isolasi dna, pcr, elektro stroberi its

38
Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk BAB I PENDAHULUAN I.1. Latar Belakang DNA merupakan molekul yang sangat panjang, terdiri dari ribuan deoksiribonukleotida (ada empat jenis), yang bergabung dalam suatu urutan yang bersifat khas bagi setiap organisme. Molekul ini biasanya berbentuk untaian ganda. PCR adalah suatu reaksi invitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer, dan dilakukan di dalam thermocycler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum target disebut primer forward dan primer yang berada setelah target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru disebut sebagai enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dNTPs yang mencakup dATP (nukleotida berbasa Adenine), dCTP (nukleotida berbasa Cytosine) dan dTTP (nukleotida berbasa Thymine) (Muladno, 2002). Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama peneliti yang berkaitan dengan genetika ataupun molecular. Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat 1

Upload: trieka-herya

Post on 26-Oct-2015

278 views

Category:

Documents


4 download

DESCRIPTION

Proses isolasi DNA, PCR dan elektroforesis

TRANSCRIPT

Page 1: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

BAB I

PENDAHULUAN

I.1.Latar Belakang

DNA merupakan molekul yang sangat panjang, terdiri dari ribuan deoksiribonukleotida

(ada empat jenis), yang bergabung dalam suatu urutan yang bersifat khas bagi setiap organisme.

Molekul ini biasanya berbentuk untaian ganda. PCR  adalah suatu reaksi invitro untuk

menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA

baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target dengan bantuan enzim dan

oligonukleotida sebagai primer, dan dilakukan di dalam thermocycler. Panjang target DNA

berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer

yang berada sebelum target disebut primer forward dan primer yang berada setelah target disebut

primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru disebut

sebagai enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR,

diperlukan juga dNTPs yang mencakup dATP (nukleotida berbasa Adenine), dCTP (nukleotida

berbasa Cytosine) dan dTTP (nukleotida berbasa Thymine) (Muladno, 2002).

Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama peneliti

yang berkaitan dengan genetika ataupun molecular. Seiring dengan kemajuan zaman yang

semakin pesat dinegara-negara berkembang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu

pengetahuan yang semakin marak dibidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah

pengembangan di bidang Biologi Molekul. Bidang ilmu pengetahuan Bidang Molekuler ini telah

dimulai pada akhir abad ke 19, setelah metode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk

menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan

Bio-sistematik). Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19 setelah ditemukan

penelitian yang menunjukkan adanya penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik

terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam hal ini termasuk

juga protein. Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau

perpindahan melalui partikelpartikel listrik. Metode elekroforesis telah digunakan dan

dikembangkan didalam teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode

1

Page 2: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

tersebut berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena

pengerjaannya sangat sederhana dan sangat mudah. Di dalam ilmu biologi maupun biologi

molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari

hewan ataupun tumbuhan.

Lamdji (1998, dalam Wahyuni: 2009) mengatakan bahwa penelitian keragaman genetik

tanaman buah merupakan salah satu kegiatan penting untuk mendukung pemuliaan tanaman.

Perbedaan tanaman dapat dideteksi melalui beberapa penanda, antara lain dengan pola pita DNA.

Dalam Wahyuni (2009), Nicholl (1993) dan Surzycki (2000) pun menyatakan ada tiga langkah

utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan

padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.

Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap

jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya

senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian

DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing

buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel

yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan

sedikit.

1.2 Rumusan Masalah

Adapun rumusan masalah yang kami angkat pada praktikum ini adalah bagaimana rangkaian

proses pengisolasian dan amplifikasi gen ITS dari DNA buah stroberi?

1.3 Pertanyaan Penelitian

Untuk lebih mengetahui detail rumusan masalah dalam praktikum ini, kami mendukungnya

melalui beberapa pertanyaan penelitian, diantaranya sebagai berikut:

a. Bagaimana cara melakukan isolasi DNA dari buah stroberi?

b. Bagaimana teknik amplifikasi DNA melalui PCR?

c. Bagaimana pita DNA yang terbentuk melalui teknik elektroforesis dengan penanda gen ITS?

