laporann biotek ku

Upload: almunada

Post on 18-Jul-2015

418 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

1

A. PENDAHULUAN 1. Latar Belakang DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon. Pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, serangga, kalus, akar batang, daging dan sisik ikan. Pada individu yang sama DNA yang diperoleh dari berbagai sumber akan memiliki jenis jumlah dan ukuran yang sama. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak mengandung protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim restriksi dan menggangu proses amplifikasi DNA dengan PCR. Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik 1

2

ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik listrik. di Dalam hal ini, molekul-molekul Laju perpindahan tersebut tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak dalam matriks gel. bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut. 2. Tujuan Praktikum Tujuan dari praktikum Bioteknokogi Pertanian ini antara lain sebagai berikut : a. b. c. Mengetahui dan memahami cara ekstraksi dan DNA pada tanaman salak. Mengetahui tahap-tahap dalam pemakaian PCR dalam Bioteknologi Pertanian. Melakukan dan memahami proses elektroforesis DNA menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa. isolasi

3

B. TINJAUAN PUSTAKA 1. EKSTRASI DAN ISOLASI DNA DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak mengandung protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim restriksi dan menggangu proses amplifikasi DNA dengan PCR. Demikian pula pada hewan yang memiliki kandungan kitin (seperti serangga), memerlukan teknik dan metode khusus untuk menghancurkan sel hingga isi dapat terpisah atau keluar dari sel (Kusumawaty, 2008). Dalam proses isolasi DNA genom tanaman, keberadaan polisacharida dan senyawa metabolit sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam proses isolasi asam nukleat. Struktur polisacharida yang mirip dengan asam nukleat akan menyebabkan polisacharida tersebut akan mengendap bersama dengan asam nukleat. Penambahan senyawa pereduksi sepertri marchaptoetanol dan dithiothreitol dapat mencegar proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat (Wilkins,1996). Isolasi DNA kromosom prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel

3

4

tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90oC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air (James, 2010). Salak (Salacca zalacca G) merupakan tanaman asli Indonesia. Buahnya banyak digemari masyarakat karena rasanya manis, renyah dan kandungan gizi yang tinggi. Salak mempunyai nilai ekonomis dan peluang pasar yang cukup luas, baik di dalam negeri maupun ekspor. Pulau Jawa sebagai salah satu pusat keragaman kultivar salak, mempunyai potensi yang cukup besar untuk menghasilkan varietas-varietas unggul yang lebih bernilai ekonomis dan kompetitif (Nandariyah et al., 2004). Teknik molekuler bervariasi dalam cara pelaksanaan untuk mendapatkan data, baik tekniknya maupun tingkatan target data yang diinginkan sesuai kemudahan pelaksanaan, ketersediaan sumber daya manusia, fasilitas, dan dana. Ekstraksi untuk mendapatkan DNA berkualitas tinggi merupakan satu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler, terutama dalam pencandraan sidik jari DNA. Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metode yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA genom tanaman yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol. Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Doyle et al., 1987). 2. Polimerase Chain Reaction (PCR) Polimerase Chain Reaction (PCR), tujuannya adalah membuat tiruan DNA berlipat ganda secara in vitro. Pada saat PCR terjadi peristiwa denaturasi, annealing, dan extention. Pada saat denaturasi, rantai ganda DNA dibuka dengan memberi suhu yang tinggi. Nilai temperaturnya berbanding lurus dengan jumlah ikatan G dan C (Guanin-Cytosin). Tahap kedua adalah annealing, yaitu menempelkan primer pada DNA untuk amplifikasi. Pada tahap

