LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES

VETERINARY ACADEMY

Kristina Kęstaitienė

EPIDEMIOLOGY, DETECTION AND

PREVENTION OF BOVINE PARAINFLUENZA-3

AND RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS

INFECTIONS IN LITHUANIA

Summary of Doctoral Dissertation

Agricultural Sciences, Veterinary (02A)

Kaunas 2014

The dissertation was prepared in 2007–2013 at the Veterinary Academy

of the Lithuanian University of Health Sciences.

Scientific supervisor – Prof. Dr. Algirdas Šalomskas (Lithuanian

University of Health Sciences Veterinary Academy, Agricultural Sciences,

Veterinary – 02A).

Council of Veterinary Research:

Chairman – Prof. Dr. Albina Aniulienė (Lithuanian University of

Health Sciences Veterinary Academy, Agricultural Sciences, Veterinary –

02A).

Members:

Dr. Raimundas Mockeliūnas (Institute of Microbiology and Virology

of the Lithuanian University of Health Sciences; Agricultural Sciences,

Veterinary – 02A);

Doc. Dr. Arūnas Stankevičius (Lithuanian University of Health

Sciences Veterinary Academy, Agricultural Sciences, Veterinary– 02A);

Prof. Hab. Dr. Aniolas Sruoga (Vytautas Magnus University;

Biomedical Sciences, Biology – 01B);

Doc. Dr. Antanas Šarkinas (Food Institute of the Kaunas University of

Technology, Technological Sciences, Chemical Engineering – 05T).

Opponents:

Prof. Dr. Jūratė Šiugždaitė (Lithuanian University of Health Sciences

Veterinary Academy, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A);

Dr. Mykolas Mauricas (State Research Institute Center for Innovative

Medicine, Biomedical Sciences, Biology – 01B).

Public defence of doctoral dissertation in Veterinary Science Council

will take place at the Lithuanian University of Health Sciences Veterinary

Academy Dr. S. Jankauskas auditorium at 2 p.m. on 26th of September, 2014.

Address: Tilžės 18, LT-47181 Kaunas, Lithuania.

The summary of the dissertation was distributed to the approved list of

addresses on 26th of August, 2014.

The dissertation is available in the library of the Veterinary Academy of

the Lithuanian University of Health Sciences (Tilžės 18, LT-47181, Kaunas,

Lithuania).

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

VETERINARIJOS AKADEMIJA

Kristina Kęstaitienė

GALVIJŲ PARAGRIPO-3 IR RESPIRACINIO

SINCITINIO VIRUSŲ INFEKCIJŲ

EPIDEMIOLOGINĖ SITUACIJA, DIAGNOSTIKA

IR PREVENCIJA LIETUVOJE

Daktaro disertacijos santrauka

Žemės ūkio mokslai, veterinarija (02 A)

Kaunas 2014

Disertacija rengta 2007–2013 metais Lietuvos sveikatos mokslų

universiteto Veterinarijos akademijoje.

Mokslinis vadovas – prof. dr. Algirdas Šalomskas (Lietuvos sveikatos

mokslų universitetas Veterinarijos akademija, žemės ūkio mokslai,

veterinarija – 02A).

Veterinarijos mokslo krypties taryba:

Pirmininkė – prof. dr. Albina Aniulienė (Lietuvos sveikatos mokslų

universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A).

Nariai:

dr. Raimundas Mockeliūnas (Lietuvos sveikatos mokslų universiteto

Mikrobiologijos ir virusologijos institutas, žemės ūkio mokslai, veterinarija

– 02A);

doc. dr. Arūnas Stankevičius (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas,

Veterinarijos akademija, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A);

prof. habil. dr. Aniolas Sruoga (Vytauto Didžiojo universitetas,

biomedicinos mokslai, biologija – 01B);

doc. dr. Antanas Šarkinas (Kauno technologijos universitetas, Maisto

institutas, technologijos mokslai, chemijos inžinerija – 05T).

Oponentai:

prof. dr. Jūratė Šiugždaitė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas,

Veterinarijos akademija, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A);

dr. Mykolas Mauricas (Valstybinis mokslinių tyrimų institutas,

Inovatyvios medicinos centras, biomedicinos mokslai, biologija – 01B).

Disertacija bus ginama viešame Veterinarinės medicinos mokslo

krypties tarybos posėdyje 2014 m. rugsėjo 26 d. 14 val. Lietuvos sveikatos

mokslų universiteto Veterinarijos akademijos dr. S. Jankausko auditorijoje

(Tilžės g. 18, LT–47181 Kaunas).

Disertacijos santrauka išsiųsta 2014 rugpjūčio 26 d. pagal patvirtintą

adresų sąrašą.

Su disertacija galima susipažinti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto

Veterinarijos akademijos bibliotekoje (Tilžės g. 18, 47181, Kaunas).

5

1. INTRODUCTION

Respiratory diseases are a common cause of illness in calves in all

countries with cattle industry. They are the principal cause of economic loss

both in dairy and beef industries (Smith, 2000; Van der Fels–Klerx et al.,

2001). Foreign and Lithuanian researches show that bronchopneumonia of

calves, otherwise enzootic pneumonia, occurs for a number of reasons why

this disease generally known as the bovine respiratory disease (BRD)

complex (Hagglund, 2005).

Studying the bovine respiratory diseases in calves researchers have

found out that parainfluenza-3 (PI-3) and respiratory syncytial (RS) viruses

and, somewhat more seldom, infectious bovine rhinothracheitis (IBR)

viruses, adenoviruses, coronaviruses and Mycoplasma spp. are the main

agents of the BRD complex (Storz et al., 2000; Šiugždaitė, 2002; Snowder

et al., 2006; Autio et al., 2007). Commonly viruses are found simultaneously

with bacteria, such as Manheimia hemolytica, Pasteurella multocida,

Haemophilus somnus, Salmonella dublin and Arcanobacterium pyogenes.

The BRD complex includes a few syndromes of different epidemiology.

This complex is characterised by different clinical symptoms and

epidemiological features (Radostits et al., 2000).

Respiratory diseases may occur in cattle of different age yet is most

common in young calves when the passive immunity is reduced and the

active immunity is not yet developed (Radostits et al., 2000). The BRD

complex is distinguished for its seasonal character: the respiratory diseases

usually occur in cold seasons. However, the diseases also may occur in the

summer, especially under the humid and cool weather conditions

(Mockeliūnas et al., 2005; Hagglund, 2005).

In the assessment of individual agents of BRD complex, parainfluenza-3

and respiratory syncytial viruses should be distinguished for their important

aetiological role (Elvander, 1996; Larsen, 2000; Autio et al., 2007).

The bovine parainfluenza-3 agents are single stranded RNA viruses from

Paramixoviridae family Respirovirus genus. The bovine PI-3 virus is

genetically comparable but not identical with human and sheep PI-3 viruses

(Henrickson, 2003). The circulating PI-3 viruses in a herd always pose

threat of the outbreak of respiratory diseases as viruses create favourable

conditions for the secondary bacterial infections; thus cattle may get

infected with mycoplasma and other pathogens. The presence of this agent

in a herd may not manifest in clinical signs until favourable ambient

conditions and other pathogens occur. Commonly animals infected with PI-

3 experience mild clinical signs; cases of animal death are rather rare. Often

PI-3 virus become active along with infectious bovine rhinotracheitis,

6

bovine viral diarrhoea and RS viruses, Pasteurella multocida and

Haemophilus somnus (Cusack et al., 2003; Autio et al., 2007; Calderon et al.,

2007; Griffin et al., 2010).

Bovine respiratory syncytial virus (RS) is a single stranded RNA virus

from the Paramixoviridae family Pneumovirus genus. The RS virus is

widespread over the world among cattle, sheep, goats and other animals

(Eatson et al., 2004). The same as PI-3 agent RS viruses prime the

respiratory diseases and is usually found together with other pathogens

(O’Neill et al., 2006; Valarcher et al., 2006). The disease commonly

manifests in calves before six months of age yet its outbreaks are possible in

herds of adult animals as well (Patel, Didlick, 2004).

The bovine respiratory syncytial and parainfluenza-3 viruses are

especially relevant for the Lithuanian cattle herds as they can induce the

disease outbreaks both in calves and adult animals (Šalomskas et al., 2008).

The diseases caused by the mentioned agents and the inflicted damage to the

Lithuanian farms have not been investigated and in the last ten years there

has appeared not a single publication on this issue. This is a weighty reason

to analyse and go deeper into the extent of the incidence of these viral

infections in the Lithuanian cattle farms and to identify the agents using

different diagnostic methods at the same time devoting special attention to

preventive measures and their practical application.