2

Page 3: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

1.4 Tujuan

Adapun tujuan praktikum ini adalah sebagai berikut:

a. Mengetahui cara mengisolasi DNA dari buah stroberi

b. Mengetahui cara mengamplifikasi DNA dari buah stroberi melalui teknik PCR

c. Mengetahui cara elektroforesis DNA buah stroberi dengan penanda gen ITS

3

Page 4: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

BAB II

ISOLASI DNA, PCR DAN ELEKTROFORESIS

2.1 DNA

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk

mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada

nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus

berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria

dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA

mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal

dari garis induk. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat

dari kedua orang tua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur

DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan 3 berbentuk sirkular, sedangkan

DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon

Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam

makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup

dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk

genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel

organisme. DNA genom meliputi gen dan intergen.

DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme

prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme eukariotik mempunyai DNA

berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam inti sel, sedangkan DNA prokariot terletak dalam

sitoplasma. Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan Francis Crick. Mereka

memperoleh model DNA dari hasil foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan

Maurice Wilkins. Watson dan Crick menyimpulkan bahwa struktur DNA merupakan rantai

ganda (double helix). Untai ganda tersusun dari dua rantai polinukelotida yang terpilin. Kedua

rantai memiliki susunan antiparalel, yaitu satu rantai berorientasi dari ujung 5’ ke 3’sedangkan

yang lain berorientasi ujung 3’ ke 5’. Ujung 5’ merupakan ujung yang berakhir dengan gugus 5-

fosfat dan ujung 3’ berakhir dengan gugus OH. Kedua rantai dihubungkan dengan ikatan

4

Page 5: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

hidrogen yang memghubungkan kedua basa nitrogen. Komponen nukleotida DNA adalah gula,

fosfat, dan basa nitrogen. Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose

yang kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu purin dan

pirimidin. Purin terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin. Pirimidin terdiri dari

dua jenis, yaitu timin dan sitosin. DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh

kita. Hal tersebut dikarenakan DNA merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel makhluk

hidup. Fungsi-fungsi tersebut adalah:

1. Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup.

2. Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan molekul-

molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu fungsi DNA untuk

mereplikasi dirinya sendiri. (Campbell, 2008)

2.2 Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada

dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan

campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul

besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas

tabung.

Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan

pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2008). Presipitasi merupakan

langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran.

Sebuah difenilamin (DPA) indikator akan mengkonfirmasi keberadaan DNA. Prosedur

ini melibatkan hidrolisis kimia DNA: ketika dipanaskan (misalnya ≥ 95 ° C) dalam asam, reaksi

memerlukan gula deoksiribosa dan karena itu spesifik untuk DNA. Dengan kondisi tersebut, 2-

deoksiribosa akan dikonversi ke w-hydroxylevulinyl aldehida, yang bereaksi dengan senyawa,

difenilamin, untuk menghasilkan senyawa berwarna biru. Konsentrasi DNA dapat ditentukan

mengukur intensitas absorbansi larutan pada 600 nm dengan spektrofotometer dan

membandingkan dengan kurva standar konsentrasi DNA diketahui. Mengukur intensitas

absorbansi larutan DNA pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm digunakan sebagai ukuran

5

Page 6: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

kemurnian DNA. DNA menyerap sinar UV pada 260 dan 280 nanometer, dan protein aromatik

menyerap sinar UV pada 280 nm, sebuah sampel DNA murni memiliki rasio 260/280 pada 1,8

dan relatif bebas dari kontaminasi protein. Sebuah persiapan DNA yang terkontaminasi dengan

protein akan memiliki rasio 260/280 lebih rendah dari 1,8.