5

ini dibutuhkan suhu yang lebih rendah agar primer bisa menempel pada rantai DNA. Pada tahap extention, suhu yang diperlukan adalah 720C. Setelah itu, sampel dimasukkan pada mesin PCR dan dilakukan amplifikasi (Alberts, et al. 2002). Reaksi berantai polimerase dan Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode yang dikendalikan secara enzimatis untuk sekuen DNA yang diinginkan. Prasyarat untuk mengamplifikasi sekuen dengan mempergunakan PCR adalah mengetahui sekuen tertentu yang mengapit sekuen DNA yang diamplifikasi sehingga oligonukleotida spesifik dapat diperoleh. PCR merupakan teknik yang sangat berguna dalam membuat salinan DNA. PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA tertentu disalin (jutaan kali) untuk diperbanyak (sehingga dapat dianalisis), atau dimodifikasi secara tertentu (Sambrook, 2001). PCR dapat digunakan untuk menambahkan situs enzim restriksi, atau untuk memutasikan (mengubah) basa tertentu pada DNA. PCR juga dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil (Fessenden, 1986). Proses PCR untuk memperbanyak DNA melibatkan serangkaian siklus temperatur. PCR memanfaatkan enzim DNA polimerase yang secara alami memang berperan dalam perbanyakan DNA pada proses replikasi. Namun demikian, tidak seperti pada organisme hidup, proses PCR hanya dapat menyalin fragmen pendek DNA, biasanya sampai dengan 10 kb (kb=kilo base pairs=1.000 pasang basa). Fragmen tersebut dapat berupa suatu gen tunggal, atau hanya bagian dari suatu gen (Khopkar, 2003). Uji PCR dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan virus. Pengujian keberadaan virus dengan PCR dimulai dengan pengambilan sampel. Sampel

6

yang akan diuji PCR sebaiknya dalam kondisi segar, tetapi bila tidak memungkinkan, sampel dapat disimpan dalam larutan alkohol 95% dengan perbandingan 1 : 9 (1 bagian sampel dengan 9 bagian alkohol 95%). Hal ini bertujuan untuk mencegah terjadinya kerusakan DNA/RNA (Haliman, 2005). 3. Elektroforesis dan Identifikasi DNA Analisa molekuler secara modern yaitu pemaparan bahan genetik menggunakan alat yang dikenal sebagai elektroforesis dan ini membutuhkan kemampuan listrik dan pendingin yang memadai. Selain itu faktor bahan kimia yang dibutuhkan dan alat-alat yang dipakai beragam. Prinsip dasar elektroforesis yaitu bahwa setiap genom tumbuhan (enzim/protein dan DNA) mempunyai berat yang berbeda-beda sehingga kecepatan bergeraknya pada media gel juga berbeda-beda dan hal ini hanya dapat dilihat melalui pewarnaan (trouble shooting). Alat elektroforesis untuk enzim/protein biasa dibikin sendiri dengan fiberglas. Sistem elektroforesis yaitu penggunaan arus listrik dari arus negatif ke arus positif melalui media gel untuk menggerakkan bahan genetik (running). Namun pendeteksian alel enzim (bagian dari kromosom yang menentukan warna, bulu, rasa, dll) individu tumbuhan tidak hanya sampai running saja masih perlu dinampakkan dengan pewarna (staining) (Sudarmono, 2006). Proses denaturasi DNA cetakan, penempelan primer pada DNA cetakan, dan polimerisasi DNA membutuhkan suhu yang spesiflk. Sekarang ini pengaturan suhu dilakukan dengan mesin Thermal Cycler, yang disebut juga mesin PCR. Keberhasilan suatu primer mengampliftkasi DNA cetakan ditentukan oleh ada tidaknya homologi sekuens nukleotida primer dengan DNA cetakan, kemurnian dan banyaknya DNA yang mencukupi, konsentrasi MgCl2 yang sesuai, banyaknya enzim Taq DNA polimerase yang cukup, dan suhu pelekatan primer yang cocok (Lengkong et al., 2001). Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode),

7

sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya (Klug, 1994). Agarose gel elektroforesis (AGE) merupakan system analisis yang banyak digunakan dalam penelitian maupun uji diagnostik di laboratorium biokimia dan biologi molekuler. Alat ini lazimnya berfungsi menganalisis berat molekul suatu fragmen DNA. Dalam proses elektroforesis dengan menggunakan gel low melting, penggunaan aliran listrik yang semakin besar menimbulkan kalor yang mengakibatkan hasil fragmen pada gel tidak dapat diamati. Untuk itu, digunakan alat pemompa kalor yaitu 3 buah Modul termoelektrik yang disusun tunggal dengan tujuan menjaga temperatur gel sehingga proses elektroforesis dapat berlangsung optimal (Danardono, 2008). Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel. Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak melalui matriks tersebut (Brown, 1992).