The main objective of the present dissertation

To carry out epidemiological investigations of PI-3 and RS viral

infections in the Lithuanian cattle farms, to establish the duration of passive

and active immunity and to find out the possibilities of immune response

using different routes of vaccination.

Goals of the study

1. To determine the prevalence of bovine PI-3 and RS viruses in the

Lithuanian cattle farms.

2. To compare the prevalence of bovine PI-3 and RS viral infections

with the prevalence of other cattle–relevant viral diseases at Lithuanian

cattle farms.

3. To determine the geographical distribution patterns for PI-3 and RS

viruses.

4. To conduct comparative analysis of laboratory diagnostic methods for

PI-3 and RS viral infections.

5. To investigate the dynamics and duration of colostral immunity to

bovine PI-3 and RS viruses and its influence on the morbidity of calves.

7

6. To conduct a comparative investigation of different routes of

vaccination – intramuscular (IM) and intradermal (ID) – and different doses.

Scientific importance and novelty of research

1. The prevalence and epidemiological peculiarities of PI-3 and RS

viruses in the Lithuanian cattle farms were determined.

2. A comparative analysis prevalence of bovine PI-3, RS, IBR and BVD

viral infections was conducted.

3. A comparative assessment of various diagnostic investigations was

performed.

4. The seroprevalence of bovine PI-3 and RS viral infections in the

Lithuanian counties was determined.

5. The duration of passive colostral immunity to bovine PI-3 and RS

viruses and its influence on morbidity of calves was determined.

6. It was determined that ID vaccination against PI-3 and RS viral

infections is effective and easily accomplished.

Practical importance

1. It was determined that the main agents of respiratory diseases in the

Lithuanian cattle herds are PI-3 and RS viruses.

2. It was proved that combined employment of Enzyme linked

immunosorbent assay (ELISA Ab) reaction and polymerase chain reaction

(PCR) methods can guarantee a prompt and effective identification of PI-3

and RS viral infections in cattle herds.

3. The duration of passive colostral immunity, which is important in

veterinary practice for development of vaccination programmes against PI-3

and RS infections, was determined.

4. It was found out that the intradermal (ID) vaccination against PI-3 and

RS viral infections may be as an alternative for the common vaccination

routes.

5. A memo of differential diagnostics of bovine respiratory diseases and

other economically important diseases was developed for veterinary

surgeons.

2. MATERIALS AND METHODS

The doctoral research was carried out in six phases. The first phase

included the epidemiological investigations of RS and PI-3 viruses for

determining the serological incidence of the mentioned agents in the

Lithuanian cattle population. Also the serological incidence of PI-3 and RS

viruses in two chosen cattle farms with similar cattle rearing technologies

8

was analysed in detail using Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

and hemagglutination binding reactions. The blood samples for laboratory

analysis of bovine PI-3 and RS viruses were taken from the cattle herds of

15 Lithuanian farms in 9 districts. The chosen farms had histories of the

symptoms characteristic of bronchopneumonia. A total of 347 single blood

samples were examined for antibodies against PI-3 and RS viruses. For

determining the spread trends of PI-3 and RS viruses, the results obtained

during the investigations carried out in 2006–2007 were analysed. A total of

935 blood sample data from 36 farms were analysed for antibodies against

PI-3 viruses and 905 from 33 farms for RS viruses.

The second phase was devoted to comparison of bovine PI-3 and RS

viral infections versus other relevant bovine viral infections in Lithuania.

The investigation of the spread of IBR, PI-3, RS and BVD viruses was

conducted by ELISA. For this purpose, 553 blood samples were examined

for antibodies against PI-3 and BVD viruses and 538 samples for antibodies

against RS and IBR viruses. The incidence of these viruses was investigated

in 20 farms from 11 districts holding more than 200 head of cattle.

During the third phase of the present research, the geographical

distribution of PI-3 and RS viruses in the Lithuanian cattle farms was

determined. For this purpose, in 2006–2013, 2225 blood samples were

serologically tested for PI-3 virus and 2142 samples for RS virus.

In the fourth phase, the identification of PI-3 virus in the clinical

material was performed by ELISA whereas for RNA detection of RS virus

by reverse transcription polymerase chain reaction (RT–PCR). A total of 96

samples of pathological material (nasal discharges) were collected from

cattle of different age (treated or untreated by antimicrobials) held in the

farms in 13 Lithuanian districts.

The fifth investigation phase was devoted to determining the duration of

the passive immunity and its influence on occurrence of respiratory diseases

in calves. For this purpose the blood samples from the calves were taken and

the level of antibodies to PI-3 and RS viruses were assessed. At the same

time the health parameters of all groups of calves were monitored.

In the sixth phase, the immune response was investigated after

vaccination using different routes – intramuscular (IM) and intradermal (ID),

and different application doses (4 ml and 0.4 ml). For determining the

amount of antibodies, i.e. the dynamics and duration of post–vaccination

immunity, 126 blood samples were serologically analysed. The samples

were taken from cattle held in one farm. The trial included 21 calves from 3

weeks of age. The calves were respectively allocated into three groups – 7

animals in each. The first blood samples for serological analysis were taken

at the age of three weeks and, later, at the age of 6, 10, 18, 27 and 35 weeks.

9

2.1. Immunological and virusological research methods

2.1.1. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) as a method for

determining antibodies against PI-3 and RS viruses in blood serum

Commercial standartized Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

kits (Institute Pourquier, France) were used for the detection of antibodies in

blood serum against bovine PI-3 and RS viruses. These kits are designed for

determining the specific IgG antibodies against bovine PI-3 viruses and

antigens of RS viruses in blood serum. The diagnostic kit included plastic

microplates with wells covered with antigens of bovine PI-3 and RS viruses.

The analysed sera (control and tested) were diluted and poured into 96 wells

of plates. When a sample contained specific antibodies against PI-3 and RS

viruses, during the incubation there developed complexes of antigen and

antibody, i.e. the antibodies of the tested animals adhered to the plate. The

optical density was evaluated by reading using spectrophotometer. The

antibody titre was entered up using the system of pluses; from 1+ to 5 +.

2.1.2. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) as a method for

determining antigens of PI-3 and RS viruses in blood serum

For analysis of antigens of PI-3 and RS viruses, IFA commercial

diagnostic kits BIO K Pulmotest (Belgium) were used. The microtitration

plates with 96 wells were sensibilised using specific antibodies against PI-3

and RS viruses. The reaction was evaluated by colour intensity when

measuring the optical density.

2.1.3. Hemagglutination binding reaction for determining the antibody

titres against PI-3 viruses

The antibody titres against PI-3 viruses were determined by standard

hemagglutination binding reaction using guinea–pig erythrocytes and

twofold sera dilutions (Rossi & Kiesel, 1971).

The reaction was performed using plates with 96 wells and V–shaped

bottom. The reaction in the wells without hemagglutination was regarded

positive because the specific antibodies, contained in the serum, inhibited

virus induced agglutination.

2.1.4. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT–PCR) for

detection of RNA of RS virus

The samples also were analysed for RS viruses using polymerase chain

reaction technique. The extraction of the RNA of the virus was performed

10

using phenol chloroform isoamyl alcohol and genomic methods. For

diagnosing by polymerase chain reaction, the primers of oligonucleotides

were used allowing specific identifying of bovine RS viruses alone (Vilcek

at al., 1994).

B5A 5’-CCA CCC TAG CAA TGA TAA CCT TGA C-3’ 25

B6A 5’-AAG AGA GGA TGC (T/C)TT GCT GTG G-3’ 22

B7A 5’-CAT CAA TCC AAA GCA CCA CAC TGT C-3’ 25

B8 5’-GCT AGT TCT GTG GTG GAT TGT TGT C-3’ 25

2.1.5. Investigation of colostral immunity duration and health status of

calves

The passive colostral immunity was investigated via the evaluation of

the dynamics of antibody titres and number of seropositive calves. The

passive immunity level in calves aged 24–48 hours was determined by

semi–quantitative sodium sulphate precipitation method. 24 calves from one

farm were selected for the trial based on the IgG concentration in the blood

serum. The calves were allocated into three groups 8 individuals in each:

group I – IgG>15g/l, group II – 5–15 g/l and group III –

11

The confidence interval (CI) of serological distribution of PI-3 and RS

viruses in cattle population and reliability of distribution percentage

differences at 95 % of probability were calculated using “Dimension

Research” Inc. software.