DNA bisa diukur dengan memotong DNA dengan enzim restriksi, menjalankannya pada

gel agarose, pewarnaan dengan bromida etidium atau noda yang berbeda dan membandingkan

intensitas DNA dengan penanda DNA konsentrasi dikenal.

Weisburg, et al (1991) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-

tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstraksi sel dan presipitasi

DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis

atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa

polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA.

Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah

berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang

terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan

sedikit.

2.3 PCR

Rantai polimerase reaksi (PCR) adalah teknik ilmiah dalam biologi molekuler

untuk memperkuat tunggal atau beberapa salinan sepotong DNA di beberapa kali lipat,

menghasilkan ribuan sampai jutaan salinan dari urutan DNA tertentu. Dikembangkan

pada tahun 1983 oleh Kary Mullis, PCR sekarang teknik umum dan sering sangat

diperlukan digunakan di laboratorium penelitian medis dan biologi untuk berbagai

aplikasi. Reaksi berantai polimerase dapat digunakan untuk memperkuatDNA

beruntai ganda dan tunggal kedua. Untuk melakukan PCR, orang harus tahu setidaknya

sebagian dari urutan molekul DNA target yang harus disalin. Umumnya, PCR

menggunakan DNA kecil target 100-1000 pasangan basa (bp) panjang. Ini secara teknis

sulit untuk memperkuat target lebih dari 5000 bp panjang. Sepasang primer

oligonukleotida tunggal terdampar, yang memiliki urutan DNA melengkapi daerah

6

Page 7: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

mengapit dari urutan target, harus disintesis. Primer yang melengkapi kedua ujung urutan

target, tetapi terletak pada untaiyang berlawanan. Primer biasanya 20-30 nukleotida

panjang dan mengikat ke wilayah mengapit komplementer pada ujung 3 ' (Rao, 2006).

Polymerase chain reaction (PCR) adalah suatu proses pembentukan cetakan DNA

secara berulang kali dengan menggunakan prosedur dan waktu yang tertentu (Wolfe,

1993). PCR menggunakan teknik amplifikasi (perbanyakan) secara spesifik pada suatu

segmen DNA secara in vitro dengan menggunakan DNA polimerase, cetakan (template),

DNA genom, dan primer oligonukleotida yang akan menempel pada segmen yang akan

diamplifikasi (Davis et al, 1994).  Prinsip dasar dari teknik PCR tersebut merupakan

adanya enzim DNA polimerase yang digunakan untuk membuat cetakan dari segmen DNA

yang diinginkan (Wolfe, 1993).

2.3.1 Komponen PCR

Pada proses PCR selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase,

komponen lain yang dibutuhkan adalah:

1. Primer

Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi

sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan

membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang

panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah

tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000

bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi

dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.

2. dNTP (deoxynucleoside triphosphate)

dNTP alias building blocks sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas

4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.

3. Buffer

Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar

berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.

4. Ion Logam

7

Page 8: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA

polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja. Ion logam

monovalen, kalsium (K+) (Innis, MA, et al, 1994).

2.3.2Tahapan Reaksi

Berdasarkan Mullis, et al, 1987 setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:

1. Denaturasi

Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 90°C-95°c selama 30-60 detik. Pada suhu

ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu

denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang

komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi

polimerisasi pada siklus yang sebelumnya.

2. Annealing

Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40°C-60°C selama 20-40

detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di

tempat yang komplemen dengan sekuen primer. Pada tahap penempelan primer (annealing),

primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada

proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan

komplemen pada template. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan

hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan

reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72 oC.

3. Ekstensi/elongasi

Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase,

biasanya 70°C-72°C. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang

sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP,

begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya).

Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi

bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit

8

Page 9: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

untuk setiap 1000 bp. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada

sisi 3’nya. Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer

akan diamplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda),

sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n adalah

jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA

sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan

menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini

akan berlangsung secara eksponensial. PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA

polimerase pada akhir dari setiap siklus akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A

pada ujung 3’ dari potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat

di kloning dengan menggunakan vektor yang ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung

5’-nya. Proses PCR dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut thermocycler.

Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:

4. Pra-denaturasi

Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan

mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih

dahulu).

5. Final Elongasi

Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk

memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna.

Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir. PCR dilakukan dengan menggunakan

mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat

sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water

bath) untuk melakukan denaturasi, annealing dan ekstensi secara manual, berpindah dari

satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. Sekarang mesin Thermal Cycler sudah

terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan (Mullis, et al, 1987).

2.4 Elektroforesis

Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan

partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik.  Prinsip kerja dari elektroforesis

9

Page 10: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA,

yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif

(kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode).  Elektroforesis digunakan untuk

mengamati hasil amplifikasi dari DNA.  Hasil elektroforesis yang terlihat adalah

terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-

potongan jumlah pasangan basanya (Klug & Cummings, 1994).

Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel.  Perpindahan partikel

pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel, komposisi dan

konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan sebagainya.  Semakin kecil partikel

tesebut, maka pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung

jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak melalui

matriks tersebut (Klug & Cummings, 1994).

Di dalam elektroforesis digunakan sumber arus listrik searah (DC), ruang untuk

elektroforesis (Comb, Well, platform dan cetakan wadah gel), larutan buffer (buffer ionik

danloading buffer), matriks elektroforesis, marker dan gel. Elektroforesis digunakan dengan

tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein.  Selain

itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi

masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan

mempelajari penyakit yang diturunkan. Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk

mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu (Klug &

Cummings, 1994).

Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan

memurnikan fragmen DNA. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-

partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif

(anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub

negatif (anode).  Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA.  Hasil

elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil

amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya. Elektroforesis

digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA

dan protein.  Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan

10

Page 11: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

untuk mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika,

kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan.  Elektroforesis dalam bidang genetika,

digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA

tertentu (Ward, 1998).

Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk

memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA dapat dilihat secara

langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose maupun gel

poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. Untuk dapat

divisualisasikan, maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan Ethidium Bromida (EtBr),

kemudian dilihat di atas sinar ultra violet. Ethidium bromida dapat menangkap sinar ultra violet

sehingga pendaran sinar UV ini dapat terlihat. Ethidium mengikat molekul DNA, sehingga

molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar ultra violet. DNA merupakan molekul

bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan dalam medan listrik, DNA akan bermigrasi dari

kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan migrasi ditentukan oleh : i) ukuran molekul DNA; ii)

prosentase/kerapatan gel yang dilalui DNA; iii) arus listrik yang diberikan untuk memigrasikan

molekul DNA. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. Semakin rapat

media yang digunakan, semakin tinggi prosentasenya, maka semakin lambat DNA bermigrasi.

Semakin besar arus yang diberikan, maka semakin cepat DNA bermigrasi. Gel elektroforesis

digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi

berarti memisahkan molekul menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis

berarti memisahkan molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis

mengambil keuntungan bahwa, sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika

diletakkan di dalam medan listrik, molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda) dan menjauhi

kutub negatif (katoda). Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus

ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk i) menambah densitas, sehingga DNA

akan selalu berada di dasar well; ii) pewarna untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke

dalam well, iii) agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga

dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Pewarna yang biasa digunakan adalah

bromophenol blue dan xylene cyanol. (Zumft, 1997)

11

Page 12: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

2.5 Internal Transcribed Spacer (ITS)

Pada nrDNA ditemukan bagian yang tersusun berulang-ulang pada genom. Masing-

masing kelompok pengulangan mengandung daerah yang akan ditranskripsi (gen 18S, 5.8S, dan

26S, Internal Transcribed Spacer dan External Transcribed Spacer) dan daerah yang tidak

ditranskripsi yaitu Non-transcribed Spacer (NTS). NTS memisahkan kelompok pengulangan

yang satu dengan yang lain. Skema pengulangan pada nrDNA dapat dilihat pada gambar di

bawah.