8

C. ACARA EKSTRAKSI DNA 1. a. 1) Waterbath 2) Timbangan 3) Mortar dan penumbuknya 4) Tabung steril 5) Centrifuge b. 2) 5 M NaCl 3) 10% CTAB 4) Mercaptoetnol 5) H2O 6) Daun salak muda c. Waktu dan Tempat Praktikum Praktikum acara Ekstraksi DNA telah dilaksanakan pada hari Senin, 22 November 2011 pukul 13.00 17.00 WIB, bertempat di Laboratorium Bioteknologi Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret Surakarta. Bahan 1) 1 M Trish Ph 9,0 Metode Praktikum Alat

9

2.

Hasil Tabel 2.1 Tahapan dalam ekstraksi DNA dapat dijelaskan sebagai berikut : 8 No. Cara Kerja Gambar 1 Menyiapkan daun salak muda

2

Memisahkan daun dengan tulang daun dan menimbangnya sampai 0,2 gram

3

Menggerus daun sampai halus

4

Memasukkan daun microsentifuge tube

ke

dalam

5

Sebelumnya buffer ekstraksi dipanaskan pada suhu 65oC ke dalam waterbath

6

Memasukkan buffer ekstraksi ke dalam microsentifuge tube yang telah berisi sample sebanyak 1 ml dan menggojognya sampai homogen Memasukkan microsentifuge tube ke dalam waterbath selam 1 jam pada suhu 65oC Memasukkan microsentifuge tube yang berisi sample pada kecepatan 11.000 rpm selama 5 menit Menambahkan kloroform sebanyak 800 ml ke dalam sample

7 8

9

10

10

Mensentrifuge kembali sample dengan kecapatan 12.000 rpm selama 10 menit

11

12

Mengambil cairan lapisan atas (warna kuning) untuk dipindahkan ke tabung baru dan menambahkan 1/10 dari 2,5 M sodium asetat dan 0,65 ml isopropanol dingin lalu mencampurkannya hingga homogen Mencentrifuge kembali dengan kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit

13

Membuang supernatan kemudian pelet dicuci dengan ethanil 70%, setelah itu membuang ethanol tersebut dari tabung Mengeringkan pelet DNA pada kering angin kemudian meyimpannya pada kulkas

14

Sumber : Laporan Sementara

11

3.

Pembahasan DNA adalah penyusun asam nukleat yang ada di dalam tubuh makluk hidup. DNA merupakan cerminan kode genotif yang menghasilkan tampilan berbeda-beda pada tiap individu. Tiap individu memiliki susunan DNA yang berbeda, DNA dapat digunakan sebagai penciri bagi tiap individu makhluk hidup. DNA merupakan pembawa kode genetik. Dalam tubuh manusia dan tanaman tersusun dari basa-basa DNA yang jumlahnya berates-ratus bahkan beribu-ribu. Perlu dilakukan pengujian DNA guna untuk mengetahui DNA dalam tubuh individu makhluk hidup guna untuk penelitian yang berkelanjutan dan digunakan untuk identifikasi dan telah susunan DNA makluk hidup yang beraneka ragam, yang dapat digunakan untuk pengelompokan makhluk hidup. Selain untuk identifikasi makhluk hidup per individu, uji DNA dilakukan untuk identifikasi genetik makhluk hidup yang berfungsi sebagai dasar dalam rekayasa genetik dalam bioteknologi Adapun tujuan dari isolasi DNA yaitu :

a. b. c.

Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA Praktikum ekstrasi dan isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan dua macam metode yaitu metode konvensional dan metode DINAMITE plan kit. Perbedaan dari kedua metode ini yaitu pada metode konvensional kurang efisien karena membutuhkan waktu yang cukup lama dalam mengisolasi DNA, sedangkan untuk metode II yaitu metode DINAMITE plan kit lebih efisien. Tapi untuk hasilnya, pada metode I DNA yang diisolasi warnanya lebih jernih bila dibandingkan dengan metode II, hal ini sangat mempengaruhi hasil pembacaan pita DNA setelah dilakukannya elektroforesis. Hasilnya pada metode I lebih baik dan lebih terlihat pita-pita DNA bila dibandingkan dengan metode II (DINAMITE plan kit). Isolasi dan ekstraksi DNA bahan yang digunakan adalah daun yang masih muda, hal ini dilakukan karena daun yang masih muda memiliki susunan bahan yang mudah untuk dihancurkan, hal tersebut karena pada isolasi DNA

