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La culture des bactéries

CIVEL / Microbiologie


I. Multiplication des bactéries

Bactérie mère

Allongement Invagination Division

2 bactéries filles

La scissiparité


II. Techniques d’étude des caractères culturaux

L’isolement :Obtention d’une colonie pure

(ensemble de clones bactériens)

En milieu solide : méthode des quadrants

méthode des quadrants

2 : Diviser la boîte de petri en 4 quadrants

3 : soulever le couvercle de la boite de Pétri et déposer l’inoculum (à l’aide de l’oese) sur une petite surface au point initial.

4 : stériliser l’oese et après refroidissement faire des stries serrées sur toute la surface des quadrants 1 et 2

5 : stériliser de nouveau l’oese et faire des stries serrées sur les quadrants 2 et 3.

6 : stériliser de nouveau l’oese et faire des stries serrées sur les quadrants 3 et 4.

7 : stériliser l’oese et placer la boite (correctement identifiée) à l’envers (couvercle vers le bas) dans l’étuve.

3

4

2

1

1

2 3

4Isolement sur milieux solides, par la méthode des quadrants

Zone riche

Colonies isolées

1

2 3

4- Le dépôt est effectué en zone 1-2, les colonies y sont serrées et petites.- La fin de l’isolement se fait en zone 4 : on retrouve des colonies isolées



Colonie isolée


(ensemble de clones bactériens) Variantes



Initiales, N°de poste, référence de la souche

Ne jamais écrire sur le couvercle !!






En milieu solide : méthode par épuisement


Face Profil


Gélose inclinée

Vue de profil

Vue de face

Stries







L’examen macroscopique

En milieu liquide

L’examen macroscopique : En milieu liquide

SURFACE : Voile, Anneau

CULOT : Couleur, adhérence

Importance du trouble +(bulles ? Homogénéïté, couleur…)

L’examen macroscopique : En milieu liquide







L’examen macroscopique

En milieu liquide

En milieu solide

L’examen macroscopique : Sur milieu solide

L’étude de colonies

L’examen macroscopique : Sur milieu solide

L’étude de colonies

Taille, forme, relief, contour,

aspect de la surface, transillumination,

consistance, couleur,

présence d’un halo…

Halo opaque

Halo clair

Centre noir (colonie)


III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture



III.1. Définitions

-Milieux de culture = préparation dans laquelle un microorganisme peut se multiplier. Il doit donc comporter tous les éléments nutritifs et les conditions physico-chimiques (pH, T°, concentration en ions…) nécessaires au développement du germe étudié.

-Ensemencer = c’est introduire un microorganisme dans ou sur un milieu de culture.

-Culture = c’est le résultat de la multiplication d’un microorganisme.

-Culture pure = milieu ne contenant qu’une seule espèce bactérienne. (Notion de clone bactérien)


III.2 : composition chimique moyenne sèche d'une bactérie

Éléments Pourcentage (en masse sèche)

Carbone 50

Oxygène 20

Azote 14

Hydrogène 8

Phosphore 3

Soufre 1

Potassium 1

Sodium 1

Calcium 0,5

Magnésium 0,5

Chlore 0,5

Fer 0,2

divers 0,3



III.3. Composition d’un milieu de culture

- Source de C et N et d’énergie (glucides (C), lipides (C et P), protides (C et N = peptone)) = elles fournissent de l’énergie et des matériels cellulaires aux bactéries.

Peptones (muscles, cervelle d'animaux, caséine, gélatine, soja...) : contient des aa, fact de croissance, ions, glucides !!

- Eléments minéraux = Na+, K+, Cl-, PO42-, Mg2+… Ils ont un rôle

dans l’équilibre physico-chimique (pression osmotique) et les besoins en minéraux de la bactérie (+ CoEnzyme)



III.3. Composition d’un milieu de culture

-Eau = (solvant indispensable à la vie sur terre) rôle majeur dans les réactions de solvatation, hydratation, réactions chimiques et enzymatiques se réalisent majoritairement en milieu aqueux.

-Facteurs de croissance = ils stimulent la croissance et sont indispensables à certaines bactéries dites exigeantes (éléments que les bactéries ne savent pas synthétiser).

-Agar = composé présent dans les milieux solides. C’est un polyoside extrait d’algues japonaise (=gélose) qui à la propriété d’être liquide à >56°C et solide à 40°C.

(- Autres : indicateur de pH, agents sélectifs…)



Exemple : la gélose ordinaire (GO)

Peptones = hydrolysat de protéines (source d’aa)

5 g

source d’A, N, énergie + facteurs de croissance + apporte des ions

Extrait de viande = macération de viande contenant des protéines, glucides, vitamines et sels minéraux.

