a@ cu spectr%"etrul de "as cu capca+ i%+ic

>OC! M@ >dreapta@-

iste"ul r%$%ti)at Na+%?Mate c%"plet aut%"ati)at cu c


30/59

pipetei c%+ducti7e i a difere+.ei de p%te+.ial di+ c


31/59

II.=.No&n!2("ur(

II.5.1. Nomenclatura gangliozidelor

!e"e+ul de +%"e+clatur repre)i+t ter"e+ul f%l%sit pe+tru +u"irea c%"puil%r

c


32/59

'e+tru a se putea +tele4e ce s?a "surat aceste specii de 4a+4li%)ide au ur"t%area

+%"e+claturG2;H, + care M +sea"+ +u"rul de u+itati de acid sialic >NeuAc@, 8M

"%+%sial%, 8D disial% , 8! trisial% iar +r 3,2, arat practic lu+4i"ea la+.ului )aNeuAc3@8al^8lcCer 8M2

8al^38alNAc^>NeuAc3@8al^8lcCer 8Ma

NeuAc38al^38alNAc^8al^8lcCer 8M$

NeuAc;NeuAc38al^8lcCer 8D3

8alNAc^>NeuAc;NeuAc 3@8al^8lcCer 8D2

NeuAc38al^38alNAc^>NeuAc3@8al^8lcCer 8Da

8al^38alNAc^>NeuAc;NeuAc3@8al^8lcCer 8D$

NeuAc;NeuAc38al^38alNAc^>NeuAc3@8al^8lcCer 8!a

NeuAc38al^38alNAc^>NeuAc;NeuAc3@8al^8lcCer 8!$

8al^38alNAc^>NeuAc;NeuAc;NeuAc3@8al^8lcCer 8!c

NeuAc;NeuAc38al^38alNAc^>NeuAc;Neuc3@8al^8lcCer 8$

e p%ate %$ser7a cu" arat structurile 4a+4i%)idel%r i care este difere+.a +tre specii-Aceast 7aria$ilitate de c%+stituire "%lecular d +atere la u+ +u"r "are de specii

clasificate + serie de %li4%)a


33/59

II.5.2. Nomenclatura ionilor fragment (glicoconjugailor

E0ist 3 tipuri de i%+i fu+da"e+tali utili)a.i + cadrul spectr%"e+triei de "as#

I%+ M%lecular # i%+ul care d "as "%lecular a c%"pusului

I%+ de Fra4"e+tare # i%+ul care apare + ur"a fra4"e+trii i%+ului precurs%r

I%+ de Reara+Bare # i%+ul p%)iti7 care apare + ur"a i)%"eri)rii i%+ului "%lecular de

%ri4i+e sau a u+ui i%+ fra4"e+t

I%+i fra4"e+t apar dat%rit tra+sf%r"ril%r i%+ului "%lecular de %ri4i+e- Nu"rul

i%+il%r fra4"e+t depi+de de c%+di.i%area ci+etic >7ite)a reac.iei de fra4"e+tare@ i dec%+di.i%+area ter"i+c >sta$ilitatea structurii@-

8lic%c%+Bu4a.iG35H su+t f%r"a.i di+ %li4%? i p%li4lucide care su+t cuplate cu structuri

pr%teice sau lipidice- Fra+c%is ac%$ a afir"at # W"preu+ cu aci)ii +ucleici i pr%tei+ele ,


34/59

Fi4ura 2 # N%"e+clatura i%+il%r fra4"e+t de car$%5?55+l/"i+@ + siste" aut%"at, + plus siste"ul are ca

i c%"p%+e+t pri+cipal u+ c


35/59

C9i. no662

Ro4o"

Fi4ura 3 # C


36/59

Dista+.a care defi+ete cJ"pul electric este de ap%0i"ati7 555 de %ri "ai "ic decJt

dista+.a di+tre %rificiu i spectr%"etrul de "as- 'ri+ ur"are p%)i.ia spectr%"etrului de "as

i 7%ltaB, care erau cruciale pe+tru tra+sferul de i%+i + a+ali)%r, +u "ai B%ac +ici u+ r%l +

f%r"area c


37/59

III. R6u2"(" 'i di/!u1ii

III.+ E>ri&n" d o"i&i6(r ( /!"ro&"ru2ui d &(/3 !u !9i n(no#

2!"ro/r(: n"ru (n(2i6( 8(n82io6id2or

*+ 7ederea %$.i+eri u+%r re)ultate cJt "ai e0acte la a+ali)a ea+ti%a+el%r de4li%$last%"a "ultif%r", tre$uie ca asupra sectr%"etrului s se efectue)e u+ +u"r de