12

diperlukan proses yang cepat dalam penggerusan bahan yang dijadikan sampel, agar tidak merusak struktur DNA. Selain itu juga menggunakan daun salak yang masih muda dengan maksud bahwa pada jaringan tersebut masih mengalami perkembangan dan senyawa-senyawa kimia yang terkandung masih steril atau belum terjadi kontaminasi dengan zat-at kimia lain. Menurut Kusumawaty menjelaskan bahwa jaringan tanaman/daun yang masih muda mengandung sedikit kontaminan oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid sehingga memudahkan dalam ekstraksi. Alat yang digunakan pada isolasi DNA seperti : 1. Mortar untuk menghaluskan bahan 2. Pertridish untuk mencuci sampal daun salak sebelum dihaluskan 3. Hot plate sirrer dan magnetic stirer untuk inkubasi sampel daun yang telah diekstraksi 4. Sentrifuse untuk memisahkan supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah 5. Eppendof yaitu tabung untuk tempat ekstrak DNA 6. Mikropipet untuk mengambil larutan dengan ukuran/volume tertentu, yakni 2-20 l; 20-200 l ; dan 200-1000 l. 7. Termometer untuk mengukur suhu 8. Spektrofotometer untuk menghitung konsentrasi DNA 9. Timbangan analitik untuk menimbang sampel daun yang akan diekstraksi 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Blue Tip : Pengambil larutan etidium bromide dan larutan buffer Yellow tip: Pengambil larutan etidium bromide dan larutan buffer, Magnetik stirer: Untuk mengaduk DNA yang sudah dieksraksi Erlenmeyer: Untuk tempat pelarut agar Cetakan: Untuk mencetak agar Gelas ukur: sebagai tempat /wadah untuk memanaskan Gunting: memotong bahan ekstrak (daun salak muda) 1ml. untuk mikropipet dengan ukuran 200 -1000 ml untuk mikropipet dengan ukuran 200-1000 ml.

13

Larutan yang digunakan dalam praktikum ekstrasi DNA ini antara lain seperti larutan LA sebagai larutan penyangga atau buffer, larutan PA sebagai chloroform berfungsi untuk memisahkan DNA pada daun muda agar mudah terlepas dari serat daun, larutan CA (Chlorofom isoamil alcohol) berfungsi untuk memurnikan DNA sahingga DNA bisa mengalami pengendapan dan larutan TE dimanfaatkan untuk memurnikan debris. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan dengan mengambil beberapa daun muda dan dihaluskan. Selanjutnya melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis, yaitu menggunakan larutan buffer ekstraksi. Jaringan tanaman tersebut yang masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu dengan lainnya sehingga yang tersisa hanya sel darah putih. Karena itu ke dalam tabung diberikan larutan pelisis sel yaitu buffer ekstraksi seperti yang dipaparkan di atas yang merupakan larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan terjadi hemolisis. Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Untuk memisahkan DNA diperlukan senyawa kimia seperti: EDTA (ethyllenediamine tetraacetic), dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). Larutan pelisis sel terdiri atas EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks (chelate) dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse. Selain itu dalam larutan tersebut juga terdapat larutan NaCL yang berfungsi untuk menstabilkan larutan sehingga mempercepat reaksi-raksi yang akan terjadi pada tahapan berikutnya. Untuk melisiskan membran sel dan membran nukleus sel tanaman yang terisolasi tadi, diberikan pula larutan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) yang berfungsi untuk merusak lipid pada membran sel sehingga leukosit hancur. Pada saat proses destruksi jaringan tanaman dapat menyebabkan degradasi pada DNA dengan adanya aktivitas enzim endonuklease, karena itu digunakan buffer ekstraksi yang mengandung senyawa Tris, EDTA, CTAB, potassium asetat, dan SDS. Senyawa CTAB dan SDS merupakan detergen, yang dapat melisis dinding sel dan mendenaturasi protein. Selain itu CTAB dan EDTA adalah senyawa

