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Instrução de Uso_XG-CVM-MB_Rv.02_DEZ.2017

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Instruções de Uso

Kit XGEN CHIKUNGUNYA IgM (XG-CVM-MB)

Kit de Sorologia para Detecção de Anticorpos IgM para vírus Chikungunya

1. USO PRETENDIDO

O kit XGEN CHIKUNGUNYA IgM é destinado para a detecção qualitativa de anticorpos IgM para o vírus

Chikungunya (CHIKV) em amostras de soro e plasma humano, através de imunoensaios - ELISA.

O kit pode ser utilizado em combinação com os seguintes equipamentos: lavadora, leitora e

incubadora de microplacas para imunoensaios - ELISA. Também pode ser utilizado em estações de trabalho

automatizadas.

PRODUTO PARA DIAGNÓSTICO DE USO IN VITRO.

2. INTRODUÇÃO

A Chikungunya (CHIKV) é uma doença viral transmitida por mosquitos infectados e foi descrita pela

primeira vez durante uma epidemia no sul da Tanzânia em 1952. É um vírus RNA pertencente ao gênero

Alphavirus, da família Togaviridae. O nome Chikungunya deriva-se de uma palavra da linguagem

Kimakonde, com o significado de “tornar-se contorcido”, descrevendo assim a aparência encurvada de

pacientes que sofrem com dores nas articulações (artralgia) quando são infectados pelo vírus.

É caracterizada pelo começo abrupto de febre, frequentemente acompanhado de dores fortes nas

articulações. Outros sinais e sintomas comuns incluem dores musculares, dor de cabeça, náuseas, fadiga e

erupções cutâneas. A dor nas articulações geralmente é muito debilitante, podendo durar poucos dias ou

prolongar-se durante meses. Assim, o vírus pode causar doença aguda, subaguda e crônica.

A maioria dos pacientes se recupera completamente, mas em alguns casos a dor nas articulações pode

prolongar-se por meses ou até anos. Alguns casos de complicações nos olhos, neurológicos,

gastrointestinais e cardíacos foram relatados. Complicações sérias não são comuns, mas em pessoas idosas

a doença pode levar a morte. Geralmente os sintomas são moderados nos indivíduos infectados e a

infecção pode passar despercebida ou ser mal diagnosticada em áreas que também possuem incidência do

vírus da Dengue.

O CHIKV foi identificado em mais de 60 países da Ásia, África, Europa e Américas. O vírus é transmitido

através das picadas de mosquitos fêmeas infectadas e o início da doença geralmente ocorre entre 4 e 8

dias, mas pode variar de 2 a 12 dias. Testes sorológicos como o ensaio de ELISA podem confirmar a

presença de anticorpos IgG e IgM anti-CHIK.

3. PRINCÍPIO DO TESTE

O kit XGEN CHIKUNGUNYA IgM se baseia em reações antígeno-anticorpo detectáveis através de

reações enzimáticas. As microplacas são revestidas com antígeno sintético imunodominante derivado da

região ENV do CHIKV. Na primeira incubação, a fase sólida é tratada com amostras diluídas diretamente nos

poços e se houver anticorpos no soro em teste ocorrerá a ligação antígeno-anticorpo. Após a lavagem,

todos os componentes presentes nos poços são descartados, mantendo apenas a ligação antígeno-

anticorpo.

Na segunda incubação, a ligação antígeno-anticorpo é detectada através da adição de anticorpos

dirigido contra imunoglobulinas da espécie (anti hIgM) marcados com peroxidase (HRP). A enzima

capturada na fase sólida, que atua sobre a mistura de substrato/cromogênio, gera um sinal óptico que é

proporcional à quantidade de anticorpos anti-CHIK IgM presentes na amostra.


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A neutralização do anti-CHIKV IgG, realizada diretamente no poço na primeira incubação é feita no ensaio com o objetivo bloquear interferências dessa classe de anticorpos na determinação de IgM.

4. COMPONENTES

O formato padrão do kit contém reagentes para 96 testes.