Pada daerah yang ditranskripsi, daerah ITS terletak di antara kedua sisi 5.8S RNA.

Daerah ITS sendiri terdiri dari ITS-1, gen 5.8S, dan ITS-2 secara berurutan (Hillis et al., 1996).

ITS-1 dan ITS-2 memiliki struktur yang tida ekuivalen walaupun kadang-kadang memiliki

struktur yang substitusional. ITS-1 berkembang dari daerah intragenik dan ITS-2 merupakan

ekspansi segmen di unit besar rDNA. Penampakan dari daerah ITS dapat termutasi dengan

adanya delesi dan insersi yang menyebabkan adanya perbedaan panjang daerah ITS diantara

taksa-taksa.

Daerah ITS (Sumber : Hidayat & Pancoro, 2001)

Keterangan :

NTS = Non-transcribed Spacer

ETS = External Transcribed Spacer

ITS = Internal Transcribed Spacer

12

Page 13: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

BAB III

METODE PENGAMATAN

3.1 Alat dan Bahan

A. Alat

1. Alat Isolasi DNA dan PCR

a. Mortar

b. Sarung tangan

c. Saringan

d. Tabung Eppendorf

e. Mikropipet

f. Tips kuning 20-200 µl

g. Mesin PCR

h. Tube PCR

i. Tips biru 0,2-10 µl

j. Vortex

k. Penangas air

l. Ice box

m. Sentrifuge

n. Oven

o. Alat pendingin

2. Alat Elektroforesis

13

Page 14: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

a. Sarung tangan

b. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

c. Kertas parafilm

d. Seperangkat alat elektroforesis

e. UV transluminator

f. Kamera digital

B. Bahan

1. Bahan Isolasi DNA

a. Buah strawberry segar

b. Es batu

c. Buffer ekstraksi

d. SDS 20%

e. Potassium asetat

f. Chloroform:Isoamil alcohol (24:1)

g. Alcohol 100 dan 70%

h. TE

14

Page 15: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

2. Bahan Mix PCR

a. Buffer : 5 μl

b. dNTPs : 0,1 μl

c. Primer ITS-4 : 0,5 μl

d. Primer ITS-5 : 0,5 μl

e. Taq poly : 0,25 μl

f. DNA template : 1 μl

g. ddH2O : 13,65 μl

h. MgCl : 4 μl

3. Bahan Elektroforesis

a. Agarosa 1%

b. DNA marker

c. Sampel DNA

d. Aquades

e. Larutan buffer TAE 1x

Page 16: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

3.2 Langkah Kerja

1. Langkah Kerja Isolasi DNA

Page 17: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

2. Langkah Kerja PCR

3. Langkah Kerja Elektroforesis

BAB IV

Page 18: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

Hasil pengamatan yang kami lakukan dapat dilihat di gambar 5 (diberi lingkar merah)

yang merupakan hasil elektroforesis dari isolasi DNA buah stroberi dan buah pisang (pada

kelompok lain). Pada hasil tersebut tidak di menggunakan marker atau penanda, sehingga

hasil tersebut merupakan benar-benar hasil isolasi DNA buah saja.

Gambar 3.1

Hasil Elektroforesis Kelas C 2008 yang pertama, keterangan: sumur 1= kelompok 1, sumur

2= kelompok 2, sumur 3 = kelompok 3, sumur 4 = kelompok 4, sumur 5 = kelompok 5,

sumur 6 = kelompok 6, sumur 7 = kontrol positif, sumur 8 = kontrol negatif.

Sumber: Dokumentasi Pribadi

Setelah didapatkan hasil elektroforesis pertama dilakukan perbanyakan fragmen DNA

yaitu pada situs ITS melalui PCR. Kemudian dilakukan elektroforesis kembali dengan hasil

sebagai berikut:

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 43 65 7 8

Page 19: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Gambar 3.2

Hasil Elektroforesis Kelas C 2008 yang kedua, keterangan: sumur 1= marker, sumur 2=

kelompok 1, sumur 3 = kelompok 2, sumur 4 = kelompok 3, sumur 5 = kelompok 4, sumur 6

= kelompok 5, sumur 7 = kelompok enam, sumur 8 = kontrol negatif.