14

inhibitor yang dapat menghambat aktivitas enzim nuclease. Kemudian sampel tersebut dihomogenkan dengan menggunakan vortekx. Setelah dihomogenkan warna larutan berubah menjadi hijau. Sampel yang telah homogen kemudian diinkubasikan, setelah itu diberi larutan Potassium asetat dan dihomogenkan, setelah homogen sampel disimpan dalam wadah berisi es. Potassium asetat adalah senyawa yang berikatan dengan debris sel dan protein sehingga membentuk senyawa kompleks dengan CTABpotassium aesta-protein- debris sel. Setelah itu sampel disentrifuga pada kecepatan 14.000 rpm selam 10 menit. Setelah sampel disentrifuga terbentuk 2 lapisan, fasa atas berupa larutan ekstrak dan berwarna bening, sedangkan fasa bawah berupa endapan yang berwarna hijau. Fasa atas yang kemudian diambil untuk digunakan pada tahap selanjutnya. Tahap ini disebut juga dengan tahap purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan sel tanaman dari zat-zat lainnya. Kemudian, pada tahap berikutnya digunakan klorofom: isoamil alcohol (24:1) yang berperan untuk mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom, sedangkan untuk mempresipitasi asam nukleat digunakan alkohol 100%. Pemberian alkohol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotorpengotornya. DNA dalam alkohol akan terpresipitasi (menggumpal) sedangkan DNA dalam air akan larut, tetapi protein tidak dapat larut dalam air. Tahap tersebut merupakan terakhir, disebut juga tahap presipitasi. Presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Hal tersebut dapat terlihat dengan adanya benang-benang endapan DNA pada dasar tabung dengan warna kecokelatan.

D. ACARA PCR

15

1. Metode Praktikum a. Alat 1) Apendof 2) PCR b. Bahan 1) 2) 3) 4) 5) 6) DNA sampel Larutan TE dH2O Premier Larutan RTG Aquadest Praktikum acara PCR dilaksanakan pada hari Selasa, 6 Desember 2011 pukul 13.00-17.00 WIB bertempat di Laboratorium Bioteknologi, Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta. 2. Hasil Pengamatan a. Mengambil sampel DNA dan dilarutkan dengan TE 50 mikroliter, kemudian digojog sampai larut.b. Melarutkan premier dengan tipe OPA 11 dengan dH2O dengan takaran 659

c. Waktu dan Tempat Praktikum

mikroliter. Dari larutan dH2O dan premier dijadikan 10 apendof, dan @ apendof masing-masing 65 mikroliter. c. Melarutkan RTG dengan aquadest 23 mikroliter, kemudian menimbang lagi 1 mikroliter larutan premier, lalu dibagi menjadi 2 apendof. d. Menambah 1 mikroliter DNA ke masing-masing apendof kemudian dirunning PCR 40 siklus. e. Mengelektroforesis hasilnya.

15

16

Gambar 2.1 Mesin PCR

Gambar 2.2 Hasil Visualisasi PCR

Gambar 2.3 Hasil PCR (Supernatan dan Pelet)

17

3. Pembahasan Polimerase Chain Reaction ( PCR) merupakan teknik yang sangat berguna dalam membuat salinan DNA. PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuan DNA tertentu disalin (jutaan kali) untuk diperbanyak (sehingga dapat dianalisis) atau dimodifikasi secara tertentu. Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk menambahkan situs enzim restriksi, atau untuk memutasikan (mengubah) basa tertentu pada DNA. PCR juga dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuen DNA tertentu dalam sampel. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Proses PCR untuk memperbanyak DNA melibatkan serangkaian siklus temperatur. PCR memanfaatkan enzim DNA polimerase yang secara alami memang berperan dalam perbanyakan DNA pada proses replikasi. Namun demikian, tidak seperti pada organisme hidup, proses PCR hanya dapat menyalin fragmen pendek DNA, biasanya sampai dengan 10 kb (kb=kilo base pairs=1.000 pasang basa). Fragmen tersebut dapat berupa suatu gen tunggal, atau hanya bagian dari suatu gen. Pelaksanaan praktikum acara PCR ini menggunakan metode PCR- dan alat yang digunakan yaitu PCR merupakan alat yang berfungsi untuk melakukan siklus amplifikasi DNA. Bahan yang digunakan adalah DNA slak bali yang telah diekstrak, kemudian ditambah dengan larutan TE yang berfungsi untuk memurnikan ekstrak DNA setelah disimpan. Bahan lain yang digunakan antara lain premier yang berfungsi sebagai penentu tempat penempelan dan pemanjangan dari nukleotida sintetis untuk melakukan elongasi. Premier yang digunakan adalah tipe OPA 11 dan larutan dH2O berfungsi sebagai pelarut atau pengencer, serta RTG (Ready To Go) yang berfungsi sebagai nukleotida sintetis yang akan mengkomplementasi pita DNA yang kosong.