COMPONENTES CONTEÚDO QUANTIDADE

MICROPLACA CHIKV IgM Microplaca para Reação 12 strips x 8 poços

CONTOLE NEGATIVO CHIKV IgM Controle Negativo 1 frasco x 2,0 mL

CONTROLE POSITIVO CHIKV IgM Controle Positivo para anticorpos IgM para

vírus Chikungunya 1 frasco x 2,0 mL

TAMPÃO DE LAVAGEM CONCENTRADO 20x

Mistura de Tampão 1 frasco x 60 mL

CONJUGADO ENZIMÁTICO CHIKV IgM

Anticorpo policlonal humano IgM marcado com peroxidase (HRP)

1 frasco x 16 mL

CROMÓGENO/ SUBSTRATO Substância Cromógena 1 frasco x 16 mL

SOLUÇÃO STOP Solução de Parada de Reação 1 frasco x 15 mL

DILUENTE DE AMOSTRAS Solução para Diluição de Amostras 2 frascos x 60 mL

REAGENTE NEUTRALIZANTE Solução de Neutralização 1 frasco x 8 mL

FILME SELADOR Filme Selador Adesivo 2 unidades

5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE

O kit XGEN CHIKUNGUNYA IgM deve ser armazenado e transportado em sua embalagem original em

temperatura controlada entre 2°C e 8°C e é estável até a data de vencimento indicada no rótulo.

6. MATERIAIS NECESSÁRIOS, MAS NÃO FORNECIDOS

✓ Micropipetas calibradas (10 μL < volume < 1.000 μL);

✓ Água grau EIA Reagente (bidestilada ou deionizada, tratada com carvão vegetal);

✓ Timer com 60 minutos ou mais;

✓ Papéis absorventes;

✓ Tubos de ensaio 12 x 75 mm ou microtubos de 1,5 mL para realizar a diluição das amostras;

✓ Incubador Termostático de Microplacas ELISA calibrado (banho seco ou banho-maria) configurado

a +37°C (± 0,5°C de tolerância);

✓ Leitor de Micropoços ELISA calibrado com filtros de 450 nm (leitura) e com 620-630 nm (branco);

✓ Lavadora calibrada de microplacas de ELISA;

✓ Agitador tipo Vortex ou similar;

✓ Ponteiras estéreis descartáveis com filtro;

✓ Luvas descartáveis sem talco.

7. AVISOS E PRECAUÇÕES

1. O kit deve ser utilizado somente por pessoal técnico qualificado e devidamente treinado.

2. Todo o pessoal envolvido na execução do teste deve utilizar equipamentos de proteção individual.

O uso de objetos perfuro-cortantes deve ser evitado. Todo o pessoal envolvido deve ser treinado em

procedimentos de biossegurança, como recomendado pela legislação em vigor.

3. Os responsáveis pelo manuseio de amostras devem ser vacinados contra tétano, difteria, hepatite

B e os estabelecidos no PCMSO, de acordo com a Norma Regulamentadora 32.


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4. O ambiente do laboratório deve ser controlado, a fim de evitar contaminantes como poeira ou

agentes microbianos transportados pelo ar.

5. Proteger o Cromógeno/Substrato da iluminação forte e evitar vibração na superfície da bancada

onde o teste é realizado.

6. Após o recebimento, armazenar o kit entre 2°C e 8°C, em uma geladeira com temperatura

controlada.

7. Não trocar os componentes entre diferentes lotes dos kits. Recomenda-se que os componentes

entre dois kits do mesmo lote também não sejam trocados.

8. Verificar se os reagentes estão limpos e não contém partículas visíveis pesadas ou grumos. Caso

contrário, comunicar o supervisor do laboratório para iniciar os procedimentos necessários para reposição

do kit.

9. Evitar contaminação cruzada das amostras utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as após

cada amostra.

10. Evitar contaminação cruzada entre os reagentes do kit utilizando ponteiras descartáveis e

trocando-as entre o uso de cada uma.

11. Não utilizar o kit após a data de validade apresentada na etiqueta externa e etiquetas internas dos

frascos.