e0peri"e+te de %pti"i)are- 'e+tru u+ spectru cJt "ai c%rect, i+terpreta$il se utili)ea) %

pr%$ de "aterial cu+%scut, ap%i se cali$rea) aparatul- e p%t "%difica# s%l7e+tul, te+siu+ea

pe c%+traelectr%d, +u"rul de sca+ri i "%dul, p%)iti7 sau +e4ati7-

Ca+titatea de .esut prelucrat di+ 4li%$last%" a f%st cJ+trit cu aBut%rul u+ui cJ+tar de

la$%rat%r- ?a cJ+trit u+ tu$ epe+d%rf fr su$sta+., ap%i cel cu su$sta+. i s?a calculat

ca+titatea de .esut pri+ difere+.a de "as di+tre cele d%u-

*+ ur"a deter"i+rii ca+tit.ii de su$sta+., ea+ti%+ul a f%st di)%l7at + "eta+%l-

Dup acest pas, s?a 7%rte0at i ce+trifu4at pe+tru a %$.i+e % s%lu.ie st%c de 555 p"/Tl-

%lu.ia st%c s?a pastrat + fri4ider ti"p de 9 )ile la te"peratura de ?29 %C-

!%tui pe+tru a putea utili)a pr%$a + spectr%"etru de "as acesta c%+ce+tra.ie este

"ult prea "are, de aceea acesta se diluea) cu "eta+%l pJ+ la %$.i+erea u+ei c%+ce+tra.ii de

p"/Tl-

pectr%"etria de "as cu c


38/59

143.3

233.2

283.4369.5

599.5

804.1

885.7 1077.7

1573.2

-MS, 0.1-8.1min #(4-249)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

4x10

Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z

structura c%"p%+e+tel%r acestei tu"%ri, pe+tru a putea 4si p%te+.iali "ar:eri de dia4+%stic

sau "%lecule .i+t specifice-

'ri+ %pti"i)area para"etril%r spectr%"etrului de "as s?au putut a+ali)a ur"t%arele

tipuri de 4a+4li%)ide # 8M, 8D i 8!-

III.1.1.!naliza fraciunii standard de tip G"1

'J+ + a+ul 255, ;; de specii de 4a+4li%)ide au f%st cart%4rafiate pe+tru 7erte$rate,

cea "ai c%"u+ specie di+tre 4a+4li%)idele "%+%sialilate fii+d 8M sau NeuAc2?3>8al?

38alNAc?@8al?8lcCer- Acest tip de 4a+4li%)id c%+.i+e acid sialic + ca+titateredus i are pr%piet.i fi)i%l%4ice + "eca+is"ele de reparare i de eli$erarea de

+eur%tr%p25#@ "as 93

3;


39/59

Fi4ura # pectrul de "as a speciei de "%+%sial%tetra%se pri+ +a+%?EI?c


40/59

*+ fi4ura 6 este pre)e+tat spectrul u+ei frac.iu+i 8Da di+ creierul u"a+- I+ter7alul

de "as selectat pe+tru a fi pre)e+tat + aceast fi4ur este u+ul e0tre" de "ic >6?2 "/)@

pe+tru a putea 7i)uali)a picurile i)%t%pice i a putea sta$ili starea de +crcare a fiecrui i%+-

Dup cu" se %$ser7 acest tip de 4a+4li%)id apare la picurile cu 7al%rile de 9-;, ;- ,

3-6 i 32-5- Difere+.a de u+it.i di+tre cele d%u picuri se dat%rea) faptului c i%+i

a+ali)a.i su+t du$lu +crca.i e p%ate %$ser7a c dei i+tru"e+telul f%l%sit are % re)%lu.ie

relati7 B%as, fii+d u+ spectr%"etru de "as de tip capca+ i%+ic, t%tui se p%t disti+4e

i)%t%pi, care i+dic % stare de +crcare du$ludepr%t%+at pe+tru a"$ele specii, atJt la 9-;

cJt i la 3-6-

-

Fi4ura 6 # pectrul de "as pe+tru 4a+4li%)ide de tip 8D

Di+ acest aspect deduce" faptul ca "as i%+il%r pre)e+ta.i este de fapt de d%u %ri "ai

"are decJt "as "asurat -Astfel#>"?2O@/2 ] 6 ]b" ] >2 0 6@Y2O ] 206Y2] ;36" ] >3202@Y2O ] ;66e %$ser7 ca pr%$a de 4a+4li%)ide de tip 8D +u este u+itar dat%rit difere+.ei

di+tre "asele cel%r d%u picuri de 2;- Ele su+t diferite d%ar pri+ +atura acidului 4ras i au

aceeasi sec7e+. 4lucidic-5


41/59

917.8

931.8

1077.7

-MS, 0.1-3.9min #(5-162)

0

1

2

3

4

5

6

5x10

Intens.

