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Departamentode FisiologíaFacultadde Medicina
UniversidadComplutensedeMadrid
INTERACCION DE NEUROTRANSMISORESY ENVEJECIMIENTO CEREBRAL
ESTUDIODE LA INTERACCIÓN ENTREDOPAMINA, ÁCIDO GLUTAMICO Y GABA
EN EL ESTRIADO Y EN LA CORTEZA PREFRONTALDE LA RATA
TesisDoctoral
Alberto PorrasChavarino
Madrid, 1996
INFORME DEL DIRECTOR DE LA TESIS
El trabajo de investigación “Interacción de neurotransmisores
y envejecimiento cerebral”, q-ue presenta D. Alberto Porras
Chavarino para optar al grado de Doctor, ha sido realizado
bajo ml dirección. Este trabajo es de una alta calidad
científica, tal cual atestigua la serie de publicaciones
internacionales realizadas por el autor a lo largo de este
periodo.
Va B~EL TUTOR (2>
El Direcí~esIs
7 de octubre de 1996
Pdo.:__________________ Pdo.: FRANCISCO NORA(Fecha y (¡‘ma> <Fecha y (¡‘ma>
DNI ONI 21 907 303
INFORME DEL CONSEJO DE DEPARTAMENTO
La Comisión Permanente del Consejo de Departamento, en su reunión de
fecha 30 de septiembre de 1996, acordó admitir a trámite la Tesis Doctora
presentada por O. ALBERTO PORRA CHAVARINO, titulada: “Interacción de neuro
transmisores y envejecimiento cerebral”
Fecha reunión
Consejo Departamento
30 septiembre 1996
F.Mora Teruel
<Fecha y firma>
Llevaratérminoun trabajode investigación,aúndelahumildadde éste,requiere,siempre,elesfuerzode un grupode personas.Quisierahacerpúblico aquími agradecimientohaciaellos,
Agradecimientoque,en muchasocasiones,me resultadificil expresarlesen privado.
Me pareceobligadoempezarreconociendoa mis padres,y a todami familia, lamismaposibilidadde poderdedicarmea la investigaciónduranteestosaños.Esaposibilidadse
materializóal aceptarmeel profesorFranciscoMoraen su laboratorio.A él ledebohaberllevadoacaboesteTesisDoctoral,tanto porpermitirmetrabajarcon él comopor elestímuloquede él herecibido.No quiero dejardc mencionarala Dra. ManuelaCobo, queguiómi aprendizajeinicial.
Duranteestosañoshe compartidomuchashorasdetrabajo,de entusiasmoy de desalientoconmis compañerosde laboratorio.Agredecerlesaquísucompañía,su amistady suayudaes unaexpresiónmínimade lo quesientoporellos,perome pareceobligadohacerlo.Macu Expósito,
BelénSanzy GregorioSegoviame hanayudadoen la realizaciónde partede losexperimentosdeestetrabajo.A susconsejosy aliento,junto alos deAlberto del Arcoy Rodrigo Martínez,lesdeboelhaberlomejoradoen lo posible.Detodosellos he aprendidoy aellosdeboel estímulo
intelectualy emocionalquemeha permitidoconcluirestaTesis.
Todala ayudarecibidano hubiesesido suficientesinel apoyoconstantede mi mujer, ala quetantodebo.Tambiénme haayudadoen la composiciónfinal de estetrabajoy en su corrección.
Sirva estode excusaparaexpresarleaquími gratitud.
A la horade agradecerla ayudarecibida,se tiendearecordarsólo a las personasquenos hanayudadoen la fasefinal del trabajo.Soyconscientede queolvido a muchaspersonassin cuyas
enseñanzasno podríahaberrealizadoestetrabajode investigación.La listaseríademasiadolarga,perosu recuerdopemnneceen mi memoriay mi agradecimientoaellosno se diluye en el
tiempo.
ÍNDICE
PROLOGO
ABREVIATURAS III
INTRODUCCIÓN 1
1. ENVEJECIMIENTO CEREBRAL 1
1.1. CONCEPTODE ENVEJECIMIENTO 1
1.2. ENVEJECIMIENTOCEREBRAL: CAMBIOS ESTRUCTURALESY BIOQUMICOS 2
1.2.1.Cambiosmacroscópicos 2
1.2.2.Cambiosmicroscópicos 2
1.2.2.1.Atrof¡aymuerteneuronal 31.2.2.2. Envejecimientoy célulasgliales 4
1.2.2.Cambiosbioquimicos 4
2. NEUROTRANSMISORESY ENVEJECIMIENTOCEREBRAL 72.1. DOPAMINA 7
2.1.1.Neurotransmisióndopaminérgica 7
2.1.1.1.Metabolismode laDA 8
2.1.1.2.Almacenamiento,liberacióneinactivacióndelaDA 8
2.1.1.3.Receptoresdopaminérgicos 8
2.1.1.4.Vías dopaminérgicas 9
2.1.2.Efectosdelenvejecimientosobrelaneurotransmisióndopaminérgica 11
2. 1.2.1. Efectosdel envejecimientosobrela concentraciónde DA enmuestrasde tejido cerebral II
2. 1.2.2. Efectosdel envejecimientosobrela liberaciónde DA II
Índice
2.1.2.3.Efectosdel envejecimientosobrelos sistemastransportadoresdeDA 12
2.1.2.4.Efectosdel envejecimientosobrelosreceptoresdopaminérgicos 132.1.2.5.Acercadel efectodel envejecimientosobrelaneurotransmisión 13
dopaminérgica
2.2. ÁCIDO GLUTÁMICO 142.2.1.Neurotransnúsiónglutamatérgica 14
2.2.1.1.MetabolismodelGLU 14
2.2.1.2.Almacenamiento,liberacióneinactivacióndel 0113 14
2.2.1.3.Receptoresglutamatérgicos 15
2.2.1.4.Viasglutamatérgicas 17
2.2.2.Efectosdel envejecimientosobrelaneurotransmisiónglutamatérgica 192.2.2.1.Efectosdel envejecimientosobrelaconcentracióndeOLU en 19
muestrasdetejido cerebral
2.2.2.2.Efectosdelenvejecimientosobrela liberaciónde GLU 202.2.2.3.Efectosdelenvejecimientosobrelossistemastransportadoresde
GLU 21
2.2.2.4.Efectosdel envejecimientosobrelos receptoresglutamatérgicos 21
2.2.2.5.Acercadelefectodel envejecimientosobrelaneurotransmisiónglutamatérgica 22
2.3. CABA 232.3.1.Neurotransmisióngabérgica 23
2.3.l.I. MetabolismodelGASA 23
2.3.1.2.Almacenamiento,liberacióneinactivacióndelGASA 24
2.3.1.3.Receptoresgabérgicos 242.3.1.4.Víasgabérgicas 25
2.3.2.Efectosdel envejecimientosobrela neurotransmisióngabérgica 28
2.3.2.1.EfectosdelenvejecimientosobrelaconcentracióndeGASA enmuestrasdetejido cerebral 28
2.3.2.2.Efectosdelenvejecimientosobrelos receptoresgabérgicos 28
3. INTERACCIÓNDE NEUROTRANSMISORES 293.1. INTERACCIÓN DE NEUROTRANSMISORESEN EL ESTRIADO 29
3.1.1.Conexionesneuralesy neurotransmisoresdelestriado 29
3.1.2.Interacciondeneurotransmisoresenel estriadode larata 33
3.1.2.1.Efectode agonistasy antagonistasglutamatérgicos 333.1.2.2.Efectode agonistasyantagonistasdopaminérgicos 34
3.1.2.3.Efectode agonistasy antagonistasgabérgicos 34
Indtce
3.2, INTERACCIÓN DE NEUROTRANSMISORESEN LA CORTEZA PREFRONTAL 35
3.2.1. Conexionesneuralesy neurotransmisoresdela cortezaprefrontal 35
3.2.2.Interacciondeneurotransmisoresen la cortezaprefrontalde la rata 37
4. INTERACCIÓN DE NEUROTRANSMISORESY ENVEJECIMIENTOCEREBRAL: PLANTEAMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN 39
MATERIAL Y MÉTODOS 43
1. ANIMALES 43
2. MATERIAL 43
2.1.. CONSTRUCCIÓN DE IMPLANTES PARA LA PERFUSIÓNINTRACEREBRAL pv vIvo 43
2.2. CONSTRUCCIÓNDEL SISTEMA DE CÁNULAS PUSH-PULL 432.3. PREPARACIÓNDE EQUIII4ESIN 45
3. IVIETODOS EXPERIMENTALES 45
3.1. PROCEDIMIENTOQUIRÚRGICOESTEREOTÁXICO 45
3.2. PERFUSIÓNINTRACEREBRALpv vivo 46
3.3, ANÁLISiS DE AMINOÁCIDOS PORCROMATOGRAFíALÍQUIDA DEALTA
RESOLUCIÓN(HPLC) 47
3.3.1.CuantificacióndeaminoácidoscomoOPA-derivados 47
3.3.2. Condicionescromatográficas 48
3.2.2.1. Factordedilución 49
3.2.2.2. Calibración 49
3.2.2.3.Coeficientedevariación 49
3.2.2.4. Linealidaddel análisiscromatogrático 50
3.4, COMPROBACIÓNDE LA LOCALIZACIÓN DE LAS CÁNULAS 504. MÉTODOSESTADÍSTICOS 51
RESULTADOS 531. INTERACCIÓN DE NEUROTRANSMISORES Y ENVEJECIMIENTO:
ESTUDIOSEN EL ESTRIADO 53
1.1. Efectodela apomorfinasobrelas concentracionesdeGLU en el estriadodelarataadultajoven 53
1.2, Efectodela apomorfinasobrelasconcentracionesdeGLU en el estriadode laratade edadmedia 53
1.3. Efectodela apomorfinasobrelasconcentracionesdeGLU en el estriadode laratavieja 54
1.4. Efectodela apomorfinasobrelasconcentracionesdeGLU en el estriadode larataalo largo del envejecimiento 54
Índice
1.5. Efectodelaapomorfmasobrelas concentracionesde GASAenel estriadodelarataadultajoven 54
1.6. Efectodela apomorfinasobrelas concentracionesde GABA enelestriadodelaratade edadmedia 55
1.7. Efectodela apomorfinasobrelas concentracionesde CIABA en el estriadodelaratavIeja 55
1.8. Efectodela apomorfinasobrelasconcentracionesde GASA en el estriadodelarataalo largodel envejecimiento 55
1.9. Efectodela apomorfinasobrelasconcentracionesde OLN en elestriadodelarataalo largodel envejecimiento 55
2. INTERACCIÓN DE NEUROTRANSMISORESY ENVEJECIMIENTO:ESTUDIOSEN LA CORTEZAPREFRONTAL 67
2.1. Efectode laapomorfinasobrelas concentracionesdeGLU en lacortezaprefrontalde la rataadultajoven 67
2.2. Efectode laapomorfmasobrelas concentracionesdeGLU en lacortezaprefrontalde la ratade edadmedia 67
2.3.Efecto de laapomorfinasobrelas concentracionesde GLU enlacortezapreftontaldela ratavieja 67
2.4. Efecto dela apomorfinasobrelasconcentracionesdeGLU enla cortezaprefrontaldela rataa lo largodel envejecimiento 67
2.5. Efecto dela apomorfinasobrelasconcentracionesde GASA en la cortezaprefrontalde la rataadultajoven 68
2.6. Efecto de la apomorfmasobrelasconcentracionesdeGASA en la cortezapreftontaldela ratade edadmedia 68
2.7. EfectodelaapomorfinasobrelasconcentracionesdeCIABA en lacortezapreftontalde la ratavieja 68
2.8. Efectode laapomorfinasobrelas concentracionesdeCIABA enlacortezaprefrontalde la rataa lo largodel envejecimiento 68
2.9. Efectodela apomorfinasobrelasconcentracionesdeGLN enlacortezaprefrontaldela rataalo largo del envejecimiento 69
Indice
DISCUSIÓN 79
1. ACERCA DE LOS METODOS 79
1.1. SOBREEL MÉTODO DE PERFUSIÓNINTRACEREBRAL IN VIVO 79
1.1.1.Comparaciónde lastécnicasdeperfusiónintracerebral:diálisis vs. push-80
1.1.2. Limitacionesdela técnicadeperfUsiónintracerebralpush-pull 80
1.2. SOBREEL MÉTODO DE ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS 83
1.2.1.Dela derivacióny cuantificaciónde aminoácidos 83
1.2.2.Delas condicionescromatográficas 84
1.2.3. Dela variabilidaddel métodode análisis 84
2. ACERCA DE LOS RESULTADOS 85
2.1. INTERACCIÓN DENEUROTRANSMISORESEN EL ESTRIADODE LA RATA 85
2.1.1.InteracciónDA-GUi en el estriadodela rata 86
2.1.1.1 ¿LiberacióndeCILU o inhibición desurecaptación? 86
2.1.1.2.LiberacióndcCILU ¿vesicularo citoplasmática? 86
2. 1 .1.3. LiberacióncitoplasmáticadeGLU ¿deorigennenronalo de origenglial? 88
2.1.1.4.Otrasposibilidades 89
2.1.2. InteracciónDA-CIABA enel estriadodela rata 89
2.2. INTERACCIÓN DE NEUROTRANSMISORESEN LA CORTEZA PREFRONTALDE LARATA 90
2.2.1.InteracciónDA-GLU enla cortezaprefrontaldela rata 90
2.2.2.InteracciónDA-CIABA en lacortezapreftontaldela rata 91
2.3. INTERACCIÓN DE NEUROTRANSMISORESY ENVEJECIMIENTO 92
2.3.1. Sobrelas dificultadesde interpretaciónde losestudiossobreenvejecimiento 92
2.3.2.Efectodel envejecimientosobrelas concentracionesextracelularesdeCILU,CIASAyCILN 92
2.3.3.Interaccióndeneurotransniisoresy envejecimiento:estudiosen el estriadodela rata
2.3.4.Interaccióndeneurotransmisoresy envejecimiento:estudiosenla cortezaprefrontaldela rata
CONCLUSIONES 97
BIBLIOGRAFÍA 99
PRÓLOGO
La presenteTesisDoctoral llevaportitulo:Interacciónde neurotransmisoresy envejeci-mientocerebral, y por subtítulo:estudiode lainteracciónentredopamina,ácidoglutdmicoyCABAen elestriadoyen la cortezaprefrontaldela rata. Se trata,portanto,delamemoriadeun trabajo experimentalque se ha llevado acaboutilizando comosujetosdeestudioratasycomo objeto de estudio dos estructurascerebralesde esteanimal y tresneurotransiní-sores;y ello conel fin de estudiarla interacciónde neurotransniisoresdurante el envejeci-miento. Portanto,en todolo quesigue,si biense daránnotasdelos aspectosbásicosde cadaasunto tratado, se hará especial referenciasiemprea estaspalabrasclave (rata, estriado,cortezapreftontal, dopamina.ácido glutámicoy GASA). Se entenderá,así, que al tratar elaspecto de los cambios macroscópicosymicroscópicos que ocurren en el cerebrodurante el envejecimiento,no se hagaunadescripciónextensay se aluda, sobre todo, alos conocimientosquetenemossobrela rata.Igualmente, al tratar sobre el efecto delenvejecimiento sobre la neurotransmisión,quedasólo nombradala acetilcolinérgica,por
ejemplo, y se extiende más el capítulodedicadoa la glutamatérgica.Por estamismarazón, se hacen referencias mínimas a laespeciehumanay, en todo caso, seftalandoexpresamentecuandoesasí.
La cantidadde publicacionesquepodríanmanejarsea la hora de escribir una TesisDoctoralesenorme.Conel fin demoderarestaingentecantidadde publicaciones,en muchoscasosse hanutilizado revisionesactualessobrelosaspectostratados. Deestaforma tambiénserestringeel extensoapartadobibliográfico deestaTesisDoctoral, puestoque el objetivo deeste trabajono es exclusivamentede revisiónbibliográfica Se da referencia, esosí, de laspublicaciones que contienen afirmacionescontrovertidas o aspectos especialmenteinteresantesparaladiscusión.
Estetrabajoha sido posiblegraciasaunabecapredoctoralde la UniversidadComplu-tense de Madrid y a la financiación de laDirecciónGeneraldeInvestigaciónCientificayTécnicaatravésdelosproyectosPB9O-0252yP893-0075,cuyo investigadorprincipal es elDr. FranciscoMora.
1
ABREVIATURAS
ACH Acetilcolina
AMPA a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol-propionatoAP4 2-anxino4-fosfonobutirato
APO ApomorfinaDA DopaminaCIABA Acido gamma-aininobutíricoCIAHA-T Ácidogamma-aminobutírico-transferasaCIAD Ácido glutámicodecarboxilasa
CILN OlutaminaGUi Ácido glutámicoHPLC Cromatografialíquidade altaresoluciónKA KainatoLCRs Líquido cefalorraquideosintéticomCIIuR ReceptorglutamatérgicometabotrópicoNMDA N-metil-D-aspartatoOPA 0-flaldialdehido
111
INTRODUCCIÓN
1. ENVEJECIMIENTOCEREBRAL
El envejecimiento se ha convertido enobjeto prioritario de la investigación bio-sanitariaenlas últimasdosdécadas.Esteaugede la investigaciónsobreel envejecimientoseexplicapor el aumentoque la proporción depoblación anciana está teniendo en lassociedades occidentaies. Por ejemplo, enEspaña la población de más de 65 añossuponiaen 1950 el 7.2% dela poblacióntotal;en 1991 suponeel 13.8%(Anuario estadísticodeEspaña,NL, Madrid, 1995).
1.1. CoñícIEnoDE ENVEJECIMIENTO
El envejecimientoes la etapafinal de lavida de los seresvivos, caracterizadapor unapérdidaprogresivade las funcionespropiasdela madurezy que culmina en la muerte delindividuo.
Es dificil determinarcuándocomienzalavejez. En el ser humano se sueleconsiderar,actualmente,que el periodode vejezcomienzaen tomo alos 65 años.En el casode la rataderaza Wistar(la quese usaen el trabajoexperi-mentalde estaTesis Doctoral), la mayoríadelaspublicacionesutilizan comoanimaiesviejosratasde a partir de 18-20 mesesde edad.Sin
embargo,debesubrayarsequelaedadde iniciodel proceso de envejecimiento varia entreindividuos de unamismaespecie.Por ejemplo,las capacidades cognitivas, sensoriales ymotoraspuedensufrir déflcits no patológicosen muchos individuos antes de la edadconsideradacomo límite entre el periodoadultoy el devejez.Estehechoponederelievela dificultad de delimitar esa etapade la vidallamadavejezutilizando como único criterio la«edadcronológica» (el número de años devida)delosindividuos.
Se hanpropuestootrasvariablesdiferentesde la edadcronológica paradefinir la vejez,por ejemplo la «edadbiológica» definida porel gradode funcionamientodel organismo.Sin
embargo,definir la vejez de acuerdoal gradode funcionamientono es posiblemientras no
dispogamosde parámetrospara delimitar qué
grado funcional es el característicode unindividuo anciano. Por tanto, la edadcrono-lógica es la única vauiable objetiva de quedisponemosactualmenteparadefinir lavejez.
El envejecimientoes un procesouniversaly normal,es decir, aunqueconlíevaunamayorsusceptibilidad a sufrir enfermedades, elenvejecimiento no es una acumulación de
Introducción
patologías.Estees, precisamente,uno de losprincipales factores que afectan a lainterpretaciónde los resultadosde los estudiossobre el envejecimiento: la dificultad dediferenciar entre los cambios primarios
(debidos al envejecimiento per se) y loscambiosquesonconsecuenciadepatologías.
Desdeel puntode vistade laconducta,elenvejecimientose caracterizapor la pérdidadecapacidaden funcionessensoriales,motorasycognitivas (va p.ej. Jolles et al., 1986;Katzniany Ter¡y, 1992).
En relaciónconlas funcionessensorialesymotoras, en los individuos viejos se handescrito deficienciasen tareas de percepciónvisual, auditiva y táctil, así como unadisminuciónde la velocidadde realizacióndelos movimientos simples (que parece tela-cionarsemáscon limitacionesmuscularesquecon factores nerviosos)y un déficit de lacoordinaciónde movimientoscomplejos (quese relaciona más con linataciones neuro-lógicas).
Las alteracionescognitivasmásllamativasenlosindividuosancianosson las queafectanala memoria. Aunque en los humanosestasalteracionessonmásintensasen lasdemencias,también están presentesen los individuosviejos sanos.Los déflcits de memoriade losancianos afectan, fundamentalmente, a lamemoria a corto plazo así como a laadquisición y consolidaciónde infonnaciónnuevay a la evocación de esta información(memoriaa largoplazo).
Los déficits funcionales que aparecenduranteel envejecimiento(señaladosaquí deforma muy esquemática)son consecuenciadelas modificacionesestructurales(anatómicasehistológicas)y bioquímicasqueocurren en elSistema Nervioso durante este proceso deenvejecimiento.
1.2. EA.rI’EIECIMIENTO CEREBRAL:CAMBIOS
ESTRUCTURALESYBIOOU/MICOS
1.2.1. (‘amb¡os macroscópicos
Los cambiosmorfológicos descritosen elcerebroduranteel procesode envejecimientoincluyendisminucionesdel pesoy del volumencerebral. Por ejemplo, en el humano, se hadescritounadisminución de en tomo al 10%del pesodel cerebroa los90 añoscon respectoal individuo adulto(ver Brody, 1990; Katzmany Teny, 1992); asimismo,la disminucióndelvolumen cerebral se ha cuantificado en el
humanoenun 2%pordécadaapartir delos50años,aunqueestadisminucióndel volumen esdiferentesegúnla regióncerebralestudiada.
La disminución del pesoy del volumenglobalesdel cerebroen el humano duranteelenvejecimiento se acompañade un aumentodel tamaño de los surcos cerebrales, unadisminución del tamaño de las circunvolu-cionescerebralesy un aumentodel volumendelos ventrículos(ver Brody, 1990; KatzmanyTeny, 1992).
Estoscambiosmorfológicosobservadosenlos cerebros viejos son producto de lasmodificacioneshistológicasy bioquímicasquetienen lugar en este órgano durante el
envejecimiento.
1.2.2. Cambiosmicroscópicos
Loscambiosmicroscópicosqueocurrenenel cerebroduranteel envejeciniientoparecenser el resultado de la degeneraciónde lasneuronas.Tales cambiosaparecenno sólo enindividuosviejos sino tambiénen el cerebrodeindividuos que padecenciertasenfermedadesneurológicas como la enfermedad deAlzheimer en el casode la especiehumana.Estos cambios incluyen la presencia degránulosde lipotbcsina, gránulosbasófilos yovillos neurofibrilaresen el citoplasmade las
2
Introducción
neuronasy de placas seniles en el espacioextracelular(verKatzmany Teny, 1992).
La presenciade gránulosde lipofucsínaenel citoplasmade las célulases, normalmente,expresiónde queéstasestánsufriendocambiosdegenerativoslentos como los que ocurrendurante el envejecimiento, aunque tambiénpueden aparecer como consecuencia delesionescrónicas. Se observanacúmulos delipofucsina,porejemplo,en célulasdel corazóny del hígado como consecuenciadel enve-jecimientoo en célulasde músculoestriadoenextremidadesparalizadaso inmovilizadas. Enel SistemaNervioso se observangránulosdelipofiicsina enlas neuronasde algunasregionescerebralesde individuos viejos (ver p. ej. larevisióndeSohaly Wolfe, 1986) Porejemplo,en la cortezacerebral de los humanosse hadescritoque el 10% de las grandesneuronaspresentancúmulos de lipofiicsina (ver Brody,1990). La lipofiicsina procede de laperoxidaciónde los lípidos poljinsaluradosdelas membranas biológicas provocada,probablemente,por radicales libres. Aún noestáclarosí estepigmentoes sóloconsecuenciade la acumulaciónde productosde desechopor degeneracióno iras lesiones o puedeproducirdañocelularpor sí mismo.
En el citoplasmay las dendritasde ciertasneuronas(fiindamentalmente neuronaspira-midales de la corteza cerebral y del hipo-campo)del cerebrode individuosviejos se hadescritola presenciade pequeñasvacuolasdecontenidobasófilo de unos5 mm de diámetro(Katzman y Teny, 1992). Se desconoceelsignificado de este fenómeno, que ha sidodescrito con el nombre de degeneracióngránulo-vacuolar.
Otro rasgo histológico descrito en elcerebrode individuosancianoses la existenciade una marañasde fibrillas llamadas ovillosneurofibrilares(verKat.zmany Terxy, 1992). El
núcleo de estos ovillos neurofibrilares estáformado por paresde filamentoshelicoidalesque contienen proteínas tau (proteínasasociadasa los microtúbulos) anormalmentefosforiladas. Las proteínas tau son compo-nentesnormalesdelas neuronas,por lo queseaceptaque los ovillos neurofibrilaresderivandelas proteínasdel citoesqueletoneuronaltrasun proceso de degeneración.Estos ovillosaparecenfimdanientalmenteen el citoplasmade neuronasde la corteza cerebral frontal ytemporaly del hipocampo.
Juntoaestasformacionesintracelulares,enel cerebrode individuos viejos tambiénse hadescritolapresenciaen el espacioextracelularde placasneuríticaso placasseniles(Katzmany Ten~y, 1992) Las placas seniles sonformacionesaproximadamenteesféricas, conun tamañode entre10 y 200 hm de diámetro,que aparecenpnncipalmenteen la cortezacerebraly en el hipocampo.Estánconstituidaspor un núcleo de sustanciaamioidea (el ¡3-amiloide) rodeadopor un anillo de fibrillas(prolongacionesneuronalesdegeneradas)y decélulasgliales. El ¡3-amiloideestáformadoporun péptido (la proteína 13-amiloide) que sesintetizaa partir de unaproteínaprecursora(laproteínaprecursoradel ¡3-amiloide). Tanto laproteína ¡3-amiloide como su proteínaprecursorase sintetizan de fonna normal enneuronasy célulasgliales, pero la proteínaI~-amiloidequeforma partede las placassenilesestáalteradade forma quese haceinsolubleyforma el núcleo en tomo al cual aparecelaplacasenil.
1.2.2.1. AtroJiaymuerteneuronal
Además de los cambios histológicosdescritos,duranteel envejecimientocerebralseproduceatroflay muertede neuronasen ciertasregiones cerebrales(ver las revisiones deColemany Flood, 1987 y Katzmany Teny,1992).