12. Tratar todas as amostras como potencialmente infectantes. Todas as amostras de soro humano,

sangue, plasma devem ser manuseadas em Nível de Biossegurança 2, como recomendado pela legislação

em vigor.

13. O uso de plásticos descartáveis é recomendado na preparação dos componentes líquidos ou na

transferência dos componentes para sistemas automatizados, a fim de evitar contaminação cruzada.

14. Os resíduos gerados durante a utilização do kit devem ser descartados, de acordo com as diretrizes e regras de descarte de resíduos químicos e substâncias biológicas do laboratório, conforme legislação em vigor. Em particular, os resíduos líquidos gerados no processo de lavagem a partir reagentes e das amostras devem ser tratados como potencialmente infectantes e inativados antes do descarte.

15. Os respingos provocados acidentalmente durante o manuseio das amostras devem ser absorvidos

por lenços de papel umedecidos com hipoclorito, e em seguida, com água. Os lenços devem ser

descartados em recipientes específicos para resíduos laboratoriais.

16. A Solução STOP é uma substância irritante (H315, H319; P280, P302 + P352, P332 + P313, P305 +

P351 + P338, P337 + P313, P362 + P363). Em caso de respingo, lavar a superfície repetidas vezes com água.

17. Outros resíduos gerados devem ser manuseados como potencialmente infectantes e descartados,

de acordo com as diretrizes e regras relativas a resíduos laboratoriais.

8. AMOSTRAS: PREPARAÇÃO E RECOMENDAÇÕES

O ensaio é para uso com anticorpos IgM de amostras de soro e plasma humano.

1. O sangue deve ser colhido assepticamente por punção venosa. O plasma e o soro devem ser preparados utilizando as técnicas padrão de preparação de amostras para análises clínicas. Nenhuma interferência foi observada em amostras com citrato, heparina e EDTA.

2. Evitar a adição de qualquer conservante nas amostras, especialmente azida de sódio, pois este reagente pode afetar a atividade enzimática do conjugado, gerando resultados falso-negativos.

3. As amostras devem estar claramente identificadas com nomes ou códigos para evitar a interpretação errada dos resultados.

4. Amostras hemolisadas e visivelmente lipêmicas devem ser descartadas, pois podem gerar resultados errados. Amostras contendo resíduos de fibrina, partículas pesadas, corpos ou filamentos devem ser descartadas, pois podem gerar falsos resultados.


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5. As amostras de soro ou plasma podem ser armazenados entre 2°C e 8°C por até 7 dias após a coleta. Para períodos mais longos, as amostras podem ser congeladas a -20°C por vários meses. As amostras não devem ser congeladas e descongeladas mais de uma vez, pois esta prática pode gerar partículas que podem afetar os resultados.

6. Se alguma partícula estiver presente, centrifugar a 2.000 rpm por 20 minutos ou utilizar um filtro de 0,2 – 0,8 (µm) para limpar a amostra.

9. PREPARAÇÃO DOS COMPONENTES E AVISOS

MICROPLACAS CHIKV IgM

12 strips x 8 poços revestidos com antígenos sintéticos CHIK ENV. Deixar a microplaca atingir a temperatura ambiente antes de abrir o pacote por, pelo menos, 30

minutos. Verificar se o dessecante não está verde escuro, indicando um defeito de fabricação. Neste caso, contatar o Serviço de Atendimento ao Cliente.

As tiras não utilizadas devem ser guardadas novamente na embalagem de alumínio, junto com dessecante fornecido, firmemente fechada e armazenada entre 2°C a 8°C.

Após a abertura da embalagem, as tiras são estáveis até o indicador de umidade, localizado dentro da embalagem do dessecante, passar de amarelo para verde.

CONTROLE NEGATIVO CHIKV IgM

Contém 1% de proteína de soro de cabra, 10 mM de tampão citrato de sódio pH 6,0 ± 0,1, 0,5% de

Tween 20, 0,09% de azida de sódio e 0,1% de Kathon GC.

Solução pronta para uso. Homogeneizar em agitador tipo vortex.