18

Sebelum kita melakukan pengujian sebaiknya jika kita mengetahui tentang PCR terlebih dahulu. Seperti komponen yang dibutuhkan dalam pengujian, komponen PCR itu sendiri dan tahap/ prinsip kerja dari PCR itu sendiri. Adapun penjelasan dari masing-masing antara lain sebagai berikuta. Komponen-komponen yang dibutuhkan untuk melakukan pengujian dengan

PCR antara lain adalah:1) Sejumlah kecil molekul DNA, termasuk segmen DNA yang akan

diamplifikasi;2) Primer PCR, primer yang dibutuhkan ini berjumlah dua buah berupa

potongan pendek DNA single strand yang sesuai dengan sekuens yang akan diamplifikasi;3) Enzim yang diperlukan untuk mengatur salinan DNA; 4) Nukleotida yang dibutuhkan untuk membuat DNA baru; 5) Mesin PCR yang dibutuhkan untuk mengatur temperatur. Dengan

kelengkapan prasyarat di atas diharapakan proses PCR berjalan dengan semestinya. b. Komponen PCR Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah 1. Primer Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya

19

kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.

2. dNTP (deoxynucleoside triphosphate)

dNTP atau building blocks sebagai batu bata penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP. 3. Buffer Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase. 4. Ion Logam Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja.5. Ion logam monovalen, kalsium (K+). c. Prosedur atau Prinsip Kerja Reaksi Berantai Polimerase

Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 2030 kali siklus. Setiap siklus umumnya terdiri dari 3 tahap. Berikut adalah 3 tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus. 1) Denaturasi Tahap denaturasi DNA biasanya dilakukan pada kisaran suhu 92 95 oC. denaturasi merupakan proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal, ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan

20

agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat (patokan) bagi primer. Durasi tahap ini 12 menit.. Tahap denaturasi yang terlalu lama dapat mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim polymerase. Setelah terjadi pemisahan utas ganda menjadi utas tunggal, dilakukan penurunan temperatur pada tahap kedua sampai 4560C yang memungkinkan terjadinya penempelan.

2) Annealing Annealing adalah proses penempelan primer, dalam annealing ada sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka akan mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan. Suhu annealing yang terlalu rendah dapat mengakibatkan timbulnya pita elektroforesis yang tidak spesifik, sedangkan suhu yang tinggi dapat meningkatkan kespesifikan amplifikasi. Dalam Annealing terjadi proses kenaikan suhu hingga mencapai 740C. Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45 60 C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 12 menit. 3) Extension Dalam extention enzim polimerase bergabung bersama dengan nukleotida dan pemanjangan primer lengkap untuk sintesis sebuah DNA utas ganda. Tahapan Extensen juga disebut sintesi DNA. DNA yang diperoleh dari tahapan extension berperan sebagai template untuk tahapan siklus berikutnya dan kemudian DNA dapat mengganda. DNA dapat mengganda sampai jumlah yang sangat besar. Setelah itu DNA yang telah mengganda mengalami proses elektroferesis. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polimerase yang dipakai. Dengan

21

Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit. Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial. PCR dalam penerapanya di laboratorium melalui beberapa tahapan, antar lain yaitu:a) Dilakukan ekstraksi, sampel DNA, kemudian sampel DNA yang sudah

diekstraksi tersebut disentrifuse hingga memperoleh pelet atau butiran DNA. b) Tahapan kedua adalah proses penggandaan hasil ekstraksi dari DNA, enzim yang bekerja secara spesifik. Proses penggandaan ekstraksi DNA juga dapat dikenal dengan istilah amplifikasi DNA. c) Selanjutnya terjadi tahapan yaitu elektrolisis, dari tahapan elektrolosis dapat diketahui status sampel. Dalam melakukan pengujian sampel menggunakan metode PCR dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain: faktor kontaminasi silang, Umur reagen atau enzim yang dipakai, Jumlah enzim yang dipakai, Ketelitian saat poses ekstraksi, Kondisi larutan buffer dan larutan etidium bromida yang dipakai.

22

E. ACARA ELEKTROFORESIS 1. Metode Praktikum a. 1. Cetakan sisir 2. Chambet 3. PCR b. 1. Agarus 2. Aquadest 3. Larutan TAE 4. Etidium Bromida 5. Blue jus 6. Hasil dari PCR Bahan Alat

23

c.