3
Introducción
La atrofla neuronal descrita durante elenvejecimientoconsiste en una disminuciónprogresivadel árbol dendriticode lasneuronasy deladensidadde espinasdendríticasy, comoconsecuencia,del númerode sinapsisde estasneuronas(Colemany Flood, 1987; KatzmanyTeny, 1992). Sin embargo, esta atroflaneuronalno pareceocurrir en todo el cerebroen las primeras fases del envejecimiento.Algunos estudioshan demostradoque duranteel envejecimientocerebral normal se puedeproducir un crecimiento dendritico comorespuestaalapérdidadeneuronasen lacortezacerebraly elhipocampo(verColemany Flood,1987).En la rata, sehadescritoun aumentodela longitud total del árbol dendritico de lasneuronashastaedadesde en tomo a los 21mesesseguidadeunaatrofla dendriticaapartirde los 27 meses(Colemany Flood, 1987).
En relación con la muerteneuronal,variosestudios han demostrado que existe unadisminucióndel númerode neuronasen variasáreascerebralesperono enotras(ver Colemany Fload, 1987). Por ejemplo, Mufson y Stein(1980) han descrito una disminución en ladensidadde neuronasen la cortezafrontal deratasde24 mesesde edad.Tambiénen la rata,Landfleld et al. (1981) han demostradounadisminucióndel 25% en la densidadneuronalen el áreaCM del hipocampoentrelos 13-15y los25-28mesesdeedad.
En todo caso,los fenómenosde degenera-cióny muerteneuronalparecequeocurrenentoda la cortezacerebral,peroni con la mismaintensidadni almismotiempo. Las regionesdelacortezamásafectadasparecenserlaprefron-tal y la parieto-temporal.También seproducepérdidade neuronasen el hipocampo,en laamígdalay en ciertasáreassubcorticalescomoel locus coeruleus, la sustancía negra, lasuhs(anua innominata (núcleo basal deMe~,iieil) y vadosnúcleoshipotalámicos(p. ej.el núcleo supraquiasmáticoy el áreapreópticamedial)(Colemany Flood, 1987).
1.2.2.2.Envejecimientoy célulasgliales
Durantelosúltimos añoslosestudiossobrelagUahanprofundizadoen el conocimientodelpapel que estascélulas pueden jugar en elflincionanilento del Sistema Nervioso (sepuedeconsultarYu eta!, 1990).
En relaciónconel envejecimiento,algunosestudioshansugeridoqueel componenteglialdel cerebroaumentacon la edadtanto en ratascomoen humanos(Teny, 1986; Hansenel aL,1987; Vázquezel aL, 1992). También se hadescritounaumentorelacionadoconlaedaddela proteína glial fibrilar (un marcadorde losastrocitos)(O’Callaghany Miller, 1991)y delARNm paraestaproteína(Nichoisetal., 1993)en varias estructurascerebralesincluyendoelhipocampoy el estriado.
I3asándoseen estas observaciones,se hasugeridoqueenel cerebrode individuos viejosexiste una hiperactividadgUa]. Sin embargo,aún no estáclaro si estahiperactividadglial essólo una respuestasecundariaa la atrofia ymuerteneuronalo si sepuedeasignara lagliaun papel primano en el envejecuinentocerebral.
1.2.3.Cambiosbioquímicos
Los estudiosbioquímicossobreel enveje-cimientocerebralno sontan extensoscomoloshistológicos y sus resultados son contra-dictorios, - probablementecomo consecuenciade la escasezde estudiosrealizadosen áreascerebralesconcretas.En todocaso,loscambiosbioquímicosdescritosparecenrelacionarseconloscambiosmicroscópicosyamencionados.
En relación a los ácidosnucleicos, se hadescritoun aumentodel contenidocerebraldeADN que podría debersea la proliferaciónglial. El contenidode ARI4 parecedisminuircon la edaden neuronas,perose mantieneencélulasgliales(ver p. ej. Maroltae aL, 1986 yla revisióndeFinchy Morgan, 1990).
4
Introducción
En lo que se refiere a las proteínas,se hadescritounadisminucióndel contenidodeéstasen el cerebroduranteel envejecimiento,cifradaen el 5-25% entre los 30 y 90 años en laespecie humana. Esta disminución delcontenidodeproteínasen el cerebropodriaserconsecuenciade alteracionesen su síntesis, tal
y como sugierela disminución paralela delcontemdo de ARN descrita en algunasneuronas(p. ej. en neuronasque contienenmelatonmaen sustancianegray en neuronaspiramidalesdela cortezay del hipocampo)(verMarottaetal., 1986y Finchy Morgan, 1990).
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Introducción
2. NEUROTRANSMISORESYENVEJECIMIENTOCEREBRAL
Los cambioshistológicos y bioquímicosque tienen lugar en el cerebro durante elen4eJeclmtentopuedenproducir cambiosen laneurotransmisión. Por ejemplo, la atrofianeuronal.que conlieva una disminuciónde ladensidad de espinas dendrítícas, puedeprovocar alteraciones en la transmisiónnerviosa.Además,la alteracióndela síntesisydegradaciónde las proteínas pueden tenermultitud de consecuenciassobrela acción delos neurotransmisores:por ejemploa travésdela alteración de las enzimas que catalizan lasíntesiso la degradaciónde estosneurotrans-misores o mediantelos cambiosque puedentenerlugaren susreceptores.
Los estudiossobrelas alteracionesque elenvejecimientopuede producir en diferentessistemas neurotransmisores son escasos.Probablemente, los neurotransmisoresmásestudiadosen relación con el envejecimientoson la acetilcolina, la doparnina y lanoradrenalina (ver p. ej. Pradhan, 1980;Katzmany Teny, 1992). Las víasneuralesmásafectadaspor el proceso de envejecimientonormalparecenserlasproyeccionesque, desde
el núcleobasalde Meynert, inervanla cortezacerebral (acetil-colína), las proyeccionesquevan desde el locus eoeruleus a la cortezacerebral(noradrenalina)y las proyeccionesquevandesdelasustancianegra(par~compacta)alestriado(dopamina).
En esta Tesis Doctoral nos ocupamosespecíficamentede los efectos del envejeci-miento sobre la neurotransmisióndopaminér-gica,glutamatérgicay gabérgica,centrándonos,esencialmente,en losestudiosquese hanhechoen el estriadoy en lacortezacerebraldelarata.
2.1. DOPAMINA
2.1.1. Neurotransmisióndopaminérgica
La dopamina (DA), consideradaen unprincipio como un simple intennediariode lasíntesis de adrenalinay noradrenalina, fueidentificadacomoneurotransmisoren los años60 (ver Molinoff y Axelrod, 1971). La investi-gaciónacercade la transmisiónneuralmediadapor DA aumentórápidamentedebido,en parte,al descubrimientode la iníplicaciónde la DAen la enfermedadde Parkinson y en laesquizofrenia(verp. ej. Cótéy Cmtcher, 1991yKandel, 1991).
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Introducción
2.1.1.1.Metabolismodela DA
La DA se sintetiza en el citosol de lasneuronasa partir de la tirosina mediante laacción de las enzimas tirosina-hidroxilasaydopa-decarboxilasaLa enzima limitante enesta ruta de síntesises la tirosma-hidroxílasa.Estaenzimase encuentraen el citosol de lasneuronas catecolaminérgicas,requiere de lapresenciade 02, Fe2~ y el cofactor tetra-hidrobiopterinay es inhibida por su producto(ver lasrevisionesde Weinery Molinoff, 1989y Cioldsteín,1995).
La degradaciónde la DA se lleva a cabopor medio de la acción de dos enzimas: lamonoamninoxidasa y la catecol-O-metil-transferasa. La monoaminooxidasaes unaenzimaintracelularquese encuentralocalizadaen la cara externa de las mitocondrias ydegrada la DA citoplasmáticaque no estáalmacenada dentro de las vesículaspresinápticas.La catecol-O-metiltransferasaesunaenzimaprmcipalmenteextracelularque,enel SistemaNervioso, degradala DA liberadaala hendidurasináptica (Weiner y Molinoff,1989).
2.1.1.2. Almacenamiento,liberación einactivaciónde la 1)A
La DA sintetizada en el citosol de laneuronas es introducida en las vesículaspresinápticasatravésde sistemasde transporteacoplados a un gradiente de H* que esmantenido por una ATPasa dependientedeMg2~ (Seidenet aL. 1993). Sin embargo,notodalaDA neuronalseencuentradentrode tasvesículas: existe una pequeíiaproporción deDA libre enel citosol.
La DA vesicular es liberada de fonnadependientede Ca~ tras una despolarizaciónde la membrananeuronal. La DA que seencuentraen el citoplasmapuede ser liberadade fonna independientede C? mediantela
inversión del sentido del transportede DA através de los sistemastransportadoresque seencuentranen la membranade la terminaciónnerviosa,aunqueesta liberaciónindependientede Ca2 no parece ser fisiológica (Leví yRaiteri, 1993; Seideneta!, 1993).
La mactwaciónde la DA liberada a lahendidurasinápticase producepor captura através de sistemasde transportedependientesde Na y CF o por degradaciónde la mismamediante la acción de la catecol-O-metil-transferasa(Amaray Kuhar, 1993; SeidenelaL, 1993).
2.1.1.3. Receptoresdopaminérgicos
Clásicamente,y basándoseen estudiosfarmacológicos.se han descrito dos tipos dereceptoresparalaDA: losreceptoresDl y losreceptores 02 (Kebabian y Calne, 1979).AmbossonreceptoresacopladosaproteínasG.La activaciónde losreceptoresDl estimulalaadenilato-ciclasa y eleva, por tanto, laconcentraciónde AMIPc. La activación de losreceptores02, en general,inhibe la adenilato-ciclasa,aunquetambiénpuedenactuara travésde la aperturade canalesde K~, el bloqueodecanalesdeCa2’ y la inhibición dela ruta delosfosfatidil-inositoles (ver Sibley y Momsma,1992).
Los estudiosmoleculareshandemostradolaexistenciadeun mayornúmerodereceptoresdopaminérgicos(ver p. ej. las revisionesdeSibley y Momsma, 1992 y Civelli, 1995).Hasta la fecha se han descrito seis tipos dereceptoresdopaminérgicos:Dl, D2s, D21, D3,04 y 05. A pesarde todo, estosreceptoressepuedenseguirclasificandoen basea los tiposfarmacológicosclásicos.Así, losreceptoresDly 05 estimulanlaadenilato-ciclasay formanlafamilia de receptoresDI (se los denominaavecescomoDíA y 018 respectivamente).Porotra parte, los receptoresD2s, D21, 03 y 04inhibenla adenilato-ciclasay formanla familia
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de receptoresD2 (denominadosa vecescomoD2As, D2AI, D2By D2Crespectivamente).
Farmacológicamente.los receptoresDl y05 son equivalentes(el SKF-38393 y elfenoldopamactúancomo agonistasselectivosen ambosy el SKF-83566 y el SCH-23390actúan sobre ellos como antagonistasselectivos>. La única diferencia conocidaactualmenteentreambostipos de receptoresessu localización:ambosson postsinápticos,perolos Dl se localizan en el estriado,el núcleoaccumberny el tubérculo olfatorio mientrasquelos 05 se encuentranenel hipocampoy elhipotálamo(verSibleyy Momsma,1992).
En cuantoala familia de receptores02, elN-0437 y la bromocriptina actúan comoagonistas selectivos en todos ellos; sinembargo,el sulpiride y el YMO-91512 sonantagonistasselectivosde los receptoresD2 yD3, mientras que la clozapina actúa comoantagonistaselectivo de losreceptores04. Porotra parte, los D2 se encuentran,fundamen-talmente, en elesiriado,el núcleoaccumbens yel tubérculo olfatorio, los D3 en el núcleoaccwnbens,eltubérculoolfatorioy el cerebelo,y losD4 enlacortezafrontal, lamédulaespinaly el mesencéfalo(ver Sibley y Momsma, 1992yfliazetat, 1995).
La presenciade receptores03 en areascerebralesque reciben una inervación dopa-minérgicapobre sugiereque estosreceptorespodrían participar en accionesde la DA nomediadapor contactossinápticos(ver liMar etaL, 1995).
En general, los receptores02 se puedenlocalizaranivel tanto pre comopost-sináptico.Los receptores02 presinápticos(autorrecep-tores) se encuentran en terminaciones
nerviosas, flmdamentalmenteen las termina-ciones dopaminérgicas,y no parecen estaracopladosa proteínas O. Estos receptorespresinápticosregulanla síntesisy liberacióndeDA (se puedeconsultarunarevisión en Roth,1984). Los receptores02 postsinápticossíestánacopladosa la adenilato-ciclasaa travésde proteínasO de forma que su activacióninhibelaadenilato-ciclasa.
2.1.1.4. Víasdopaminérgicas
Las príncipales vías dopaminérgicasdelcerebrode la rata(ver Bjñrklund y Lindvall,1984) son las que forman los sistemasdeproyección mesoestriatal, mesolímbico ymesocortical.Seoriginanen la sustancianegray el áreavenirotegmentaldel mesencéfaloyproyectana estriado,áreaslímbicasy áreasdelacortencerebralrespectivamente.
Se han descritootrasvías dopaininérgicas(verBjórklundy Lindvali, 1984)quevan desdehipotálamo dorsal y posterior hacia médulaespina];desdezonainciertae hipotálamoperi-ventricular a áreapreópticae hipotálamope-riventricular; desde sustanciagris periacue-ductal y sustancia gris periventricular delhipotálamo a sustancia gris periacuedultal,tálamomedial e hipotálamomedial; y desdenúcleosarcuatoy periventricularapituitaria yeminenciamedia.
Ademásde estasneuronasde proyección,existenintemeuronasdopaminérgicasen bulboolfatorioy retina.
El másimportantede todosestossistemasdopaniinérgicoses elmesoesiriatal.De hecho,se ha calculado que el 80% de toda la DAcerebralseencuentraen elestriado(ver Weinery Molinoff 1989).
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Fig. 1. Esquema de losprocesos relacionados con laneurotransmisión dopaminérgica. CDSíntesis dedoyamina(DA) a partirde tirosina (Tyr); la tirosina-hidroxílasa <271) es laenzimareguladora de esta nita(.¿)AlmacenmnientodeDA en vesículaspresinñpticas. CI)LiberacióndeDApor exocítosís. unión de
la DA a los receptores DI produce un aumento de AMPe. La unión de la DA a losreceptoresD2postsinápticos produce, en general, una disminución de AMPc. La activación de los receptores D2presinápticos (autorrecepbores) regula la síntesisy liberación de DA. CrL0 inactivación de la DA se producepor recaptación a través de transportadoresypor degradaciónpor la enzima extracelidar catecol-O-metil-transíerasa (CO/vID. C~La DA recaptada es degradadapor la enzima monoamino oxidasa (MAO).
TERMINACIÓNPRESINÁPTICA
Tyr
4THO
DOPA
NEURONAPOSTSINÁPTICA
DA
AMPc
4AMPc
lo
Introducción
2.1.2.Efectosdel enve¡ecimientosobrelaneurotransmisióndopammnérgíca
Probablemente,la vía mejor estudiadaenrelación con el envejecimientocerebral es laproyeccióndopaniinérgicanigro-estriatal.Estose debe, en gran parte. al descubrimientodeque la enfennedadde Parkinson se producecomo consecuenciade la muerte de lasneuronasde proyecciónde la sustancianegra,con la consiguientedisminucióndel contenidode DA enel estilado
2.1.2.1.Eféctosdel envefecimientosobrela concentraciónde DA en muestrasdete/idocerebral
La concentraciónde DA en muestrasdetejido cerebrales un buenindicadordel estadoen quese encuentranlos procesosde síntesisydegradaciónde la DA y, por tanto, de lacantidadde DA de que disponenlas ternnna-dones dopaminérgicas. Esta aproximaciónmetodológica ha sido muy utilizada paraestudiarel efectodel envejecimientosobre laneurotransmisióndopammérgica. Los resul-tactos descritosson, sin embargo,contradic-tonos.
En la rata, algunosautoreshandescritounadisminucióndel contenidodeDA en elestriadoduranteel envejecimiento(Josephel al, 1978;Ponzioel al, 1982; Strong etal, 1982; Oiorgiel a!, 1987; Stoesslet aL, 1989; Marsball yRosenstein,1990); sin embargo,otros no handetectadotales cambios(Ponzio el al, 1978;Rose el al, 1986; Watanabeel al, 1987;Godefroyel al., 1989).
Dado que existen trabajosque, utilinudotécnicas, razas de rata y grupos de edadsimilares, obtienenresultadosopuestosy, a lainversa,con técnicas,razasy edadesdiferentes,vatios trabajosobtienenresultadossimilares,no se puede apelar a estos factores comocausantesde la disparidadde estosresultados.Por ello, estosdatos no nos permiten,por sí
solos, dilucidarel efectoqueel envejecimientotienesobrelacantidaddeDA enelestriado.
Por otra parte, se ha descrito unadisminución de la actividad de la enzimatirosina-hidroxilasaen el estriado de la rataduranteel envejecimiento(Algeri el al, 1977;Ponzioel a!, 1982)y unareducciónsimilar dela tasade síntesisde DA (Ponzioel al., 1978;Waianabeel a!, 1987; Marshall y Rosenstein,1990). También se ha descrito una mayoractividad de la enzimamonoamino-oxidasa-Ben el estriadode ratasviejas(Strolin Benedettiy Dostert, 1989). Estos datos sugieren queexiste una disminución real de DA en elestriado duranteel envejecimiento.Además,estahipótesisseveapoyadapor ladisminucióndel número de neuronasdurante el enve-jecimientodescritaenlasustancianegra(dondese encuentran los cuernos celulares de laterminaciones dopaminérgicas del estriado)(Sabely Stein, 1981).
En el humano,también se hadescritounapérdida de neuronasen la sustancianegra,(Colemany Flood, 1987)y unadisminucióndela actividad de la enzima tirosina-hidroxilasa(MeGeerel al., 1971). Sinembargo,cuandoseestudiael contenidode DA en el estriadolosresultados vuelven a ser contradictorios,describiéndosetanto reduccionesdel contenidodeDA duranteel envejecimiento(Adolfssonelal, 1979) como mantenimientodel contenidode DA a lo largo de la edad(Robinsonet al,1977; MacKayetal, 1978; se puedeconsultarla revisióndeKatzmanyTeny, ¡992).
2. 1.2.2. Efectosdel enve¡ecbrnentosobrela liberación de 1)A
Hay pocostrabajosquehayanestudiadolasconcentracionescerebralesde DA en condi-cionesbasales.En el estilado,varios trabajos.utilizando técnicas in varo e itt vivo, no handetectado cambios significativos de lasconcentracionesextracelularesde DA con la
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edad(Diuzen cí aL, 1991;Veneroel al?, 1991;Kametanieta!, 1995).
La liberación de DA inducida por altasconcentracionesde < se ha utilizado comomodelo para estudiar la capacidad de lasterminacionesdopaminérgicasparaliberar DA.Duranteelenvejecimiento,sehadescritoquelaliberación in viti-o (Thompsonel aL, 1981;Josepheta!, 1988) e in vivo (Kametaniel al,1995)de DA inducidapor 1< sc mantienesincambios en el estilado de animales viejos.Otros autores, sin embargo, han descntodisminucionesconla edadde la liberacióndeDA inducidaporK (Roseelal, 1986; Dluzenel aL, 1991; Friedemanny Gerhardt, 1992;Dobrevel a!, 1995). Porotraparte,Roseelal(1986), utilizando técnicasitt vivo handescritouna disminución de la liberación de DA trasestimulacióncon K heterogéneaen lamuestrade animales de experimentación utilizados.Estos autoresdescribendos gruposdiferentesde animalesviejos: uno de ellos no muestracambiosencuantoalaliberaciónestimuladadeDA, mientrasque el otro muestrauna dismi-nución deésta,lo cual ponede manifiestounavez más la variabilidad entre individuos delprocesodeenvejecimientocerebral.
De forma similar a lo que ocunecon laconcentraciónde DA en el tejido cerebral, laexistencia de varios trabajos de diferentemetodologíaen uno y otro grupo de resultadosdescartanla posibilidadde imputar a factoresmetodológicosla existenciade datos contra-dictorios. Ello nosimpidedeterminarde formaclara el efecto del envejecimientosobre laliberacióndeDA.
2.1.23.Efectosdel envejecimientosobrelossistemastransportadoresdeDA
La aplicación de anfetamina ha sidoutilizada como método para estudiar lacapacidaddelas terminacionesdopaminérgicasde liberar DA. Sin embargo, la anfetamina
produceunaliberación de DA citoplasmáticaquees independientede Ca2‘,por lo queestosestudiosnos informan másdel estadode lossistemasdetrasportede DA y de la capacidadde síntesisde DA que de los mecanismosdeliberaciónvesiculardeDA.
En el estriado,variostrabajoshandescritouna menor liberación de DA tras laadministración de anfetamina en animalesviejos (Dluzen el al, 1991; Kametani el aL,1995),aunquetambiénexisteun trabajoquenodetectatalescambios(Thompsoneta!, 1981).
Enun extensotrabajoutilizandotécnicasinvi1ro, Dobrevel al (1995)han descrito vanasmodificacionesen la liberación de DA enanimales viejos. Así, la aplicación deverairidina produce una liberación de DAmayor en animalesviejos que en animalesjóvenes. Esta liberación de DA no se vióafectadaenanimalesjóvenespor la tratamientoprevio de reserpina (lo que indica que talliberaciónno es vesicular)pero si en animalesviejos. Por otra parte, la liberación de DAinducidapor K> fue menoren animalesviejos,sin embargo, la ouabaína (inhibidor de labomba N& -K~-ATPasa) disminuyó estaliberación de DA en los animales jóvenes(como cabíaesperar)peroaumentóla obtenidaen animalesviejos. Estosresultadoshanhechosugeriralosautoreslahipótesisde queduranteel envejecimiento podría existir una dismi-nución de la liberación vesicular de DA(dependiente de Ca2j, acompañada de unaumentode la liberación citosólica de DA(independientede Ca2) (Dobrevel aL, 1995).Esta hipótesis, sin embargo, no estaría deacuerdocon los resultadosobtenidospor otrosenlos quela anfetaminainduce unaliberacióndeDA similar o menoren animalesviejos (vermásarriba).
Por otra parte, los trabajos que hanestudiadodirectamenteelnúmerode transpor-tadoresdeDA y suafinidadpor la DA no han
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detectadocambioalgunoa lo largo de la edaden el estriado de la rata (Thompson el a!,1981; Strong el aL, 1984; Marshall y Alter,1986).
En el humano,estudiosrealizadositt vivohan descrito una disminución del númerodetransportadoresde DA durante el envejeci-miento en el cuerpoestriado(Volkow ci a!,1994; Van Dyck el a! ¡995).
2.1.2.4.Efectosdel enve/ecimientosobrelos receptoresdopaminérgícos
Uno de los hechosmejor establecidosenrelacióncon el efectodel envejecimientosobrela neurotransmisión dopaminérgca es ladisminución de la densidad de receptoresdopaminérgicos02 en el estriado.Estehechose ha observado tanto en animales deexperimentacióncomo en humanos,indepen-dientementedelas técnicasutilizadas(verp. ej.Joyceeta!, 1986,Hyitel, 1987,Morganeta!,1987; 1-lan el a!, 1989; Morelli et a!, 1990;Rinne el al., 1990; Murray y Waddington,1991; Antononí ci a!, 1993 y la revisión deJosephel a!, 1990).
En relación con los receptoresdopami-nérgicosDI, existen datoscontrovertidos(sepuede consultar una discusión de estacontroversia en Joseph el a!, 19%). Así,algunosautoreshan descrito una disminucióndel número de receptores Dl durante elenvejecimientoparalelaa laqueocurrecon losreceptores02 (p. ej. Giorgi el cl., 1987;Hyttel,1987; Morelli eta!, 1990);sin embargo,otrosautoresdescribenque el númerodereceptoresDl no cambiaduranteel envejecimiento(p. ej.Rinne, 1987; O’Boyle y Waddington, 1984 yMuaayyWaddington,1991).
En todo caso, se ha sugerido que ladisminución del número de receptoresdopaminérgicosduranteel envejecimientosepodríaproducir comoconsecuenciatanto delamuerte de neuronas que expresan estos
receptorescomo de la disminución de lasíntesis de receptoresdopaminérgicosen lasneuronassupervivientes(Mesco el al, 1991;Giorgí el al.. 1992; ver la revisióndeJosephela!, 1990).
2.1.2.5.Acercadelefectodelenvejecimientosobre laneurotransmísióndopaminérgica
Todos los datosaquí revisadosse refierenal estadodelaneurotransmisióndopaminérgicaenelestriado,no sóloporserel estriadoel áreacerebraldondese concentrala mayor partedela DA, sino, sobre todo, por la ausenciadetrabajosenotrasáreasdel cerebro.
Delosdatosrevisadospodríasugerirsequeel envejecimientoproduceunaalteracióndelaneurotransmisióndopaminérgicaen el estriadofundamentalmente a nivel postsináptico,produciendouna disminución del número dereceptoresde DA. A nivel presináptico, ladisminución del númerode neuronasdescritaen la sustancia negra parece tener comoconsecuenciaunadisminuciónde la capacidadde liberar DA por partede las terminacionesdopaminérgicasdel estilado, probablementepor una disminución en la síntesis de DA,aunqueestehallazgono estábienconfirmado.
Efectos delenvejecimiento sobre laneurofrwzsmi¶ión dopa>ninhTjcaenelauñadode¡a rata
• DisminucióndelasíntesisdeDA
• Disminuciónde la concentracióndeDA (7)
• Conservacióndela capacidadde liberarDA encondicionesbasales
• Disminución de la capacidadde liberar DAtrasestimulaciónconK (7)
• Conservacióndel número de transportadoresdeDA y de suafinidadpor la DA
• Disminucióndel númerodereceptoresD2
• DisminucióndeJ númerodereceptoresDl (7)
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Se ha sugerido que la alteración de laneurotransmisión dopaminérgica que seproduceduranteel envejecimientoestáimpli-cadaen las alteracionesmotorasy cognitivasqueseobservanen losindividuosviejos (verp.ej. Murray y Waddington, 1991 y Arnsten,1993).