CONTROLE POSITIVO CHIKV IgM

Contém 1% de proteína de soro de cabra, anti CHIKV IgG humano inativado, 10 mM de tampão citrato de sódio pH 6,0 ± 0,1, 0,5% de Tween 20, 0,09% de azida de sódio e 0,1% de Kathon GC.


TAMPÃO DE LAVAGEM CONCENTRADO 20x

Contém 10 mM de tampão fosfato pH 7,0 ± 0,2, 0,05% de Tween 20 e 0,05% de Kathon GC.

Diluir o tampão de lavagem para uma solução 1x de acordo com a quantidade de amostras a ser testada (por exemplo: 60 mL da solução 20x concentrada em 1.200 mL de água grau EIA). Misturar gentilmente antes da utilização. Alguns cristais de sal podem ficar no fundo do frasco, atente-se para dissolver todo o conteúdo ao preparar a solução.

Evitar a formação de bolhas no preparo do tampão, pois podem diminuir a eficiência da solução.

Nota: Uma vez diluída, a solução de lavagem é estável durante 7 dias armazenada entre 2°C a 8°C.

CONJUGADO ENZIMÁTICO IgM CHIKV

Contém anticorpos policlonais conjugados com peroxidase de rábano para IgM humano, 5% de BSA, 10 mM tampão Tris pH 6,8 ± 0,1. 0,1% de Katon GC e 0,02% de sulfato de gentamicina.


Cuidado para não contaminar o líquido com substâncias oxidantes, pó ou microrganismos. Se for necessária a transferência deste componente, utilizar frascos estéreis.


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CROMÓGENO/SUBSTRATO

Contém 50 mM de tampão citrato-fosfato pH 3,5 a 3,8, 4% de dimetilsulfóxido. 0,03% de tetra-metil-benzidina (TMB) e 0,02% de peróxido de hidrogênio (H2O2).


Não expor o componente a luz forte, agentes oxidantes e superfícies metálicas. Cuidado para não contaminar o líquido com substâncias oxidantes, pó ou microrganismos. Se for necessária a transferência deste componente, utilizar frascos estéreis.

DILUENTE DE AMOSTRA

Contém 2% de caseína, 10 mM de tampão citrato de sódio pH 6,0 ± 0,1, 0,2% de Tween 20, 0,09% de azida de sódio e 0,1% de Kathon GC.


REAGENTE NEUTRALIZANTE

Contém anti hlgG de cabra, 2% de caseína, 10 mM de tampão citrato de sódio pH 6,0 ± 0,1, 0,09% de

azida de sódio e 0,1% de Kathon GC.


SOLUÇÃO STOP

Contém 0,3 M de solução H2SO4.


Atenção: Irritante (H315, H319; P280, P302 + P352, P332 + P313, P305 + P351 + P338, P337 + P313,

P362 + P363).

LEGENDA:

AVISO – Declaração H

H315 – Provoca irritação cutânea.

H319 – Provoca irritação ocular grave.

PRECAUÇÃO – Declaração P

P280 – Usar luvas e vestuário de proteção e proteção ocular e facial.

P302 + P352 – Se na pele, lavar com água abundante e sabão.

P332 + P313 – Em caso de irritação cutânea, procurar assistência médica.

P305 + P351 + P338 – Se nos olhos, lavar cuidadosamente com água durante vários minutos. Se estiver com lentes de contato

fáceis de retirar, removê-las e continuar a lavar com água.

P337 + P313 – Caso a irritação ocular persista, procurar assistência médica.

P362 + P363 – Retirar a roupa contaminada e lavá-la antes de reutilizar.

10. EQUIPAMENTOS E FERRAMENTAS USADOS EM COMBINAÇÃO COM O KIT

1. Micropipetas

Devem estar calibradas para distribuir o volume correto necessário para o teste e devem ser submetidas a regulares descontaminações das partes que podem acidentalmente entrar em contato com a amostra. As micropipetas devem ser certificadas e devem estar com seus certificados válidos a fim de mostrar precisão de 1% e exatidão de ± 5%.