Sumber: Dokumentasi Pribadi

4.2 Pembahasan

1. Isolasi DNA

Pada praktikum yang dilakukan terdapat 6 kelompok, 4 diantaranya mengisolasi DNA

yang berasal dari buah stroberi sedangkan 2 lainnya mengisolasi DNA yang berasal dari

buah pisang. Kelompok kami yaitu kelompok 3, termasuk kedalam kelompok yang

mengisolasi DNA dari buah stroberi. Jika dibandingkan hasil isolasi DNA keduanya

(stroberi dan pisang) tidak terlihat adanya perbedaan dari segi jumlah. Hal tersebut

disebabkan proses pengambilan sumber DNA relatif mudah dan tersedia dalam jumlah

yang banyak. Berbeda dengan isolaso DNA bakteri yang sebelumnya dilakukan, dimana

terdapat perbedaan jumlah karena terkait sumbernya yang berbeda-beda. Pada saat

isolasi dapat terjadi beberapa faktor yang dapat menyebabkan kegagalan, diantaranya

sebagai berikut:

a. Pada saat pencacahan buah, buah dicacah terlalu keras, hal tersebut dapat

menyebabkan smear pada saat elekroforesis.

b. Selain pencacahan yang terlalu keras, faktor lain yang dapat menyebabkan smear

adalah pada saat pengambilan fase cair dari fase padat, fase padat terambil.

c. Ketika penambahan etanol 70% ujung tips yang digunakan menyentuh tabung

ependorf dan menyebabkan kontaminasi (pengotor).

Page 20: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

d. Pada saat isolasi harus digoyang pelan, goyangan yang diberikan terlalu keras

sehingga sampel dapat rusak. Begitupun dengan yang harus digoyang keras malah

digoyang pelan.

e. Pada saat pemindahan isolat dari tabung Ependorf ke tabung PCR terdapat kotoran

yang terambil sehingga dapat menimbulkan kontaminasi.

2. PCR

Pada saat melakukan teknik PCR, sebelumnya DNA dicampurkan dengan larutan

mixing. Larutan ini mengandung beberapa bahan, diantaranya sebagai berikut: ddH2O,

Taq buffer, dNTPs mix, Taq Poly, ITS- 4, ITS- 5 dan DNA templatenya sendiri. Ketika

melalui tahap ini beberapa kesalahan dapat terjadi, sebagai berikut:

a. Terdapat sidik jari pada tabung PCR, karena tabung PCR tidak boleh kotor termasuk

oleh sidik jari tangan.

b. Pada saat dilakukan mixing, tips yang digunakan terkontaminasi.

c. Pada saat DNA template dimasukkan tidak terambil sepenuhnya, sehingga DNA

yang diamplifikasi hanya sedikit.

d. Pada saat PCR dilakukan primer salah mengenali gen yang diamplifikasi yaitu yang

seharusnya mengamplifikasi gen pada tumbuhan malah mengamplifikasi gen pada

bakteri yang terdapat pada tumbuhan, namun hal tersebut tidak akan terjadi pada

amplifikasi ITS karena gen tersebut hanya terdapat ditumbuhan.