2.2. ACIDO GLUTAMICO
2.2.1. Neurotransmisiónglutamalérgica
El ácidoglutámico(GLU) es elneurotrans-misor excitadormásabundanteen el SistemaNervioso de los mamíferos. Sus efectosexcitadoresfuerondescritosen los años50, alobservarque su aplicación tópica sobre lacortezacerebralproducíaactividad convulsiva(Hayashi, 1952) y que su aplicación ionto-foréticaproducíadespolarizacióndeneuronaseincrementode la frecuenciade potencialesdeacción (Curtis ci a!, 1959). Actualmente,seconsiderabienestablecidoqueelGLU cumpleel papelde neurotransmisoren la mayoríadelas sinapsisexcitadorasrápidas del SistemaNervioso Central (se pueden consultar lasrevisionesde Fagg y Foster, 1983; Fonnum,1984; Cotman el al., 1987; Nicholls, 1993;Orregoy Villanueva, 1993).
2.2.1.1.Metabolismodel<tU
El GLUpuedesersintetizadoen el SistemaNerviosoatravésde multitud de rutas(apartirde glutamina -GLN-, a-cetoglutarato,proteínas,arginina, ornitina o prolina) siendosusprincipalesprecursoreslaglucosay laGLN(Eonnum, 1993).Actualmenteseconsideraquela síntesis de (JLU en el SistemaNerviosoocurre,principalmenteapartir dela GLN poracción de la enzimaglutaminasa(Bradford ela!, 1978: Fonnum, 1993). Tambiénexisteunarata de síntesis a partir del a-cetoglutaratocatalizadapor la aspartatoaminotrausferasa(Bradford 1988; McOeer y McQeer, 1989;Fonnuin, 1993).
Laglutamínasaes unaenzimamitocondrialque se encuentra mayoritariamente en lasterminaciones nerviosas de las neuronasglutamatérgicas,aunquese puedelocalizar enotros tipos celulares (Fonnmn, 1993). Laenzima glutaminasa está regulada princi-palmentemedianteinhibición por su producto(Bradford,1978);puedeactivarsepor fosfatoyCa2 es decir,porel incrementode laactividadenla terminaciónnerviosa,y puedeserinhibidaporNl-Ii yH~(Fonnum,1993).
El catabolismo del GLU se realizaprincipalmentepor oxidaciónatravésdel ciclode Krebso por conversióndel OLU en OLNmediante la enzima glutamina sintetasa(Fonnum, 1993). La glutamina sintetasaseencuentralocalizadacasi exclusivamenteen laastroglía(Martínez-Hemández,1977), si bienno se puedeexcluir unapequeñaactividad deestaenzimaenneuronas(Fonnum, 1993).
El metabolismodel GLU en el SistemaNervioso se encuentra,por tanto, separadoendoscompartimentoscelulares:por un ladolastennuiacionesnerviosasy porelotro lascélulasgliales. Así, el GLU es sintetizadoen lastenni-naciones nerviosasy, tras su liberación alespaciosináptEo,escaptadoen su mayoríaporlascélulasgliales,dondeesconvertidoen GLNmediantela enzimaglutainina sintetasa.Unavez sintetizada, la OLN difunde al espacioextracelular, de donde es captada por lasneuronas glutamatérgicas a través detransportadoresde baja afinidad, utilizándoseparalasíntesisdeGLU(Fonnum,1993).
2.2.1.2.Almacenamiento,liberación einacíivacióndel (tU
El OLU sintetizado en la terminaciónnerviosaes almacenadoenvesículassinápticas.El mecanismode transportevesicularde GLUes independientede Nat y estáacopladoa ungradientedeH~ queesgeneradoporuna
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ATPasadirigida haciael mtenorde lavesícula(Naito y Ueda, 1985, N¡cholls, 1993).También existe un almacén de GLU encitoplasma
La liberaciónsinápticaCa2’-dependientedeGLU tras estimulaciónquímica o eléctricaseha demosirado in vitro (Fonnuni, 1984;Nicholís, 1989). Estudiosen sinaptosomashandemostradoqueestaliberaciónse produceporexocitosis y no por salida directa desde elcitoplasma(Nicholls, 1989).
La inactivación del GLU liberado alespacio smápbco se produce mediante laintroducción de éste en las terminacionesnerviosasy en los astrocitoscircundantesatravésde sistemasde captaciónde altaafinidady dependientesdel gradiente de Na~ y(Nicholls, 1993). De estos dos componentescelulares,el glial es el quecaptala mayoríadelGLU liberado (Rothsteinel al, 1996): se hacalculadoque,en elestriado,el 80%del GLUes captadopor los transportadoreslocalizadosen lascélulasgliales(Rothsteincial, 1996).
Hasta la fecha se han donado trestransportadoresde membranade alta afinidadpara el GLU (ver la revisión de Attwell yMobbs, 1994). En todo caso, los tres parecentener el mismo mecanismo de acción: laentrada de cada molécula de OLU seacompañade laentradade 2 moléculasde Na~y de la salidade 1 moléculade K y otra deORodeHCO<.
El transportede OLU puede invertirsecuandola concentraciónextracelularde K eselevadao cuandosedisipael gradientede Nat(p. ej. con veratridina), produciéndoseunaliberación de GLU que es independientedeCa2 Estetipo de liberaciónse ha demostradoiii vi/ro (Nicholís, 1989; Attwell el a!, 1993).Iii vivo, experimentosrealizadosen nuestrolaboratoriohanmostradola liberacióndeGLUa través de transportador(del Arco el a!, ySegovia el al, datos no publicados).
Actualmentese discute que la liberación deGLU atravésdesutransportadorpuedaseruncomponente importante de la liberaciónfisiológicade OLU, aunquesi parececlaroqueel aumentode la concentraciónextracelulardeGLU observadoen determinadascondicionespatológicas (p. ej. en isquemia), podríaexplicarsetambiénpor la liberaciónde GLU através de estos sistemas transportadores(Nicholísy Atrwell, 1990; Levi y Raiteri, 1993;Nicholls, 1993).
2.2.1.3. Receptoresglutamatérgicos
Los estudiosfannacológicosy moleculareshan permitido demostrarla existenciaen elSistema Nervioso de receptoresglutamatér-gicosde dos clases:receptoresionotrópicosyreceptoresmetabotrópicos.
Los receptores glutamatérgicos iono-trópicos son canales íonicos. Farmacológi-camentesehandescritotrestipos dereceptoresionotrópicospara el GLU en función de sudiferenteafinidadpor sustancias:los receptoresN-metil-D-aspartato(NMDA), los receptoresa-am¡no-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol-propio-nato (AMPA), y los receptoreskainato (KA)(Farooquiy Horrocks, 1991; Nakanishi, 1992;Sprengely Seeburg,1993).
El receptor NMDA es un canal iónicoselectivo para el Ca~ reguladopor múltiplessitios deunión. Sehan descritositios de uniónespecificosparael GLU o sus agonistas;paraglicina; paracationes,en el interior del canal,dondeel Mg2~ puedeunirsey bloquearel flujode iones; parapenciclidinas; parapoliaminas;parael Zn2’ (distinto del de Mg2j; paraH yun sitio redox (Farooqui y Horrocks, 1991;Nakanishi, 1992; Hollmann y Heinemann,1994).
Los receptoresNMDA poseenunaelevadapermeabilidadparael Ca2~, puedenactivarsedeformaprolongaday puedenserbloqueadosporMg2~ dependiendodel voltajede la membrana(Nakanishi, 1992; Sprengely Seeburg,1993).
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íntroduccuin
Sus propiedades indican que el receptorNMDA puede actuarcomo un detectordecoincidenciamolecular: su activacióndependede la existencia simultánea de actividadpresináptica (liberación de GLU) ypostsináptica(despolarización).Debido a esto.el receptor NMDA ha sido implicado enprocesostales como aprendiz~je,memoriaycoordinación motora Por otra parte, esasmismaspropiedadestambién sugierenque elreceptorNMDA podríaparticiparen la muerteneuronal inducida por la presenciade altasconcentracionesde GLU en el espacioextracelular (Farooqui y Horrocks, 1991;Sprengely Seeburg,1993).
LosreceptoresAMPA son canalesiónicosindependientesdevoltaje, de cinéticarápidaycon permeabilidad selectiva para cationesmonovalentes(Nat, Kl). Se consideraque elreceptor AMPA es el responsablede latransmisión excitadorarápida mediada porGLU y de la activación del receptorNMDApor desbloqueo del canal iónico comoconsecuenciade la despolarización.Por estoúltimo se comprendeque sudistribuciónen elSistemaNerviosoCentral seamuy similar a ladel receptorNMDA: ambosse encuentranenalta concentraciónen la cortezacerebral, elhipocampo,el estriadoy el tálamo(FarooquiyHoaocks,1991; Sprengely Seeburg,1993).
Los receptoresKA presentan,como losreceptoresAMPA, unaaltapenneabilidadparacationesmonovalentes(Nat, K~) (EarooquiyHorrocks, 1991; Sprengely Seeburg, 1993).En realidad,variosestudioshanmostradoqueelKA puedeactuartanto sobrereceptoresKAcomo sobre receptores AMPA. El papelfisiológico de estosreceptoresKA es incierto.Se ha sugerido su participación en latransmisiónexcitadorarápida. Su localizaciónes complementariaa la de los receptoresNMDA y AMPA, si bien parecen estarpresentesen todoslos circuitosneuronalesdel
SistemaNervioso Central (Nakanishi, 1992;Sprengely Seeburg,1993).
Los receptoresglutamatérgicos metabo-trópicos, por su parte, actúan acopladosadistintos efectores celulares a través deprotemas G. Se han donado hasta8 tiposdiferentesdeestosreceptores(mGluRI-8)a losquese haagrupadoen tresfamiliasen funcióndela afinidad pordiferentesagonistasy de lossegundosmensajerosligados a su activación(Nakanishi, 1992; Schoepp y Conn, 1993;Hollmann y Heinemann, 1994; Nakanishi,1994; Pm y Duvoisin, 1995):
- los receptores mOluR1 y 5 respondenmejor al quisqualatoy su estimulaciónaumentala síntesisde inositoles infosfatoy, por tanto, la concentraciónintracelularde Ca2~ por movilización de las reservasinternas de este catión; se ha descritotambién el amnento de los niveles deAMPc y de ácido araquidónico poractivacióndel receptormOluR1;
- los receptoresmGluR2 y 3 respondenmejor al trans-l-aminociclopentano-1,3-dicarboxilatoy su estimulacióninhibe laformacióndeAMPe;
- los receptoresmGluR4, 6 y 7 respondenmejor al 2-amino-4-fosfonobutiratoy suestimulacióntambién inhibe la sintesis deAMPc.
Los receptores mGluR8 son de dificilclasificación: algunos autores los incluyendentro del grupode los receptoresmOluR2-3(Nakanishi, 1994)y otros dentro del grupo delos receptoresmOluR4-6-7 (Pm y Duvoisin,1995).
En general,se haasignadoalos receptoresmetabotrópicosun papel predominantementemodulador de la neurotransmisión(Baskys,1992; Nakanishi,1992). La activaciónde estosreceptores puede producir despolarización
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Introducción
(Schoeppy Conn, 1993); sin embargo, enfunciónde losdistintosefectorescelularesalosque estén acoplados,sus efectos pueden sertanto excitadorescomoinhibidores. De hechose ha descritoun aumentode las corrientesdeCF y de K4 tras activación de receptoresmetabotrópicosqueprovocaunareduccióndela excitabilidad neuronal (Schoeppy Conn,1993; Hollmanny Hememann,1994).
La activación de receptores giutama-.térgicos metabotrópicos puede inhibir latransmisión glutamatérgica. Este efecto estámediado, probablemente,por autorreceptorespresinápticosdel tipo mGluR4 (que fUeronconsideradoshaceañoscomoun tipo diferentede receptoresglutamatérgicos:losreceptores2-amino-4-fosfonobutirato-AP4-), mGluR2 ymGluR3 (Nakanishi, 1992; Schoeppy Conn,1993; Holimanny Heinemann,1994).
2.2.1.4. Víasglutamatérgicas
Las neuronas glutamatérgicas estándistribuidas ampliamenteen todo el SistemaNervioso Central, principalmente en eltelencéfalo, donde la mayoria de las
proyeccionescorticalescontienenGLU (ver lasrevisionesdeFaggy Foster, 1983 y Cotmanelal, 1987). Las vías glutamatérgicas sonflincionalmente heterogéneas,debido a ladiferente distribución de los receptoresglutamatérgicos.Porejemplo,lasvíasqueusanreceptoresNMDA estánvinculadasaprocesosde plasticidadsinápticae integraciónsensorial,mientrasquelas queusan receptoresAMPA oKA lo estána la transmisiónexcitadorarápida(Colmaneta!.. 1987).
Las vías glutamatérgicasmejor conocidasson lasproyeccionescórtico-fligalesque,desdecorteza,llegana estriado,tálamoy núcleosdeltronco cerebral(ver la revisión de Cotmanelal, 1987).
También han sido descritas víasgiutamatérgi~ tálamo-corticalesy córti ca-corticales,éstasúltimas fundamentalmenteenel hipocampo. Son glutamatérgicas, porejemplo, la vía entorrino-cortical (víaperforante), las fibras comisurales, las fibrasmusgosasy lascolateralesde Schaffer(FaggyFoster, 1983; Fonnum, 1984; Cotmanet al,1987).
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Introducción
Fig 2. Esquemade ¡os procesosrelacionadosconla transmisióngíníamatérgícaCi)Síntesisdeácidoglutánico(GUI) apartir deglutamina(GLAQ, reaccióncatalizadapor la g~utaminasa(Gín-asa).El GLUtambiénpuedesersintetizado apartir deglucosa(Gluc) (¡‘ir: piruvato). (.&AlmacenamientodeGLUenvesiculaspresinápeicas.(J) LiberacióndeGLUpor exocUosi& ®La unióndel GLUalasreceptoresAMPAyAA producela entradadeN~t en la neumnapostsináptica.La unión delGLUa losreceptoresNAdVAproducela entradadeCa enla neuronapostsinápticaLa activaciónde losreceptoresmetabotrópicos(mGlu.R)postsinápticosproduceun aumentodel inositol tr~fosfato(1P3). la activacióndelosmGlu-RpresinápticosproduceunadisminucióndeAMPc. (9La inactivaciándelGLUseproducepor recaptaciónatravésdetransportadoressituadosenlaslenninacionespresinápticasyenlascélulasguaJes. (~)ElGLUrecaptadopor lascélulasglialesestransfrnnadoenCHINa travésdela acciónde laglutaminasintetasa(Gín..s). La GLNglialesliberadaal espacioextracelui’arycaptadopor lasterminacionespresinápuicasyutilizadaparasintetizarGLU
GIuc—. Pir
Ca2 Na Na
GLU
TERMINACIÓNPRESINÁPTICA
CÉLULAGLIAL
oNEURONA
POSTSINÁPTICA
GLN
GIn-s
OLU
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Introducción
2.2.2.Efectosdel envejecimientosobrela neurotransmisiónglutamatérgica
2.2.2.1.Efectosdel envejecimientosobrela concentraciónde CLU en muestrasdetejido cerebral
Los primeros estudiossobreel efectodelenvejecimientoen la neurotransmisióngluta-matérgicase hicieron analizandoel contenidode GLU en muestrasde tejido cerebral(en loquesigueacercadel efectodel envejecimientosobre la neurotransmisiónglutamatérgica,sepuede consultar Porras y Mora, 1996 o larevisión de Porras y Mora, de próximaaparición).
En lacortezacerebral,cuandoes analizadasin distinguir entre áreas, la mayoria de losestudioshan mostradoun menor contenidode(RU en animalesviejos en comparaciónconanimalesadultosjóvenes(Davis y Himwich,1975; SIrolin Benedetti el aL, 1990, 1991;SaransaariyOja,1995).
Cuando la corteza cerebral es analizadaseparándolaen áreasdiferentesdeacuerdoa suestructura, se observa que el efecto delenvejecimientosobreel contenidode GLIJ esdiferenteen cada una de ellas. Por ejemplo,algunostrabajosdescribencantidadesmenoresdeOLU enlacortezafrontal deanimalesviejosencomparacióncon animalesjóvenes(Dawsonel aL, 1989; Wallace y Dawson, 1990)mientrasqueotros no detectandiferenciasen elcontenido de GLU en cortezas parietal otemporal entre animales viejos y jóvenes(Fomielesel aL, 1986; Banay-Schwartzet al,1989). Inclusodentrodelacortezafrontal sehadescrito una disminución de GLU con elenvejecimientoen la cortezaprefrontalmedialperono en las subdivisionessulcaly dorsaldelacortezaprefrontal(Fomielesel aL, 1986).
En el estriadolosresultadosdescritosen labibliografiasoncontradictorios:sehandescritodisminuciones(Strolin Benedettiet aL, 1990,
1991), ausenciade cambios(Dawson el al,1989; Wallacey Dawson,1990, SaransaanyOja, 1995)y aumentos(Donzantiy Ung, 1990)de la concentración de OLU durante elenvejecimiento.
En el hipocampo, sí parece existir unaconcentraciónde OLIJ menor en animalesviejos en comparacióncon animalesjóvenes(Banay-Schwartzcíal, 1989; StrolinBenedettiet al. 1990, 1991; Saransaariy Oja, 1995).Existe un trabajo en el que no se detectancambiosen laconcentracióndeGLU duranteelenvejecimientoen el hipocampo(Dawson yWallace, 1992). Sin embargo,estetrabajoestáhecho con ratas de raza Long-Evans cuyalongevidades mayor quelas de raza WistaryFisher-344(ver Colemany Flood, 1987), porlo quees posibleque los cambiosdebidosalenvejecimientose detectenen estosanimalesaedadesmásavanzadas.
En otras estructurascerebrales,los resul-tadosobtenidosal cuantificarla concentraciónde GLU duranteel envejecimientoson contra-dictorios. Porejemplo,enel núcleoaccwnbensse handescritoausenciade cambios(DonzantiyUng, 1990)o disminucionesdel contenidodeGLU(StrolinBenedettietaí,1990, 1991)yenla sustancianegra se han descrito aumentos(Donzantiy Ung, 1990), ausenciade cambios(Banay-Schwartzelal., 1989)y disminuciones(Strolin Benedetti el aL, 1990, 1991) delcontenidode(RU.
Las disminucionesde la concentracióndeGLU en lacortencerebral,específicamenteenlacortezafrontal yen el hipocampoduranteelenvejecimiento parecen bien establecidas.AdemÁs,concuerdancon los resultadosde lostrabajosqueanalizanel númerode neuronasalo largo del envejecimiento.De hecho se hadescrito muerte de neuronas durante elenvejecimientoen la cortezacerebral(Knox,1982; Heumami y Leuba, 1983; Petersel al,1987), específicamenteen la cortezafrontal
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Introducción
(Mufson y Stein, 1980), y en el hipocampo(Brizzeey Ordy, 1979; LandfieldelaL, 1981).En estasestructuras,lamayoríadelasneuronasson glutamatérgicas,por lo queladisminuciónde la concentración de OLU puede serconsecuenciadelamuerteneuronalqueocurreduranteel envejecimiento.
El análisisde la concentraciónde GUi enmuestrasdetejido, sin embargo,no es un buenindicador del estado de la neurotransmisiónglutamatérgica. ya que el QLU es unaminoácidoqueformapartedeproteínasy queinterviene en multitud de rutas metabólicas.Así, unaalteraciónen la concentracióntisularde GLU podría reflejar cambios en rutasmetabólicasenlas queintervieneel GLU peroque no están relacionadas con la neuro-transmisión. Para estudiar el estado de laneurotransmisiónglutamatérgcaconel enveje-cimiento es necesarioestudiarparámetrosmásdirectamente relacionados con la funciónneurotransmisoradel GLU: por ejemplo, laconcentración extracelular de GLU, laliberación de GLU inducida por agentesdespolarizantesy los transportadoresy recep-toresdeOLU.
2.2.2.2.Efectosdel envejecimientosobrela liberacióndeGLU
En la cortezacerebral, la mayoría de losestudios han demostrado que no existencambiosalo largo dela edaden la liberaciónde GLU en condicionesbasales.Estaausenciade cambios duranteel envejecimientose hadescrito tanto en estudios itt vitro como enestudios itt vivo independientementede laespecie utilizada (ratas y ratones),del áreacerebral estudiada(cortezasfrontal, parietalyoccipital) y de la razadeanimalutilizada(ratasWistar, Long-Evansy Fisher-344)(Dawsonelal., 1989; Cobo el aL, 1992; Dawson yWallace, 1992;Coboeta!, 1993; Porrasel aL,1993; Palmer et aL, 1994; Sánchez-Prietoelal., 1994;SaransaanyOja,1994, 1995)
En la corteza cerebral, la liberación deGLU inducidapor agentesdespolarizantestalescomo o 4-aminopiridina,tampocoparececambiarduranteel envejecimiento(DawsonelaL, 1989; Pairneret al., 1994; Sánchez-Prietoel aL, 1994; Saransaariy Oja, 1994), aunqueexisteun trabajo quedescribequela liberaciónde GLU inducidapor es mayor en ratonesviejos (Saransaariy Oja, 1995). Sin embargo,cuandose hananalizadoreasdeterminadasdela cortezase hanencontradoalgunoscambios.Por ejemplo, en la corteza temporal se hadescritouna liberaciónde GLU inducidapor
mayor en animalesviejos queen animalesjóvenes(Meldnmi el aL, 1992). En la cortezaprefrontalse hadescritounadisminuciónde lasensibilidadal estimuloeléctrico en animalesviejos(Coboeta!, 1993).
En el estriado,la mayoriade los estudiosmuestranque la concentraciónde GLU encondiciones basales(Sánchez-Prieto el al.,1994; Saransaari y Oja, 1995) o trasestimulación (Freeman y G¡bsow 1987;Sánchez-Prietoet al, 1994, Donzanti ez aL,1993; Saransaari y Oja, 1995) no cambiaduranteel envejecimiento.Sin embargo,existeuna publicación que describe unaconcentración basal de GLU mayor enanimalesviejos (Freemany Gibson, 1987). Esposiblequelas diferenciasen estosresultadosse debanaque los cambioscausadospor elenvejecimiento se produzcan en ciertasregionesdel estriadoperono en otras.En estesentido, se ha descrito un aumento de laconcentración basal de GLU durante elenvejecimientoenel estriadolateralpero no enel estriadomedial de la rata(Donzanti el a!,1993).
En otras áreascerebralestambién se haestudiado la liberación de GLU con elenvejecimiento.Por ejemplo,en el hipocamposehadescritounaconcentraciónexiracelulardeGLU en condiciones basales mayor enanimales viejos que en animales jóvenes
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Introducción
(utilizandoratonesy ratas>(Freemany (libson,1987; Meldrum el aL, 1992), aunqueSaransaariy Oja (1995) describenunamenorconcentración de GLU en ratones viejos.También son controvertidos los resultadosobtenidoscuandose induce la liberación deQLU porK~: algunosautoresmuestranqueesmayor en animalesviejos (Meldrum et a!,1992; Saransaariy Oja, 1995), pero otrosautoresno detectantales cambios(Freemany(3ibson, 1987). Todos estos estudios se hanhechoconmétodositt vflro. Hastala fechanoexisten trabajospublicadossobrela liberaciónitt vivo de GLU en el hipocampoduranteelenvejecimiento
2.2.2.3.Efectosdelenvejecimientosobrelos sistemastransportadoresde GLU
Los trabajosque estudianla capacidadderecaptarGLU por partede las neuronasy lascélulas gliales en relación con el procesodeenvejecimiento ofrecen resultados contradic-torios.
En la cortezacerebral y en el estriadosehan descrito tanto disminuciones(Wheeler,1980; Price ex aL, 1981; Wheeler y Oxido,1986; Najlerahim ex al., 1990; SaransaariyOja, 1995) como aumentos(Strong el aL,1984) o ausenciade cambios(Dawson el a!,1989; Palmereta!, 1994)de la capacidadderecaptacióndeGLU duranteelenvejecimiento.Las diferenciasentreestosresultadospodríandeberseaqueexistandisminucionesrealesdelnúmero de transportadoresde GLU compen-sadaspor un aumentode la afinidadde estostransportadores,tal y como se ha sugeridorecientemente(Saransanríy Oja, 1995). Porotra parte, todos estos trabajosestánhechosutilizando métodos in vitro, sobre todopreparacionesde sinaptosomas(terminacionesnerviosas),queno incluyencélulasgliales. Sinembargo,el (RU liberadoal espaciosinápticoes captadofundamentalmentepor las célulasgliales (Rothsteinel al., 1996). Por tanto, los
cambiosdescritosen algunosde estostrabajosno son expresiónfiel de lo que ocuneen losmecanismos de recaptacióndel GLU. Dehecho, un cambio en la capacidad derecaptación de GLU por parte de lastemxinaciones nerviosas podría sercompensadopor cambiosen sentidocontrarioen el componenteglial, por ejemplo con elaumento del número o de la capacidadfuncionalde losastrocitos.De hecho,algunostrabajoshandescritotales cambiosen la gliadurante el envejecimiento (Teny, 1986;Vázquezex aL, 1992). Estaposibilidadse veapoyadaporlosresultadosobtenidosutilizandocortesde tejido cerebral, que incluyen tantoneuronas como células gliales, y que handescritoel mantenimientode la capacidadderecaptaciónde(RU duranteel envejecimiento(DawsonetaL, 1989).
Es interesante subrayar que todos lostrabajos que han estudiadola capacidadderecaptaciónde GLU en el hipocampohandemostradotambiénelmantenimientodeestossistemasduranteel envejecimiento(Gilad elaL, 1990; Najlerahim el a!, 1990; Paliner elal., 1994).