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2. Incubadora para Imunoensaios - ELISA

A incubadora para Imunoensaios - ELISA deve ser configurada a +37° C (tolerância de ± 0,5°C) e ser regularmente verificada para assegurar a manutenção da temperatura correta. Tanto o banho-seco quanto o banho-maria são adequados para as incubações, desde que os equipamentos sejam validados para a incubação de testes de ELISA. O tempo de incubação possui tolerância de ± 5%.

3. Lavadora para Imunoensaios - ELISA

A lavadora de ELISA é extremamente importante para o desempenho geral do ensaio. A lavadora deve ser cuidadosamente validada e corretamente otimizada usando os controles do kit e painéis de referência. Normalmente 5 ciclos de lavagem (aspiração + dispensação de 350 µL/ poço de solução de lavagem = 1 ciclo) são suficientes para assegurar que o ensaio tenha o desempenho esperado. É sugerido um intervalo de 20 - 30 segundos entre ciclos. A fim de configurar corretamente os números, é recomendado realizar um ensaio com os controles do kit e amostras de referência negativas e positivas bem caracterizadas e verificar os resultados, de acordo com os valores reportados no Item 14. A calibração periódica dos volumes dispensados e manutenção da lavadora devem ser realizadas de acordo com as instruções do fabricante.

4. Leitora de Imunoensaios - ELISA

O leitor de microplacas imunoensaios - ELISA deve conter um filtro de leitura de 450 nm e um filtro de 620 - 630 nm para fins de supressão. O desempenho padrão deve apresentar (a) largura de banda ≤ 10 nm; (b) faixa de absorção de 0 a ≥ 2,0; (c) linearidade ≥ 2,0; (d) repetibilidade ≥ 1%. O sistema óptico do leitor deve ser calibrado regularmente para garantir que a densidade óptica seja medida corretamente. Deve ser mantido regularmente de acordo com as instruções do fabricante.

5. Estação de Trabalho Automatizada

Quando uma estação de trabalho automatizada for utilizada, todos os passos críticos (dispensação, incubação, lavagem, leitura e manuseio de dados) devem ser cuidadosamente configurados, calibrados, controlados e regularmente inspecionados para que os valores estejam conforme o reportado no Item 14. O protocolo do ensaio deve ser instalado no sistema operacional da unidade e validado para a lavagem e leitura. Além disso, a estação de trabalho que faz o manuseio de líquidos (aspiração, dispensação e lavagem) deve ser validada e configurada corretamente. Deve-se ter uma atenção particular para evitar o extravasamento de líquido (carry over) das agulhas utilizadas na dispensação e lavagem. Isso deve ser estudado e controlado para minimizar a possibilidade de contaminação de poços adjacentes. O uso das estações de trabalho automatizadas é recomendado para triagem de sangue quando o número de amostras testadas excederem 20 - 30 unidades por corrida.

Nota 1: Ao utilizar equipamentos automáticos, no caso de o suporte de frasco do instrumento não encaixar com os frascos disponibilizados no kit, transferir a solução para frascos apropriados e identificar com a mesma etiqueta do frasco original. Essa operação é importante, pois pode evitar troca de conteúdo dentro dos frascos. Quando o teste acabar, retornar os frascos com etiquetas para temperatura 2 a 8°C, firmemente fechados.

Nota 2: O Serviço de Atendimento ao Cliente oferece suporte para o usuário na configuração e checagem de

instrumentos usados concomitantemente com o kit, para assegurar que os requerimentos descritos sejam

cumpridos. O suporte também é oferecido para a instalação de novos instrumentos a serem utilizados com o kit.

11. CONTROLE PRÉ-ENSAIO E OPERAÇÕES

1. Verificar a data de validade do kit impressa na etiqueta externa da caixa do kit.

2. Verificar se os componentes líquidos não estão contaminados por partículas visíveis a olho nu ou

grumos.


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3. Checar se o Cromogênio/Substrato é incolor ou azul claro, aspirando um pequeno volume do

componente com uma pipeta de plástico transparente estéril. Observar se há ruptura na caixa de

transporte e se não há derramamento de líquido dentro da caixa.