The comparative statistical analysis of different vaccination routes also

was conducted using SPSS program „Statistic 20”. The differences between

the number of seropositive animals in the three groups (2 vaccinated and 1

unvaccinated) at different times were evaluated by the Fisher’s exact test.

The differences among the mentioned three groups at different times were

evaluated by the nonparametric Kruskal–Wallis test. When statistically

significant differences were established, the groups were compared in pairs

using the Mann–Whitney–Wilcoxon test.

The differences between the same groups at different times were

evaluated by the Friedman test. When statistically significant differences

were established by Friedman test, the groups were compared in pairs using

Wilcoxon Signed Ranks test (SPSS IBM, New York, USA, 2011).

3. RESULTS

The serological investigations carried out in 2006–2012 showed that RS

and PI-3 viruses are rather widespread in the Lithuanian cattle population. It

also is obvious that without preventive measures these viruses are able to

persist for a long time in a herd and permanently or sporadically cause

respiratory diseases in cattle.

0

20

40

60

80

2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

%

PI-3 RS

Fig. 1. Serological spread dynamics of parainfluenza-3 and

respiratory syncytial viruses

12

The evaluation of the data for 2006, showed a rather high prevalence of

both viruses: PI-3 72.8 % (CI 68.5–77.1) and RS 56.8 % (CI 51.9–61.7). A

statistically significant decrease of seropositive animals in respect to RS

virus was observed in 2009 and 2012 whereas in respect to PI-3 virus in

2008, 2009 and 2012.

0

20

40

60

80

100

13

comparatively short duration of passive and active immunity (Hodgins et al.,

2002).

Analysis of the distribution of antibodies against RS virus showed that

the greater part of animals in farm 3 had no antibodies and were susceptible

to RS virus. Yet high antibody titres in some animals were indicative of the

recent history of disease. Such animals pose threat to susceptible individuals.

The age dynamics of antibodies against RS virus in farm 3 also showed that

some animals had a history of disease until the age of two years. It has been

established that after the termination of immunity, animals may get

reinfected in cow group (De Jong et al., 1996). Meanwhile, most of the

samples from farm 1 had high antibody titres what is indicative of recent

history of infection (Schrijver et al., 1996; Hagglund, 2005).

The dynamics of seropositive animals and antibody titres in different age

groups of cattle showed that RS viruses also pose danger for heifers and

cows over two years of age causing serious respiratory damage (De Jong et

al., 1996). The dynamics of the number of seropositive animals in different

age groups also showed that in farm 1 even 66.7 % young animals had

antibodies against PI-3 viruses, i.e. they already had a history of this disease

(Lazić et al., 2009). The higher titres of antibodies in cow group older than

four years are indicative of repeated infection yet usually PI-3 viruses are

less pathogenic in older animals (Graham et al., 1999). However in farm 3,

animals younger than 2 years of age had no antibodies what was indicative

of the terminated immunity. When included in the group of cows the

animals got infected repeatedly (Lazić et al., 2009).

The complex evaluation of the incidence of bovine viral infections

confirmed the hypothesis that in Lithuania not only PI-3 and RS viruses are

agents of respiratory diseases. It was determined that 95 % of investigated

farms had animals with antibodies against PI-3 and RS viruses. There were

fewer farms where IBR and BVD infections were detected serologically:

84.2 and 85 % respectively. Most farms (15 of 20; 75 %) had animals with a

history of all four viral diseases and only in five herds (25%) the animals

had histories of two or three viral diseases, i.e. in most of the herds mixed

viral diseases were prevalent.

The analysis of geographical distribution of PI-3 and RS viruses showed

high incidence of these viruses in all Lithuanian counties. The greatest

losses were inflicted by PI-3 virus in the Panevėžys, Kaunas and Telšiai

counties. Yet in other regions of the country the percentage of incidence is

rather high. The highest number of seropositive animals against RS virus

was identified in the Utena, Telšiai, Šiauliai, and Marijampolė counties.

Thus, we may state that the incidence of PI-3 and RS viruses is high all over

the country and, presumably, is the main cause of the recent frequent

14

outbreaks of endemic respiratory diseases. It should be pointed out that the

largest cattle breeding farms (with the highest density of animals) are

concentrated in North and Central Lithuania. Namely in these herds other

viral infections are extremely widespread (Mockeliūnienė et al., 2004;

Gulliksen et al., 2009; Jacevičius et al., 2010).

The tests for PI-3 and RS virus antigens and nucleic acids showed that

only some of the samples from infected calves contained viruses though the

serological analysis indicated that the majority of farms had animals with

antibodies against PI-3 viruses (91.7 %) and RS viruses (91.2 %). Animals

shedding PI-3 viruses were only identified in 23.1 % and shedding RS

viruses in 30.8 % of farms. Thus the positive results of single serological

tests are not necessarily indicative of virus–induced infection. The obtained

results partly correlate with the results of paired blood serum tests during

which it was determined that seroconversion (i.e. confirmed infection) was

characteristic only of 19.0–23.8 % of infected calves. Similar results have

been obtained by Swedish researchers who, investigating the outbreaks of

respiratory diseases, identified seroconversion of PI-3 and RS viruses in 17

and 22 % of cases respectively (Hagglund, 2005). This can be accounted for

by that the some tested calves still had colostral immunity which may

interfere with the induction of the active immunity after infection. The

absence of seroconversion during infection is characteristic of RS viruses

and it is associated with the interference of the residual passive immunity

(Hartel et al., 2004).

Yet the detection of PI-3 virus antigen and nucleic acids of RS virus in

the pathological material of infected calves showed that five samples were

PI-3 seropositive (5.2 %) and six samples were RS seropositive (6.25 %).

These data seem to be at variance with the results of serological tests. Yet it

is known that the viruses from the Paramyxoviridae family are extremely

labile, i.e. after infection, they are detected in the respiratory airway only at

the beginning of disease and for a very short time (Antonis et al., 2010).

Also it should be reminded that during the present study, the animals

shedding PI-3 viruses were identified in 3 (23.1 %) farms and RS viruses in

4 (30.8 %) farms. These data also are at variance with our data of single

serological test according to which even 95 % of all herds had seropositive

animals. This phenomenon can be explained by the fact that the majority of

seropositive animals is found in the adult group where PI-3 and RS viral

infections often manifest only sub–clinically. Also it should be born in mind

that bovine respiratory diseases are caused not only by viral infections but

also by plenty other factors (Härtel et al., 2004; Taylor et al., 2010).

The quality and duration of colostral immunity are a very important

index for prediction of the health status of calves and establishing the

15

optimal time for vaccination against respiratory diseases (Arthington et al.,

2000). The present complex investigation showed that the maximal duration

(age of seropositive calves) of passive immunity and antibody titres

depended on the quality of colostral immunity, i.e. on IgG content in the

blood serum of calves. The statistical analysis of the passive immunity

showed that the half–life of antibodies for PI-3 viruses was 28.55 days and

for RS viruses 35.18 days.

For establishing the optimal vaccination time, the statistical mean

duration of immunity is a very important index. The present research

revealed that this index for PI-3 and RS viruses was 41.19 and 50.75 days

respectively. Thus, the logical conclusion is that the optimal age of calves

for vaccination would be not less than 1.5 months, since it has been

determined that the huge amounts of antibodies acquired through the passive

immunity interfere with vaccine antigen and inhibit the formation of

humoral immunity (Parish et al., 2003; Fulton et al., 2004).

The trial for the influence of passive immunity on the health status of

calves showed that irrespective of the quality of the passive immunity in

general the morbidity and mortality caused by respiratory diseases were the

same (p>0.05). Yet in the calves who got sufficient amount of colostrum the

clinical signs were milder and lasted shorter. Concomitantly a smaller

number of treatment courses was necessary (p

16

against viral diseases and its effectiveness using different vaccines are

lacking (Meyer et al., 2008).

In the present research, the immune response of calves was evaluated

using the intradermal (ID) route of vaccination and compared with the

response after the standard intramuscular (IM) vaccination commonly

applied against PI-3 and bovine RS viruses.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

3 6 10 18 27 35

Weeks

Tit

res

Vacc. IN/IM Vacc. IN/ID Controls

Fig. 3. The average distribution of PI-3 antibody titres in calves vaccinated

using ID and IM vaccination routes and in unvaccinated calves (controls)

from different age groups

The research revealed that calves vaccinated intradermally using 1/10

(0.4 ml) of the common doses (indicated in the approved instruction)

demonstrated immune response against bovine RS and PI-3 viruses.