2.2.2.4.Efectosdelenvejecimientosobrelos receptoresglutamatérgicos
Uno de los resultadosmejor establecidosen relación con el estado de la neuro-transmisióngiutamatéwjcaduranteel envejeci-miento es la disminuciónde receptoresglula-niatérgicosNMDA. Esta disminución se hadescritoen la mayoría de las áreascorticales,en el hipocampoy en elestriado(PetersonyColman,1989; Miyoshieta!, 1991;TamaruetaL, 1991;Wenk el al, 1991,CohenyMúller,1992; Cimino el aL, 1993; MagnussonyColman,1993a, 1993b;Castorinael aL, 1994;Senael a!, 1994). Estosresultadosse hanrepetido independientementede la especieanimaly de la razaestudiadas(ratasWistar y
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Introducción
Fisher-344;ratonesBALB/c, CS7B1y NMRI),asícomodela técnicautilizada
Juntoa la disminuciónde la densidaddereceptores NMDA se han descrito otroscambiosen este receptor durante eí enve-jecimiento. Por ejemplo, se ha descrito unadisminuciónde la respuestapostsinápticatraslaestimulacióndel receptorNMI)A (BaskyselaL, 1990; Gonzalesel a!, 1991; pero vertambiénSerrael al., 1994),aunquetambiénunaumentode la afinidad del receptor NMDApor el GLU (Cohen y Miil1er4 1992). Asímismo, se han descrito cambios en lainfluenciaquetienen los sitios demodulacióndel receptorNMDA sobrela actividadde estereceptor(Miyoshi el aL, 1990; Piggott ex a!,1992).
El número de receptoresglutamatérgicosAMPA pareceexperimentartambiéndisminu-cionesconel envejecimiento,sin embargo,losresultados con este receptor no son tanconsistentescomolosobtenidosconelreceptorNMDA. Así, sehandescritodisminucionesenel númerode receptoresAMPA en la cortezafrontal y parietal del ratón (Magnusson yCotman,1993b),perono enlacortezacerebralde la rata(Tamaruex al., 1991; Cimino eta!,1993). Por otra parte,en el hipocamposehandescrito disminuciones del número dereceptoresAMPA duranteelenvejecimientoenalgunasáreas,perono entodo el hipocamnpo(Cimino el aL 1993; Magnussony Cotman,1 993b>.
De modo similar a lo que ocurre con elreceptorNMDA, ladisminucióndelnúmerodereceptores AMPA en ciertas áreas delhipocampo (R ej. en el área CAl, verMagnussony Connan, 19931,) durante elenvejecimiento es coherentecon la disnú-nución de la respuestaa la estimulacióndeestos receptores descrita por otros autores(Barneseta!, 1992).
En relaciónconel receptorKA, ennuestroconocimientosólo existe un trabajo que loestudie en relación con el envejecimiento,señalandoqueno variaconla edadencortezaehipocampo(Tamameta!, 1991).
No existen trabajos publicados queestudien otros receptores glutamatérgicosdurante el envejecimiento. Por otra parte,algunostrabajoshan descritoquela respuestaneurona]trasla aplicaciónexógenadeGLU nocambiaduranteelenvejecimiento(Lippael a!,1981; Rao eta!, 1993).
2.2.2.5.Acercadel efectodelenvejecimientosobrelaneurotransmisióngluiamatérgica
La mayoría de los estudiosmuestranquelas terminaciones nerviosas glutamatérgicasmantienen, durante el envejecimiento, sucapacidadde liberarGLU tanto en condicionesbasalescomo tras estimulacionesexógenas.Estaafirmaciónseapoyaen estudiosrealizadostanto itt vitro comoitt vivo, utilizandoratonesyratas como animales de experimentaciónyanalizando varias estructurascerebralesqueincluyen corteza cerebral, hipocampo yestriado.Sin embargo,el análisis del compo-nente postsináptico de la neurotransmisiónglutamatérgica durante el envejecimientodemuestraque existe una disminución delnúmerodereceptoresNMDA enlamayoríadelas estructuras cerebralesestudiadasy delnúmerode receptoresAMPA enalgunasáreasdel hipocampo. Estadisminución del númerode receptoreses coherentecon el descensodela respuestapostsinápticatras la estimulaciónselectivade los mismos en estasestructurasduranteelenvejecimiento.
Por otra parte,se ha descritoun aumento,duranteel envejecimiento,de laafinidadde losreceptoresNMDA por el GLU, lo cual añadeun grado másde contbsiónala cuestión,yaque este aumento de afinidad podría
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Introducción
compensarla disminución del número dereceptoresgiutamatérgicos.Es más,estaúltimaposibilidad coincide con los resultados dealgunos trabajos que han mostrado que noexistencambiosde larespuestaa la aplicaciónexógenade GLUduranteel envejecimiento
Por tanto, los datos aquí revisados (yresumidosacontinuación)acercadel efectodelenvejecimiento sobre la neurotransmisiónglutamaérgicason, aún,insuficientesy contro-vertidos, por lo que no se puede aclarar siexiste un déficit real de este sistemaneuro-transmisoren el animalviejo.
Efectosdelenvejeelmientosobre¿aneurotransmisiónglutamatérgicaen la cortezacerebralyel tibiadodela nito
• Disminución de la concentraciónde GLU enalgunasáreasdeLa corten(7)
• Conservacióndela capacidadde liberar GLU encondicionesbasales
• Conservaciónde la capacidadde liberar GLUtrasestimulaciónconK’ (7)
• Disminucióndel númerodereceptoresNMDA
• Aumentode la afinidaddel receptorNMDA porel GLU
• Disminución de la respuestapostainápticaa laestimulacióndel receptorNMDA
• Disminucióndel númerode receptoresAMPA(7)
2.3. GASA
2.3.1. Neurotransmisióngabérgica
El aminoácido neutro ácido gamma-aminobutirico(GABA) es el neurotransmisorinhibidor más ampliamentedistribuido en elSistemaNerviosoCentral (Mugnaini y OerteL1985). Su presenciaen el tejido cerebral sedescubrióen 1950, demosfrándosesu funciónneurotransmisoraa finales de los años 60(Krnjévicy Schwartz,1966).
2.3.1.1.MetabolismodelCABA
En el cerebroadulto de los mamtferos,elGASA se sintetizaprincipalmentea partir deGLU enun solopasoenzimáticocatalizadoporla enzima ácido glutámico decarboxilasa(GAD) Estaenzimarequierela presenciadepiridoxal fosfato como cofactor.ExistenotrasvíasdesíntesisdeGASA en el cerebro(p. ej. apailir de putrescina)aunquese considerandemenorunportancia(Martin y Rimvall, 1993).
La GAD es unaenzimacitoplasmáticaquese encuentralocalizada sólo en las neuronasgabérgicas, por lo que se utiliza comomarcador específico de estas neuronas(McGeer y McGeer, 1989). La reaccióncatalizada por la GAD es esencialmente
irreversible,por lo querequieredeunaestrecharegulación(Martin y Rimvafl, 1993). Así, almenosun 50% de GAD estápresenteen elcerebrocomo apoenzinia, constituyendounareservade GAD inactivo (Martin y Rimvall,1993). Además, la GAD es inhibida por su
24-producto (Portery Martin, 1984), por Zn yporct-cetoglutarato(Wu, 1976).
La degradacióndel GASA se realiza através de una reacción de transaminacióncatalizadapor laGABA transaminasa(GABA-
En esta reacción se produce la transanii-nacióndel GASA conel «-cetoglutaratoparaoriginar semialdehidosuccinico y GLU. Elsemialdehídosuccínico es oxidado por lasemialdehidosuccínicodeshidrogenasaaacidosuccinico, el cual entraen el ciclo de Krebs.Por suparteel GLU puedeserutilizadoparalasíntesisdeGASA (McoeeryMcGeer,1989).
La GABA-T es una enzimaniitocondrialque requierepiridoxal fosfato como cofactor.La disponibilidadde cx-cetoglutarato,metabo-.lito intermediodel ciclo de Krebs, es un factorregulador importante de la actividad de laGASA-T (McGceryMcGeer,1989).
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Introducción
La ruta metabólicadescrita (cortocircuitoCABA) constituyeun pequeñoanexoal ciclode Krebs en el cerebro,que ofrece una víaalternativaentre el a-cetoglutaratoy el ácidosuccinico, cuya función principal es labiosintesis de CABA en las terminacionesnerviosas (Martin y Rimvall, 1993). Elcortocircuito CABA puede ser tambiéncompletadoen lascélulasglialesyaqueposeentodas las enzimas necesarias para ladegradación del GASA captado desde elespaciosináptico (GABA-T y semialdehidosuccínicodeshidrogenasa).El <RU formadoen los astrocitosatravésde la GABA-T, queno puedeserconvertidoen GASA debidoa lafalta de CAD, es transformado por laglutaminasintetasaenglutamina,lacualpasaalastenninacionesnerviosas.En éstas,laenzimaglutaminasaconviene la glutamina en CLI)manteniendoasí el suministrode precursordeGASA(McGeery McGeer,1989).
23.1.2.Almacenamiento,liberación einactivacióndelCABA
El GASA se almacena en vesículassinápticasgraciasa la acciónde un sistemadetransporte vesicular de baja afinidad,independiente de Nat y acoplado a ungradienteelectroquímicode W generadoporuna ATPasadependientede Mg” (Fykse yFonnum, 1988).
Estudios itt vitro han mostrado laliberaciónde GASA defonnadependientedeCa” desde terminaciones nerviosas enrespuestaaestumulosquímicosdespolarizanteso ala activacióndeunavíanerviosa(Nicholls,1989). Estaliberación dependientede Ca” seproduce principalmente por exocitosis(Nicholis, 1989).
La inactivacióndel GASA liberadodesdelatenninaciónnerviosasellevaacaboatravésde sistemasde transportede alta afinidadlocalizadosen la membranapresinápticay en
los elementosgliales circundantes. Hasta lafecha se han donado4 transportadoresdeCIABA con diferentes afinidades para elCIABA y diferentes farmacologia y loca-lización (ver A.ttwdll y Mobbs, 1994). Laestequiometríade este transportepareceserelcotransporte de 1 CABA, 1 (?U y 2 Na>(Attwell y Mobbs, 1994).
Debido al carácter electrogénico deltranspone de CABA así como a sudependencia del gradiente de Na’, ladespolarizacióndel terminal nerviosofavorecela salidadeGASA deforma independientedeCa’4-. La existencia de esta liberación inde-pendientede Ca’4- a través del transportador,queparececontribuira la liberaciónde GASAinducida por despolarización, ha sidodemostradaitt vitro (Bernathy Zigmond, 1988;Meyer, 1991; LeviyRaiteri, 1993)einvivo enlas célulashorizontalesde la retina(Schwartz,1987).
2.3.1.3.Receptoresgabérgicos
Se han descrito dos tipos diferentes dereceptores para el CASA, caracterizadosinicialmente por su diferente sensibilidad aagonistasy antagonistas:el receptorGASA-A,sensibleal agonistamuscimol y al antagonistabicuculina, pero insensible al agonistabaclofén; y el receptorGABA-B, insensibleala bicuculinay sensibleal baclofén. Diversosestudios farmacológicos y molecularessugierenlaexistenciade unagranvariedaddesubtiposde receptores,tanto parael receptorCASA-A como parael CABA-B (Bormann,l988~ Burt y Kamatchi, 1991; Bonanno yRaiteri, 1993; MacDonald y Olsen, 1994;Sieghart,1995).
El receptor GASA-A es un canal iónicocon permeabilidad selectiva para el CLContiene sitios de unión específicosparaGASA, picrotoxina, barbitúricos, benzodia-zepinasy anestésicosesteroideos.El sido de
24
Introducción
unión para el CABA regula la apertura delcanal,requiriéndoseal menos2 moléculasdeCABA para la activación del receptor(Sieghart, 1992, 1995; Macflonald y Olsen,1994).
El receptor GASA-A se localiza princi-palinente a nivel postsinápúcoy es elresponsablede la clásica acción inhibidorapostsinápticadel CABA. La activación delreceptor GASA-A produce la aperturabrevedel canalde CL, quehiperpoíarizalamembranapostsináptica(McGeery McGeer, 1989). LascorrientesdeC~ atravésdel receptorCABA-Apueden verse reducidas por la acción depicrotoxinay bicuculina(agentesconvulsivos)y aumentadaspor la acción de benzodiaze-pinas, barbitúricos y anestésicosesteroideos(agentes depresores del Sistema NerviosoCentral)(Macflonaldy Olsen, 1994).
Los receptoresCASA-B sedescubrieronalobservarlapresenciadereceptoresparaGASAen terminacionesnerviosasperiféricas insen-sibles a bicuculina y sensiblesa baclofén(Boweiy el aL, 1980). El receptorGABA-Bestáacopladoala adenilatociclasaa travésdeproteínasG y modula canalesde Ca2’ enterminacionesnerviosasperiféricasy de1(4- ensmapstscentrales(Bowery, 1993; MacDonaldyOlsen,1994).
Los receptoresCABA-E se localizantantopre como posísmápticamente,predominandoen un lugar o en otro segúnla regióncerebral(Boweiy, 1993). Los receptores GASA-Epresinápticosinhiben la liberación de neuro-transmisorestales como CLI), noradrenalina,DA, serotoninay variospéptidos(substanciaP,colecistoquinina, somatostatina). Tambiénactúan como autorreceptores,modulando laliberación de GASA. La activación de losreceptorespostsmhpticosGASA-E producenpotenciales postsinápticos inhibidores(Eoweiy, 1993; Bittiger eta!, 1993).
2.3.1.4. Víasgabérgicas
El CASA es el neurotransniisorinhibidordistribuido más ampliamenteen el SistemaNervioso Central. Mientras que las neuronasmonoammérg’casy colmérgicas constituyenpoblaciones relativamentepequeñasy loca-lindas, lasneuronasgabérgicasse distribuyende forma ubicua (Mugnaini y Oertel, 1985;McGeer y McGeer, 1989). Existen, además,regionescerebralesen las quela granmayoríade las neuronaspresentesson gabérgicas(p.ej.estriado,núcleo pálido, sustancianegrapanreticulata, varios núcleosde la amígdalay elnúcleo interpedimcularj)(Mugnainí y Oertel,1985).
Las neuronasgabérgicaspuedenser tantointerneuronas,mtegradas dentro de circuitoslocales inhibidores, como neuronas deproyección(Fagg y Foster, 1983; MeGeer yMcGeer,1989).
El GASA está localizado sobre todo eninterneuronas en la corteza cerebral, elhipocampo,el bulboolfatorio, el hipotálamoyla retina También existen interneuronasgabérgicas en el estriado, el tálamo, loscoliculos superior e inferior, el cerebeloy lamédulaespinal(Faggy Foster,1983; Mugnainiy Oertel, 1985).
Las vías de proyeccióngabérgicasmejorconocidasson las proyeccionesde las célulascerebelosasde Purkinje y de las neuronasestriatonigrales.En los últimos años se handescrito neuronasde proyección gabérgicas,incluso en áreasdondehabíasido postuladasutotal ausencia,por ejemplo, enla cortezay elhipocampo.
Losgangliosbasalesson la regióncerebralque presenta mayor abundancia deproyeccionesgabérgicas,formando circuitoscomplejosdondelos procesosde inhibición y
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Introducción
desinhibición juegan un papel fundamental(FaggyFoster,1983; Mugnainiyoertel,1985;McCeery McGeer,1989). Sehandescritovías
de proyeccióngabérgicadesdeel estriadoa lasustancianegray alnúcleopálidoy desdeésteanúcleostalámicos.
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Introducción
Fig. 3. Esquemadelosprocesosrelacionadosconla transmisióngabérgica. (DsíntesisdeCABAapartir deglutamina(CLV) tantoenla initocondria,poracciónde¡a CABA transferasa(GABA-t),comoenelcitoplasma,por accióndelaglutámicodeshídrogenosa(CAD). El CLUutilizadoprocededela síntesisapartir deglueazninapor accióndelaglutaminasa<0hz-aso)o dela síntesisapartir deglucosa(Cluc) <¡‘ir:piruvato). Q)Almacena,nientodeCABA envesículaspresinápticas.(i)LiberacíóndeCABApor exocitosis.é)Launióndel CABAa losreceptoresCABA-Aproducela entradadeCF enla neuronapostsinñptica.LaactivacióndelosreceptoresCABA-Bpre-ypos-sinñpticosdtsminuye,engeneral, laproduccióndeAMPc.<»La inactivacióndelCABA seproducepor recaptaciónatravésde transportadoressitiadosen las
ternzinacionespresinápticasyen lascélulasgliales. C5>E¡ CABArecaptadopor lascélulasguaJesestransjbnnadoenCLUporaccióndela CABA-ty, después,enCLNatravésdela accióndela glutaminasintetasa(Gln-V. Li CLNgIIaIes liberada al espacíoextracefular ycaptadopor las terminacionespresinápticasyutilizadaparasintetizarCLUy CABA.
TERMINAGIÓNPRESINÁPTIGA
GIuc—g. pir
4, AMPc
NEURONAPOSTSINÁPTICA
GABA
GLN GLN
t GIn-s
GLU
oCÉLU LA
GLIAL
GABA
O cl-
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Introducción
2.3.2.Efectosde/envejecimientosobrela neurotransmisióngabérgica
Los estudiosacercadel efecto del enveje-cimiento sobrela neurotransmisióngabérgicasonescasosy sus resultadosson poco consis-tentes.
2.3.2.1.Efectosdel envejecimientosobrela concentraciónde GABAenmuestrasde tejido cerebral
La concentracióndeCABA enmuestrasdetejido cerebral es un indicador válido de lacantidad de CASA de que disponen lasterminaciones gabérgicas, puesto que elCABA, adiferenciadelGLU, no intervieneenel metabolismocelular. Sin embargo,existenpocos estudios que hayan analizado laconcentraciónde GASA en muestrasdetejidocerebral a lo largo del envejecimiento. Susresultadosademás, son contradictorios.Porejemplo en la cortezaprefrontal dorsalse hadescrito un aumentode la concentracióndeCABA con la edad(Fornieles el aL, 1986),aunque Donzanti y Ung (1990) no hanreproducido este hallazgo. En el estriado,Strolin Benedettiet al. (1990) y Donzanti yUng(1990)handescritoun aumentodeGASAcon la edad;sin embargo,Banay-Schwartzeta! (1989) describenuna disminución de laconcentraciónde GASA. En la sustancianegraStrolin Benedetti et a! (1990) describen unaumento de la concentración de GASAmientras Banay-Scbwartzet a! (1989) nodetectancambios.
Tantopor la escasezdeestudioscomoporla disparidadde susresultados(que se pueden
deber, en parte, a las diferentes técnicasutilizadas), no podemosextraer conclusionesclaras sobre el efecto que pueda tener elenvejecimientoen la concentracióntisular deCABA.
Porotraparte, la actividaddela enzimadesintesis del CASA, la CAD, no parecemodificarseconlaedaden el estriadodela rata(Lai el al., 1981; Stronget aL, 1982), aunquese han descrito disminucionesde la actividadde la CIAD enel coliculoinferiory enel núcleodel lemnisco lateral (Gutienez et al., 1994;Razaeta!, 1994).
2.3.2.2.Efectosdelenvejecimientosobrelos receptoresgabérgicos
De forma similar a lo que ocurre con losestudios sobre la concentración tisular deGASA, los estudios sobre el efecto que elenvejecimiento tiene en los receptores deCABA son muy escasos.En cortezacerebralparecequeelnúmerode receptoresde CABA-A no varíacon la edad(Wenk el aL, 1991;Gutierrezet a!, 1994), aunquese handescritomodificaciones en sus propiedades(Samochocki y Strosznajder, 1994). Enrelación con el receptorGABA-B no se handescritovariacionesdesu númeroenel cerebrodela rataduranteel envejecimiento(TurgeonyAlbin, 1994).
En un trabajo reciente, Abdulla et al.(1995) han descrito un aumento de lasensibilidad de las neuronas de la cortezafrontal ala aplicaciónde bicuculinaqueindicala existenciade un tono gabérgicoaumentadoenestaregión corticalenlas ratasviejas.
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Introducción
3. INTERACCIÓNDENEUROTRANSMISORES
Desde hace algunos años se ha venidoestudiandoconintensidadun aspectonuevodela neurotransmisión:el modo en que unneurotransnjisorpuedemodular la neurotrans-misión mediadapor otros y verse,a su vez,modulado por ellos. A este hecho se le hallamado«interaccióndeneuroiransmisores».
Durantelosúltimos años,variosgruposdeinvestigaciónse han dedicadoa estudiarestefenómeno.Concretamente,la mayoríade losestudios se ha centrado en el estriado, unaestructura que, por el conocimiento quetenemos de las vías neurales en las queparticipay los neurotransmisoresimplicadosenellas, sirve de modelo ideal paraestudiar lainteracciónde neurotransmisores(verp. ej. lasrevisiones de Carlsson y Carlsson, 1990;Lannes y Micheletti, 1994; Mora y Porras,1994; Di Chiara y Morellí, 1994; Kótter,1994).Másrecientemente,lacortezaprefrontalha sido, también, objeto de este tipo deestudios(ver Sanz,1995).
3.1. INTERACCIÓNDENEUROTRÁNSMISORESENEL ESTRIADO
3.1.1.Conexionesneuralesyneurotransmisoresdel estriado
El estilado, como ya se ha señalado,hasido el modelo utilizado de forma preferentepara estudiar la interacción de neurotransm¶-sores.Estapreferenciase debe,enbuenaparte,al conocimientoque se poseeactualmentedelasvíasneuralesenlas queparticipael estriadoy de los neurotransmisoresque están impli-cadosen estasvías(ver p. ej. las revisionesdeSmith y Bolam, 1990 y de Parenty Hazrati,1995).
En la rata, la mayoria de las neuronasdelestriadoson de tamañomedioy sus dendritasestán recubiertas de abundantes espinasdendríticas. Los axones de estas neuronasforman las eferencias del estriado haciasustancianegra(pars compacta),núcleo pálido(núcleo pálido externoen primates)y núcleoentopeduncular(núcleopálido interno en losprimates).Estosaxonesposeen,además,ramas
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introducción
colateralescuyas temanacionesestánsituadasdentro del propio estriado. Estas neuronascontienenGASAcomoneurotransmisor.
Entre estasneuronasgabérgicasse puedendiferenciardossubpoblacionesenfunciónde lacoexistenciaen ellas de diferentespéptidos ydel áreacerebralde destinode susaxones.Así,lasneuronasgabérgicascuyosaxonesterminanenelnúcleoentopeduncularcontienentambiéndinorfinay sustanciaP; lasneuronasgabérgicascuyos axones tenninan en el núcleo pálidocontienentambiénencefalinas;y las neuronasgabérgicas cuyos axones terminan en lasustancianegracontienenencefalinas,sustanciaPy/o dinorfinas(Parenty Hazrati, 1995).
Aparte de las neuronas espinosas detamaño medio, el estriado contiene unapequeñaproporción de neuronas de grantamañocuyasdendritasno estánrecubiertasdeespmasy cuyos axonesterminan dentro delestriado.Estasneuronascontienenacetilcolinacomo neurotransmisor(ver Smith y Bolam,1990). Tambiénexisteunapequeñaproporciónde interneuronasde tamaño medio y sinespmas:algunasde ellas contienenGASA yparvalbún-iina; otras contienensomatostatina,neuropéplido Y y nicotinanxida adeninadinucleátido fosfato-diaforasa,la enzima desintesisdel óxido nitrico (ver Parenty Hazrati,1995).
Las neuronasdel estriadoestánconectadasentresí. Las terminacionesnerviosasacetilco-linérgicasde las grandesneuronassin espinasformansinapsisen la porciónproximal de lasdendritasde las neuronasespinosas.Por otraparte,lasterminacionesnerviosasgabérgicasdelasramascolateralesdelosaxonesdeneuronasespmosasdel propio estriadoforman sinapsiscon las grandesneuronasacetilcoimérgicasyconotras neuronasespinosasdel estriado(verSmith y Bolam, 1990 y Parení y Hazrali,1995).
Las aferencias que llegan al estriadoproceden, fundamentalmente,de la cortezacerebraly del mesencéfalo.También existenaferenciasprocedentesdel tálamo.
Las terminacionesnerviosasprocedentesde la cortezacerebral contienen GLU comoneurotransmisor y fonnan sinapsis axo-dendriticas con la porción distal de lasdendritasde las neuronasespinosas(Smith yBolam, 1990; Parenty Hazrati, 1995) y, enpequena proporción, sobre las neuronasacetilcolinérgicasy sobre las neuronasconneuropéptidoY (Vuillet eta!, 1989; Dimovaet a!, 1993). También existen terminacionesnerviosas glutamatérgicas procedentes denúcleostalániicos (principalmentedel núcleoparafascicular)que forman sinapsis con lasgrandesneuronasacetilcolinérgicasdel estriado(LapperyBolam, 1992).
Las tenninacionesnerviosasprocedentesde áreasmesencefálicas(fundanienta]mentedesustancianegra,pancompacta)contienenDAcomo neurotransmisory fonnansinapsisaxo-dendriticas con la porción distal del árboldendritico de las neuronas espinosas delestriado. También existen terminacionesnerviosas dopaminérgicas procedentes delmesencéfaloqueformansinapsisconelcuerpocelulary la porción proximal de las dendritasde las grandes neuronasdel estriado (verDimovaetaL, 1993).
Se han descrito también terminacionesgabérgicasque llegan al estriadoprocedentesdel núcleopálido y de la sustancianegra,parsreticulata, aunque estas proyecciones seconsideranescasas(ver ¡Cita, 1993).
En resumen, las neuronas del estriado(neuronas espinosas de tamaño mediogabérgicas; neuronas de tamaño medio sinespinas con neuropéptido Y y neuronasgrandes acetilcolinérgicas)reciben aferencras
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Introducción
glutamatérgicasprocedentesde la cortezayaferencias dopaininérgicas procedentes delmesencéfalo. Estas aferencias convergenfundamentalmenteen las neuronasgabérgicas.Sediscutesi lasaferenciastalámicasconvergeno no en las mismasneuronasquelas aferenciascorticales(verParenty Hazrati, 1995).
Tanto las neuronasgabérgicascomo lasacetilcolinérgicaspresentanreceptoresdopami-nérgicosy glutamatérgicosensusmembranas.
Los receptoresdopaminérgicosDl (Dl A)se localizanfundamentalmenteen lasneuronasgabérgicasquecontienentambiénsustanciaP yque proyectan a sustancianegray a núcleoentopeduncular. Los receptores dopaminér-gicos D2 (D2A) se localizan flindamen-talmente en las neuronas gabérgicas quecontienentambiénencefalinasy queproyectana núcleo pálido, en las neuronasacetiicoli-nérgicasy en las neuronasdopaminérgicasdelasustancianegra(Yungeta!, 1995).
Esta visión de los receptoresdopami-nérgicos claramente disgregadosen pobla-ciones neuronalesbien determinadasha sidocriticada recientementepor Surmeier el a!(1992) quienesafirman que la mayoríade lasneuronasde estriadoexpresanambostipos dereceptores dopaminérgicos. De hecho, LeMoine et a!, (1990, 1991) han descritoquealgunas de las grandes neuronas acetilco-linérgicas del estriado expresan no sóloreceptoresD2, sinotambiénreceptoresDl.