700 800 900 1000 1100 1200 m/z

'e+tru a putea calcula c%"p%)i.ia u+ei 4a+4li%)ide "ai +tJi c%+sider % cera"id de

tip ;#/;#- e tie di+ literat ca "as "%lecular a acesteia este de 63-Di+ structura 4a+4li%)idei de tip 8D se p%ate calcula "as "%lecular pe+tru cele

d%u picuri f%l%si+d ur"t%area l%4ic# se adu+ "asele "%leculare ale c%"p%+e+tel%r

"%+%)a+ rap%rt cu structura 8Da@ difer pri+ p%)i.i%+area acidului sialic- Astfel a"$ele resturi de

aci)i sialici su+t le4ate la 4alact%)a di+ i+teri%rul cate+ei-e p%t %ser7a 2 4a+4li%)ide c%respu+)t%are cel%r 2 picuri, acestea repre)i+t

i%+i dulu +crca.i-


42/59

OH

H

O

H

HOH

H

H2

O

HO

O

OH

H

H

O

H

H!H

H

H2

O

OH

O H

H

OH

HH

H!

H

OH3

H

HO OH

O

O-O

H

H

H

HO

HOH2

H

H!H3

O

H

H

HO

HOH2

HO

H

O-O

H3

O

O

OH

H

HO

H

H

H

H2

OH

HO

HO

O

OH

H

OH

H

H

OH

H

H2

O-e"

HO

Fi4ura ;#tructura 4a+4li%)idei de tip 8D$

OH

H

O

H

HOH

H

H2

O

HO

O

OH

H

H

O

H

H!H

H

H2

O

OH

O H

H

OH

HH

H!

H

OH3

H

HHO

OHHOH2

O-O

H3

O

O

OH

H

HO

H

H

H

H2

OH

HO

O

O-O

H

H

HOH

H!H3

O

H

H

HO

HOH2

HO

H

O

O

OH

H

OH

H

H

OH

H

H2

O-e"

HO

Fi4ura - tructura 4a+4li%)idei de tip 8Da

*+ fi4urile ; i se p%ate %$ser7a difere+.ele di+tre cele d%u tipuri de 4a+4li%)ide

8D a i 8D $-

III.+.5.An(2i6( fr(!1iunii /"(nd(rd d "i $T+

2


43/59

'e+tru picurile structurii 8! s?a de"%+strat, pri+ calcule, c difetre+.a di+tre cele

d%u 4a+4li%)ide este t%t la acidul 4ras- tructura acestei 4a+4li%)ide >8!@ este pre)e+tat +

fi4ura 25-

Fi4ura 25

#tructura

4a+4l%)idei

de tip 8!G33H

OH

H

OH

HOH

H

H2

O

HO

O

OH

H

H

O

H

H!H

H

H2

O

OH

O H

H

OH

HH

H!

H

OH3

H

HO

OHO

O-O

H

H

H

HO

HOH2

H

H!H3

O

H

H

HO

HOH2

HO

H

O-O

H3

O

O

OH

H

HO

H

H

H

H2

OH

HO

O

O-O

H

H

HOH

H!H3

O

H

H

HO

HOH2

HO

H

O

O

OH

H

OH

H

H

OH

H

H2

O-e"

HO

Fi4ura 2 # tructura i sc


44/59

pectr%"etria de "as a aprut rece+t ca p%si$il i+tru"e+t de i+de+tificare a

%$iecti7el%r terapeutice, a $i%"ar:eril%r pe+tru terapii +%i- e cu+%ate faptul c re)ec.ia

c


45/59

Fi4ura 2 #pectrul de 4a+4li%)ide di+ 4li%$last%"a "ultif%r"

*+ fi4ura 2 a" 4sit f%r"e ale 4a+4li%)idel%r di+ 4li%$last%"a "ultif%r" de tipul

8M >-@i 8D>;36-5 @, f%l%si+d % c%+ce+tra.ie de p"%l/Tl + "et


46/59

'ri+ lucrarea de fa. s?a ur"rit utili)area acest%r "et%de a7a+sate de spectr%"etrie de

"as pe+tru a defi+ii $i%"ar:eril%r "%leculari di+ 4li%$last%"a "ultif%r" , cu % ate+.ie

special asupra 4a+4li%)idei de tip 8M pe care a" d%7edit?% a fi u+ui di+tre acesti