However, the response was somewhat weaker if compared with the response

of calves vaccinated intramuscularly using the full dose (4 ml).

The obtained result could be explained by the fact that 0.4 ml is a rather

small dose responsible for weaker immune response and lower Ab titres

(Eble et al., 2009). Therefore it seems likely that a higher dose of vaccine

administered intradermally could produce a better immune response

(Bernardy et al., 2008; Eble et al., 2009). The high level of maternal

antibodies in the blood serum at the beginning of the trial also could be the

cause of lower immune response after the initial vaccination than expected

(Fulton et al., 2004).

Vaccination Vaccination

17

0,01,02,03,04,05,0

3 6 10 18 27 35

Weeks

Titre

s

Vacc. IN/IM Vacc. IN/ID Controls

Fig.4. The average distribution of RS virus antibodies in calves vaccinated

using ID and IM vaccination routes and in unvaccinated calves (controls)

from different age groups

The most important advantages of the intradermal administration are that

it is less invasive and painless, as well as quickly and easily performed.

Furthermore it should be emphasized that ID vaccination needs a reduced

volume of injection as compared to the more conventional intramuscular

route (Zhao et al., 2006; Goubier et al., 2008). The main disadvantage of the

ID technique is that the jet injection devices are not common equipments in

the veterinary practice therefore it remains the probability of injection faults

(Bernardy et al., 2008).

Recently, vaccination as a preventive measure against respiratory

diseases in the Lithuanian cattle farms has become especially relevant. The

main obstacle to its implementation refers to the necessary huge investments

into expensive vaccines. Therefore ID vaccination could be a perfect

preventive alternative as it requires minimal expenditures. It should be

pointed out that there are no data about cattle vaccination against PI-3 and

RS viruses yet this vaccination route is an object of great interest as a more

promising measure in comparison with the IM vaccination commonly

practiced for many years.

Vaccination Vaccination

18

4. CONCLUSIONS

1. The respiratory syncytial and/or parainfluenza-3 infections are among

the main causes of respiratory diseases in cattle. In 91.7 % of cattle farms

animals with antibodies against PI-3 virus and in 91.2 % of farms animals

with antibodies against RS agents were identified. In the infected farms, the

numbers of PI-3 and RS seropisitive animals accounted on the average for

59.1 % and 53.1 % respectively.

2. The important role of PI-3 and RS viruses for bovine respiratory

diseases was confirmed by virus antigen and nucleic acids detection

methods: in 23.1 % of cattle farms animals shedding PI-3 viruses and in

30.8 % of farms animals shedding RS viruses were identified. Respectively,

PI-3 and RS viruses were detected in 5.2 % and 6.25 % of the total of

animals with clinical signs.

3. The several of viruses were identified as agents of respiratory diseases

occurring in the Lithuanian cattle farms. The analysis of PI-3, RS, IBR and

BVD incidence showed that in 75.0 % of cattle farms there were animals

with a history of all four viral diseases. Only in 25.0 % of cattle farms,

animals with a history of two or three viral diseases were identified.

4. The serological analysis of geographical distribution of RS and PI-3

viruses showed 53–79 % (PI-3) and 17–84 % (RS) seropositive animals in

different Lithuanian counties. The biggest number of seropositive animals

was determined in North and Central Lithuanian counties.

5. The half–time of colostral antibodies against PI-3 viruses was 28.55

days and against RS viruses 35.18 days. The average duration of the passive

immunity against PI-3 and RS viruses was 41.19 and 50.75 days

respectively.

6. Depending on the quality of colostral immunity, the duration of

respiratory diseases in young animals ranged from 3.25 to 6.13 days. In

general, the morbidity and mortality rates were comparable but the calves

who received sufficient amount of colostrum were sick for a shorter time

and suffered milder clinical signs.

7. The after vaccination indexes of immune response using different

vaccination routes (IM and ID) and different doses (4 ml and 0.4 ml) were

statistically comparable throughout the 35 weeks long trial. This implies that

ID vaccination can be a cheaper alternative to the commonly applied IM

vaccination.

19

5. PRACTICAL RECOMMENDATIONS

Prepared and contained in dissertation annexes:

1. Recommendations for diagnostics and prevention of bovine

respiratory diseases.

2. Standard plan of vaccination against respiratory diseases.

3. Memo for differential diagnostics of bovine respiratory diseases and

other economically important diseases.

4. Presentation of the scientific research (method, invention, prototype,

device, technology, etc.) at the Lithuanian University of Health Sciences:

the ID vaccination has certain advantages against IM vaccination. It is

cheaper, painless and less invasive into the tissues. The ID route of

vaccination may serve as an alternative to the commonly practiced IM

vaccination.

6. LIST OF PUBLICATIONS BY THE AUTHOR

REPORTING THE RESULTS OF THE PRESENT

DISSERTATION

1. Kęstaitienė K, Šalomskas A, Jacevičius E, Petkevičius S, Lelešius R,

Mockeliūnas R, Liutkevičienė V, Galvijų paragripo 3 ir respiracinių

sincitinių virusų paplitimo serologiniai tyrimai. Veterinarija ir zootechnika.

2009, T. 47(69). P. 32–36.

2. Šalomskas A, Jacevičius E, Kęstaitienė K, Petkevičius S, Lukauskas

K, Liutkevičienė V, Milius J, Venskutonis D, Mockeliūnas R, Jokimas J,

Ekonomiškai svarbių virusinių ligų paplitimas galvijų bandose. Veterinarija

ir Zootechnika. 2008. T. 41(63). P. 95–100.

3. Kęstaitienė K, Šalomskas A, Jacevičius E, Kerzienė S, Petkevičius S,

The dynamics and duration study of post vaccination immunity of

parainfluenza-3 and bovine respiratory syncytial viruses using intradermal

and intramuscular vaccination routes in calves. Veterinarni Medicina Czech.

2013 (in print).

20

1. ĮVADAS

Kvėpavimo takų ligomis galvijų prieauglis serga visose pramoninės

gyvulininkystės šalyse. Šie susirgimai daro didžiulių ekonominių nuostolių

tiek pieno, tiek mėsos pramonėje (Smith, 2000; Van der Fels–Klerx et al.,

2001). Užsienio ir Lietuvos mokslininkų tyrimai rodo, kad veršeliai

bronchopneumonija, kitaip dar vadinama enzootine pneumonija, suserga dėl

daugelio priežasčių, todėl apibendrintai šios ligos dar vadinamos galvijų

respiracinių ligų (GRL) kompleksu (Hagglund, 2005).

Tirdami galvijų prieauglio kvėpavimo takų ligas mokslininkai pastebėjo,

kad pagrindiniai bronchopneumonijų arba GRL komplekso sukėlėjai yra

paragripo-3 (PG-3) virusai ir respiraciniai sincitiniai (RS) virusai, rečiau –

galvijų infekcinio rinotracheito (GIR) virusai, adenovirusai, koronavirusai ar

mikoplazmos (Storz et al., 2000; Šiugždaitė, 2002; Snowder et al., 2006;

Autio et al., 2007). Dažniausiai virusai aptinkami kartu su tokiomis

bakterijomis kaip Manheimia hemolytica, Pasteurella multocida,

Haemophilus somnus, Salmonella dublin ir Arcanobacterium pyogenes.

GRL kompleksą sudaro keli skirtingos epidemiologijos sindromai. Šiam

kompleksui būdingi įvairūs klinikiniai simptomai ir epidemiologiniai

požymiai (Radostits et al., 2000).

Kvėpavimo takų ligomis serga įvairaus amžiaus galvijai, bet dažniausiai

– prieauglis tuo metu, kai susilpnėja pasyvusis imunitetas ir dar nėra

susidaręs aktyvusis imunitetas (Radostits et al., 2000). GRL būdingas

sezoniškumas – šie susirgimai dažniausi šaltuoju metų laiku, tačiau ligos

gali pasireikšti ir vasarą, ypač esant drėgnesniam ir vėsesniam orui

(Mockeliūnas ir kt., 2005; Hagglund, 2005).

Vertinant atskirus bronchopneumonijų sukėlėjus, dėl svarbios

etiologinės reikšmės GRL komplekse reikėtų išskirti paragripo-3 ir

respiracinius sincitinius virusus (Elvander, 1996; Larsen, 2000; Autio et al.,

2007).