También se ha descrito la presenciadereceptores D2 en terminaciones nerviosasdoparoinérgicas (autorreceptores) y enterminacionesnerviosas no dopaminérgicasque, probablemente (aunque no se haconfirmado),procedende lacortezay son,portanto,glutamatérgicas(Yung ela!, 1995).Esteúltimo hecho es controvertido. La posible
existenciadereceptoresdopaminérgicosen lasterminaciones nerviosas del estriado queprocedende la cortezaha sido defendidaporalgunos autores (ver p. ej. Kornhuber yKornhuber, 1986; Maurael al, 1988) a pesarde que se habíadescrito que las conexionessinápticasaxo-axónicaseranmuy raras,si noinexistentes,en el estriado(ver KornhuberyKornhuber, 1983 y la revisión de Parent yHazrati, 1995). Además,otros autoresno hanlogrado demostrarla existenciade receptoresde DA en estas terminaciones (ver p. ej.Trugmanetal., 1986;Joycey Marshafl, 1987).La descripción reciente de la presenciadereceptores para DA fuera de estructurassinápticas(Yung eta!, 1995)podríaexplicarlaexistenciade receptoresdopaminérgicosenterminacionesglutamatérgicasdel estriado apesarde la ausenciade sinapsisaxo-axónicas.Además, basándose en este tipo dedescripciones,se ha sugeridola existenciadeun tipo de transmisiónnerviosa diferentedelconocido clásicamente (confinado a laconexión sináptica) del que se ha venidohablandoen losúltimosañosconel término de«transmisiónvolumétrica» (para unarevisiónextensadel conceptode transmisiónvolumé-trica ver FuxeyAgnati,1991).
En relación conlos receptoresde CLU enel estriado, se ha descrito la presenciafundamentalmentede receptoresNMDA yAMPA situados, probablemente, en lasneuronasgabérgicasy acetilcolinérgicas.Sediscutesobrela existenciao no de receptoresde CLII en las terminacionesdopaminérgicasdel estriado procedentes del mesencéfalo.Aunque la ausencia de conexiones axo-axónucasen esta estructurasugeriríanque noexisten receptores glutamatérgicos enterminacionesdopaminérgicas,no se puedeexcluirestaposibilidad(vermásarriba).
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Introducción
Estriado
Fig. 4. Esquema& lasconexionesneuralesylosneurotransmisoresdelestiladode la rata. Noserepresentranlasneuronasdetamañomedianosmespinas.Sehan diferenciadolasneuronasespinosasdemedianotamañosegio;eldestinode %l¿s axonesylospéptidosquecontienen<ENC: encefalinas;SP:sustanciaP). Lossemicírculosnegrosrepresentanlas terminacionesglutamatérgícas(CLLQ; lossemicírculosgrisesrepresentanlas terminacionesdopaminérgicas(DA); lossemicírculosblancosrepresentanlasterminacionesgabérgicas(CARA); las triángulosrepresentanlasterminacionesacetilcolinérgicas(ACH). Ba~vdoenSmithyBolam, 1990yParentyHazrati, 1995.
a 5. negra (pars reticulata) lnúcleo entopeduncular
Sustancia negra(pan compacta)
32
introduccion
3.1.2. Interacción de neurotransmisoresen el estriadodela rata
En los últimos añosse han publicado ungrannúmerode trabajosqueestudianel efectode agonistas y antagonistas de diferentesneurotransmisoressobrelas concentracionesdeotros neurotransmisoresen el estriado deanimalesdeexperimentación.
Centréndonosfundamentalmenteen losestudiosrealizadoscontécnicasfi vivo (,push-pulí y microdiálisis), se han descritodiferentescambiosen las concentracionesextracelularesde varios neurotransmisorescomo respuestaala aplicación, local o sistémica, de múltiplesagonistasy antagonistasde receptoresde DA,GLU, GAHA y acetilcolina (para variasrevisionesse puedenconsultarp. ej. Keefe ela!, 1993b; Lannes y Micheletti, 1994; DiChiarael al., 1994). Dehecho,la aplicacióndelastécnicasdeperfusiónin vivohacontribuidoen gran medidaa la extensiónde los estudiossobreinteraccióndeneurotransmisores.Ante laamplitud del número de trabajospublicadossobreeste asuntoen los últimos quince años,aquí se describenlos estudiosmásrelevantesparala discusiónde nuestrosresultados,sinhacer una enumeración exhaustiva dereferencias bibliográficas que apoyan unmismohecho.
3.1.2.1.Efectodeagonistasyantagonistasglutamatérgicos
La aplicación deagonistasglutaniatérgicos(tantoelpropio GLU comoNMDA, AMPA yKA) en el estriadoproduceliberaciónde DA(ver p. ej. Carterel a)., 1988; Barbeitoel aL,1990;Imperatoetal.,1990; Levieletat, 1990;Moghaddam y Gruen, 1991; ¡Ceefe et a!,1992, 1993a Martínez-Fong el aL, 1992;Moran el a!, 1994), GABA (Moran el al.,1993, 1994; Young y Bardford, 1993) yacetilcolina(Dansmaetal., 1991).
El hecho de que el CLII produzcaunaliberaciónde GABA y de acetilcolina en elestriado es coherentecon la presencia dereceptoresde GLU en neuronasgabérgicasyacetilcolinérgicasen estaestructuracerebralyconlaactividadexcitadoradeestosreceptores.
Másdificil de explicar, sin embargo,es laliberacion de DA inducida por GLU en elestriado,dadala ausenciade conexionesaxo-axónicasenel estriadoentrelas terminacionesglutamatérgicasy las dopaminérgicas Paraexplicaestacontradicciónentre losresultadosdelosestudiosneuroquimicosy delosestudioshistológicos se ha sugeridola existencia dereceptores de GLIJ en las tenninacionesnerviosasdopaniinérgicasfUera de estructurassinápticas(neurotransmisiónvolumétrica)(verp. ej. Lannes y Micheletti, 1994). Por otraparte, también se ha sugerido que la DAliberadapor el CLII procedade la que estápresenteen el citoplasmamásque de la DAalmacenadaen vesículasa travésde un efectodel GLU sobreel transportadorde DA de lasmembranasneuronales(Lannesy Micheletti,1994). Además,recientementese ha sugeridoquelaactivacióndereceptoresdeOLU podríaproducir su efectosobrela DA atravésde laliberaciónde óxido nítrico (Hanbaueret al.,
1994).
El efectode la aplicaciónde agonistasdelOLU sobre la liberación de DA pareceserdiferentedependiendode la concentracióndeagonistautilizado. Así, Chéramyet al. (1986)han descritoqueconcentracionesde GLU pordebajode 0.1 mlvi estimulanla liberación deDA, mientraspor encimade 10 mM podríaninhibiría Levíel et al. (1990) haninterpretadoestosresultadossugiriendoqueelCLII tendríaun efecto excitador directo a través dereceptoresno NMDA e inhibidor a través dereceptoresNMDA queactivaríaninterneuronasinhibidoras.
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Introducción
3.1.2.2. Afectodeagonistasyantagonistasdopaininérgicos
La aplicaciónde agonistasdopaminérgicosestimulala liberacióndeacetilcolinaatravésdereceptoresDl (Consoloel aL, 1987; Bertorelliy Consolo,1990; Consoloeta!, 1992; Stoofetal., 1992;Zoccin y Pert, 1993; ver la revisiónde Di Chiaraela!, 1994),peroladisminuyeatravésde receptoresD2 (Stoofet al., 1982;Bertorelli y Consolo, 1990; DeBoer et a!,1992).
Los agonistas dopaminérgicos mespe-cificos tambiéninducenla liberaciónde CLII(Godnkhinet al., 1984; Expósitoel aL, 1994)y de CABA (Girault el aL, 1986b), mientrasquelos antagonistasdopaminérgicosno tienenningún efecto sobre CLU y CABA (Daly yMoghaddam,1993;Moran eta!, 1994).
La liberación de acetilcolina y CABAinducidapor DA es coherentecon lapresenciade receptoresde DA en las neuronasacetil-colinérgicasy gabérgicasy con la actividadexcitadorade aquéllos.Se ha sugeridoque elefecto inhibidor de los agonistasD2 sobrelaliberación de acetilcolina se debaa que sonautorreceptoresy disminuyen, por tanto, laliberaciónde DA (DanismaetaL, 1991).
En relación conelefectoquela DA puedatenersobrelaliberacióndeCLII en elestriado,se han sugerido varias posibilidades,incluyendo la existenciade un mecanismovolumétrico de transmisióna nivel local y laparticipacióndecircuitosneuraleslargos(verlaDiscusióndeestaTesisDoctoral).
Por otra parte,agonistasselectivosde losreceptoresDl o D2 no afectanala liberaciónbasalde CLII y CABA (lamamotoy Davy,1992), indicandoqueel efectode los agonistasno específicospuededeberseaun balanceentrelos efectosexcitadoresde los receptoresDl ylos efectos inhibidores de los receptoresD2(ver laDiscusióndeestaTesisDoctoral).
Por otra parte,elefectode los agonistasyantagonistasde los receptoresde DA sobreestos neurotransmisoresen el estriado esdiferente según se estudien en condicionesbasales(lo revisado hastaahora) o en condi-cionesde estimulaciónde la liberación(p. ej.con altas concentracionesde Kt$>. Así, se hadescritoque los agonistasselectivosD2 (yerono los Dl) bloqueanla liberación de CLIIestimuladapor K~ (Yamamotoy Davy, 1992),mientrasque ninguno de ellos tiene efectosobrela liberaciónestimuladade CABA. Sinembargo,un agonistainespecificode laDA siinhibe la liberacióndeCABA inducidapor(Tossmany Ungerstedt,1986).
Estosresultadossugierenquela DA puedemodular la liberación fásica (estimulada)másque la liberación tétrica (basal)de CLU yCABA (verLannesy Micheletti, 1994).
3.1.2.3.Efectodeagonistasyantagonistasgabérgicos
Los agonistasde los receptoresCABA-Aproducenen el estriadouna disminuciónde laliberaciónde acetilcolina(DeBoery Westerink,1994), mientrasque los antagonistasde losreceptoresCABA-A producenun aumentodela liberación de acetilcolina (Defloer yWesterink,1994)y deDA (Cruenetal., 1992).
Los agonistasde los receptoresCABA-Bproducen,enel estriado,unadisminucióndelaliberacióndeacetilcolina(DeBoery Westermnk,1994) sin afectar a la liberación de DA(Santiago el a!, 1993a), mientra que losantagonistasde los receptoresCABA-B noproducenningún efectosobrela liberacióndeacetilcolina en el estriado (DeBoer yWesterink,1994).
En general, se ha sugeridoque el CABAmodula la liberación de CLII y DA en elestriado(Scheel-Krúger,1986; Voshidaet al,1993).
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Introducción
El efectode la estimulaciónde receptoresde CABA sobre la acetilcolina es coherentecon la presenciade aquéllosen las neuronasacetilcolinérgicas del estriado. El efectomoduladordel CABA sobre la liberacióndeCLII y DA, sin embargo, sólo puede serexplicado por la existenciade receptoresdeCABA en terminacionesglutamatérgicasydopaminérgicas(que no han sido descritos)oporqueel efectodel CABA estémediadoporlaactivacióndevíasneuraleslargasquelleguenacortezacerebraly asírstancianegra
3.2. ZNTERACCIONDENEUROTJC4NSMISQRIZSEN L4 CORTEZAPREFRONTAL
3.2.1.Conexionesneuralesyneurotransinisoresde La cortezaprefroníal
Las neuronas piramidales de cortezapreftontal de la rata así como una pequeñaproporción de neuronas no piramidales,contienenCLII (Otterseny Storm-Mathissen,1984). Los axonesdelas neuronaspiramidalesde lacortezaconstituyenlasproyeccionesde lacorteza a estructuras subcorticales(ver larevisión de Colman el a!, 1987). De estasproyecciones,la que llega a estilado ha sidoampliamenteestudiada(ver p. ej. Fonnumetal., 1981 y Cirauit eta!, 1986a). Lasterminacionesdeestavíacórtico-estriatalhacensinapsis sobre las neuronasgabérgicas delestriado(Smithy Bolam, 1990).
El CABA se encuentraen la cortezaprefrontal fUndamentalmenteen interneuronas(Esclapezela!, 1987), aunquetambiénexistenterminacionesnerviosasque contienenCABAy que procedendel área venirotegmentaldelmesencéfalo (Pirot el a!, 1992). Lasterminacionesgabérgicasformansinapsisen elsoma neuronaly en la porción proxirnal delaxón de las neuronaspiramidales, las cualespresentan receptores CABA-A y CABA-E(Boweryela!, 1987; Bonannoy Raiteri, 1993)
La DA seencuentraen lacortezapreftontalen terminacionesnerviosas procedentesdeláreaventrotegmentaldel mesencéfalo(Thienycí al., 1973; Lindvall y Bjóklund ¡974). Estastenninacionesdopaminérgicashacensinapsisen las dendritasde las neuronaspiraniidalescorticales(Van Edenel al., 1987; Séguélaela!, 1988; Verneyela!, 1990). Se hasugeridoque las dendritasde las neuronaspiramidalescorticalespresentanreceptoresDl (Retauxela!, 1991a)y que las terminacionesnerviosasde las ramas recurrentes de sus axonespresentanreceptoresD2 (Retauxeta!, 199Ib;Law-Thoela!, 1994).
La corteza preifontal de la rata poseetambién intemeuronas acetilcolinérgicas asícomo terminaciones nerviosas acetilcoli-nérgicasprocedentesde los núcleosbasalesdeMeynert. Estasterminacionesforman sinapsisaxo-dendríticas con las neuronaspiramidalesdelacorteza(Houserela!, 1983, 1985).
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Introducción
a estriado yotros núcleossubtalámicos
Área ventrotegmental Núcleos basalesde Meynert
Fig. 5. Esquemadelasconexionesneuralesy losneurotransnzisoresde la cortezaprefrontalde la rata. Lossemicírculosnegrosrepresentanlas lerminacionesgíníamatérgicas(QL U); lossemicírculosgrisesrepresentanlas terminacionesdopaminérgicas(DA); lossemicírculosblancosrepresentanlasterminacionesgabérgicas(CiAHA); los triángulosrepresentanlas terminacionesacetilcolinérgicas(ACH). Basadoen Vanhilen elal,1987; Séguélaelal., ¡988y VerneyelaL, 1990.
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Introducción
3.2.2. Interacciónde neurorransin¿sotesen la cortezaprefrontal de la rata
A pesar de que recientementela cortezaprefrontal está recibiendomayor atención enrelación con la interacción de neurotrans-misores,las publicacionessobreinteraccióndeneurotransmisoresen esta estructuracerebralson más escasasque las realizadassobreestriado.
La estimulación de receptoresglutama-térgicosAMPA y KA producenliberacióndeDA en la corteza prefrontal (Jedema yMoghaddam, 1996). Sin embargo, laestimulaciónde receptoresNMDA no produceliberación de DA, aunque si de CABA(Jedemay Moghaddam.,1996). Se ha descritoque el efecto de la aplicación de NMDA esdiferentesegúnlasdosisutilizadas.Así, 1 mMde NMDA induce liberación de DA en lacorteza,pero 0.1 mM de NMDA inhibe laliberaciónde DA (Feenstrae aL, 1995). Porotraparte,el bloqueode losreceptoresNMDAproduce liberación de DA (Wedzony el a!,1993; Nishijima cfaL, 1994).
No está claro cómo la estimulación dereceptores glutamatérgicos AMPA y KAproduceuna liberaciónde DA en la cortezaprefrontal,yaqueno sehadescritolapresenciade estosreceptoresen terminacionesdopami-nérgicasen esta estructuracerebral.TampocoestáclaralafUnción del receptorNMDA comomodulador de la neurotransmisióndopami-
nérgica en la cortezaprefrontal, aunquelosdatosdisponiblesapuntan a que tendría unafunción inhibidora de las tenninacionesdopaniinérgcias.probablementea través de laestimulacióndeintemeuronasgabérgicas.
En relación con el efectode la aplicaciónde agonistasy antagonistasdopaminérgicossehadescritoqueel bloqueedereceptoresde DAcon haloperidol aumentala liberaciónde DAsin modificar la de CLII (Beany Rotli, 1991;Daly y Mogiiaddain, 1993; Pehek yYamamoto, 1994). Por otra parte, estudiosinvdro han descrito que la estimulación dereceptoresdeDA produceliberacióndeCABA(a través de receptores D2) (Retaux ci al,1991a), pero también inhibición de laliberación de CABA inducida eléctricamente(Retauxeía!,1991b).
La aplicación de agonistas de losreceptoresCABA-A no afectaa la liberaciónde DA, aunque su bloquee produce unaumentode la liberación de DA (Santiagoetal, 1 993b), indicandoqueel CABA inhibe deforma tónica la liberación de DA. Por otraparte, la estimulaciónde receptoresCABA-Ereducela liberaciónin vivo de DA (SantiagoetaL, 1993b) y la liberación in viíi’o de CLII(Pendeel a!, 1993). mientasque su bloqueoaumentala liberaciónde DA (Santiagoel a!,1993b), lo cual sugiere la existencia dereceptores CABA-E a nivel de lasterminacionesdopaminergicasy glutamatér-gicasconfunción inhibidora.
37
Introducción
4. INTERACCIÓNDENEUROTRANSMISORESYENVEJECIMIENTO CEREBRAL:PLANTEAMIENTO DE LAINVESTIGACIÓN
La modulaciónrecíprocade la transmisionneural mediada por diferentes neurotrans-misores es un campo relativamentenuevo deinvestigaciónen neurociencias(ver p. ej. lasrevisionesdeLannesy Micheletti, 1994; Moray Porras, 1994; Di Chiara y Morellí, 1994).Aunque la forma en la que diferentesneurotransmisoresse modulanrecíprocamenteen diferentesestructurascerebralestodavíanose comprende bien, este concepto deinteracción de neurotransmisores podríaayudarnosa entendermejorel funcionamientodel cerebroy sus alteraciones.Por ejemplo,lacomprensiónde que en el estriadoexiste unbalance entre la neurotransmisióndopami-nérgicay la neurotransnasiónacetilcolinérgicaayudé a buscarnuevos tratamientospara laenfermedad de Parkinson. Recientemente,larevisión de esta interacciónentrela DA y laacetilcolinaa la vista de los resultadossobreinteracciónentreDA y CLU estáabriendounanuevayaen el tratamientofarmacológicodela
enfermedadde Parkinson(ver la revisión deSclumidt et al., 1992). Una alteración en lainteracciónde neurotransmisorespodría estarimplicada también en la esquizofrenia(ver p.ej. Cartssony Carlsson, 1990; Crace, 1991;Lannesy Micheletti, 1994).
A lavistadequeelconceptode interaccióndeneurotransmisorespuedeexplicar mejor lasalteracionesque ocurren en algunasenferme-dadespsiquiátricasy neurológicas,escoherentepensarquetambiénpodríaexplicar loscambiosqueseproducenduranteel envejecimiento.Porejemplo, las alteraciones motoras que seobservandurante el envejecimiento,y quetradicionalmentese han consideradoprodu-cídas por la alteración aisladade la neuro-transmisión dopaminérgica en el estriado,puedenentendersemejorcomolaconsecuenciade una alteración de la interacciónde neuro-transmisoresenestaregión cerebral.
Algunos autoreshan descrito ya ciertasalteraciones en la interacción de neuro-transmisoresdurante el envejecimiento. Porejemplo,Thompsonet al., (1984)y Josephetal., (1988)handescrito,contécnicasin vitro, laexistencia de un deterioro en la interacción
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Introducción
entre laDA y laacetilcolinaen elestriadode larata.
El objetivo de esta Tesis Doctoral fueestudiar la interacción de neurotransmisoresduranteelprocesode envejecimiento.Conestefin sediseñaron,enprimerlugar, experimentosparaabordarel conocimientode la interacciónqueexisteentrelaDA, el GLU y el CABA enel estriadoy la cortezapreftontal de la rataadulta joven. A continuación se diseñaronexperimentos con el fin de estudiar lainteracciónentre estosneurotransmisoresa lolargo del procesode envejecimientodela rata
La eleccióndel estriadoy de la cortezacerebral como estructurasobjeto de estudioobedeceados razones.
En primerlugar, ambashansido objetodeinvestigaciónsobre interacciónde neurotrans-misores debido a los conocimientosque setienen sobre los neurotransmisores quecontieneny las vías neuralesen las queestánimplicadas.Así, en el estriado, las neuronasgabérgicasreciben aferenciasglutaniatérgicasprocedentes de la corteza y aferenciasdopaminérgicasprocedentesde la sustancianegra(Smithy Bolam, 1990; Parenty Hazrati,1995). En la cortezaprefrontal, las neuronaspiranadales son glutamatérgicasy recibenaferenciasdopaminérgicasprocedentesdeláreaventrotegmentaldel mesencéfaloy aferenciasgabérgicasprocedentesde interneuronasde lapropiacorteza(Van Edenel a!, 1987; Séguélaetal., 1988; Verneyeta!, 1990). En resumen,tanto en el estriado como en la cortezaprefrontal existe una base anatómica yneuroquimica para la existencia de unainteracciónentreDA, CLII y CABA.
En segundolugar, ambasestructurasestánimplicadasen las alteracionesde la conductaque pueden observarseen el proceso deenvejecimiento:el estriadoha sido implicadoen los trastornos de la coordinación de
movimientos que ocurren durante elenvejecimiento,y la cortezapreftontalha sidoimplicada en los trastornoscognitivos de losancianos.
Con el fin de cumplir el objetivo de estaTesis Doctoral, se realizaron los siguientesexpenmentos:
1. Estudio del efecto de la aplicaciónintracerebralde apomorfinaa las dosis de5, 10 y 20 pM sobrelas concentracionesextracelularesde CLU, CABA y CLN enelestriadodela rataadultajoven.
2 Estudio del efecto de la aplicaciónintracerebralde apomorfinaa las dosisde10 y 20 1iM sobre las concentracionesextracelularesde CLU, CABA y GLN enel estriadodelaratadeedadmedia
3. Estudio del efecto de la aplicaciónmtracerebralde apomorfinaa las dosisde10 y 20 pM sobre las concentracionesextracelularesde CLU, CABA y CLN enelestriadodela ratavieja
4. Estudio del efecto de la aplicaciónmtracerebralde apomorfinaa las dosis de5, 10 y 20 gM sobre las concentracionesextracelularesdeCLU, CABA y GLN enlacortezaprefrontaldela rataadultajovea
5. Estudio del efecto de la aplicaciónmtracerebralde apomorfinaa las dosis de10 y 20 pM sobre las concentracionesextracelularesde CLU, CABA y CLN enla cortezaprefrontal de la rata de edadmedia
6. Estudio del efecto de la aplicaciónintracerebralde apomorfinaalas dosis de10 y 20 pM sobre las concentracionesextracelularesde CLII, CABA y CliN enlacortezaprefrontaldela ratavieja
Dado que la CLN es el precursormetabólicoprincipal tanto del CLU como del
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Introducción
CABA, entodoslosexperimentosse analizólaconcentración extracelular de GLN comoíndice del estado en el que se encuentraelmetabolismode ambosaminoácidos.
En estos experimentos, se usó laapomorfina, un agonistano selectivo de losreceptoresde DA, con el fin de imitar losefectosde la DA, ya que la apomorfina,deforma semejante a la DA, posee mayor
potenciasobrelosreceptoresD2 que sobrelosreceptoresDl (ver Creeseet al., 1983). Entodo caso, a las concentracionesusadasennuestrosexpenmentos,la apomorfinaproducesu efectoatravésde la estimulaciónde ambostipos de receptores,puesto que a concentra-cionesnanomolaresactúasólo sobrereceptoresD2, peroaconcentracionesmicromolaresactúasobreambosreceptores(Creeseel al., 1983).
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MATERIAL Y MÉTODOS
1. ANIMALES
Los animales utilizados en el trabajoexperimental de esta Tesis Doctoral fueronratas adultas macho de raza Wistar de tresgruposde edad:ratasjovenes,de 2 a 3 mesesdeedady unpesocomprendidoentrelos 230ylos400 g (315 ~ 6 g); ratasde edadmedia,deII a 14 mesesdeedady un pesocomprendidoentrelos 510 y los 745 g (615±16 g); y ratasviejas de 24 a 34 mesesde edady un pesocomprendidoentrelos 380 y los 845 g (604±46 g de peso). Las ratasfueron suministradaspor el Servicio de Animales de Experimen-taciónde laUniversidaddeCranada.
Durante la experimentación,los animalesse mantuvieronenjaulas individualescon unfotoperiodode 12 h y unatemperaturade 20-25 oc. La comida y la bebidafueron sumi-nistradasadlibuum.
2. MATERIAL
2.1. CONSTRUCCIÓNDEIMPlANTESPARALA PERFUSIÓNINIRACEREBRALIN VIVO
Los implantesempleadosparalaperfusiónintracerebralin vivo constande los siguienteselementos:
- dos cánulasde acero inoxidable de 0.90mm (20 ga) de O externo,0.66 mm de Ointerno y 10 mm de longitud, que seutilizan paraguiar el sistemade cánulaspush-pull(cánulasgula);
- dos cánulasde acero inoxidable de 0.63mm (23 ga) de O externoy 10.2 mm delongitud, que se utilizan para cerrar lascánulasguía(obturador).
Una vez colocadas en paralelo y a ladistanciaadecuada,se unieronambascánulasguia mediante resina plástica Ivoclar. Ladistancia a la que se fijan las cánulasguíadependedela estructuracerebralaestudiar.Lascánulas guía bilaterales utilizadas en losexperimentosdeestaTesisDoctoralse unieronaunadistanciade 5 mm paralos experimentosrealizadosen el estriadoy de 1.8mm paralosexperimentos realizados en la cortezaprefrontal.
2.2. CONSTRUCCIONDEL SISTEMADECÁNULASPEJSJCI-PULL
El material utilizado para la construcciónde cada sistemade cánulaspush-pull fue elsigwente:
43
Material yMétodos
- unacánuladeaceroinoxidablede 1.27mm(18 ga) de O externo, 0.84 mm de Ointernoy 12 mm delongitud;
- unacánuladeaceroinoxidablede0.63mm(23 ga) de O externo, 0.33 mm de Ointernoy 20 mm delongitud;
- unacánuladeaceroinoxidablede0.63mm(23 ga) de O externo, 0.33 mm de Ointerno y 10 mm de longitud, con uno desusextremosbiselado;
- unacánuladeaceroinoxidablede0.30mm(30 ga)deO externoy 35 mm delongitud.