$i%"ar:eri-*+ fi4ura este pre)e+tat u+ spectru al 4a+4li%)idel%r di+ tu"%are + care se p%t

%ser7a picuri

!a$elul 2

-

Fi4ura 22 #pe+trul de "as pe+tru 4a+4li%)ide di+ 4li%$last%"ul "ultif%r" de tip 8M,8D2

&06 S"ru!"ur( rou/3

- 8M> d ;#/;#5@

92-6 8M > d ;#/25#5@;36-5 8D > d ;#/;#5@

;6-5; U

6


47/59

"/) tructura pr%pus

2-5 (?Ac?8D3 >d ;#/;#@

95-5; 8M > d ;#/25#2@

9- 8M > d ;#/25#5@

92-5 8M > d ;#5/25#5@

6;9- 8D2 > d ;#/2#@

!a$elul 3

Figura 23 : Spectrul de mas cu infuzie prin robot NanoMate al extrasului

nativ de gangliozide din esut tumoral de tip glioblastoma multiform

9


48/59

!a$elul

AtJt + fi4ura 22 cJt i + fi4ura 23 s?au 4sit "ult "ai "ulte specii de tip 8M3, 8D3,

8D2, 8D, a+e0ate fiecare + ta$ele pe+tru a putea face a+ali)a c%"patari7 cu 4a+4li%)idele

di+ .esutul cere$ral s+at%s- Aceste 7al%ri au f%st calculate i a+ali)ate pe+tru a ati+4e sc%pul

acestui studiu, adic 4sirea speciil%r de 4a+4li%)ide care su+t "ar:eri "%leculari-

*+ ur"a c%"para.iei cu .esutul u"a+ s+at%s s?a putut %$se7a, c + ca)ul

4li%$last%"ului "ultif%r" apar "ai "ulte specii de tip 8D2, specii %acelitate i fr parte de

)a


49/59

III.2.1.!naliza de screening pentru c$ip Nano"ate %&' "S a esutului sntos

De)7%ltarea de surse de i%+i)are MALDI cu ti"p?de?)$%r >!(F@, u+ tip de

i+stru"e+te?uadr%p%l %rt%4%+al, i?a "$u+t.it selec.ia precurs%ril%r i%+ici + "%d

su$sta+.ial- F%l%si+d MALDI %!(F M, este p%si$il s se %$.i+ u+ pr%dus de i%+i spectru

CID M / M al u+ui )a


50/59

m/z

3 x

1 x

5 x

1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200

10 x

GM3

(18:1/18:0)1179.72 GM2

(18:1/20:0)

(18:1/18:0)

1382.804GM3

(18:1/20:0)

1207.758 1410.832

GD3 (18:1/20:0)

(18:1/18:0)

1470.814

O-Ac-GD3

(18:1/18:0)

1512.826

GM1(18:1/18:0)

1544.850

(18:1/20:0)

1572.871

GD2

(18:1/18:0)

1673.866

(18:1/20:0)

1718.919

Fuc-GM1

(18:1/18:0)1690.892

GalNAc-

GM1(18/18)1747.92

GD1

(18:1/18:0)

1835.933

(18:1/20:0)1863.953

O-Ac-nLD1

(18:1/18:0)

1877.937

(18:1/20:0)

1905.973

Fuc-GD1

(18:1/18:0)

1982.969

(18:1/20:0)

2010.022

GT1

(18:1/18:0)

(18:1/20:0)

2127.015 2155.009

GD1

GM1

Fuc-GM1

1-

1-

1-

1-

1-

1-

1-

1-

1-

1-

1-

1-

1-

1-

1-

Fi4ura 2 # pectrul de "as cu i+fu)ie pri+ r%$%t Na+%Mate al e0trasului +ati7 de

4a+4li%)ide di+ creier u"a+ adult +%r"al

&06 S"ru!"ur( rou/3

9-92 8M3>;#/;#5@

259-9; 8M3>;#/25#5@ 3;2-;5 8M2 >;#/25#5@

5-;32 8M2>;#/;#5@

95-; 8D3 >;#/;#5@

2-;26 (?Ac?8D3 >;#/;#5@

-;5 8M >;#/;#5@

92-;9 8M >;#/25#5@

693-;66 8D2 >;#/;#5@

65-;2 Fuc?8M >;#/;#5@

9;- Fuc?8M >;#/25#5@

;3-33 8D >;#/;#5@

;63-3 8D >;#/25#5@

;99-39 (?Ac?+LD >;#/;#5@

!a$elul

5


51/59

*+ scree+i+4ul c%"parati7 pe+tru e0presiile 4a+4li%)idel%r di+ .esutul cere$ral s+t%s

i cel pat%l%4ic a" ide+tificat faptul c su+t "ult "ai "ulte specii i c su+t structuri "ai

c%"ple0e de tip 8M2 ,8D3 c


52/59

De%arece c%+.i+utul de i+f%r"a.ii di+ spectrele de "as pr%duse de i%+i depi+de + "are