3. Elektroforesis

Elektroforesis pertama merupakan elektroforesis hasil isolasi DNA tanpa melalui

proses amplifikasi terlebih dahulu melalui PCR. Sehingga dapat dikatakan tujuan dari

elektroforesis pertama ini hanyalah untuk melihat berhasil atau tidaknya isolasi DNA

dilakukan. Pada hasil Elektroforesis yang pertama tampak seluruh band terputus-putus

atau smear. Hal ini dapat disebabkan pada saat pemisahan fase cair dan fase padat

protein ikut terambil atau pada saat pencacahan buah, buah dicacah terlalu keras

sehingga DNA didalamnya dapat terpotong-potong. Seperti yang diketahui bahwa

struktur buah (stroberi dan pisang) lebih lembut dibandingkan dengan bagian tumbuhan

yang lain, sehingga pada saat pencacahan tidak memerlukan tekanan yang keras untuk

diambil sebagai sampel isolasi DNA. Selain itu dari hasil yang diperoleh tidak terlihat

jelas pita marker (penanda) begitupun dengan pita marker positif dan negatif.

Page 21: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

DNA adalah sesuatu yang tidak terlihat di dalam gel, sehingga perlu penambahan

Ethidium Bromida yang pada umumnya digunakan untuk membuat pita DNA terlihat.

Molekul Ethidium Bromida berinterkalasi di antara basa menyebabkan DNA

berfluorosescens ketika gel dieluminasi dengan sinar ultraviolet akan tetapi proses

tersebut akan sulit apabila proses destaining tidak dilakukan. Proses destaining ini

dilakukan setelah proses staining yaitu dengan membilas gel agarose dengan akuades.

Hal ini dimaksudkan untuk menghilangkan Etidium bromida yang terperangkap di dalam

gel sehingga ketika dieluminasi oleh sinar UV hanya pita DNA yang terlihat karena

DNA berikatan dengan Etidium Bromida melalui ikatan hidrogen. Hal ini berkaitan

dengan hasil elektroforesis yang kedua, yang merupakan elekroforesis hasil PCR dengan

penanda ITS. Pada hasil elektroforesis tersebut tidak nampak band satupun, termasuk

markernya. Marker yang tidak terlihat menyebabkan sulitnya menghitung kuantitas DNA

tersebut. Kuantitas DNA sampel dapat diketahui dengan membandingkan pendaran pita

DNA sampel yang dianalisis dengan pendaran pita DNA penanda (marker).

Tidak terlihatnya band ini dapat dikarenakan oleh beberapa sebab, namun sebab

utama yang paling memungkinkan hal tersebut terjadi adalah kurangnya konsentrasi EtBr

yang digunakan sehingga band-band DNA tidak muncul. Kurangnya atau tidak adanya

EtBr menyebabkan band DNA tidak berfluorescent ketika disinari UV sehingga tidak

terlihat. Faktor lain yang menyebabkan tidak terlihatnya band tersebut adalah gagalnya

PCR yang dilakukan sehingga gen ITS yang diinginkan tidak teramflifikasi. Mengenai

kegagalan pada saat PCR tersebut mungkin saja terkait dengan hasil elektroforesis yang

pertama, dimana DNA yang diisolasi tampak smear atau terpotong-potong sehingga

mengalami kegagalan pada saat PCR.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Page 22: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Isolasi DNA buah stroberi yang dilakukan berhasil dilakukan yang ditandai adanya

potongan DNA pada hasil elektroforesis pertama, meskipun pada hasil elektroforesis tersebut

band-band yang dihasilkan mengalami smear yang artinya DNA yang diisolasi terpotong-

potong. Hasil isolasi DNA tersebut kemudian di amplifikasi untuk menghasilkan

perbanyakan gen ITS. Lalu hasil amplifikasi tersebut di elektroforesis, namun hasil

elektroforesis kedua ini menunjukkan tidak adanya band satupun, baik DNA maupun marker.

Hal tersebut kemungkinan besar disebabkan kurangnya konsentrasi EtBr yang digunakan

sehingga DNA tidak terlihat pada saat dilihat dibawah UV.

5.2 Saran

Pada saat melaksanakan praktikum isolasi DNA perlu diperhatikan dalam kegiatan ini

adalah ketelitian, keterampilan, dan ketepatan. Alat yang digunakannya pun harus steril dan

sesuai dengan ketentuan.