4. Diluir o conteúdo do Tampão de Lavagem Concentrado 20x conforme descrito no Item 9.

5. Deixar os outros componentes atingirem a temperatura ambiente.

6. Configurar a incubadora ELISA a 37°C e preparar a lavadora de ELISA por meio de priming com a

solução de lavagem diluída de acordo com as instruções do fabricante. Configurar o número

certo de ciclos de lavagem.

7. Verificar se o leitor de ELISA foi ligado por, pelo menos, 20 minutos antes da leitura.

8. Ao utilizar uma estação de trabalho automatizada, ligar a estação, verificar a configuração e checar

se o protocolo de ensaio correto está sendo utilizado.

9. Verificar se as micropipetas estão configuradas para o volume necessário.

10. Verificar se todos os outros equipamentos estão prontos para uso.

11. Em caso de problemas não continuar o teste e comunicar ao supervisor do laboratório.

12. PROTOCOLO

O ensaio deve ser realizado de acordo com as instruções abaixo. Manter o mesmo tempo de incubação

para todas as amostras em teste.

1. Diluir as amostras 1:101 em um microtubo/placa de diluição (exemplo: 1.000 µL de Diluente de

Amostra + 10 µL de amostra). Os Controles já estão prontos para uso. Misturar cuidadosamente

todos os componentes líquidos no vortex.

2. Colocar o número necessário de strips no suporte de micropoços. Deixar o poço A1 vazio para o

branco.

3. Dispensar 50 µL de Reagente Neutralizante em todos os poços, exceto nos poços usados para o

branco.

Dispensar 100 µL de Controle Negativo em triplicata, 100 µL de Controle Positivo em simplicata. A seguir,

dispensar 100 µL das amostras diluídas em cada poço de acordo com o mapa de trabalho.

4. Incubar a microplaca por 60 minutos a +37°C.

Nota: as tiras devem ser seladas com o filme selador fornecido somente quando o teste for realizado

manualmente. Não selar as tiras quando forem utilizados sistemas automatizados.

5. Lavar os micropoços 4-5 vezes: aspiração + dispensação de 350 µL/ poço de solução de lavagem.

6. Pipetar 100 µL do Conjugado Enzimático em cada poço, exceto no poço A1, e selar com o filme

selador.

Nota: cuidado para não tocar a superfície interior de cada poço com a ponteira preenchida com a Enzima

Conjugada. Pode ocorrer contaminação.


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7. Incubar a microplaca por 60 minutos a +37°C.

8. Lavar os micropoços conforme o passo 6.

9. Pipetar 100 µL do Cromogênio/Substrato em cada poço, incluindo o A1. Incubar a placa em

temperatura ambiente (+18°C a +24°C) por 20 minutos no escuro.

Nota: não expor diretamente a luz forte. Pode ser gerada uma alta interferência de fundo (background).

10. Pipetar 100 µL da Solução STOP em todos os poços. A adição da solução irá mudar a cor do

controle positivo e amostras positivas de azul para amarelo.

11. Medir a intensidade da cor da solução em cada poço na leitora em filtro de 450 nm (leitura) e de

620 – 630 nm e o branco no poço A1.

Notas Gerais Importantes:

1. Se o segundo filtro não estiver disponível, assegurar que não há impressões digitais presentes na

parte inferior do micropoço antes da leitura a 450 nm. As impressões digitais podem gerar

resultados falsos positivos na leitura.

2. A leitura deve ser realizada logo após a adição da Solução STOP e de não mais do que 20 minutos

após a sua adição. Há chances de oxidação do cromógeno podendo levar a um elevado

background.

13. ESQUEMA DE ENSAIO

Método Operações

Reagente Neutralizante

Controles

Amostras diluídas 1:101

50 µL

100 µL

100 µL

1ª Incubação 60 minutos

Temperatura +37°C

Passo de lavagem 4-5 ciclos

Conjugado Enzimático 100 µL


Temperatura +37°C

Passo de Lavagem 4-5 ciclos

Cromógeno/Substrato 100 µL


Temperatura Ambiente

Solução STOP 100 µL

Leitura OD 450 nm

Um exemplo de esquema de dispensação para análise segue abaixo:


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Microplaca

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A BCO A4

B CN A5

C CN A6

D CN A7

E CP A8

F A1 A9

G A2 A10

H A3 A11

Legenda: BCO = Branco; CN = Controle Negativo; CP= Controle Positivo; A1 – A11 = Amostras.