El sistema de cánulas pusIi-pulí seconstruyedelasiguientemanera(verFigura6):se introducela cánulade 30 ga o cánulapush
enel interiordela cánulade 23 gay 20 mm delongitud o cánula pulí. Entre los extremosdistalesde las cánulaspushypulí debeexistirunadistanciade 0.3 mm con el fin de que lasuccióndel líquido deperfusióny elarrastredelas sustanciasliberadas sean óptimos. Estesistemaconcéntricose introducea su vez enunacánulade 18 gay 12 mm delongitud. Poruno de los extremosde esta cánulade 18 gasobresaleel sistemaconcéntricocompleto; porel extremo opuesto,por dondesobresalelacánulapush,se introducela cánulade 23 gay10 mm de longitud por su extremobiselado.Ambos extremosde la cánula de 18 ga secierran con sendassoldadurasde estañodemodo que dicha cánula se convierte en unacámaraperfectamentecerrada en la que ellíquido que penetra en la cánula pulí delsistemaconcéntricoes recogidopor la cánulapulí deextremobiselado.
El resultadofinal es un sistemade cánulasen elqueel líquido deperfusiónes introducidoa travésde la cánulapushy recogidoatravésdelacánulapuii(verFigura7).
cánula cánulapush push
NL
cánula
puil
NS
cánula cánula
push
NL
soldadura
~~
Fig. 6 Representaciónesquemáticadelprocesodeconslrucc¡ónde la~ cánulavpush-pulL
Fig. 7. Representaciónesquemáticadel]Imcionaznienzode la cánulapush-pultEláreasombreadarepresentael volumencerebralperfundido.A la izquierda,dibujo a tamañoreal deuna canulapush-pull.
u
A
4
—25 mm
~ mmj 41> ~563Qi4p~0300gm
44
Material yMétodos
2.3. PREPARACIÓNDE /VQUJTHESLN
El anestésicoEquithesinfue preparadoenel laboratoriodisolviendo2 1.25 g dehidratodecloral en 49.4 mL de etanolabsoluto.Una vezobtenida dicha solución se añaden sucesi-vamentelassiguieniessoluciones:
- 4.86g de pentobarbitalsódicodisueltosen21 mL deaguabidestilada;
- 198mL de 1,2-propilenglicol;
- 10.63 g de sulfato magnésicodisueltosen50 mL deaguabidestilada;
- aguabidestiladac.s.p.500mL.
La solución obtenidadebe conservarseatemperaturaambiente.
3. METODOSEXPERIMENTALES
3.1. PROCEDIMIENTOQUIRURGICOESTEREOTAX1CO
Los implantespara la perfusión intrace-rebral in vivo fueron colocadosestereotáxi-camenteen el cerebrodel animalmedianteunaintervenciónquinirgica descritamásadelante.El materialempleadoendichaintervenciónfueel siguiente:
- bisturí;
- destornilladorderelojero;
- pinzashemostáticas;
- resinaplásticaIvoclar (InternationalDentalProducta);
EspongostanFilm (Fenosan);
tornillos de 1.4mm deO;
espátularecta;
agujadeinsulina
- estereotáxicopararoedores(David Kopf
instrumenta900);
- brocadelnndeO;
- motorportabrocas(CasaliDSE-47).
El instrumentalquirúrgico se mantuvo enunasolucióndesinfectantedeannil al 1 pormildurantetodala intervención.
Previamentealaoperación,lasratasfueronpesadasy anestesiadascon Equithesin (verpreparaciónen el apartado2.3 de Material yMétodos)ya intraperitoneala la dosis de 2mL/kg de peso. El animal se colocó en elestereotáxicopinzando el maxilar superior 4mm por debajo de la línea interaural. Trasdescubrir la calata mediante una incisiónlongitudinal y controlar con Espongostanlaspequeñashemorragiasproducidas,se localizóel punto BregmaBregmafue utilizado comoreferenciaen la obtenciónde las coordenadasestereotáxicasanteropostenory lateral nece-sanasparasituarlascánulasguía.
Las coordenadasestereotáxicasutilizadasparala localizaciónde las cánulasguíafueroncalculadasa partir del atlas estereotéxicodeKónig y Klippel (1967). Paralos implantesenel estriado las coordenadasfueron: 0.6 mmanterior y 2.5 mm lateral aEregmaPara losimplantes en la corteza prefrontal de lascoordenadasfueron:3.6mm anteriory0.9 mmlateralaBregma
Seguidamentese abrieroncuatro orificiosen la calota, dos parael emplazamientode lostornillosdefijación y otrosdosparalascánulasguía A continuaciónse localizó la superficiede la duramadre, tomándose ésta comoreferenciaparala coordenadade profundidad.Posteriormentese rasgó superficialmenteladuramadrecon una aguja y se introdujo lacánulagnia 1 mm por debajode la superficiedural en el casode los implantesen el estriado
45
MaterialyMétodos
y 0,5 mm de profundidaden el caso de losimplantesen lacortezaprefrontal.
El implante se fijó a la calota con resmaplásticaIvoclar. Una vez que la resinahubofraguadose introdujeronlos obturadoresen elinteriordelas cánulasguía
Finalizadalaoperaciónse colocóal animalen su jaulavigilándole la ingestade comida ybebida así como el peso durante los diassigmentesa la rntervenc¡ón. Dianamentesemovilizaron los obturadores,limpiándoseconetanol al 70%, con el fin de mantenerpermeablelacánulaguia
3.2. PERFUSIÓNlNnt4CEREBRAL17V VIVO
Laperfusiónintracerebralin vivose realizóutilizando el sistemade cánulasconcéntricasocánulaspush-puiidescritoen el apartado2.2.de Materialy Métodos.Estesistemapermitelainfusión de un liquido de perfusión en unaestructuracerebral determinadaa través de lacánulapushy suposteriorrecogida,junto conlassustanciasquímicasliberadas,atravésde lacánula pulí. La técnica de perfusiónintracerebral itt wvo push-puil que se va adescribir es unamodificación de la publicadapor Myers (1972) y ha sido utilizadarutinariamenteen nuestrolaboratorio(Mora yPorras,1993; Porrasy Mora, 1993; Sanzetal.,1993; Expósito el al., 1994; Segovia et al,1994).
El extremo superior de la cánulapushseunió medianteun tubo de polietileno PE-lO aunajeringaHamiltonde 5 mL acopladaenunabombade infusión Harvard 22. El extremosuperiordelacánulapulí biseladase unió aunpolietileno PIE-SO cuyo extremoopuestoquedóacopladoen un colector de ftaccionesJaytee5512 (ver Figura 8). El colectorde fraccionesse colocópor debajodel punto de perfusiónaunadistanciatal que la inijisión y la recogidade líquido se realizaron al mismo flujo ysimultáneamente.
flg. & Representaciónesquemálicadelsistemacompletoutilizadoparala realizaciónde losexperimentosmediantela técnicade push-pullcontinuo.(a)Bombadeinflhsion; <b) xálvuladecuatro vias; «9 animaldeexperimentacióncon lacánulapush-pull; (d) colectordefracciones.
Las perfusionesintracerebralesitt vivo serealizaronde dos a cuatro díasdespuésde laintervención quirúrgica Tras retirar el obtu-rador,lacánulapush-pullseintrodujodefomiaquesuextremoinferiorquedó4mw ó 2.5 mmpor debajodelasuperficiedural en los experi-¡tientosrealizadosenel estriadoy en lacortezaprefrontalrespectivamente(verFigura9).
b
a
d
a b c
4,
Fig. 9. Dibujoesquemáticode la cánulaguíaimplantadaenlacalota delanimalconelobturadorintroducido(a). Para inciar laperfusiónintracerebral,seretirael obturadorde la cánulagula(b)y seintroducelacánulapush-pull(c).
46
Material yMétodos
El liquido de perfusión utilizado fueliquido cefalorraquideo sintético (LCRs)preparadopreviamenteen el laboratorio. Lacomposicióndel LCRs fije la siguiente:NaCí:122.0 mM; KCI: 3 mM; CaCI2: 1.2 mM;KH2PO4. 0.4 mM; NaHCO3: 25 mM;MgSO~±7WO:12 mM y glucosa 5.9 mM(pH=7.8). Antesde comenzarla perfusión,sefiltró el LCRs un filtro Millipore de 0.22 mmde diámetro de poro y se alamacenóen unfrasco. Los filtros y los frascosfueron esteri-lizadospreviamenteenun autoclave.
La perfusiónserealizóde formacontinuaaun flujo de 20 jiL/mun durante150 miii. Eltiempo de recolecciónde cadamuestrafue de10 miii. En estudios previos de nuestrolaboratorio se ha comprobadoque, con estatécnica, los niveles de aminoácidos seestabilizantras 50 miii de perfUsión continua(Porras. 1992), por lo cual las muestrasrecogidas durante los 50 primeros mm deperfusión no se analizaronen los sucesivosexperimentos.Tras la obtención de nivelesestablesde aminoácidosse recogieroncincomuestras(50 miii) paradetenninarlos nivelesbasalesde aminoácidos (muestras basales).Durantela recogidade la sextamuestra(entreel mm SOy elmiii 60) ymedianteel giro delallave de unaválvula Harvard1-1V 4-4 de cuatrovías se infundió la apomorfina (muestrasestimulo). Posteriormente,medianteun nuevogiro de la llave de la válvula HarvardHV 4-4,la perfusiónse continuóconLCRs durante40min (muestraspartesíímulo).
La apomorfina se inñmdió directamentesobrelaestructuraen estudiodisueltaen LCRs.La soluciónde apomorfinase preparóde 10 a30 mm antesde utilizarla en cadaexperimento.Además,conel fin de evitar la degradacióndela apomorfinase añadióa la disoluciónácidoascórbicoaunaconcentraciónde0.4 gM.
La apomorfinase utilizó a las dosis de 5,10 y 20 pM en los experimentoscon ratas
jóvenesy a las dos dosis superioresen losexperimentosconratasde edadmediay viejas
Los perfundidos obtenidos se hicieronpasara travésde un filtro Millipore de 0.22mm. Inmediatamentedespués la muestrasfueronalmacenadasa-so 0(7 hastaelmomentodesuanálisis.
3.3. ANÁLISISDÉ] AMíNOÁCIDOSPOR
CROMATOGRAFÍALÍQUIDA DEALTARESOLUCIÓN(HFLQ)
Todos los perfundidosfueron analizadosen un cromatógrafoWaters 600E acopladoaun detectorde fluorescenciaWaters420-AC.Se utilizó una precolumna Resolve C15(Waters) seguida de una columna de faseinversa Resolve Ct~ (Waters) de 15 cm delongitud, 3.9 mm de diámetro, 5 mm detamañode particula y 90 Á de diámetro deporo.
3.3.1. Cuanqílcactóndeaminoácidos
como0PtA-derivados
Para la deteccióny cuantificaciónde losaminoácidos presentes en las muestrasrecogidasserealizóunaderivaciónprecolumnacon el reactivo o-fiaidialdehído-3-mercapto-propiónico (OPA-3-mercaptopropiónico)deacuerdoconel métododescritopor ionesel al.(1981)y modificadoporHerranzel al. (1985).Estemétodosehavenidoutilizando en nuestrolaboratorio, con pequeñasmodificaciones,deforma rutinaria (Cobo, 1990; Cobo el al.,1992, 1993; Expósitoel al., 1994; Segoviaetal., 1994).
El material necesariopara la preparacióndel reactivo OPA-3-mercaptopropiónicoes elsiguiente:
- boratosódico(Na2B4O7 10H20)(Merck);
- metanolgradoHPLC (Scharlau);
- o-flaldialdehido(OPA) (Sigma);
4.7
Material yMétodos
- ácido3-mercaptopropiónico(Sigma).
El reactivo sepreparadel siguientemodo:tras disolver 32 mg de OPA en 800 pL demetanolseañaden7140 pL deunasolucióndetampónborato0.1 M ajustadaaunpHde9.5.Posteriormentese añaden54 pL de ácido 3-mercaptopropiónico.La solución debeconser-varse a temperaturaambiente en un frascoopacoy cerrado.El reactivo preparadoposeeunavalidezde15 días.
La derivación precolumnade los amino-ácidosfUe realizadade la siguientemanera.A20 pL de muestrase le incoiporaron5 pL delestándarinterno utilizado (homoserina0.025mM) y 10 pL del reactivo OPA-3-mercapto-propiónico.La mezclaresultantese agitó en unaparatovortexdurante15 segparafavorecerlareacción.Transcurrido1 tuin desdela adicióndel reactivo OPA-3-mercaptopropiónicoa lamuestra,se añadieron5 1.tL de ácidoacéticoal5%conel fin de disminuir el pH de la mezclay evitar la pérdidade sílice de la columnaFinalizadala derivación, se inyectaron en elcromatógrafo20 jiL de la solución obtenidamediante un inyector tipo Reodhyne devolumenfijo.
3.3.2. Condicionescromarográficas
Paraconseguiruna correcta separacióndelos picos correspondientesa cadaaminoácidose empleóun gradientede dos fasesmóviles,conun flujo constantede entradaa lacolumnade 1 mL/mm (Herranz el al., 1985). Elprogramade gradientesutilizado puede verseen laTabla 1.
Losreactivosempleadosen lapreparaciónde las dosfasesmóviles utilizadas fueron lossiguientes:
- tampónacetatosádico4 M (Pierce);
- alcoholisopropilicogradoIcIPLC(Scharlau);
- metanolgradoHPLC (Scharlau);
aguaultrapuraobtenidade un sistemadepurificación de agua Milli-Q plus(Millipore) y filtrada a travésde un filtroMillipore de0.45 mr.
La fasemóvil A consistióen unasolición95/5 (vol/vol) de tampón acetato sádico 50mM y metanol,a la que se le añadieron12.5mL de alcohol isopropilico por cada litro demezcla.El tampónacetatosádico utilizado enla fase móvil A se preparóa partir de unasolución de acetato sódico 4 M con pHajustadoa 5.67 y filtrada a travésde un filtroMillipore de0.45pin.
La fase móvil B consistió en unamezcla70/30(vol/vol) demetanoly agua.
Previamentea su utilización, ambassolu-ciones se degasificaronmediante sonicacióndurante15 mm. Posteriormentesecolocaronenel cromatógrafoy durante5 mm se sometierona un burbujeo de helio a un flujo de 100¡nL/mm. Duranteel procesodeanálisisel flujodehelio semantuvoa 10 mL/mm.
Tabla1. Programadegradientesutilizado enelanálisiscromatográficode lasmuestras.Los16primerosmm deesteprogramadegradientesfueronusadosparaelanálisisdelasmuestras;los4 mm siguientesfueronusadoscomoprogramadepreparaciónparaun nuevoanálisis.
TIEMPO FLUJO Fase A Fase 13
(miii) (nilJnuin) (%) (%)0.00 1 90 10
9.00 1 52 48
12.00 1 0 100
16.00 1 0 100
16.01 1 90 lO
20.00 1 90 10
48
MaterialyMétodos
La detección de los aminoácidosOPA-derivados se realizó con un detector defluorescenciaWaters420-AC con un filtro deexcitaciónde 340 nm y un filtro de emisiónde460nm
EJ cálculo de factores de respuestaytiemposde retencióny la cuantificaciónde losaminoácidosse llevó acabocon un integradorregistradorWaters745 siguiendoel métododelestándarinterno. El estándarinterno empleadofríe lahomoserinaEn laFigura 10 puedeverseun ejemplo de cromatogramasobtenidosconlas condicionesdescntas.
3.2.2.1. Factordedilución
El hecho de realizar una derivaciónprecolumnade la muestrao de la soluciónpatrón obliga a calcularun factor de diluciónquetengaen cuentael volumendemuestraquese encuentra en la mezcla inyectada Lapreparaciónde la muestrase hizo, tal y comose hamencionadopreviamente,añadiendoalos20 ¡iL de muestrao soluciónpatrón, 5 li deestándarinterno, 10 ¡iL de OPA-3-mercapto-propiónicoy 5 ¡iL de ácido acéticoal 5%. Elvolumenfinal de la mezclafue, por tanto, de40 1iL. Deestos40 ¡iL se inyectaron20 1iL enel cromatógrafo.El volumentotal de muestrainyectadofue, portanto,de 10 pL. El factordedilución se calculó hallando la inversa delvolumende muestrainyectado,resultandoserdc 1/10 = 0.1. La concentraciónde cadaaminoácidopresenteen la muestrase calculómultiplicando la cantidad medida de dichoaminoácidoporel factorde dilución 0.1.
3.2.22. Calibración
Lacalibraciónserealizaconel fin de daralintegradorvaloresde referenciade los tiemposde retencióny factoresde respuestade cadaaminoácidoanalizado.El tiempo de retenciónde cadasustanciaes el tiempomedioquetardaen salir de la columnadel cromatógratoy es
utilizadopor el integradorparaidentificarla Elfactor de respuestade cada sustanciaes unvalor que relacionalas concentracionescono-ciclas de esta sustanciay del estándarinternoconlas áreasdelospicoscromatográficos.
Para ¡a calibración del cromatógrafo, seprepararonsolucionesestándarde cadauno delos aminoácidos analizados a una concen-traciónde0.05 mM. El disolventeempleadoentodas las disolucionesfue LCRs. Los amino-ácidos empleados fueron L-GLU, (liABA,GLN y HL-homoserina(Sigma).
A partir de las soluciones estándar sepreparóunasoluciónpatrónmezclando150 pide la solución estándarde cada aminoácido,excluido el estándarinterno (homoserina).Lassolucionespatrónasí obtenidassealmacenarona-80 0(7 bastaelmomentode suutilización
La calibración se realizó inyectandoen elcromatógrafo5 partes alícuotasde soluciónpatrón. La inyección de la misma muestravarias vecespennite al integradorregistradorWaters745 calcularlos factoresde respuestaylos tiempos de retención medios para cadaaminoácido.En laTabla2 se recogenlos datosobtenidosdeunadelascalibracionesrealizadaspara el trabajo experimental de esta TesisDoctoral
3.2.23Coeficientede variación
Paracalcularla variaciónintrínsecapropiadel método de análisis se inyectaron en elcromatógrafo7 partesalícuotasdeunasoluciónpatróncon concentracionesde 5 mM de cadaaminoácido. Puesto que estas inyeccionesfueronrealizadasporelmismoexperimentadory en las mismas condiciones, las posiblesdiferencias obtenidas son reflejo de lavariabilidadpropia del método.En la Tabla 2puedeobservarseel coeficientede variacióndecada aminoácidoobtenido duranteel trabajoexperimentaldeestaTesisDoctoral.
49
MaterialyMétodos
Tabla2. Factoresderespuesta(FJ~L tiemposderetención(IR)y coeficientedevariación(CV)obtenidosenunadelascalibracionesrealizadasduranteeltrabajo experimentalrealizadoparaestaTesisDoctoraL
Fig. 10. Ejemplodecromatogramasobtenidosconlascondicionescromatográficasdescritaseneltexto:a)patrón;b) muestraobtenidadeun animalmedianteperfusiónintracerebrallii vivo. La escalarepresentael tiempodeanálisis(enmiii). 1: GLLk2: GLN; 3: homoserina;4: GASA.
y dela concentraciónde aminoácidoen el ejede abcisasresultó ajustarsea una línea recta(verFigura11).
Fig. 11.Curvade linealidadobtenidaparalosaminoácidosGLU GAliA y GLNbajolascondicionescromatográficasdescritaseneltexto.
3.4. COMPROBACIÓNDE LALOCALIZ4CIÓNDELASCÁNULAS
Una vez finalizadoslos experimentos,secomprobó la correcta localización de lascánulasguía y push-pullmedianteel estudiomacroscópicodelaspiezascerebrales.
El material empleadocomprobaciónfue el siguiente:
3.2.2.4.Linealidaddelanálisiscromatográfico
Paradeterminarla linealidaddel métododeanálisis cromatográficodescrito se inyectaronen el cromatógrafosolucionespatrón conunaconcentraciónconstantede homoserina(5 ¡iLde homosermna0.025 mM — 62.5 pmoles)y
concentracionesvariablesde losaminoácidosaanalizar. La representacióngráfica de larelación entreel áreade cadaaminoácidoy eláreadelestándarinternoen el eje deordenadas
- NaCí(Merck);
- fonnaldehído3540%(Panreac),
- heparina5%(Leo);
- microtomode congelaciónLeitz (Wetzlar);
- lupabinocular(Zeiss).
Los animalesfUeron anestesiadoscon unainyección intraperitoneal de 2 mL/Kg deEquithesin(vercomposiciónen elapartado2.3de Material y Métodos).A continuaciónse les
AMINOÁCIDO FR TR CVÁcidoglutámico 1.014 5.04 3.18%
Glutainina 1,170 7.31 1.11%
Homoserina - 8.25 -
GABA 1.119 14.34 2.45% CURVA DE LINEALIDAD• GABA• GLN• GLU
4>~ 2 -
1•tu•13 o.
0 5 10 15 20 25
[AA] en i.IMa b 2
___________ ~>~;i
para dicha
50
Material yMé¡oda
infundió soluciónsalinaisotónica(NaCí 0.9%)conheparinaal 1%, seguidadeunasolucióndeformaldehídoal 10% atravésde un punciónenel ventrículo izquierdo. Terminadala infusión,se extrajeron los cerebroscon unos alicatesplanosy semantuvierona-4”(7 sumergidosenunasolucióndefonnaldehídoa] 10%.
Parasu estudioniacroscopicolos cerebrosfueroncolocadosen un microtomodecongela-ción y se cortaronen seccionesde 150 ¡im. Acontinuaciónse comprobóla localizaciónade-cuadade las cánulasgala implantadasy deláreade perfusiónutilizandounalupabinocular.
4. MÉTODOSESTADÍSTICOS
Parael análisisde los resultadosobtenidosse consideraroncorno valorescontrol de cadagrupo lamediade los cinco valoresobtenidos
antesde la aplicación devalores control reflejanaminoácidos de cadacondicionesbasales.
laapoinorfma.Estosla concentracióndegrapo obtenida en
Los valorescontrol de los tres gruposdeedad en cada una de las estructuras secompararon utilizando un análisis de lavarianzadeunavía.
Los resultadosobtenidosen los gruposdeanimalesde diferenteedadtraslaestimulacióncon apomorfinase analizaron utilizando undiseño factorial de tres vías en el quelas víasfueronlas dosisdeapomorfinautilizadas(10 y20 pM), el grupo de edad de los animales(jóvenes, de edadmediay viejos)y el tiempo(10 muestras).El diseño factonal se hizo conmedidasrepetidasen el tiempo, comparandolos valores estimulo y post-estimulocon elvalorcontrol.
51
RESULTADOS
Los resultados obtenidos en los expe-rimentosrealizadosparaestaTesisDoctoral sepresentanen forma de Tablasy Gráficas.LasTablas muestran, en valores absolutos, lasconcentracionesextracelularesde los aimno-ácidosanalizados(en gM las deGLU y GLN,en nM las de (liABA). Las Gráficasmuestrandichas concentracionesen porcentajes conrespectoa su valor control (la media de losvaloresdelascincomuestrasbasales).
Todaslosresultadosmostradospertenecenaexperimentosen losquese comprobóqueelárea de perfusión estaba localizada en elestriadoo en la cortezaprefi-ontalde la rataenestudio.
1. INTERACCIÓNDENEUROTRANSMISORESYENVEJECIMIENTO: ESTUDIOSENEL ESTRIADO
1.1. Efectode la apomorfinasobrelasconcentracionesde CLU en el estriadodela rata adultajoven
La concentración extracelular de GLUobtenidaen el estilado de la rataadultajoven
en condiciones basales fríe, con nuestrométodo,de0.24 + 0.02¡iM.
La aplicación directadel agonistadopami-nérgico apomorfina en el estriado de ratasjóvenesprodujo un aumentode la concen-traciónextracelularde GLU dependiendode ladosisutilizada.
A la dosis de 5 pilvl, la apomorfinanomodificó de forma estadisticamentesignifica-tiva laconcentraciónextracelularde GLU en elestriado de ratas jóvenes. El incrementomáximo alcanzó el 136% del valor control(P>0.l0). Sinembargo,adosisde lOy 20 ¡iM,la apomorfina produjo un aumento de laconcentración extracelular de GLU quecomenzódurantelaaplicación delamismay semantuvodurante30 mm. El aumentomáximode laconcentraciónde GLU alcanzóel 167%del valor control con la dosis de 10 ¡iM(P<0.005) y el 184%del valor control con ladosisde20 gM (P<0.001).
7.2. Efectode la apomoty9nasobre lasconcentracionesde CLU en el estriadodela rata deedadmedia
La concentraciónextracelular de GLUobtenidaen elestriadode la ratadeedadmedia
53
Resultados
en condiciones basales fue, con nuestrométodo,de0.30±0.03pM.
En lasratasdeedadmedia,laaplicacióndeapomorfinaa la dosisde 10 pM produjo unaumentode la concentraciónextracelulardeGLU sólo en la muestraspostenora la aplica-ción de apomorfinaEsteaumentoalcanzóel171% del valor control (P<0.005). Por elcontrario,la apomorfina,a la dosisde20 jíM,no modificó de forma estadisticamentesignifi-cativalaconcentraciónextracelulardeOLU enel estriadode ratasde edadmedia El incre-mento máximo alcanzóel 124% del valorcontrol(P>0.10).
1.3. Efectode la apomorfinasobrelasconcentracionesde CLU en el estriado
dela rata vieja
La concentración extracelular de CLUobtenidaenel estriadodela ratavieja encondi-ciones basalesfue, con nuestrométodo, de0.26±0.04 jíM.
En las ratas viejas, la aplicación de apo-morfina,a las dosisde 10 y 20 ¡iM, no modi-ficó de forma estadísticamentesignificativa laconcentración extracelular de GLU en elestriado. Los aumentosmáximos alcanzadosfuerondel 121%del valorcontrol conla dosisde 10 1iM (Pi’O.l0) y del 136% del valorcontrolcon ladosisde20 MM (P>O.10).