Waktu dan Tempat Praktikum Praktikum acara Elektroforesis dilaksanakan pada hari Selasa, 29 November 2011 pukul 13.00-17.00 WIB bertempat di Laboratorium Bioteknologi, Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta.

2. Hasil a. Membuat agarus dengan menimbang 1 gram agarus. b. Membuat larutan TAE dengan takaran TAE 25 ml dan aquadest 225 ml. c. Mengambil larutan TAE sebanyak 100 ml, kemudian dilarutkan agarusnya dan dipanaskan sampai larut. d. Menunggu sampai hangat, lalu menambahkan Etidium Bromida sebagai pewarna agar dapat terlihat jelas sebanyak 2 mikrolitere. Memasukkan larutan tersebut ke dalam Chambet diatasnya, kemudian

diletakkan pada cetakan sisran untuk membentuk 12 lubang. f. Setelah memadat kemudian memasukkan ke dalam elektroforesis. Sisa larutan TAE dan aquadest diawal tadi dimasukkan pada alat elektroforesis. g. Menimbang lagi 100 mikroliter campuran TAE dan aquadest. Posisi agarus harus tenggelam agar panas pada elektroforesis merata. h. Mengambil 5 mikroliter hasil dari PCR dan blue jus 1 mikroliter (sebagai 22 pemberat), kemudian memasukkan pada lubang- lubang agarus. i. Menyalakan mesin elektroforesis dengan tegangan 80 volt. j. Hasil dpat dilihat ketika mencapai 1/3 agarus.

24

Gambar 3.1 Alat Elektroforesis

Gambar 3.2 Spektrofotometer

Gambar 3.3 Sumber arus listrik elektroforesis

Gambar 3.4 Fragmen DNA Daun Salak pada elektroforesis Gel agarosa 3. Pembahasan Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan memanfaatkan muatan

25

listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan. Elektroforesis berfungsi untuk membaca DNA yang telah diamplifikasi. Elektroforesis yang digunakan untuk pembacaan DNA adalah elektroforesis gel. Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis). Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel. Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak melalui matriks tersebut. Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp). Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida,

26

dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan. Proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif. Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang disebut fase diam dan fase bergerak (eluen). Fase diam berfungsi menyaring objek yang akan dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Sering kali ditambahkan larutan penyangga pada fase bergerak untuk menjaga kestabilan objek elektroforesis gel. Elektroda positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung aparat elektroforesis gel. Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada kolom (well) pada sisi elektroda negatif. Apabila aliran listrik diberikan, terjadi aliran elektron dan zat objek akan bergerak dari elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi-kisi gel berfungsi sebagai pemisah. Objek yang berberat molekul lebih besar akan lebih lambat berpindah. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna biru Coomassie (Coomassie blue) dapat digunakan

27

untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah diwarnai dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat. Cepat atau lambat proses running yang terjadi pada elektroforesis dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain : a) Kualitas DNA, b) Ukuran poripori pada agarose, c) Arus buffer pada saat elektroforesis. Kualitas DNA ini dapat dilihat berdasarkan ukuran molekul dan beratnya. Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Sedangkan berat DNA juga turut mempengaruhi, DNA yang terlalu berat maka proses runningnya akan semakin lambat, dan DNA yang terlalu ringan maka proses runningnya akan semakin cepat. Namun DNA yang terlalu ringan tidak baik sehingga perlu ditambahkan DNA loading sebagai pemberat. Semakin besar ukuran pori-pori pada agarose maka proses running akan berjalan semakin cepat, namun pori yang sangat rapat akan menurunkan kecepatan running. Pada saat elektroforesis, alat elektroforesis dihubungkan dengan arus listrik. Sehingga buffer yang ada pada alat elektroforesis akan dialiri oleh arus, maka arus ini harus diperhatikan besarnya (dinyatakan dalam ampere). Arus listrik ini harus sesuai dengan yang dibutuhkan, karena apabila tidak sesuai akan mengganggu jalannya proses elektroforesis. Hasil dari elektroforesis pita DNA tidak dapat terlihat, karena kemungkinan saat ekstrasi DNA tidak terlalu lembut sehingga masih terdapat kontaminan dan bahan yang digunakan jaringannya sudah rusak. F. KESIMPULAN DAN SARAN 1. Kesimpulan Berdasarkan praktikum Bioteknologi Pertanian ini dapat diambil kesimpulan antara lain :