"sur de starea i%+ului precurs%r, este i"p%rta+t s se e0a"i+e)e i+f%r"a.iile disp%+i$ile +

acest d%"e+iu-

Fi4ura 2 #A+ali)a structural pri+ ta+de" M >M/M@ a speciei "ar:er tu"%ral de

tip 8D2 >d;#/;#5@*+ fi4ura 2 este pre)i+tat structura 4a+4li%)idei de tip 8D2- Aceast a" a+ali)at?%

pri+ ta+de" , fra4"e+tat?% i i?a" pre)e+tat structura, + fi4ura 2 dreapta sus-

pectrele de "as cu i%+i pr%dui di+ 4lic%c%+Bu4a.i su+t "ult "ai c%"plicate decJt

su+t cele de la peptide di+ cau)a structurii l%r ra"ificare- 'e+tru astfel de structuri ra"ificate,

fra4"e+tarea are l%c de la captul +ereduct%r al fiecrei a+te+e i pe+tru a d +atere la %

c%"ple0itate "ai "are de la captul reduct%r- I+tr%ducerea e+er4iei + "%lecula de c%li)iu+e

este cel "ai pr%$a$il s rup le4tura si"pl di+ le4turile 4lic%)idice- &tili)area c%li)i+ii

i+dus pri+ dis%ciere>CID@cu e+er4ie redus, pr%$ailitatea fra4"e+trii le4turi 4lic%)idice

este "ult "ai pr%$a$il fra4"e+tarea di+tre i+elele de )a


53/59

pre)i+t + "ai "ulte ca)uri "%dele ale i%+il%r pr%dui disti+cte, de%arece "ediile sterice

difer +tre i)%"eri i duce la diferite e+er4ii de le4tur i a$u+de+.a de i%+i + spectre de

"as-

3


54/59

IV. Con!2u6ii 'i r/!"iv

*+ aceast lucrare a" a+ali)at 4a+4li%)idele di+tr?% tu"%are de tip 4li%$last%"a

"ultif%r"- 'ractic 7%r$esc despre deter"i+area "%delului i structurii 4a+4li%)idel%r di+

ca+cerul la creier i ide+tificarea speciil%r as%ciate $%liil%r, + ca)ul "eu particular este 7%r$a

de 4li%$last%"a "ultif%r"-

'ri+ f%l%sirea spectr%"etrului de "as cu c


55/59

Datele %$!i+ute i+dic $e+eficiile de utili)are a "et%del%r ultra?se+si$ile i de +alt

perf%r"a+! a spectr%"etria de "as + deter"i+area c%"p%)i!ie "%dificate de 4a+4li%)ide

di+ creier, precu" i + desc%perirea de +%i structuri di+ !esutul tu"%ral, + sc%pul de a

fur+i)a "ar:eri $i%c


56/59

V. %i42io8r(fi

GH nnifr $riffi"9/, ABrief History of Mass Spectrometry, An(2. C9&.,)**B

G2H LAR ENNERO(LM, The gangliosides, Depart"e+t %f Medical i%c


57/59

G3H8ar= iu=da:,Mic

, 2559?255;

G6H M- Pi+ter, N- E-


58/59

G22 u:eliS et al-,Hman gliosarcoma+associated ganglioside composition is comple> and

distincti%e as e%idenced by high+performance mass spectrometric determination and

strctral characterization,>2559@

G23H A2>(ndr( %ond(rn7o,Andr(/ L/!9, %(o9on8 Liu,E2n( To4o27in(,or/"

Pi!7,or/" Vo82, Li(n8 i(o,u4r" . $ir(u2",i(oGin Z9on8 ,4lectrostatic Spray

2onization Mass Spectrometry, I"a4i+4,An(2. C9&.,)*+

G2H

line capillary electrophoresis/electrospray ionization+=adrpole time of flight+tandem mass

spectrometry approach for ganglioside analysis, Electr%p


59/59

G32H Ali+a D- Za"fir, Ou$ert O- 8irault, as+a 'eter?Patali+ic, Laura i+dila, Mar: Alle+,

Niels Li%+, "hip electrospray mass spectrometry for carbohydrate analysis,Electr%ptran, Rapid C%""u+- Mass pectr%"-

2556

lucrare de licenta- lupu loredana

Documents