Galvijų paragripą sukelia Paramixoviridae šeimos Respirovirus genties

viengubos spiralės RNR virusai. Galvijų PG-3 virusas antigeniškai panašus į

žmonių ir avių PG-3 virusus, tačiau nėra jiems identiškas (Henrickson,

2003). Dėl bandoje cirkuliuojančių PG-3 virusų visada yra respiracinių ligų

protrūkio grėsmė, nes virusai sudaro palankias sąlygas antrinėms

bakterinėms infekcijoms, ir galvijai gali užsikrėsti mikoplazmomis bei kitais

patogenais. Esant šiam sukėlėjui bandoje, klinika gali ir nepasireikšti, jei

nesusidarys tam tikros aplinkos sąlygos ar neprisidės kiti patogenai. PG-3

virusinė infekcija dažniausiai pasireiškia švelnia klinika, gyvuliai gaišta retai.

PG-3 dažnai pasireiškia kartu su infekcinio galvijų rinotracheito, galvijų

virusinės diarėjos ir RS virusais, Pasteurella multocida ir Haemophilus

21

somnus (Cusack et al., 2003; Autio et al., 2007; Calderon et al., 2007;

Griffin et al., 2010).

Galvijų respiracinis sincitinis (RS) virusas yra Paramixoviridae šeimos

Pneumovirus genties viengubos ribonukleorūgšties virusas. RS virusai

plačiai išplitęs visame pasaulyje tarp galvijų, avių, ožkų bei kitų gyvūnų

(Easton et al., 2004). Kaip ir PG-3 sukėlėjas, RS virusai tampa pirmine

respiracinių susirgimų priežastimi ir paprastai aptinkami kartu su kitais

patogenais (O’Neill et al., 2006; Valarcher et al.; 2006). Susirgimas

dažniausiai pasireiškia galvijams iki 6 mėn., tačiau ligos protrūkiai galimi ir

tarp suaugusių galvijų (Patel, Didlick, 2004).

Galvijų respiraciniai sincitiniai ir paragripo-3 virusai turi ypač didelę

reikšmę Lietuvos galvijų bandoms, nes gali sukelti kasmetinius ligos

protrūkius tiek prieaugliui, tiek ir suaugusiems galvijams (Šalomskas ir kt.,

2008). Šių sukėlėjų susirgimai ir jų daroma žala Lietuvos ūkiams nėra

tyrinėta ir pastaruosius dešimt metų apie šias ligas mokslinių publikacijų

nėra. Tai svari priežastis analizuoti ir gilintis į šių virusinių infekcijų

paplitimo mastą šalies galvijų ūkiuose bei identifikuoti sukėlėjus taikant

skirtingus diagnostikos metodus, kartu skiriant ypatingą dėmesį prevencijos

priemonių galimybėms ir jų praktiniam pritaikymui.

Darbo tikslas Atlikti PG-3 ir RS virusų infekcijų epidemiologinius tyrimus Lietuvos

galvijininkystės ūkiuose, nustatyti pasyvaus ir aktyvaus imuniteto trukmę

bei išaiškinti imuninio atsako galimybes, naudojant skirtingus vakcinacijos

būdus.

Darbo uždaviniai

1. Nustatyti galvijų PG-3 ir RS virusų paplitimą Lietuvos galvijų ūkiuose.

2. Palyginti galvijų PG-3 ir RS virusinių infekcijų paplitimą su kitomis

Lietuvos galvijų ūkiams aktualiomis virusinėmis ligomis.

3. Nustatyti galvijų paragripo-3 ir respiracinio sincitinio virusų paplitimo

geografinius ypatumus.

4. Atlikti PG-3 ir RS virusinių infekcijų laboratorinės diagnostikos

metodų palyginamąjį tyrimą.

5. Ištirti krekeninio imuniteto galvijų PG-3 ir RS virusams dinamiką ir

trukmę bei jo įtaka veršelių sergamumui.

6. Atlikti vakcinacijos palyginamąjį tyrimą naudojant skirtingus

įraumeninį (IM) ir įodinį (ID) vakcinacijos būdus ir bei skirtingas vakcinos

dozes.

22

Darbo mokslinė reikšmė ir naujumas

1. Nustatytas PG-3 ir RS virusų paplitimas ir epidemiologiniai ypatumai

Lietuvos galvijų ūkiuose.

2. Atliktas galvijų PG-3, RS, GIR ir GVD virusinių infekcijų paplitimo

palyginamasis tyrimas.

3. Atliktas įvairių diagnostinių tyrimų palyginamasis įvertinimas.

4. Nustatytas galvijų PG-3 ir RS virusų serologinis paplitimas Lietuvos

apskrityse.

5. Nustatyta pasyvaus krekeninio imuniteto trukmė galvijų PG-3 ir RS

virusams bei jo įtaka veršelių sergamumui.

6. Nustatyta, kad ID vakcinacija nuo PG-3 ir RS virusinių infekcijų yra

efektyvi, lengvai atliekama.

Darbo praktinė reikšmė

1. Nustatyta, kad Lietuvos galvijų bandose pagrindiniai kvėpavimo takų

ligų sukėlėjai yra PG-3 ir RS virusai.

2. Įrodyta, kad kartu naudojant imunofermentinės analizės (IFA Ak) ir

polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodus, galima greitai ir

efektyviai nustatyti PG-3 ir RS virusų infekcijas galvijų bandose.

3. Išaiškinta pasyvaus krekeninio imuniteto trukmė, svarbi veterinarinėje

praktikoje, kuriant efektyvias vakcinacijos programas nuo PG-3 ir RS virusų

infekcijų.

4. Nustatyta, kad įodinė (ID) vakcinacija nuo PG-3 ir RS virusinių

infekcijų gali tapti alternatyva įprastiems vakcinavimo būdams.

5. Sukurta ir pasiūlyta galvijų kvėpavimo takų ir kitų ekonomiškai

svarbių ligų diferencinės diagnostikos atmintinė praktikuojantiems

veterinarijos gydytojams.

2. MEDŽIAGOS IR METODAI

Tiriamasis darbas buvo atliekamas šešiais etapais. Pirmame etape buvo

atliekami RS ir PG-3 virusų epidemiologiniai tyrimai, kuriais išaiškintas

minėtų sukėlėjų serologinis paplitimas Lietuvos galvijų populiacijoje. Taip

pat atlikome detalų PG-3 ir RS virusų serologinio plitimo tyrimus,

pasirinktuose dviejuose ūkiuose su panašiomis galvijų auginimo

technologijomis, taikėme imunofermentinės analizės ir hemagliutinacijos

stabdymo reakcijas. Laboratoriniams galvijų PG-3 ir RS virusų paplitimo

Lietuvoje analizės tyrimams kraujo mėginiai buvo paimti iš 15 ūkių galvijų

bandų, esančių 9 rajonuose. Atrankai parinkti tie ūkiai, kuriuose galvijams

buvo pasireiškę bronchopneumonijoms būdingi simptomai. Iš viso dėl

antikūnų prieš PG-3 ir RS virusus buvo ištirti 347 vienkartiniai kraujo

mėginiai. Siekiant nustatyti RS ir PG-3 virusų plitimo tendencijas buvo

23

analizuojami ir 2006–2007 metais atliktų tyrimų rezultatai. Iš viso dėl

antikūnų prieš PG-3 virusus išanalizuoti 935 iš 36 ūkių, o dėl RS virusų –

905 kraujo mėginių tyrimo duomenys iš 33 ūkių.

Antrame darbo etape, norėdami palyginti galvijų PG-3 ir RS virusinių

infekcijų paplitimą galvijams aktualių virusinių ligų atžvilgiu Lietuvoje,

lygiagrečiai atlikome GIR, PG-3, RS ir GVD virusų paplitimo tyrimus

taikant imunofermentinės analizės reakciją. Tuo tikslu PG-3 ir GVD virusų

antikūnų atžvilgiu buvo ištirti 553 kraujo mėginiai, o dėl antikūnų prieš RS

ir GIR virusus – kraujo 538 mėginiai. Šių virusų paplitimas išanalizuotas 11

rajonų esančiuose 20 ūkių, kur buvo laikomos didesnės nei 200 galvijų

bandos.

Trečiame darbo etape buvo atliktas PG-3 ir RS virusų geografinio

paplitimo Lietuvos galvijų ūkiuose tyrimas. Tuo tikslu 2006–2013 metais

serologiškai buvo ištirta 2225 krajo mėginiai PG-3 viruso atžvilgiu ir 2142

mėginiai RS viruso atžvilgiu.