1.4. Efectode la apomorfinasobrelasconcentracionesde CLU enel estriadodela rata a lo largo delenvejecimiento
La concentraciónextracelularde <RU enelestriadode la rataen condicionesbasalesnofije significativamentediferente entre los tresgruposdeedad(P>0.l0).
El efectodelaapomorfina,aladosisde 10pM, sobre las concentracionesextracelularesde OLU fue significativamentemenor en elgrupoderatasviejasqueen losgruposderatasjóvenesy deedadmedia(PcZ0.0l).
El efectodela apomorfina,aladosisde201iM, sobre las concentracionesextracelularesde GLU fue significativamentediferente entrelostresgruposde edad(p<0.OS).Sin embargo,las comparacionesdos a dos no resultaronestadisticamentesignificativas.
Grupodeedad GLUTAMATO
(estilado)
2-3 meses(iriS) 0.24+002
12-13 meses(irí 1) 0.30 + 0.03
24-34meses(n=13) 0,26+ 0.04
TeibIa 3. Concentracionesextracelularesdeácidoglutámico(enpM media+ error estándardelamedia)obtenidasencondicionesbasalesdelestriadoderatasadultasmachojóvenes,demedianaedadyviejas.
1.5. Efectode la apomorfinasobrelasconcentracionesde CABA en elestriadode la rata adultajoven
La concentraciónextracelular de CABAobtenidaen el estriadode la rataadultajovenen condiciones basales fue, con nuestrométodo,de4O±7nM.
La aplicación directa del agonistadopa-minúrgico apomorfinaen el estriadode ratasjóvenes produjo un aumento de la concen-traciónextracelularde CABA dependiendodeladosisutilizada.
A la dosis de 5 jiM, la apomorfina nomodificó de forma estadísticamentesignifica-tiva la concentraciónextracelularde CABA enel estilado de ratas jóvenes. El incrementomáximo alcanzó el 146% del valor control(P>O.10). Por el contrario, a las dosisde 10 y20 gM, la apomorfinasí produjo un aumentode la concentraciónextracelularde CABA.Con la dosis de 10 1¡M de apomorfina, el
54
aumento en la concentraciónde CABA seobservódurantela aplicacióndela apomorfinay alcanzóel 178%del valor control(P<0.005).Con la dosis de 20 MM de apomorfina, elaumento en la concentración de CABAcomenzó durante la aplicación de laapomorfinay se mantuvo durante 30 mm,alcanzando su máximo valor durante laaplicación de la apomorfina(191% del valorcontrol) (P<0.005).
1.6. Efectode la apomorfinasobre lasconcentracionesdeCABA en ei estriadode la rata deedadmedia
La concentraciónextracelularde CABAobtenidaen elestriadode laratadeedadmediaen condiciones basales fUe, con nuestrométodo de50±7nM.
En lasratasdeedadmedia,la aplicacióndeapomorfina, a las dosis de lO y 20 MM,produjo un aumento en la concentraciónextracelularde CABA sólo en la muestraposteriorala aplicaciónde laapomorfina.Esteincremento alcanzó el 175% (NO.05) y el167% (P<0.05) del valor control respecti-vaniente.
1.7. Efectode la apomorfinasobrelasconcentracionesde CABAen elestriadode la rata vieja
La concentraciónextracelularde CABAobtenidaen el estriado de la rata vieja encondicionesbasalesfue, con nuestrométodo,de43+7nM.
En las ratas viejas, la aplicación deapomorfina,a la dosisde 10 MM. no modificóde forma estadisticainente significativa laconcentraciónextracelularde CABA en elestriado. El incremento máximo alcanzó el126% del valorcontrol(P>-0.10). Sin embargo,laapomorfinaaladosisde 20 MM, produjounaumentode la concentraciónextracelular de
CABA durante su aplicación. Este aumentoalcanzóel 172%del valor control(NO.01).
1.8. Ejéctodela apomorfina sobrelaconcentraciónde CABA en el estriadode la rata a lo largo delenvejecimiento
La concentraciónextracelularde CABA enel estriadodela rataen condicionesbasalesnose diferenciéde forma significativa entre lostresgruposdeedad(P>O.10).
El efectodelaapomorfina,aladosisde 10
MM~ sobre las concentracionesextracelularesde CABA fUe significativamentemenoren elgrupodc ratasviejasconrespectoa los gruposde ratasjóvenesy deedadmedia(¡‘<20.01).
El efectodelaapomorfina,ala dosisde20
MM, sobre las concentracionesextracelularesde CABA no fue significativamentediferenteentrelostresgruposdeedad.
Grupodeedad CABA
(estriado)
2-3 meses(n17) 40 + 7
12-13 meses(n=l0) 50±7
24-34 meses (n12) 43 + 7
Tabla4. ConcentracionesextracelularesdeCABA(ennA’L media+ error esiándarde la media)obtenidasencondicionesbasalesdelestriadoderatasadultasmachojóvenes,demedianaedadyveas.
1.9. Efectodela apomorfinasobrelasconcentracionesdeCLNen el estriadode la rata a lo largo del envejecimiento
Las concentracionesextracelularesde CLNobtenidasen el estriadode la rata en condi-cionesbasalesfueron, con nuestrométodo,las
55
Resultados
siguientes:en el grupode ratasadultasjóvenes,1.25 1- 0.12 pM; en el grupo de ratas demedianaedad, 1.08 + 0.08 PM; y en el grupode ratasviejas 120 + 0.16 pM. La concen-traciónextracelulardeGLN en elestiladode larataen condicionesbasalesno se diferenciódeforma significativa entre los tres gruposdeedad(P>0.l0).
La aplicacióndeapomorfina,alasdosisde5, 10 y 20 pM, no modificó de fonnaestadísticamentesignificativa la concentraciónextracelulardeGLN en elestriadodela rataenninguno de los grupos de edad estudiados.
Gn~po deM~H GLUTAMINA
(esniado)
¡
2-3 rneses(n=17) 1.25+0.12
12-13 meses(n=tl0) 108+ 0.08
24-34meses(w13) 1.20 + 0.16
Tabla 5. Concentracionesextracelularesdeglutamina(en~¿4<media-4- error estándardelamedia)obtenidasen condicionesbasalesdelestriadoderatasadultasmachojóvenes,demedianaedadyviejas.
56
Resultados
mli,
AP05~tM AW)10~iM
(n=5) (n51
APO2%±M
(n5)
APOIOF¡M
(,r6)
APO2OpíM
(n5)
A}UIOpM
(n#S)
AKI2OpM
(,r5)
lO 021 4004 0.294008 0.20-4-003 0.33+0.04 0.31 40.09 0.27-11107 027-4-0.08
20 0.2240.02 0.25+0.06 0.2240.03 0.3640.04 0.27-4-010 0.244<1.04 0.34+0.18
30 0.244<1.03 0.251-0.04 0.2540.04 0.3140.07 0.2640.09 0.21 40.04 0.3440.18
40 (1.21 4-002 0.26-4-006 Oil 40.03 02740Á)3 0.334013 0 28+0 II 025+006
50 023+004 028+0.04 023 +034 0284006 0274006 0.21 -i-005 0294<) lO
U tiC4t16 -:: MI4tUt~~~ ~37~ ~ fl4J~ S~to~’ t214t% tiCtic
70 028-4005 04240.04 040+008 050+017 02240.05 0.2640.08 035-1-014 ¡
80 0214006 04240.09** 036+0.08 039+008 033+0.04 02340.04 0284006
90 0.1940.03 0.2840.07 0.27-1-0.04 0.3940.03 0.24+0.05 0.2940.08 0.2240,06
lOO 0.1640.03 0.39+0.10 0.2040.03 0.2640.06 0.25+004 0244006 0.2940,11
ratasadultasjóvenes
ÁCIDO CLUTAMICO (estilado)
ratasdeedadmedia
Tabla6. Concentracionesextracelularesde ácidoglutámico(en~‘4<medialerror estándardela media)obtenidasmediantepeiflísiónintracerebralenelestriadoderatasadultasmachojóvenes,demedianaedadyviejas.Durantela obtencióndela sextamuestra(mm 60)seadmninistraintracerebralmenteelagonistadopazninérgicoapomoé’fina(APO)a lasdosisde5, 10 ó 20 vM Losasteriscosindican la sign~2caciónes¡ad¿stica decadavalor conrespectoasnvalor control (*** Nr P<O.O05; ~“~<‘ = P<¿0.00
58
ratasv~as
Resultados
ÁCIDO GLUTÁMICOESTRIADO
—e-- 5pM—u— 10pM—A-- 20 pM
PcO.006P.cO.001
ratas jóvenes
** *
ratas viejas
hfr½ttt4tiAPO
0 10 20 30 40 50 60Tiempo (mm)
70
Fig. 12.Efectodela aplicaciónintracerebraldeapomorfina(APO), a lasdosisde 5, lOy.20pM,sobrelaconcentraciónextracelulardeácidoglutámicoen el estriadode ratasjóvenes,deedadmediay viejas.
300 -I
260 -
cooow42>.0oen
200 -
150
100—
60 —
**
APO
0300 —
.34.-
cooo
)4
a>.0o<o
mtas de edad media
260 —
200 —
160 —
100 -A
~:i APO
300 —
-3cooo(u0>.0o‘o
260 —
200 —
160 —
100 —
50 —
o80 90 100
59
Resultados
APOSpM
miii (,r4)
APOIOgM
(n7)
AI*)2OpM
(irS)
APOIO1iM
(¡rS)
A1XÚ2OjiM
(¡rS)
APOIOpM
(¡r7)
APO2OpxM
(n5)
lO 25+4 50+14 39+9 40+12 69+16 56+20 41±11
20 26+8 47±17 43+10 34-4-9 52±7 43+6 42±10
30 29+2 49±15 44+9 48±12 50+7 41±7 34+12
40 26+7 45+11 37+11 50±13 58±7 48+10 35±9
50 24+2 47+10 42+11 42+13 58±9 41+6 45+13
e 75+ an - ~ ~ s*~9 -; .%1&s-> .
70 31+9 58+10 72±26” 80±2V 87+26* 43+6 53+15
80 29+7 56+17 69±24** 57+17 53+11 32+10 49+12
90~33±11 54+20 46±10 47+9 51+9 34+5 41+11
100 26+6 59+22 47+12 25+2 53+11 39+11 43+11
ratasadultasjóvenes
CABA (estriado)
ratasde edadmedia
Tabla 7. ConcentracionesextracelidaresdeCABA (ennA’L mecho+ error estándarde la media)obtenidasmedianteperfusiónintracerebralenelestriadode ratasadultasmachojóvenes,demedianaedady viejas.Durantela obtencióndela sextamuestra(miii 60)seadministraintracerebralmenteelagonistadopaminérgicoapomorfina(ARO)a dosisde 5, 10 ó 20 MM Losasteriscosindican la sign~/2caciónestadísticadeczz&u valor conrespectoasuvalor control (* = P<0.05¿ ** = P<0.01; ~ = P<20.005).
60
ratasxeas
Resultados
Fig. 13. Efectode laaplicación intracerebraldeapomorfina(ARO),a lasdosisde5, JOy2O~uM,sobrelaconcentraciónextracelularde(JARAenelestriadoderatasjóvenes,deedadmediay viejas.
61
Resultados
mm
APOSpM
(n5)
APOI0~iM
(n=7)
APO2O1iM
(n=5}
AIXDIOUM
(n=5)
M~2OHM
(n=5)
APoIO~M
(n=8)
APO20~vt
(n=5)
lO 08640.13 1.33+0.23 1.5240.18 1.06+026 1.1840.17 1.27+0.29 1.16+0.43
20 1.0440.14 1.20+0.15 1.7840.38 1.1440.28 1.0340.08 1.2940.34 1.54+0.90
30 ¡.04+0.15 0.9240.10 1.47+0.25 1.0140.22 1.05+0.10 ¡ 0.9540.18 1.14+0.31
40 1.18+0.32 1.1040.13 1.6440.30 1.06+0.25 1.31-1<1.2] 1.42+0.49 1.2240.50
50 1.18+0.17 159+046 1.24+0.14 11840.15 0.9640.25 I.I7+o.~
.4* tA4414 IS4UO .fl$3.4fl~ . OS+t86 tas4*.51Úi*tu
70 ¡174021 0.96+0.13 1.7240.64 0764022 1.59+0.30 143+0.71 1.51+043
80 130+031 1.0640.11 1.39+0.44 0784025 1.47+0.21 11940.48 1.96+077
90 117+025 ¡.0440.12 1.21+0.11 059+017 1.4540.23 09740.21 1.914070
100 1314024 0.96+0.10 1.2340.26 062+013 &9840.04 111+0.18 1.674054
ratasadultasjóvenes
GLUTAIVIINA (estriado)
ratasdeedadmedia
Tabla& Concentracionesextracelularesdeglutamina(en,uM media+ error estándarde la media)obtenida’medianteperfusiónintracerebralenel estriadoderatasadultasmachojóvenes,demedianaedady viejas.Durantela obtencióndela sextamuestra(mm 60) seadmmnistraintracerebralmenteelagonistadopaminérgicoapomorfina(APO) a dosisde 5, 10620iNi
62
ratasviejas
Resultados
Fig. 14.Efectodelaaplicación intracerebraldeapomorfina(ARO),a lasdosisde5, lOy2OpM sobrelaconcentraciónextracelul.ardeglutaininaenel estriadoderatasjóvenes,deedadmediay viejas.
63
Resultados
O
ÁCIDO GLUTÁMICOESTRIADO
,6
a.5 .4a-0 3‘u
~ .2oaloo
0,0
Fig. 15. Concentracionesextracelularesdeácidoglutámicoobtenidasencondicionesbasalesenelestriadoderatasjóvenes,deedadmediay viejas.
ÁCIDO GLUTÁMICO
ESTRIADO
APOlO ~iM
250 m 2-3 meses~ 12-13n,eees
200 ____\\ 24-34 meses4,
o.! 150x“5E ~oo2e4~E‘u
50
250
E200oE 150
oc
=o
Ely. .16. Aumentomáximode lasconcentracionesextracelularesdeácidoglutámicoobtenidotras laaplicacióndeapomorfina(APO)a lasdosisde 10y20pMenel estriadode ratasjóvenes,deedadmediay viejas.
2-3m 12-l3rnesesN<\ 24-34 meses
—* P.c0.01
APa 20 hM
64
GASAESTRIADO
lOO 5 2-3 mesesmeses
C
4>
c 60‘0o~4Oc4>oc20o
oo
Fig. ¡7. ConcentracionesextracelularesdeGABAobtenidasencondicionesbasalesenel estriadoderatasjóvenes,deedadmediayviejas.
GASAESTRIADO
APa 10 1aM
250
E 200o.E 150~0E ~ooo
4>E3
50
0
250
~20Oo
E ¶50E mooa~> 50E3It
0
Fig. l& Aumentomáximodelasconcentrad<mesextracelnlares de GABAobtenidotras la aplicacióndeapomorfina(ARO)a lasdosisde lOy 20pMenelestriadoderatasjóvenes,deedadmediay viejas.
Resultados
S 2-3 meses“‘~ 12-13 meses
24-34 meses
— Pca 01
APO 20 1aM
65
GLUTAMINAESTRIADO
2,5 m 2-3 meses
~ 2,0ea>
1< 12-13 meses
>< 24-34 mesese 1,5o~~ 1,0e4>oe .5oo
0,0
Fig. ¡9. Concentracionesextracelularesdeglutaminaobtenidasencondicionesbasalesenelestriadoderatasjóvenes,deedadmediayviejas.
66
Resultados
Resultados
2. INTERACCIÓNDENEUROTRANSMISORESYENVEJECIMIENTO: ESTUDIOSENLI CORTEZA PREFRONTAJI
2.1. Ejéctode la apomorfinasobrelasconcentracionesdc GLU en la cortezaprefrontal de la rata adultajoven
La concentración extracelular de CLUobtenidaen la cortezaprefrontal de la rataadultajoven en condicionesbasalesfue, connuestrométodo,de0.29+ 0.02mM.
La apomorfina,alas dosis de 5 MM y 20pM, no modificó de forma estadisticamentesignificativa la concentraciónextracelulardeCLU en la cortezaprefrontalde ratasjóvenes.El incrementomáximo alcanzóel 125% delvalor control con la dosisde 5 pM (P)>0.10)yel 119% del valor control con la dosis de 20pM (P>0.l0)
La aplicación deapomorfina,a la dosisde10 pM, produjo un aumentode la coticen-tración extracelularde CLU. Este aumentocomenzó durante la aplicación de laapomorfinay sc mantuvodurante20 mm. Elmáximo incremento de la concentracióndeGLU alcanzó el 178% del valor control(NO.001).
2.2. Efectode la apomorfinasobrelwconcentracionesde GL (¡en la cortezaprefrontal de la rata de edadmedia
La concentración extracelular de GLUobtenidaen la cortezaprefrontal de la ratadeedadmedia en condicionesbasalesfue, connuestrométodo,de0.36±0.05mM.
La aplicación de apomorfinaala dosisdeLO pM no modificóde forma estadisticamentesignificativa la concentraciónextracelulardeGLU en la cortezaprefi’ontal de las ratasde
edadmediaEl incrementomáximo alcanzóel115%del valorcontrol (¡‘>0.10). Sin embargo,laapomorfina,aladosisde20 MM, produjounaumento en la concentraciónextraceluiardeCLU en la cortezaprefrontal que alcanzóel130%del valorcontrol(¡‘<0.01).
2.3. Efectode la apomorfinasobrelasconcentracionesde (U.U en la cortezaprefrontal de la rata vieja
La concentración extracelular de GLUobtenidaenlacortezaprefrontalde la rataviejaen condiciones basales fue, con nuestrométodo,de0.31 + 0.02 mM.
En las ratas viejas, la aplicación deapomorfina,alas dosisde 10pM y 20 pM, nomodificó de forma estadisticamentesignifica-tivala concentraciónextracelularde (}LU en lacorteza prefrontal. El incremento máximoalcanzóel 132%del valorcontrol con la dosisde lOpM(P>0.10)yelll8%delvalorcontrolconladosisde20 pM (P>O.10).
2.4. Efectode la apomorfinasobrelasconcentracionesdeCL U en la cortezaprefrontalde la rata a lo largo delenvejecimiento
La concentraciónexiracelularde CLIJ enla cortezaprefrontal de la rata obtenida encondicionesbasalescon nuestrométodono fuesignificativamente diferente entre los tresgruposdeedad(¡‘-<0.10).
El efectodelaapomorfina,a ladosisde 10pM, sobre las concentracionesextracelularesde CLU fue significativamentemenor en losgruposde ratasde edadmediay viejasqueenel grupo de ratas jóvenes (p<0.05). Sinembargo,el efectode la apomorfina,a ladosisde 20 pM, sobre las concentracionesextra-celularesde GLU no fue significativamentediferenteentrelostresgruposdeedad.
67
Resultadas
Grupodeeáad GLUTAMATO
(cortezaprefrontal)
2-3 meses (n17) 0,29 + 0.02
11-l4meses(n=l0) 0.36+0,05
24-26 meses (xr13) 0.31 + 0,02
Tabla9. Concentracionesextracelularesdeácidoglutámico(enpM media terror estándardelamedia)obtenidasencondicionesbasalesdelacortezaprefrontalde ratasadultasmachojóvenes,demedianaedadyviejas.
2.5. Efectodela apomorfinasobre lasconcentracionesde CABA en la cortezaprefrontal de la rata adultajoven
La concentraciónextracelularde CABAobtenidaen la cortezaprefrontal de la rataadultajoven en condicionesbasalesfue, connuestrométodo de32 + 4 nM.
La aplicación directa del agonistadopa-minérgico apomorfinaen la cortezapreftontalde ratas jóvenesprodujo un aumentode laconcentraciónextracelularde CABA depen-diendodela dosisutilizada
A la dosisde 5 gv!, la apomorfinanomodificó de forma estadísticamentesignifica-liva laconcentraciónextracelularde CABA enla corteza prefrontal de ratas jóvenes. Elincrementomáximo alcanzóel 120%del valorcontrol (P>0.10).A las dosisde 10 ~tMy 20gM, sin embargo, la apomorfina produjo unaumentode la concentraciónextracelulardeCABA. Con ambasdosis, el aumentoen laconcentraciónde CABA se observódurantelaaplicacióndela apomorfinay alcanzóel 175%(P<10.05)yel 177%(P<0.05)del valorcontroLrespectivamente.
2.6 Efectode la apomorfinasobrelasconcentracionesdeCABA en la cortezaprefrontalde la rata deedadmedia
La concentraciónextracelularde CABAobtenidaen la cortezaprefrontal de la ratadeedad mediaen condicionesbasalesfue, connuestrométodo,de54 + 11 nM.
En lasratasdeedadmedia,laaplicacióndeapomorfina,a las dosis de 10 y 20 gM, nomodificó de forma estadisticamentesignifi-cativa la concentraciónexínicelularde CABAenlacortezaprefrontal. El incrementomáximoalcanzóel 124%del valor control con la dosisdelO~iM(P>O.l0)yel 142%delvaloreontrolcon ladosisde20 1iM (P>O.05).
2.7. Efectode la apomorfinasobrelasconcentracionesde GABA en la cortezaprefrontal de la rata vie¡a
La concentraciónextracelular de CABAobtenidaen lacortezaprefrontalde la rataviejaen condiciones basales fUe, con nuestrométodo de4S+6nM.
En las ratas viejas, la aplicación deapomorfina, a las dosis de 10 y 20 pM, nomodificó de forma estadísticamentesignifica-tiva la concentraciónextracelularde CABA enla cortezaprefrontal. El incremento máximoalcanzóel 140%del valor control con la dosisde 10 ktM (PM). 10)y el 105%del valorcontrolconla dosisde20 1.¡M (P>0.10).
2.8. Efectode la apomorfinasobrelasconcentracionesde GABA en la cortezaprefrontalde la rata a lo largo delenvejecimiento
La concentraciónextraceluiardeCABA enla cortezaprefrontal de la rata obtenidaconnuestrométodoen condicionesbasalesno fuesignificativamente diferente entre los tres
68
Resultados
gruposde edad. Sin embargo,la significaciónalcanzada (P=0.06) sugiere la necesidad deaumentarel tamañode muestrade los grupospara confirmar este resultado. Además, lacomparaciónposterior entregrupos indica laexistencia de una mayor concentraciónextracelulardeCABA enlosgruposderatasdeedadmediay viejas que en el grupo de ratasjóvenes (¡‘<0.05).
El efecto de la apomorfina sobre lasconcentracionesextracelularesdeCABA, tantoaladosisde 10 iM (P)’O.10) comoa la dosisde 20 1.¡M (¡‘>0.10), no fue significativamentediferenteentrelostresgruposdeedad.
Grupo deedad CABA
(corteza prefrontal)
2-3 meses (n17) 32+4
¡1-l4mesesQr=lO) 54+11
24-26 meses (n= 12) 48 + 6
Tabla ¡O. ConcentracionesextracelularesdeCABA(en nlvL media+ error estándarde la media)obtenid.asencondicionesbasalesde la cortezaprefrontalde ratasadultasmachojóvenes,demedianaedadyviejas.
2.9. Afectode la apomorfinasobrelasconcentracionesde GLNen la cortezaprefrontalde la rata a lo largo delenvejecimiento
Las concentracionesextracelularesdeCLNobtenidasen la cortezapreftontalde la rataencondiciones basales fueron, con nuestrométodo, las siguientes: en el grupo de ratasadultasjóvenes,1.92 + 0.25 1íM; en el grupoderatasdemedianaedad,1.51±0.26~iMyenel grupo de ratasviejas, 1.48 ±0.32 gM. Laconcentración extTacelular de CLN en lacorteza prefrontal de la rata en condiciones
basales no se diferenció de forma sígmficativaentrelos tresgruposdeedad(¡‘>0.10).
La aplicacióndeapomorfina,alasdosisde5. 10 y 20 gM, no modificó de formaestadisticamentesignificativa la concentraciónextracelulardeCLN en lacortezapreftontaldela rata en ninguno de los gruposde edadestudiados.
Grupodeedad GLUTAMINA(cortezaprefrontal)
2-3 meses (n=17) 1.92±0.25
l1-l4mesesQrlo) 1.51 +026
24-36meses(n=13) 1.48+ 0,32
Tabla ¡1. Concentracionesextracelularesdeglutamina(enpA<L media+ error estándarde lamedia)obtenidasencondicionesbasalesdelacortezaprefrontalde ratasadultasmachojóvenes.demedianaedady viejas.
69
Resultados
mil,
APOSpM
(,r~5)
APO lOpM
(n=5)
APO2O1M
(rs6)
AI’O I0!IM
(irs)
APO2OgM
(1r6)
APO 101iM
(n=5)
APO2OpM
(n~5)
10 0.30 ‘+0.04 0.27 10.06 0.31 +003 0.30+0.07 0.43 -*0.07 0.31 -*0.05 0.33 «>04
20 0.24 -*0.03 025 -+0.04 0.28+0.05 0.28 40.05 0.43 ‘+0.10 0.27 ‘40.04 0.30 +0.04
30 0.28 +0.05 029 +0.05 0.34*0.06 0.26-*0.04 0.46+0.09 0.30 +0.04 0.37+0.05
40 0.27+0.05 028+0.07 0.35+0.06 0.26-*0.04 0.41 -+008 024 +0 03 0.37 40.07
50 0.26 +0.03 028 +0.04
~
0.26 +0.04
~É44.?I~
0.27+0.06. —
.txt
0.45 +0 07 027+0 04
~
0.29 -4-0.04
70 0.33 40.09 0 45+0.09 *** 0.38 +0.11 0.28 +0.06 0.49+0.12 0.25 +0.03 0.32 40.09
80 0.31+0.06 0.34+0.08 0.31+0.08 0.2440.04 0.51+0,11 0.25 +0.04 0.35 +0.10
90 0.28+0.06 0.31 -+0.06 0.30+0.06 0.27+0.04 0.39 -+0.08 0.27+0.05 0.25+0.04
100 0.30+0.05 0.31+0.06 0.35+0.12 0.24+0.03 0.51+0.19 . 0.22+0.03 0.30+0.08
ratasadultasjóvenes
ÁCIDO GLUTAMICO (cortezaprefrontal)
ratasde edadmedia
Tabla 12. Concentracionesextracelularesdeácidoglutámico(enpU, media+ error estándardelan4on
4a)obtenidasmediantepe,fusiónintracerebralenlacortezaprefrontalderatasadulíasmacho
jóvenes,demedianaedady viejas.Durante la obtenciónde lasextamuestra(mi» 60) seadministraintracerebralinenteelagonistadopaminérgicoapomorfina(APO) a dosisde5, 10 ó 20 MM. Losasteriscosindican la significaciónestadisticade cadavalor conrespectoa su valor control
= P’<0.01; ~ = P<0.001).