1g

NaCl 5g Maintien de la pression osmotique

Agar 15g Solidifiant, support pour colonie

Eau Qsp 1LSolvatation, hydratation, permet les réactions biochimiques



Exemple : le citrate de Simmons

Citrate de Sodium 1g Seule source de C


Sulfate de magnésium 0,2g Cofacteur enzymatique

Dihydrogenophosphate 1gSystème tampon (limite les variations de pH)

Hydrogénophosphate de potassium

1g

Bleu de bromothymol 0,08g Indicateur de pH





IV. Les différents types de milieux de culture

Milieux empiriques

Milieux synthétiques

Milieux semi-synthétiques



Exemple : la gélose ordinaire (GO) – Nature du milieu : Milieu Empirique

Peptones = hydrolysat de protéines (source d’aa)

5 g

source d’A, N, énergie + facteurs de croissance + apporte des ions

Extrait de viande = macération de viande contenant des protéines, glucides, vitamines et sels minéraux.

1g






Exemple : le citrate de Simmons – Nature du milieu : Milieu synthétique

Citrate de Sodium 1g Seule source de C


Sulfate de magnésium 0,2g Cofacteur enzymatique

Dihydrogenophosphate 1gSystème tampon (limite les variations de pH)

Hydrogénophosphate de potassium

1g

Bleu de bromothymol 0,08g Indicateur de pH




III.4. Caractéristiques physico-chimiques

- pH = voisin de la neutralité (7 < pH < 7,5).

RQ : certaines bactéries peuvent soit alcaliniser soit acidifier le milieu au cours de leur croissance ce qui peut finir par entraver leur multiplication. On a donc recours à des systèmes tampons pour limiter les écarts de pH (Ex : système KH2PO4 et K2HPO4)

+ Conditions d’incubation :

- T°C = elle doit être choisie en fonction du germe étudié (en général 37°C)

- atmosphère = présence ou absence d’O2…



IV.1. Conditionnement

- Les milieux liquides = on parle de bouillon de culture.

- Les milieux solides = on parle de gélose. Ils peuvent être conditionnés en boite de Pétri ou en tube (gélose inclinée) / agar-agar

Isolement : Macroscopie / vérification de pureté



IV.2. Classification

421. Selon la composition

- Milieux empiriques = composition non connue exactement (extrait de viande…)

- Milieux synthétiques = composition qualitative et quantitative exactement connue.

- Milieux semi-synthétiques = la base est empirique et on additionne une molécule connue.




422. Selon l’utilisation

- Milieux de conservation = milieu en général très pauvre

- Milieux d’identification = milieux servant à identifier le germe (un caractère)

- Milieux d’isolement = milieux servant à séparer les bactéries contenues dans un échantillon polymicrobien pour pouvoir, par la suite, les étudier séparément.




On distingue :

a) les milieux d’isolement non sélectifs : permettent la culture de la plupart des bactéries.(GO, GTS, BCP…)Milieux usuel ou ordinaire : pour les microorganismes non exigeant (peptones, glucide, ions, eau)Milieux enrichis : addition de vitamines, sang...

b) les milieux sélectifs = contiennent un inhibiteur ou de conditions de culture défavorable qui empêche la culture des germes sauf celui qu’on étudie.


Les milieux sélectifs : Présence d’agents sélectifs

Agents sélectifs

natureEx de

milieuxBactéries inhibées

Cristal violet ColorantsDrigalski

Bactéries Gram positifDesoxycholate Dérivé des sels

biliairesBile

BEABactéries Gram

négatif (et certaines Gram positif)

Azide (de Sodium)

?

Drigalski

BEA

Les milieux sélectifs : Présence d’agents sélectifs

Agents sélectifs

natureEx de

milieuxBactéries inhibées

Cristal violet ColorantsDrigalski

Bactéries Gram positifDesoxycholate Dérivé des sels

biliairesBile

BEABactéries Gram

négatif (et certaines Gram positif)

Azide (de Sodium)

?

Acide nalidixique +

colimycineAntibiotiques

GS + ANC

Bactéries à Gram négatif

NaCl à 75g/L Sel Chapman

Gram- et certains Gram +

(Enterococcus et Streptococcus)

Cétrimide AntiseptiqueGélose au Cétrimide

Toutes bactéries sauf les

Pseudomonas (et quelques exeptions)

Drigalski

BEA

Chapman

Les milieux sélectifs : Présence d’ose et d’indicateur de pH



Milieux empiriques Milieux synthétiques Milieux semi-synthétiques

Milieux de conservation

Milieux d’identification

Milieux d’isolement non sélectifs

Milieux d’isolement sélectifs

Milieux d’enrichissement


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