Ketvirtame etape PG-3 virusams identifikuoti klinikinėje medžiagoje

buvo atliekama IFA reakcija, o RS viruso genominės RNR išskyrimui

taikėme AT-PGR reakciją. Iš viso surinkti ir ištirti 96 patologinės medžiagos

mėginiai (šnervių išskyros), paimti iš 13 įvairiuose Lietuvos rajonuose

esančių ūkių, įvairaus amžiaus galvijų, gydytų ar negydytų

antimikrobinėmis medžiagomis.

Penktame darbo etape atlikome pasyvaus imuniteto trukmės tyrimus ir jo

įtaką veršelių sergamumui kvėpavimo takų ligomis.Vertinimui paimti ir

ištirti kraujo mėginiai, nustatytas antikūnų lygis PG-3 ir RS virusų atžvilgiu.

Tyrimo metu taip pat stebėti veršelių sergamumo parametrai.

Šeštame etape tyrėme imuninį atsaką, atliekant skirtingus įraumeninį

(IM) ir įodinį (ID) vakcinacijos būdus bei naudojant skirtingas vakcinos

dozes (4 ml ir 0,4 ml). Antikūnų nustatymui siekiant išaiškinti povakcininio

imunitento dinamiką ir trukmę, buvo surinkta ir serologiškai ištirta 126

kraujo mėginių iš viename ūkyje laikomų galvijų. Iš viso šiame tyrime

dalyvavo 21 veršelis nuo 3 savaičių. Veršeliai suskirstyti į tris grupes,

kiekvienoje grupėje po 7 gyvulius. Mėginiai serologiniams tyrimams pradėti

rinkti veršeliams 3 sav. amžiuje, toliau tęsiama: 6, 10, 18, 27 ir 35 savaičių

amžiuje.

2.1. Imunologiniai ir virusologiniai tyrimų metodai

2.1.1. Imunofermentinės analizės (IFA) tyrimo metodas galvijų PG-3 ir

RS virusų antikūnams kraujo serume nustatyti

Kraujo mėginių tyrimams dėl antikūnų galvijų PG-3 ir RS virusams

buvo naudojami komerciniai standartizuoti imunofermentinės analizės (IFA)

24

rinkiniai (Institute Pourquier, Prancūzija). Jie skirti specifiniams IgG

antikūnams galvijų PG-3 ir RS virusų antigenams kraujo serume nustatyti.

Diagnostinį rinkinį sudarė plastikinės mikroplokštelės, kurių šulinėliai

padengti galvijų RS ir PG-3 virusų antigenais. Analizuojami serumai

(kontrolės ir tiriamieji mėginiai) buvo praskiesti ir išpilstyti į plokšteles su

96 duobutėmis. Jei kuriame nors mėginyje buvo specifinių antikūnų prieš

RS ar PG-3 virusus, inkubacijos metu susidarė antigeno ir antikūno

kompleksai, t. y. tiriamųjų galvijų antikūnai prisitvirtino prie plokštelės.

Optinis tankis buvo nuskaitomas IFA spektrofotometru, antikūnų titras buvo

užrašomas pliusų sistema nuo 1+ iki 5+.

2.1.2. Imunofermentinės analizės (IFA) tyrimo metodas galvijų PG-3 ir

RS virusų antigenams kraujo serume nustatyti

PG-3 ir RS virusų antigeno tyrimams buvo naudojami IFA komerciniai

diagnostikumai (BIO K Pulmotest, BIOX, Belgija), kur 96 duobučių

mikrotitravimo ploštelės sensibilizuotos specifiniais antikūnais prieš PG-3 ar

RS virusą. Reakcija buvo vertinama pagal mėginio spalvos intensyvumą

matuojant optinį tankį.

2.1.3. Hemagliutinacijos stabdymo reakcija antikūnų titrams prieš PG-3

virusus nustatyti

Antikūnų titrai prieš PG-3 virusus taip pat buvo nustatomi standartine

hemagliutinacijos stabdymo reakcija, naudojant jūrų kiaulytės eritrocitus ir

dukartinius serumo atskiedimus (Rossi & Kiesel, 1971).

Reakcija buvo atliekama mikrometodu 96 duobučių plokštelėse su V

formos dugnu. Tose plokštelės įdubėlėse, kur visiškai nebuvo

hemagliutinacijos, reakcija laikyta teigiama, nes serume esantys specifiniai

antikūnai slopino virusų sukeliamą eritrocitų agliutinaciją.

2.1.4. Atvirkštinės transkripcijos polimerazinė grandininė reakcija (AT-

PGR) RS viruso genominei RNR nustatyti

Mėginiai dėl RS virusų buvo tiriami ir polimerazės grandinine reakcija.

Viruso RNR ekstrakcija buvo atliekama fenolo chloroformo izoamylo

alkoholio ir Genomic metodais. Polimerazės grandininei reakcijai RS

diagnozuoti naudoti oligonukleotidų pradmenys, leidžiantys specifiškai

identifikuoti tik galvijų RS virusus (Vilcek et al., 1994):

25

B5A 5’-CCA CCC TAG CAA TGA TAA CCT TGA C-3’ 25

B6A 5’-AAG AGA GGA TGC (T/C)TT GCT GTG G-3’ 22

B7A 5’-CAT CAA TCC AAA GCA CCA CAC TGT C-3’ 25

B8 5’-GCT AGT TCT GTG GTG GAT TGT TGT C-3’ 25

2.1.5. Krekeninio imuniteto trukmės ir veršelių sveikatingumo tyrimas

Pasyvaus krekeninio imuniteto tyrimo metu vertinome antikūnų titro ir

seroteigiamų veršelių skaičiaus dinamiką. Tyrimo pradžioje 24–48 val.

amžiaus veršelių pasyvaus imuniteto lygis nustatytas pusiau kiekybiniu

natrio sulfito precipitacijos metodu. Taip pagal kraujo serumo IgG kiekį

tyrimui atrinkti viename ūkyje laikomi 24 veršeliai, suskirstyti į tris grupes

po 8 individus: I grupė – IgG kiekis >15g/l; II grupė – 5–15 g/l ir III grupė

26

Kruskal-Wallis testu. Jeigu buvo nustatyta statistiškai reikšmingų skirtumų,

grupės buvo lyginamos poromis naudojant Mann-Whitney-Wilcoxon testą.

Skirtumai lyginant tas pačias grupes skirtingais laiko momentais buvo

įvertinti Friedman testu. Jeigu Friedman testu buvo nustatyta statistiškai

reikšmingų skirtumų, grupės buvo lyginamos poromis naudojant Wilcoxon

Signed Ranks testą (SPSS IBM, New York, JAV, 2011).

3. TYRIMŲ REZULTATAI

2006–2012 metais atlikti serologiniai tyrimai parodė, kad RS ir PG-3

virusai yra labai išplitę Lietuvos galvijų populiacijoje. Taip pat akivaizdu,

kad, nesiimant profilaktikos priemonių šie virusai gali ilgą laiką persistuoti

bandoje ir taip nuolat arba periodiškai sukelti galvijų kvėpavimo takų

susirgimus.

0

20

40

60

80

2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

proc.

PG-3 RS

1 pav. Paragripo-3 ir respiracinių sincitinių virusų serologinio

paplitimo dinamika

Tyrimų pradžioje, vertinant 2006 m. duomenis, nustatytas pakankamai

didelis abiejų virusų paplitimas – PG-3 – 72,8 proc. (CI 68,5–77,1) ir RS –

56,8 proc. (CI 51,9–61,7). Statistinis seroteigiamų gyvulių mažėjimas RS

viruso atžvilgiu stebimas 2009 ir 2012 m. tuo tarpu PG-3 atžvilgiu jis

fiksuojamas 2008, 2009 bei 2012 metais.

27

0

20

40

60

80

100

28

Seroteigiamų skaičiaus ir antikūnų titrų dinamika įvairaus amžiaus

galvijų grupėse rodo, kad RS virusai pavojingi ir vyresnėms nei 2 metų

amžiaus telyčioms bei karvėms, nes šie virusai sukelia pavojingus plaučių

pažeidimus suaugusiems galvijams (De Jong et al., 1996). PG-3 virusų

infekcijos seroteigiamų galvijų skaičiaus dinamika įvairaus amžiaus grupėse

rodo, kad pirmame ūkyje net 66,7 proc. jaunų galvijų turėjo antikūnus prieš

PG-3 virusus, t. y. jie jau buvo persirgę (Lazić et al., 2009). Padidėjęs

antikūnų titras vyresnių nei 4 metų karvių grupėje rodo pakartotinę infekciją,

tačiau paprastai PG-3 virusai vyresnio amžiaus galvijams yra mažai

patogeniški (Graham et al., 1999). Kitokia padėtis nustatyta trečiame ūkyje.