14. CONTROLE DE QUALIDADE INTERNO

Uma verificação é realizada nos controles sempre que o kit for utilizado a fim de verificar se os valores

OD450 nm estão como esperados e informados na tabela abaixo:

Verificação Requisitos

Poço em branco < 0,100 OD450 nm

Controle Negativo (CN) < 0,200 OD450 nm após blanking

Controle Positivo (CP) OD450 nm > 0,500

15. CÁLCULO DO VALOR DE CORTE (CUT-OFF)

Se o teste for validado conforme Item 14, os resultados das amostras são calculados por meio de cut-

off determinado pela média de valor OD450 nm do controle negativo (NC), utilizando a seguinte fórmula:

O valor de cut-off encontrado para o teste é usado para a interpretação dos resultados que serão

descritos abaixo.

Nota: Quando o cálculo dos resultados for feito pelo sistema operacional de uma estação de trabalho automatizada,

tenha certeza de que a formulação adequada está sendo utilizada para calcular o valor de corte e assim gerar uma

interpretação correta de resultados.

16. INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS

Os resultados dos testes são interpretados como proporção da amostra OD450 nm (S) e o valor de

corte (Co), ou S/Co, de acordo com a tabela a seguir:

S/Co Interpretação

< 0,9 Negativo

0,9 – 1,1 Indeterminado

> 1,1 Positivo


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Um resultado negativo indica que o paciente não desenvolveu anticorpos IgM para CHIKV. O resultado

positivo é indicativo de infecção em curso por CHIKV. Qualquer paciente que tiver um resultado

indeterminado deve ser testado novamente. A segunda amostra deve ser coletada do paciente cerca de 1-2

semanas depois e examinada.

17. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE

A sensibilidade e especificidade diagnóstica foram calculadas por meio de um painel de amostras

derivadas de pessoas que tiveram sinais clínicos de infecção por CHIKV. Para a sensibilidade foram avaliadas

cerca de 44 amostras positivas e a especificidade foi determinada através da análise de 400 amostras

negativas coletadas de pacientes normais e doadores de sangue. Um painel de amostras potencialmente

interferentes (RF+, hemolisadas e lipêmicas) também foram examinadas. Não foram observadas

interferências nas amostras examinadas.

Um painel de amostras positivas para anticorpos contra flavivírus (anticorpos para dengue, Zika e vírus

Nilo do Oeste) foi testado. Foi observado reações cruzadas.

Plasmas derivados de diferentes técnicas de preparação (citrato, EDTA e heparina) e soros foram

utilizados para determinar a especificidade. Não foi observada nenhuma interferência em relação ao

método de preparação das amostras.

Amostras congeladas também foram testados para verificar se o congelamento de amostras interfere

no desempenho do teste. Nenhuma interferência foi observada. A avaliação do desempenho forneceu os

seguintes valores:

SENSIBILIDADE > 98%

ESPECIFICIDADE > 98%

Reprodutibilidade:

A reprodutibilidade foi calculada em duas amostras examinadas em replicatas e em diferentes corridas. Os resultados são apresentados na tabela abaixo:

Valores Médios

N = 144 Amostras Negativas Amostras Positivas

OD450 nm 0,037 1,485

Desvio Padrão 0,006 0,068

Coeficiente de variação% 11,5 5,1

18. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS

PROBLEMA AÇÃO CORRETIVA RECOMENDADA

Poço em branco > 0,100 OD450 nm 1. Verificar se o Cromógeno/Substrato não foi

contaminado durante o ensaio.


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Controle Negativo (CN) > 0,200 OD450 nm Após Blanking

1. Verificar se as configurações do procedimento de

lavagem e enxágue foram validados no estudo de pré-

qualificação.

