jochen harbott, onkogenetisches labor, abt. pädiat. hämatol./onkol., gießen zytogenetik der...

Jochen Harbott, Onkogenetisches Labor, Abt. Pädiat. Hämatol./Onkol., Gießen

Zytogenetikder Non-Hodgkin-

Lymphome des Kindes- und Jugendalters


pro-B common prä-B B-ALL T-ALL AUL mixed

Chromosomale Aberrationen bei ALL


t(8;14)(q24;q32)

Chromosomale Aberrationen

bei B-NHL/B-ALL

t(8;22)(q24;q11)

t(2;8)(p11;q24)

c-MYC IgH, Ig, Ig


t(2;5)(p23;q35)

Chromosomale Aberrationen

bei ALCL

Bruchpunkte der Partnerchromosomen bei varianten 2p23-Translokationen

2 5


Aberrationen in T-Zell-Lymphomen

Weitere Translokationent(8;14)(q24;q11)t(11;14)(p15;q11)

14q11 TCRa

t(10;14)(q24;q11)

t(1;14)(p32;q11)

inv(14)(q11q32)

t(11;14)(p13;q11)

Partnergene

TAL1 1p32

HOX11 10q24

RHOM2 11p13

TCL1 14q32

MYC 8q24

LMO1 11p15


Aberrationen in T-Zell-Lymphomen

Aberration Partnergent(1;7)(p34;q35) LCKt(7;10)(q35;q24) HOX11t(7;19)(q35;p13) LYL1

7q35 TCRß


Genetische Diagnostikklassische Zytogenetik

G-, R-, Q-, C-BandenfärbungMolekulare Zytogenetik

Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Chromosomen-Painting (WCP) Zentromer-Sonden YAC and Cosmid-Sonden 24-Farben-FISH (SKY/M-FISH)

Comparative genomic hybridization (CGH) CGH auf Chromosomen Array CGH

Molekulargenetik Long distance (LD-) PCR reverse transcriptase (RT-) PCR real time quantitative (RQ-) RT-PCR


Zytogenetik Versand Zellgewinnung

24 Std.-Kultur Zugabe von Colchizin

Herstellung der Präparate Hypotone Phase Fixieren in Alkohol:Eisessig 3:1 Auftropfen

Färbung G-Banden-Färbung

Auswertung Computergesteuerte Bildverarbeitung

Voraussetzung: genügend vitale Zellen


Nachweis von 8q24-Aberrationen mit break-apart-

Sonde

MYC normal

MYC-Translokation


24-Farben-FISH

43~45,X,-Y,der(1)t(1;5)(q10;?p10),+der(1)t(1;5)(q10;?p10),del(6)(q15),der(8)t(8;13)(p?;q?)t(8;22)(q24;q11),-10,-15,del(16)(q13),der(22)t(8;22)(q24;q11),+mar,inc[cp4]/43~45,idem,-der(22)t(8;22)(q24;q11),+mar,inc[cp3]/46,XY[2]


Tumor-DNA

Referenz-DNA

DNA-VerlustzB Monosomie, Deletion

DNA-ZugewinnzB Trisomie, Duplikation

Comparative Genomic Hybridization (CGH)

Nachweis der Aberration durch Fluoreszenz-Markierung normaler Chromosomen


Polymerase KettenreaktionPolymerase Chain Reaction (PCR)

94°C

60°C

72°C


Alternative Methoden zum Nachweis Lymphom-spezifischer

AberrationenInterphase-FISH am Ausstrich/Tupfpräparat oder nach Kultur mit

break-apart-Sonde Nachweis einer MYC- oder ALK-Translokation

Metaphase-FISH nach Kultur mit break-apart-Sonde Nachweis einer MYC- oder ALK-Translokation (und des Partner-

chromosoms)

24-Farben-FISH nach Kultur Nachweis der 8q- oder 2p-Translokation und des Partner-

chromosoms zusätzlich weitere Aberrationen (außer inv, kleinen del oder ins)