Čia galvijai iki 2 metų amžiaus antikūnų neturi. Veikiausiai dėl to, kad

galvijams jau pasibaigęs imunitetas, dėl ko jie pakartotinai užsikrečia

pervesti į karvių grupę (Lazić et al., 2009).

Kompleksinis galvijų virusinių infekcijų paplitimo tyrimas patvirtino

hipotezę, kad Lietuvoje kvėpavimo takų ligas galvijams sukelia ne tik PG-3

ar RS virusai. Nustatyta, kad 95 proc. visų tirtų ūkių buvo rasta galvijų,

turinčių antikūnų prieš PG-3 ir RS virusus. Ūkių, kur infekcinio galvijų

rinotracheito (GIR) ir galvijų virusinės diarėjos (GVD) virusų infekcija

nustatyta serologiškai, buvo kiek mažiau – atitinkamai 84,2 proc. ir 85 proc.

Daugumoje ūkių (15 iš 20; 75 proc.) rasta galvijų, persirgusių visomis

keturiomis virusinėmis ligomis, tik penkiose (25 proc.) bandose galvijai

buvo persirgę dviem arba trimis virusinėmis ligomis, t. y. daugumoje bandų

vyravo mišrios virusinės infekcijos.

Atlikus PG-3 ir RS virusų geografinio paplitimo galvijų ūkiuose analizę

nustatytas didelio masto virusų paplitimas visose Lietuvos apskrityse. PG-3

virusas galimai didžiausius nuostolius gyvulių augintojams kelia Panevėžio,

Kauno ir Telšių apskrityse, tačiau ir kituose šalies regionuose procentinio

paplitimo rodikliai yra pakankamai dideli. Tuo tarpu RS viruso didžiausias

procentas seroteigiamų galvijų nustatytas Utenos, Telšių, Šiaulių ir

Marijampolės apskrityse. Taigi, galime teigti, kad PG-3 ir RS virusai yra

labai išplitę visoje šalyje ir gali būti pastaruoju metu dažnai pasireiškiančių

galvijų endeminių kvėpavimo takų ligų priežastis. Reikia pažymėti, kad

Šiaurės ir Vidurio Lietuvoje yra sutelkta didžioji dalis stambių

galvijininkystės ūkių, čia yra didžiausias galvijų tankumas, ir būtent tokiose

bandose labai išplitę kitos virusinės ligos (Mockeliūnienė et al., 2004;

Gulliksen et al., 2009; Jacevičius et al., 2010).

PG-3 ir RS virusų antigeno ir nukleorūgščių nustatymas parodė, kad tik

dalis sergančių veršelių mėginių paėmimo metu išskyrė virusus, nors virusų

serologinis paplitimas rodė, kad daugumoje (91,7 proc.) ūkių buvo rasta

galvijų turinčių antikūnų prieš PG-3 virusus; 91,2 proc. ūkių buvo rasta

galvijų, turinčių antikūnų prieš RS sukėlėjus. PG-3 virusus išskiriančių buvo

29

rasta tik 23,1 proc. ūkių, o RSV išskiriantys galvijai buvo nustatyti 30,8 proc.

ūkių. Taigi, teigiami vienkartinių serologinių tyrimų rezultatai nebūtinai

rodo, kad tyrimo metu ligą sukelia būtent virusai. Šie tyrimų rezultatai iš

dalies sutampa su mūsų atliktais poriniais kraujo serumo tyrimų rezultatais,

kurių metu nustatyta, kad serokonversija (t. y. patvirtintas užsikrėtimas)

nustatytas tik 19,0–23,8 proc. sergančių veršelių. Panašius rezultatus yra

gavę švedų mokslininkai, kurie tyrė kvėpavimo takų ligų protrūkius ir PG-3

bei RS virusų serokonversiją, radę atitinkamai 17 proc. ir 22 proc. atvejų

(Hagglund, 2005). Tą galima paaiškinti tuo, kad daliai veršelių tyrimai buvo

atliekami dar esant neišnykusiam krekeniniam imunitetui, kuris gali

interferuoti su aktyvaus poinfekcinio imuniteto susidarymu. Serokonversijos

nebuvimas po užsikrėtimo yra būdinga RS virusų infekcijos savybė ir

siejama su likutinio pasyvaus imuniteto interferencija (Hartel et al., 2004).

Tačiau sergančių veršelių patologinėje medžiagoje nustatytas PG-3

viruso antigenas ir RS viruso nukleorūgštys parodė, kad tik penki mėginiai

buvo PG-3 teigiami (5,2 proc.), RS teigiamų buvo rasta šešiuose (6,25 proc.)

mėginiuose. Tokie duomenys, atrodytų, prieštarauja serologinių tyrimų

rezultatams, betgi žinoma, kad Paramyxoviridae šeimos virusai yra itin

labilūs, po infekcijos veršelių kvėpavimo takuose aptinkami labai trumpai ir

tik ligos pradžioje (Antonis et al., 2010). Reikia paminėti, kad mes PG-3

virusus išskiriančius galvijus nustatėme trijuose (23,1 proc.), o RS virusus –

keturiuose (30,8 proc.) ūkiuose. Šie duomenys taip pat prieštarauja mūsų

vienkartinio serologinio tyrimo duomenims, kurie rodo, kad net 95 proc.

visų bandų randami seroteigiami galvijai. Šį fenomeną galima būtų

paaiškinti tuo, kad didžioji dauguma seroteigiamų galvijų randama

suaugusiųjų grupėje, kur PG-3 ir RS virusų infekcija dažnai pasireiškia

subklinikine forma. Taip pat reikia nepamiršti, kad galvijų kvėpavimo takų

ligas nulemia ne tik virusų infekcijos, bet ir daugybė kitų veiksnių (Hartel et

al., 2004; Taylor et al., 2010).

Labai svarbus rodiklis, pagal kurį galima prognozuoti veršelių

sveikatingumą ir nustatyti optimalų vakcinacijos nuo kvėpavimo takų ligų

laiką – krekeninio imuniteto kokybė ir trukmė (Arthington et al., 2000).

Kompleksinio tyrimo metu nustatėme, kad pasyvaus imuniteto maksimali

trukmė (seroteigiamų veršelių amžius) ir antikūnų titrai priklausė nuo

krekeninio imuniteto kokybės, t. y. nuo IgG kiekio veršelių kraujo serume.

Statistinė pasyvaus imuniteto analizė parodė, kad antikūnų pusinio

eliminavimo laikas PG-3 virusams buvo 28,55 dienos, o RS virusams –

35,18 dienos.

Vakcinacijos laikui parinkti labai svarbi ir statistinė vidutinė imuniteto

trukmė. Mūsų tyrimai parodė, kad šis rodiklis PG-3 ir RS virusams buvo

atitinkamai 41,19 ir 50,75 dienos. Taigi, galime daryti išvadą, kad

30

optimaliausias veršelių vakcinavimo amžius būtų ne mažesnis nei 1,5

mėnesio, nes nustatyta, kad veršelių organizme pasyviai įgyti dideli

antikūnų kiekiai interferuoja su vakcinos antigenu ir aktyvus humoralinis

imunitetas nesusidaro (Parish et al., 2003; Fulton et al., 2004).

Pasyvaus imuniteto įtakos veršelių sveikatingumui tyrimas parodė, kad

nepriklausomai nuo gauto pasyvaus imuniteto kokybės, bendras veršelių

sergamumas ir gaištamumas nuo kvėpavimo takų ligų nesiskyrė (p>0,05).

Tačiau veršeliai, gavę pakankamai krekenų, sirgo trumpiau ir lengvesne

forma. Tai parodė mažesnis gydymo kursų skaičius (p

31

vakcinacijos (3 savaičių) nebuvo gautas visavertis imuninis atsakas, kokio

tikėtasi (Fulton et al., 2004).