DAFTAR PUSTAKA

Boddinghaus, I., Rogall, T., Flohr, T., Blocker, H., Bottger, E.C. (1990). “Detection and

identification of Mycobactera by amplification of rRNA”. J. Clin. Microbiol, 28: 1751-

1759.

Campbell, and Reece. (2008). Biology. San Fransisco : Pearson Education, Inc.

Page 23: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. (1994). “Basic methods: Molecular biology. 2nd ed”.

Appleton & Lange, Norwola: xii + 777 hlm.

Hidayat, T. dan A. Pancoro, 2001, Studi Filogenetik Molekuler Anacardiaceae Berdasarkan

pada Variasi Urutan Daerah Internal Transcribed Spacer (ITS), Hayati, 8, 98-101az

Hillis DM, Moritz C & Mable BK (1996) Molecular Systematics. 2 edition. Sunderland, MA:

Sinauer Associates, Inc.

Innis, MA, Gelfand, DH. (1990). “Optimization of PCRs”. PCR Protocols: A guide to

Methods and Applications. Academic Press Inc., New York, p 3-12

Karp, A., S. Kresovich, K.V. Bhat, W.G. Ayad, and T. Hodgkin. (1997). “Molecular Tool in

Plant Genetic Resources Conservation: A guide to the technologies”. IPGRI Technical

Bulletin no. 2.

Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4th ed. Prentice Hall,

Englewood cliffs: xvi + 779 hlm.

Muladno. (2002). Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda dan

USESE Foundation. Bogor.

Mullis KB, Faloona FA. (1987). “Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-

catalyzed chain reaction”. Methods Enzymol, 155: 335–350

Priyani, Nunuk. (2004). Sifat Fisik dan Kimia DNA [online]. Tersedia:

http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/825/1/biologi-nunuk2.pdf. [24 Oktober

2011]

Rao, Sridhar. (2006). Polymerase Chain Reaction [online]. Tersedia: http://www.microrao.

com/micronotes/pcr.pdf . [24 Oktober 2011]

Suryanto, Dwi. (2003). Melihat Keanekaragaman Organisme Melalui Beberapa Teknik

Genetika Molekuler [online]. Tersedia: http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/

841/1/biologi-dwis.pdf. [24 Oktober 2011]

Ward, D.M. (1998). “A natural species concepts for procaryotes”. Current Opinion in

Microbiology, p 1: 271-277.

Weisburg, William G., Susan M. Barns, Dale A. Pelletier & David J. Lane. (1991). “16S

Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic Study”. Journal of Bacteriology, p 697-

703.

Wolfe, S.L. (1993). “Molecular and cellular biology”. Wadsworth Publishing Company,

Belmont: xviii + 1145 hlm.

Page 24: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Zumft, W.G. (1997). “Cell biology and molecular basis of denitrification”. Microbiology and

Molecular Biology Review 61: 533-616.

LAMPIRAN

Lampiran 3.2

Cara Kerja

Page 25: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Gambar 1.

Proses pencacahan atau penggerusan buah stroberi

Gambar 2.

Proses penambahan larutan SDS kedalam sampel

Gambar 3.Hasil sentrifugasi pertama dengan kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit, terlihat adanya

pemisahan antara pelet dan supernatan

Gambar 4.Proses pengeringan pelet DNA yang

dihasilkan dalam oven 50˚C selama 10 menit

Gambar 5.

Pelet pada tabung Eppendorf yang selanjutnya siap untuk digunakan pada

tahapan PCR

Gambar 6.

Larutan Mix PCR dalam tabung PCR yang siap diproses

Page 26: Isolasi DNA, PCR, Elektro Stroberi ITS

Gambar 7.

Proses dimasukannya sampel untuk di elektroforesis

Lampiran 4.1Hasi Pengamatan

Gambar 8.Hasil elektroforesis pertama yang dilihat

dengan menggunakan UV

Gambar 9.Hasil elektroforesis kedua yang dilihat

dengan menggunakan UV