Polymerase-Kettenreaktion (LD-PCR, RT-PCR) Nachweis des MYC- oder ALK-Rearrangements und des Fusions-

partners

Comparative genomic hybridization (CGH) Nachweis eines Zugewinns oder Verlustes von Chromosomen-

stücken oder einzelnen Genen


Probleme bei der zytogenetischen Auswertung

von Lymphomenoft normaler Karyotyp oder kein Ergebnismögliche Ursachen:

keine Proben eingesandt inadäquate Versandbedingungen nicht genügend LymphomzellenKnochenmark ohne Befall kein Tumormaterial eingesandt eingesandtes Material kein Tumor (V.a. Lymphom)Lymphomzellen gehen schnell in Apoptose inadäquate Kulturbedingungen (Medium/Zeit)kryptische Aberrationen


Häufigkeit unterschiedlicher Karyotypen bei B-NHL

101K aryo typ n orm al

50 ,7 %

d e l(8 )(q24)n = 2

t(2 ;8)n = 2

t(8 ;22)n = 4

t(8 ;14n = 74

m it8q 24 -Ab erration

n = 82

o hne8q 24 -Ab erration

n = 16

98ab errant49 ,3 %

199 P a tien tenm it volls tänd ig em K aryo typ

963 Patienten aus mehreren BFM-NHL Studien

199 vollständige Karyotypen


Warum Zytogenetik?

spezifische Aberrationen kann man auch mit anderen Methoden nachweisen

Herstellung von Metaphasepräparaten schwierig (Kultur etc.)

Ergebnis fraglich (z.B. normaler Karyotyp)


Häufigkeit von Sekundäraberrationen


50 ,7 %

d e l(8 )(q24)n = 2

t(2 ;8)n = 2

t(8 ;22)n = 4

t(8 ;14n = 74

n ur8q 24 -Ab erration en

n = 3643 ,9 %

m itS eku nd ärab erration en

n = 4656 ,1 %

m it8q 24 -Ab erration

n = 82

o hne8q 24-Ab erration

n = 16

98ab errant

49 ,3 %



Häufigkeit sekundärer Aberrationen bei Burkitt-NHL

43.5201q+

6.53der(3q)

10.956q-

15.27+7/7q+

6.539p-

50.023others

39.118complex

4.32del(17p)

17.4813q-

4.32+12/12q+

8.7411q23

%absaberration

sekundäre Aberrationen mit 8q24

6.211q+

6.21der(3q)

31.356q-

6.21+7/7q+

009p-

75.013others

24.84complex

00del(17p)

6.2113q-

12.52+12/12q+

31.3511q23

%absaberration

Aberrationenohne 8q24


Häufigkeit von 2p23-Aberrationen bei ALCL


59 ,6 %

t(2 ;5)n = 14

t(1 ;2)n = 1

n ur2p 23 -Ab erration en

n = 3

m itS eku nd ärab erration en

n = 12

m it2p 23 -Ab erration

n = 15

m it2p -A b erration en

n = 1

o hne2p 23 -Ab erration

n = 3

19ab errant

40 ,4 %



Sekundäraberrationen bei NHL im Kindesalter

prognostische Bedeutung noch unklar

möglicherweise schlechtere Prognose für einige Aberrationen

Bedeutung für Lymphomentstehung


Problemlösung

für ein gutes Ergebnis

ausreichend Material verschickengutes Materialmöglichst Tumorgewebe

Gewebe nicht austrocknen lassen vitale Zellen

adäquate Versandbedingungen möglichst sofort versenden innerhalb von 24 Std. im Labor Kurierdienst (Ankunft bis 10.00 Uhr)


NHL-BFM-MaterialversandKM-Befall und/oder Pleuraerguss

und/oder Aszites nur Tumor

BiopsiePunktion

Diagnosestellung NHL

immunologisch und zytomorphologisch

Diagnosestellung NHL

histologisch und immunhistochemisch

Zytomorphologie / Genetik / Zellbank

Onkogenetisches Labor und

NHL-BFM-StudienzentraleGießen

Immunologie

Immunologisches

Zellmarkerlabor,

Berlin

• Tumormaterial

formalinfixiert

• Tumormaterial in

Medium • Tumortupfpräparate• Liquor, KM, Blut,

Serum

• flüssiges Material

heparinisiert• Zytospinpräparate

bzw. Ausstriche• Liquor, KM, Blut,

Serum

• flüssiges Material

heparinisiert• Zytospinpräparate

bzw. Ausstriche

Histologie / Immunhistochemie

LK-Register, Kiel

oder ein anderes referenzpathologisches Institut

der NHL-BFM-Studie

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