0,01,02,03,04,05,0

3 6 10 18 27 35

Savaitės

Tit

rai

Vakc. IN/IM Vakc. IN/ID Kontroliniai

3 pav. PG-3 antikūnų titrų pasiskirstymo vidurkis, vertinant vakcinuotus IM,

ID ir nevakcinuotus (kontrolinius) galvijus įvairiose amžiaus grupėse

0,01,02,03,04,05,0

3 6 10 18 27 35

Savaitės

Tit

rai

Vakc. IN/IM Vakc.IN/ID Kontroliniai

4 pav. RS virusų antikūnų titrų pasiskirstymo vidurkis, vertinant vakcinuotus

IM, ID ir nevakcinuotus (kontrolinius) galvijus įvairiose amžiaus grupėse

Vakcinacija Vakcinacija

Vakcinacija Vakcinacija

32

Vienas svarbiausių ID vakcinacijos privalumų yra tas, kad atliekama

mažesnė invazija, procedūra neskausminga, ją atlikti yra greita ir paprasta.

Reikia pažymėti, kad palyginti su įprastine IM vakcinacija, ID reikalingas

mažesnis injekcijos tūris (Zhao et al., 2006; Goubier et al., 2008). Šio

metodo trūkumas yra tas, kad jis nėra įprastas, o veterinarijos specialistai

neturi tam tikslui pritaikytų tinkamų įrankių. Dėl šių priežasčių išlieka rizika

vakcinaciją atlikti netinkamai (Bernardy et al., 2008).

Pastaruoju metu vakcinacija, kaip prevencijos priemonė nuo respiracinių

susirgimų, Lietuvos galvijų ūkiuose yra labai aktuali, tačiau pagrindinė

įvardijama problema trukdanti tai įgyvendinti, yra šiam tikslui reikalingos

didžiulės piniginės investicijos dėl brangių vakcinų. Taigi ID vakcinacija

būtų puiki alternatyva siekiant įgyvendinti prevenciją, tam skiriant

minimalias išlaidas. Reikėtų pabrėžti, kad apie įodinę galvijų vakcinaciją

nuo PG-3 ir RSV sukėlėjų nėra apskritai jokių duomenų, tuo tarpu šis

vakcinavimo būdas kelia didžiulį susidomėjimą kaip perspektyvus ir

alternatyvus įprastiniams ir taikomiems jau daugelį metų.

4. IŠVADOS

1. Viena pagrindinių galvijų kvėpavimo takų ligų priežasčių yra respiracinių sincitinių ir (ar) paragripo-3 virusų infekcija. 91,7 proc. ūkių

buvo rasta galvijų turinčių antikūnų prieš PG-3 virusus. 91,2 proc. ūkių

išaiškinti galvijai, turintys antikūnų prieš RS sukėlėjus. Užkrėstuose ūkiuose

seroteigiamų PG-3 ir RS virusams galvijų vidutiniškai buvo atitinkamai 59,1

proc. ir 53,1 proc.

2. PG-3 ir RS virusų etiologinė reikšmė galvijų kvėpavimo takų susirgimuose patvirtinta virusų antigeno ir nukleorūgščių nustatymo

metodais: 23,1 proc. ūkiuose nustatėme PG-3 bei 30,8 proc. ūkiuose – RS

virusus išskiriančius galvijus. PG-3 ir RS virusai rasti atitinkamai 5,2 proc.

ir 6,25 proc. visų sirgusių veršelių.

3. Galvijų kvėpavimo takų ligoms Lietuvos ūkiuose būdingos keleto virusų infekcija. PG-3, RS, GIR ir GVD virusinių infekcijų paplitimo

analizė parodė, kad 75,0 proc. ūkių rasti galvijai, persirgę visomis

keturiomis virusinėmis ligomis. Tik 25,0 proc. bandų nustatyti galvijai,

persirgę dviem arba trimis virusinėmis ligomis.

4. Atlikus RS ir PG-3 virusų serologinio paplitimo geografinę analizę, nustatytas 53–79 proc. (PG-3) ir 17–84 proc.(RS) seroteigiamų galvijų

skaičius įvairiuose Lietuvos apskričių ūkiuose. Daugiausia seroteigiamų

galvijų rasta Šiaurės ir Vidurio Lietuvos apskrityse.

33

5. Krekeninių antikūnų pusinio eliminavimo laikas PG-3 virusams buvo 28,55 dienos, o RS virusams – 35,18 dienos. Vidutinė pasyvaus imuniteto

trukmė PG-3 ir RS virusams buvo atitinkamai 41,19 ir 50,75 dienos.

6. Priklausomai nuo krekeninio imuniteto kokybės, galvijų prieauglio kvėpavimo takų ligų trukmė svyravo nuo 3,25 iki 6,13 dienos, bendras

sergamumas ir gaištamumas nesiskyrė, tačiau veršeliai, gavę pakankamai

krekenų, sirgo trumpiau ir lengvesne forma.

7. Povakcininio imuninio atsako rodikliai, taikant skirtingus vakcinacijos būdus (IM ir ID) ir skirtingas vakcinos dozes (4 ml ir 0,4 ml),

vakcinuotose grupėse per visą 35 savaičių trukmės eksperimento laiką

statistiškai nesiskyrė. Tai įrodo, kad ID vakcinacija gali būti pigesnė

alternatyva įprastai taikomam IM vakcinavimo būdui.

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Parengta ir pateikta disertacijos prieduose:

1. Rekomendacijos galvijų kvėpavimo takų ligų diagnostikai ir

prevencijai.

2. Standartinis kvėpavimo takų ligų vakcinacijos planas.

3. Galvijų kvėpavimo takų ir kitų ekonomiškai svarbių ligų diferencinės

diagnostikos atmintinė.

4. Mokslinio tyrimo (metodo, išradimo, prototipo, prietaiso,

technologijos ar pan.) pristatymas LSMU: ID vakcinacija palyginti su IM

vakcinacija turi daug privalumų: yra pigesnė, mažiau skausminga, mažiau

dirginami audiniai, todėl ID vakcinacija gali tapti alternatyva įprastai

taikomam IM vakcinacijos būdui.

6. DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ

PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS

1. Kęstaitienė K, Šalomskas A, Jacevičius E, Petkevičius S, Lelešius R,

Mockeliūnas R, Liutkevičienė V. Galvijų paragripo 3 ir respiracinių

sincitinių virusų paplitimo serologiniai tyrimai. Veterinarija ir zootechnika.

2009, T. 47 (69). P. 32–36.

34

2. Šalomskas A, Jacevičius E, Kęstaitienė K, Petkevičius S, Lukauskas

K, Liutkevičienė V, Milius J, Venskutonis D, Mockeliūnas R, Jokimas J.

Ekonomiškai svarbių virusinių ligų paplitimas galvijų bandose. Veterinarija

ir Zootechnika. 2008. T. 41(63). P. 95–100.

3. Kęstaitienė K, Šalomskas A, Jacevičius E, Kerzienė S, Petkevičius S.

The dynamics and duration study of post vaccination immunity of

parainfluenza-3 and bovine respiratory syncytial viruses using intradermal

and intramuscular vaccination routes in calves. Veterinarni Medicina Czech.

2013 (atiduotas spaudai).

35

GYVENIMO APRAŠYMAS (CURRICULUM VITAE)

Vardas pavardė Kristina Kęstaitienė

Gimimo data 1981 03 11

Gimimo vieta Panevėžys, Lietuva

Adresas Vykinto g.14–1, Panevėžys

El. paštas k.kestaitiene@lva.lt

IŠSILAVINIMAS

1988–1999 m. Panevėžio 12–oji vidurinė mokykla, Parko g.

41, LT–5300 Panevėžys

1999–2005 m. Lietuvos veterinarijos akademija (nuo 2010

09 01 – Lietuvos sveikatos mokslų

universitetas, Veterinarijos akademija). Tilžės

g. 18, Kaunas (Lietuva)

Kvalifikacijos lygmuo

pagal nacionalinę arba

tarptautinę kvalifikaciją:

Veterinarijos gydytoja

2007–2014 m. Doktorantūros studijos LVA (nuo 2010 09 01

Lietuvos sveikatos mokslų universitetas,

Veterinarijos akademija), užkrečiamų ligų

katedra, virusologija

Doktorantūros studijų

metu dalyvavau:

Kauno medicinos universiteto ir Lietuvos

veterinarijos akademijos (nuo 2010 09 01

Lietuvos sveikatos mokslų universitetas,

Veterinarijos akademija) ruošiamuose

seminaruose ir konferencijose. Latvijos

Veterinarijos asociacijos tarptautinėje

konferencijoje.

2008 m. Žemės ūkio ministerijos

finansuojamame projekte ,,Mišrių virusinių ir

bakterinių ligų (paragripo-3, respiracinės

sincitinės infekcijos) paplitimo

epidemiologiniai ypatumai galvijų bandose,

užkrato patekimo į bandas būdai ir

profilaktikos priemonės“

36