2. Verificar se a solução de lavagem apropriada foi

utilizada e se a lavadora foi preparada (primed) com a

solução antes do uso.

3. Verificar se nenhum erro foi cometido no procedimento

de ensaio (dispensação do controle positivo ao invés do

controle negativo);

4. Verificar se nenhuma contaminação do controle

negativo ou dos seus poços ocorreram devido a amostras

positivas, por via de respingos ou do conjugado

enzimático.

5. Verificar se as micropipetas não foram contaminadas

com amostras positivas ou com o conjugado enzimático.

6. Verificar se agulhas da lavadora não estão bloqueadas

ou parcialmente obstruídas.

Controle Positivo < 0,500 OD450 nm após Blanking

1. Verificar se o procedimento de lavagem e se as

configurações da lavadora estão validadas conforme o

estudo de pré-qualificação.

2. Verificar se a solução de lavagem apropriada foi

utilizada e se a lavadora foi preparada (primed) com a

solução antes do uso.

3. Verificar se nenhum erro foi cometido durante o

procedimento de ensaio.

4. Verificar se nenhum controle negativo foi utilizado por

engano.

5. Verificar se houve uso de microplaca com as dimensões

equivocadas.

6. Verificar se houve alguma contaminação externa no

controle positivo.

Se um ou mais dos problemas descritos na tabela acima acontecer, depois da investigação, informe

qualquer problema residual ao supervisor para futuras ações

19. LIMITAÇÕES

Devido à conhecida alta homologia genética do CHIKV com os outros flavivírus como o vírus Zika e

dengue, observaram-se reações cruzadas nas populações afetadas por essas infecções (principalmente

pacientes de regiões endêmicas). O ensaio deve, em princípio, ser utilizado apenas para testar indivíduos

que satisfaçam os critérios clínicos (por exemplo: sinais e sintomas clínicos associados à infecção pelo

CHIKV) e/ou critérios epidemiológicos (por exemplo: histórico de residência ou viagem a uma zona

geográfica com transmissão ativa do CHIKV no momento da viagem, ou outros critérios epidemiológicos).

Os resultados do ensaio são então úteis para a identificação presuntiva de anticorpos IgM para o vírus

Chikungunya. Resultados positivos e indeterminados isolados não são definitivos para diagnóstico de

infecção pelo vírus Chikungunya.


12

Falsa positividade foi avaliada como menos de 2% da população normal. Amostras congeladas

contendo partículas de fibrina ou agregados podem geram resultados falso-positivos. Reações cruzadas

com outros vírus correlatos foram observadas em menos de 2% das amostras positivas.

Foi observado que amostras congeladas contendo partículas de fibrina e grumos, após

descongelamento, geram resultados falsos. Estas amostras devem ser testadas após filtração ou

centrifugação.

20. GARANTIA DA QUALIDADE

A Mobius Life Science fornece garantia de todos os produtos por ela revendidos dentro dos seguintes

termos:

GARANTIA

O produto KIT XGEN CHIKUNGUNYA IgM é garantido pela Mobius contra defeitos de produção pelo

período de validade do produto, salvo especificações em contrário a constar da proposta.

• A garantia abrange defeitos de produção.

EXCEÇÕES NA GARANTIA

• Todos os produtos com defeitos oriundos de mau uso, imperícia, conservação ou armazenagem

inadequada.

EXTINÇÃO DA GARANTIA

• Quando não for utilizado de acordo com sua finalidade de aplicação.

21. INFORMAÇÕES DO FABRICANTE

Mobius Life Science Comércio de Produto para Laboratórios Ltda.

Rua Paraíso do Norte, 866 – Pinhais – PR - CEP: 83.324-221

Telefone: (41) 2108-5296

E-MAIL: [email protected] | WEBSITE: www.mobiuslife.com.br

CNPJ: 04.645.160/0001-49

22. REGISTRO ANVISA

80502070054

23. RESPONSÁVEL TÉCNICA

Flávia Rosenstein Schiel

CRBio-07 34.360/07-D

mailto:[email protected]

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