28

a. DNA adalah penyusun asam nukleat yang ada di dalam tubuh makluk hidup. Pengujian DNA guna untuk mengetahui DNA dalam tubuh individu makhluk hidup. b. Digunakan bahan berupa daun muda karena mudah untuk dihaluskan dan dihaluskan agar tidak merusak struktur DNA. c. Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Untuk memisahkan DNA diperlukan senyawa kimia seperti: EDTA. d. Polimerase Chain Reaction ( PCR) merupakan teknik yang sangat berguna dalam membuat salinan DNA. PCR memanfaatkan enzim DNA polimerase yang secara alami memang berperan dalam perbanyakan DNA pada proses replikasi. e. Komponen PCR antara lain: molekul DNA, primer PCR, enzim, nukleotida, dan mesin PCR. f. Prinsip kerja PCR meliputi 3 tahap yaitu Denaturasi, Anneling, dan Extension. g. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. h. Elektroforesis berfungsi untuk membaca DNA yang telah diamplifikasi. biasanya digunakan untuk pembacaan DNA adalah elektroforesis gel. i. Gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda.

2.

Saran Koordinasi sesama co_assisten perlu ditingkat, di sini praktikum 27 bioteknologi tidak kondusif, tidak terkontrol, dan cenderung dadakan serta semrawut. Selain itu pelaksanaan praktikum sebaiknya dilakukan oleh masing-

29

masing kelompok sehingga praktikan mampu melaksanakan semua acara yang di praktikumkan.

DAFTAR PUSTAKA

30

Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2002. Molecular Biology of the Cell. Edisi ke-4. Garland Science: New York. ISBN 0-8153-3218-1 (versi online di NCBI Bookshelf) Brown, 1992. Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant Soil, 39, 205-207. Danardono, 2008. Optimalisasi Ekstraksi DNA Dan PCR-RAPD Pada Grevillea Spp. (Proteaceae). Jurnal. Biologi XIII (1) : 12 -16. Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA Isolation Procedure for Small Quantities of Fresh Leaf Tissue. Phytochem. Bull. 19: 11-15. Fessenden & Fessenden, 1986, Kimia Organik Jilid 1, Erlangga, Jakarta. Haliman, 2005. Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi atau Identifikasi Patogen Tumbuhan. Beberapa Metode Ekstraksi DNA. Pelatihan dan Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR. Malang. hlm. 43-50. James. 2010. Isolasi DNA. http://id.shvoong.com/. Diakses pada tanggal 25 Desember 2011. Khopkar, S.M., 2003, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta. Sidohadmadjojo, 1985, Spektroskopi, Liberty, Yogyakarta. Klug, 1994. Extraction of geminiviral DNA from ahighly mucilaginous plant (Abelmoschus esculentus). Plant Mol. Biol. Rep. 18: Wilkins, T.A. and Smart, L.B.. 1996 Isolation of RNA from Plant Tissue. Di dalam: Krieg, P.A. (ed). A Laboratory Guide to RNA. Isolation, Analysis and Synthesis. New York: Wiley Liss. Kusumawaty, D. 2008. Isolasi DNA Skala Kecil. Praktikum Biologi Molekul. Program Studi Biologi Jurusan Pendidikan Biologi UPI. Lengkong, E. F., Soeharsono, S. D. Runtunuwu dan A. Hartana,. 2001. Pengoptimuman Reaksi Berantai Polimerase DNA Tanaman Kelapa. Optimization of Polymerase Chain Reaction for Coconut Plant DNA. J.Hayati. 8(4): 121-123. Mustahib. 2009. Isolasi DNA. http://biologi.blogsome.com/. Diakses pada tanggal 25 Desember 2011. Nandariyah, Soemartono, W. T. Artama dan Taryono,. 2004. Keragaman Kultivar Salak (Salacca Zalacca G Agrosains. 6(2): 75-79. Sambrook J., Russel D.W. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Edisi ke-3. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY. ISBN 0-87969-577-3 Sudarmono, 2006. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi Pertama.Liberty. Yogyakarta.

31

Wilkins, T.A. and Smart, L.B.. 1996. Isolation of RNA from Plant Tissue. Di dalam: Krieg, P.A. (ed). A Laboratory Guide to RNA. Isolation, Analysis and Synthesis. New York: Wiley Liss. Yuwono, T. 2008. Bioteknologi Pertanian. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.