70
ratasviejas
Resultados
Fig. 20. Efectode la aplicaciónintracerebraldeapomorfina(APO), a lasdosisde5, IOy20,‘M sobrelaconcentraciónextracelulardeácidoglutámicoenla cortezaprefrontalde ratasjóvenes,de edadmediayviejas.
71
Resultados
mm
AIX) 5 ~tM(n6)
AIX) lO ~tM
(n5)
APO20 pM
(n~>
AIX) lO pM
(n5)
AH.) 20 ptA
(n~)
APOlO pM
(n’5~
APO20 iNI
(n5)
10 26+4 37+11 29+5 41±12 69+19 36+1! 4~+Il
20 23+4 26±7 32±6 37+10 63+13 41±10 49±5
30 24+4 40+12 34±7 33+9 77±22 40±7 57+9
40 32+11 39+14 39+8 31±4 76±22 46±10 64+14
50 37±9 35±9 26+3 34+9 69+14 52+13 55+8
34±12 n.a fl+»-’-’~-’.4,
--4N~
~
70 34+8 45±9 35±9 36+15 83+16 32±7 58+24
80 34+10 38±8 30±7 34+1! 89+23 35+10 64+3!
90 41+17 39+11 28+6 36+10 73+12 34+8 48+17
100 23+4 27+6 30+8 29+6 71-4-15 28+8 42±14
ratas adultas jóvenes
CABA(corteza prefrontal)
ratasde edadmedia
Tabla13. ConcentracionesextracelularesdeCABA (ennAo’, media+ error estándardela media)obtenidasmedianteperfvsiónintracerebralen lacortezaprefrontalderaíasadultasmachojóvenes;demedianaedadyviejas.Durantela obtencióndelasextamuestra(mi» 60) seadministraintracerebralmenteel agonistadopammnérgicoapomorfina(ARO)a dosisde 5,10ó 20 gv!?Losasteriscosindican lasig¡4ficaciónestadísticadecadavalor conrespectoa suvalor control (* = P<0. 05).
72
ratasxejas
Resultados
GABACORTEZA PREFRONTAL
—e~— 5 VM—u— 10pM—4— 20 pM
* P<0.05
*
ratas de edad media
APO
ratas viejas
¡ ¡ ¡ ¡ ¡
10 20 30 40 50 60 70Tiempo (mm)
Fig. 21. Efectode laaplicaciónintracerebraldeapomorfina(~4PO), a las dosisde 5, IOy2OpM, sobrelaconcentraciónextracelularde CABAenla cortezaprefrontalderatasjóvenes.de edadmediay viejas.
300 —
.5
cooo
0)no
ratas jóvenes
250 —
200 —
150
100 —
50 -jAPO
0—300 —
.5
cooow
a,nou)a?
250 -
200 —
150 —
100 —
50 —
0—300 -
.5
ow0)nou)a?
250 -
200 -
150 —
100 -
50 -
oAPO
o¡ ¡
80 90 100
73
ratas adultas jóvenes
GLUTAMINA (certezaprefrontal)
ratas de edad media
mm
AIX) 5 pM
(n=5)
APO lO pM
(n=6)
AIX) 20 pM
(r.=4)
AIX) 10 pM
(u,=3)
AIX) 20 pM
(n5)
AIX) lO pM
(n5)
AIX) 20 pM
(n3)
lO 1.66+0.41 2.52+0.77 2.09+0.55 1.82+0.55 1.36+0.29 1.46*0.53 1,46+0.72
20 1.36+0.21 1.7340.41 2.27+0.37 1.54+013 1.1340.20 1.64+0.47 0.96+0.35
30 130+015 236+072 2.31+0.51 1.65+0.43 1.47+0.41 1.78+0.53 1.13+0.43
40 1.57+0.44 1.75-14)37 2.11-44)20 1.84*0.35 1.43+0.40 1.64+0.45 0.95+0.06
50 1.27+0 !5 2.524068 203+0.36 1.57+0.17 1.64+0.51 1.70+0.36 1.52+0.48
0 L43jt30 LUn’ tM$a> flsfl$~ US$21:. :E»$2UÁi Ui+t4ZWj
70 1.27+0.37 2.14+0.65 1.99+0.13 1.56+0.38 1.18+0.15 114+0.38 1.76+0.37
80 ¡.5940.33 2.1640.68 211+0.24 171+0.50 1.19+0.20 1.52+0.45 2,0140.29
90 1.85+0.41 1.92+0.63 1.87+0.35 1.67+0.30 1.34+0.31 I.42 +0.32 1.3440.22
100 1.84+027 2.1440.62 1.85+0.50 2.09+0.50 1.33+0,31 1.35+0.29 1.25+0.30
TaNa ¡4. Concentracionesextracelularesdeglutamina(enpM, media+ error estándardelamedia)obtenidasmedianteperfl¿siónintracerebralen la cortezaprefrontalderatasadultasmachojóvenes,demedianaedadyviejas. Durantelaobtenciónde la sextomuestra(mm. 60) seadministromntracerebralmenteelagonistadopaminérgicoapomorfina(ARO)a dosisdeS, 10 ó 20 pM?
74
Resultados
ratasviejas
Resultados
Fig. 22 Efectodelaaplicaciónintracerebraldeapomorfina(ARO),a lasdosisde5, ¡0 y 20 pM, sobrelaconcentraciónextracelulardeglutaminaenla cortezaprefrontalderatasjóvenes,deedadinediay viejas.
75
Acíoo GLUTÁMICOCORTEZA PREPRONTAL
A
A
~1 [7)2-a <reses-l ~ l1-l4meses~
~—1 ~< 24-26 meses.go<u
.43
aa,oaoo
.2
.1
0.0
Fig. 23. Concentracionesextracelularesdeácidaglutámicoobtenidasencondicionesbasalesen lacortezaprefrontalderatasjóvenes,deedadmediay viejas.
ÁCIDO GLUTÁMICO
CORTEZA PREFRONTAL
APOlO MM
200
aa 150oE<u 100Eoaa,Etu
50
150J
o
200
aa,o
r00joe
50J4,E=<u o
Fig. 24.Aumentomáximodelasconcentracionesextracelularesdeácidoglutámicoobtenidotras laaplicacióndeapomorfina(ARO)a lasdosisde 10y2O~dvfen la cortezaprefrontalderatasjóvenes,deedadmediay viejas.
Resultados
W 2-3 meses
11-14 meses24-26 meses
* P<O.05
APO 20 MM
76
Resultados
GASACORTEZA PREFRONTAL
125 E 2-3n,eses * RenOS
<4 11-14 meses~ 100c m24-2emeses *
a 75 1o~50a,~25oo
o
Fig. 25. ConcentracionesextracelularesdeCABAobtenidasencondicionesbasalesenla cortezaprefrontalde ratasjóvenes,de edadmediay viejas.
GASACORTEZA PREFRONTAL
APOlO ¡~M
260 E 2-3 mesos
11-14m200 esos
D 24-26 <resesa,
oElSO
E100
o
=<u
250
E,200oE 150
~100
a,E<u
50
o
o
Fig. 26. Aumentomáximode lasconcentracionesextracelularesde CABA obtenidotras la aplicacióndeapomorfina(ARO)a lasdosisde IOy20 1¿Menla cortezaprefrontalderatasjóvenes,de edadmediayviejas.
APO 20 pM
.77
Resultados
GLUTAMINACORTEZA PREPRONTAL
4,0
ne 3.0a,
25e2.0
tu 1,5e2~ 1,0a05o
0,0
[II]~-~meses
12-13 meses~ 24-34 meses
Fig. 27. Concentracionesextracelularesdeglutaminaobtenidasencondicionesbasalesenlacortezaprefrontal estriadode ratasjóvenes,deedadmediay viejas.
78
DISCUSIÓN
1. ACERCA DELOSMETODOS
1.1. SOBREEL MÉTODODEPERFUSIÓNINIRACEREBRALIii VIVO
Las concentraciones extracelulares deneurotransmisores se pueden cuantificar in vivocon dos tipos detécnicasdiferentes:técnicasiii
situ y técnicas ex sun. Las técnicas in situdetectan y miden compuestos químicosdirectamente en el espacio intersticial (p. ej. lavoltametria) (Kissinger et aL, 1973). Lastécnicasex situ, o de perfusión intracerebral,recogensustanciasdel espaciointersticial paraser analizadasposteriormente.Existen variastécnicasex sun: el cup cortical (Mclntosh yOborin, 1953), la perfusión push-pull(Gaddum, 1961) y la diálisis (Bito et al.,1966).
La voltanietría permite cuantificar lasconcentracionesextracelularesde neuroirans-misores por medio de un microelecirodo,implantado en la región cerebral a estudiar, queoxida las moléculasde interés.Estaoxidacióngenera unas comentes que pueden serrelacionadas con las concentración de lamolécula oxidada (ver las revisiones deBenveniste,1989; Westerinky Justice, 1991;
Gardneret al., 1993). La gran ventaja de estatécnica es que realiza la medición de lasconcentracionesde neurotransmisoresin situ.Posee,además,un tiempo de resoluciónmuycorto (Westerink y Justice, 1991). Sinembargo, la voltametría está, en principio,limitada a la detecciónde neurotransmisoresoxidables. Además, existen problemas deselectividad, ya que compuestosdiferentespueden poseer potenciales de oxidaciónsimilares(Benveniste,1989; Benvenisteel aL,1989). En los últimos añosse ha avanzadoenla resoluciónde estas limitaciones(ver p. ej.González-Moraet aL, 1991). En todo caso,adiferenciadelavoltametria,las técnicasexsitu
pennitendetectartodaslas sustanciasquímicaspresentes en el espacio intersticial (Myers,1986; Benveniste, 1989; Ungerstedt, 1991;Gardneretat.1993).
El cup cortical consiste en un pequeñocilindro colocadoquirúrgicamenteen contactodirecto con la superficie cortical. El cup,formadoporel cilindro y la superficiecortical,puede ser perÑndido con solucionesfisiológicas, permitiendo la recogida desustancias difundidas desde la superficiecortical al líquido de perfusión (Benveniste,
79
Discusión
1989; Westerink y Jastice, 1991; GardaerelaL, 1993). Estatécnicaes la menosempleadadelas técnicasex situ dadoquesólo permitelaperfusióndeestructurascerebralessuperficialesy es diificil de aplicar a animales despiertos(Westerink y Justice, 1991; Gardner et al.,1993).
Frente al iip cortical, las técnicas deperfusión push-pull y de diálisis, por elcontrano, permiten acceder a todas lasestructurascerebralesy puedenaplicarse alanimal despierto (Benveniste. 1989;Ungerstedt, 1991; Westerinky Justice, 1991;Gardneret al., 1993).
Las técnicas de push-pull y diálisis sonmuy similares. Ambas utilizan una cánuladeperfusiónqueesimplantadaen eláreacerebralque se desea estudiar (Benveniste, 1989;Ungerstedt, 1991; Westerink y Justice, 1991;Gardneret aL, 1993). El diseñode lacánulaesbásicamenteel mismo en ambastéc cas~. doscánulas, bien concéntricas,bien paralelas,através de las cuales fluye el líquido deperfusión.La diferenciaprincipal entreambastecnicasconsisteen lapresencia,en el casodeladiálisis,deunamembranasemipenneableenel extremo de la cánula de perfusión(Benveniste,1989).
1.1.1.Comparaciónde lbstécnicasdepeifusiónintracerebral:diálisisvs. push-pulí
La presenciade unamembranadialíticaenel extremo de la cánula de diálisis evita elcontactodirectodel liquido deperfusióncon eltejido cerebrale impide el pasode sustanciasde elevadopesomolecular(Benveniste,1989;Ungerstedt, 1991; Westerink y Justice, 1991;Gardneret al., 1993). Estamembranaevita, deeste modo, el paso de proteínasal liquidorecogido y, por tanto, la degradaciónde losneurotransmisorespor acción de enzimaspresentesen el liquido recogido, no siendo
necesariala desproteinizaciónde las muestrasantes de su análisis (Ungerstedt, 1991;Westerink y Justice, 1991; Gardner et al.,1993). No obstante, la membrana dialiticapuedeentorpecerel pasode algunassustanciasde interéspresentesen el liquido extracelular,disminuyendosuconcentraciónenel liquido deperfusión (Justicey Neil, 1986; Westerink yJustice,1991). Estoobliga a utilizar un mayortiempo de recogida para cada muestra ymétodosde analisis mas sensibles.Por otraparte, la recuperaciónde sustanciasquímicasdesde el espacio extracelular a través de lamembranadialitica dependedel coeficientededifusión de dichas sustancias,del áreade lamembranade dialisis, del flujo del liquido deperfusión,de las propiedadesde la membranay de la temperatura (Benveniste, 1989;Benvenisteetal., 1989;Ungerstedt,1991).
El sistema de perfusión push-pull evitaalgunos de los inconvenientesde la diálisis,debido a que existe un contacto directo delliquido de perfusiónconel espaciointersticial(Myers, 1986).Deestaforma, no existeningúnobstáculoa la recuperaciónde sustanciasdelliquido extracelular. Sin embargo, por estamismarazón,es necesariala desproteinizaciónde las muestrasantes de su análisis mediantefiltración. Además, la perfusión push-pullprovocaun mayordañotisulardebidoal mayortamaño de las cánulasde push-pull (0.6-0.7mm de diámetro frente a <0.5 mm en ladiálisis) y aun flujo de perfusiónmáselevado(20 pL/mm enel casodelpush-pullfrentealos1 a 3 gL/min de la diálisis) (Benveniste,1989;Ungerstedt, 1991; Westerink y .Justice, 1991;Gardneret al., 1993).
1.1.2Limitacionesde la técnicadepeifusiónintracerebralpush-pull
La técnicautilizada en los experimentosquese presentanen estaTesis Doctoral fue laperfusiónpush-pull.
80
Discusión
La principal desventajade esta técnicaesque produce un mayor daño tisular que ladiálisis (Benveniste, 1989; Ungerstedt, 1991;Westerink y Justice, 1991; Gardner el al.,1993). Con el fin de hacermínimo este daño,setomaronlassiguientesprecauciones:
- se emplearon sistemas de cánulasconcéntricasque se obturan con menorfrecuencia(Myers, 1986);
- la distancia existente entre los extremosdistalesde las cánulaspushy ¡mli fue de0.3 mm.; con esta medida el daño tisular esmimmo y la eficacia en la recogida desustanciasdesde el tejido cerebral estácercana al máximo para el flujo deperfusiónempleado(Yaksby Yamamura,1974);
- el liquido de perfusión empleado fueisotónico con respecto al líquidocefalorraquideo,ya que las solucionesisotónicasproducenun menor dañotisularque las soluciones hipotónicas ohipertónicas(Yakshy Yamura, 1974).
El uso de la técnica push-pull llevaasociadolanecesidaddeun sistemade succióndel líquido de perfusión que funcionesimultáneamentea la infusión del mismo(Myers, 1986; Westerink y Justice, 1991;Gardner et aL, ¡993). Este problema sesoluciona con el uso de las bombas deinfusión-succión.A tales bombas se aplicandosjeringasde modo que unainfundaliquidoy la otra lo recoja Tal proceder,sin embargo,tieneun importanternconveniente.Pararecogerla muestra obtenidaha de interrumpirse laperfusión y extraersela cánulapush-pull. Deeste modo,a cadaperiodode perfusióndebeseguirle un período de interrupción de laperfusión para recoger la muestradesde lajeringa de succión. Cada periodo deinterrupción exige la extracciónde la cánulapush-pulIy cadaperíodode perfusiónexigesu
nueva introducción. Tales manipulacionespuedenproducir un mayor daño tisular y laposibilidadde que los niveles de aminoácidosseanmásreflejo del dañoproducidoquede lasconcentracionesextracelularesreales.
En nuestrolaboratoriose hadesarrolladoyutilizado la técnicadepush-pullcontinuo, queevita los inconvenientesdescritos al utilizarcomo fuerza de succión la gravedady nonecesitar,por tanto, una jeringa de succión(Mora y Porras, 1993; Porrasy Mora, 1993;Sanz et aL, 1993; Expósito el aL, 1994;Segovia et aL, 1994). Para ello, el extremolibre del tubo derecogida(el tuboadaptadoalacánula pulO se coloca en un colector defracciones a una distancia del punto deperfusióntal quela infusióny la extraccióndellíquido se realice al mismo flujo ysimultáneamente.De este modo se evitan lassucesivasextraccionese introduccionesde lacánulapush-pull con lo cual se consigueunmenor daño tisular y ima mejoría en elseguimientode los nivelesdel neurotransmisoren la estructuracerebralestudiada,puesno hayperíodosde interrupciónen los que se pierdainfonnación.
La técnicapush-pull(y tambiénla diálisis)tieneotro inconveniente:la introducciónde uncuerpoextrañoen el cerebrodesencadenaunaseriedereaccionesenel tejido queperturbansuhomeostasiaSehadescritoquedurantelosdoso tres días siguientesa la implantaciónde lascánulasguíano existenalteracionesapreciablesen el tejido cerebral;sin embargo,a partir deltercer día se observauna reacciónastrocitariaquepuedealterarel metabolismoy la difusióndelosaminoácidos(Myers, 1986; BenvenisteyDiemer, 1987; Benveniste, 1989; Ungerstedt,1991). Por este motivo, los experimentospresentadosen estaTesisDoctoralserealizaronentre dos y cuatro días después de laintervención quirurgica Por otra parte, elextremodelacánulapush-pullestabasituado3
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Discusión
mm por debajodel extremodel la cánulaguíaen el casode losexperimentosen el estriadoy1.5 mm en el caso de los experimentosen lacorteza prefrontal, por lo que el área deperfusión estabaalejadadel área de posibleperturbaciónprovocadapor la implantacióndelas cánulasguía. Además,se llevó acabounúnico experimentoen cadaáreade perfusión,evitando así la introducción repetidade lacánulapush-pull y el posible daño que elloproduzca,a pesarde querecientementese hadescrito que se pueden llevar a caboexperimentos de microdiálisís sucesivosdurantesiete días con un diseño de cánulasintercambiable(Fumeroet aL, 1994).
La introducciónde la cánulapz¿s’h-pull alcomenzar los experimentos de perfusióntambién provoca alteraciones del tejidocerebralcercano.Por ejemplo.algunosestudioshandescritoquela introduccióndelas cánulasproduceuna reacciónaguda con disminucióndel flujo sanguíneocerebraly del consumodeoxigeno (Benveniste et aL, 1987). Estaperturbacióninicial haceaconsejablecomenzararecogermuestrasparasuanálisisdespuésdeobtener niveles establesdel neurotransmisorestudiado (Benveniste, 1989; Ungerstedt,1991). No está claro, sin embargo,cuántotiempo debetrancunirentrela introduccióndela cánula y el inico de los experimentos.Utilizando nuestra técnica, se comprobópreviamenteque los niveles de aminoácidosanalizadosalcanzaronun estadode equilibriotras 50 mm de perfusión continua (Pon-as,1992), por lo que las muestras recogidasdurantelos 50 primerosmiii deperfusiónno seanalizaronenlosexperimentos.
A pesar de todas estas medidas, laperfusión push-pull (y también la diálisis)produce un cierto daño tisular. Por ello se hacuestionado el origen (intracelular oextracelular)de las sustanciaspresentesen ellíquido recogido. Diversos autores han
intentadocontestara estacuestióna través dediferentesaproximacionesmetodológicas:
- se han cuantificado sustanciasque estánpresentesde fonna predominanteen elespaciointracelular, como LDH, y cuyasalidaal espacioextracelularno está enrelación con la actividad neuronal; tras laaplicación de estímulosque inducen laliberación de neurotransmisores, lasconcentracionesextracelulares de estassustanciasno semodificaron(GreenfleldetaL, 1983);
- se han infundido precursoresde neuro-transmisores marcados radiactivamente,obteniéndose,posteriormente,la liberaciónde neurotransmisoresmarcados,tanto encondicionesbasalescomotrasestimulación(Moray Myers, 1984; Bessonel aL, 1986).
- se han inflindido sustanciascapaces deliberar neurotransmisores, como altasconcentracionesde FC (30 a 100 mM); laobtenciónde un aumentoen la liberaciónde neurotransmisorestanto en la técnicadeperfusiónpush-pull como en la diálisissugiere la integridad funcional de lasneuronasen el punto de perfusión(ver p.ej. Girault er mt, 1986% Yamamoto yDavy, 1992; Campbelletat, 1993)
Los resultadosdescritosdemuestranquelastécnicasde perfusión intracerebralson útilesparaestudiarla liberacióndeneurotransnnsoresiii vivo (sepuedeconsultarunarevisiónampliaen Ungerstedt, 1991). En relación con losaminoácidos,sin embargo,no se ha podidodemostrar de forma consistente el origencelularde los aminoácidosque se recogenenlasmuestras.Porejemplo,no sehademostradoadecuadamenteque las concentracionesdeaminoácidosobtenidasen condicionesbasalesdependande Ca2~ con la técnicapush-pull. Seha descrito que la estimulación con altasconcentracionesdeK~ induceunaliberaciónde
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Discusión
aminoácidosneurotransmisoresque dependede la presenciade Ca2~ (Girault el al., 1 986a),lo cual sugeriría que esta liberación esexocitótica Sin embargo,estos resultadosnohan sido conlirmados.Además,la aplicaciónde concentracionesde K’ por encima de 50mM produce la salida de aminoácidosdesdecélulas gliales (Bemath, 1992) y los métodosparaestudiarla dependenciadel Ca2 tambiénhan sido criticados (Hernath, 1992). Por otrolado, estudiosrealizadosen nuestrolaboratoriohan mostrado que, usando la técnica demicrodiálisis,no sepuededetectarla liberaciónde GLU que produce la aplicación 4-am¡nop¡ndma,un bloqueantede los canalesdeK , in vuro, ni aúnbloqueandolos sistemasderecaptacióndel GLU (Segoviael al., 1 996a).
Todosestoshechosno permitendetenninarsilosresultadosobtenidosutilizando la técnicapusli-pnlf (o la diálisis) parael análisis de lasconcentraciones de aminoácidos neurotrans-misores son realmenteun buen reflejo de laliberaciónexocitóticadeéstos.Por tanto,todoslos resultadosde estaTesisDoctoraldebenserinterpretadosdesdeestaperspectiva.
1.2. SOBREELMÉTODO DEAN,4LISISDEAMINOÁCIDOS
El procedimientomás empleadopara elanálisis de aminoácidoses la cromatograflalíquida de alta resolución(I-IPLC) debidoa sugransensibilidad(enel rangode fentomoles),asuelevadacapacidadde resolucióny asugranversatilidad.El métodoI-IPLC penniteutilizarpequeñosvolúmenesde muestra,métodosdederivación simples y un reducido tiempo deanálisis y posee, además, un coste menor queotros métodos cromatográficos(Lindroth yMopper, 1979; JonesetaL, 1981; VenemaetaL, 1983; Allison y Shoup,1984; PeinadoelaL, 1986; Ogden y Foldí, 1986; Sherwood,1990). Dadaslas ventajasde la cromatograflalíquida de alta resoluciónparael análisis deaminoácidos,éste fue el método utilizado en
los experimentospresentadosen esta TesisDoctoral.
1.2.1. De la derivacióny cuant¼cacióndeaminoácidos
Para la cuantificaciónde los aminoácidosmediante HPLC es necesario hacerpreviamente una derivación de éstos. Laderivaciónde losaminoácidospuederealizarsemediante diferentes métodos: fonnación dePITC-derivados (con fenilisotiocianato)(Bidlingmeyer el aL, 1984), formación deFMOC-derivados (con 9-fluoroenilmetilcloroformato) (Einarsson el aL, 1983) oformación de OPA-derivados (con o-fialdehído)(Lindrotb y Mopper, 1979).
La formación de PITC-derivadosesmétodo poco sensible y que requiereprocesolargo(Ogdeny Foldi, 1986).
unun
La ventaja de los FMOC-deiivadoses sugranestabilidad(superiora las 30 h) (OgdenyFoldi, 1986). sin embargo, el espectro defluorescenciadel reactivo estámuy cercanoalde losderivadosy puedenexistir interferenciasentre ambos en el cromatograma(Ogden yFoldí, 1986).
Los OPA-derivadosposeenuna elevadafluorescencia y requieren un tiempo dereaccióncorto, porlo queestemétodoes muysensibleparael análisis de aminoácidos,tantocon detectordefluorescencia(Korf y Venema,1985; Vezzaniel aL. 1985)comocondetectorelectroquímico (Allison y Shoup, 1984,Peinado el aL, 1986). El detector electro-químico, sin embargo,es muy sensiblea loscambiosen la composiciónde la fasemóvil ysu empleo con programas de gradientesproducealteracionesde la líneabase(Allison yShoup,1984). Dadassus ventajas,el métodode derivaciónde los aminoácidosusadoen elpresenteestudio fue la formación de OPA-derivados,y su cuantificaciónse llevó a caboconun detectordefluorescencia.
83
Discusión
La reaccióndel OPA conlos aminoácidosse realizaa un pH alcalino(9.5) y necesitauntiol comomoléculaauxiliarparadar lugar auncompuestofluorescenteeinestable(Lindroth yMopper, 1979; Aflison y Shoup, 1984). Lacantidaddefluorescenciay laestabilidaddelosOPA-derivados depende del tiol empleado(Venema et aL, 1983; Allison y Shoup, 1984).Los compuestosderivadosconmercaptoetanolo mercaptopropiónicoposeenmayor fluores-cenciaquelos derivadoscontertbutiltiol, peromenor estabilidad (Allison y Shoup, 1984;HerranzelaL, 1985; Ogdeny Foldi, 1986).Enelpresentetrabajo,el compuestoutilizadoparala formación de los OPA-derivados fUe elmercaptopropiónico,dado que permite unamayor sensibilidad. Con el fin de que lainestabilidaddelos derivadosasí formadosnoinfluyese sobre la cuantificación de losaminoácidos,el tiempo transcurrido entre laadición del reactivo de derivación y lainyecciónde lamuestraen el cromatógrafofueconstanteentodoslosexperimentos.
1.2.2.Delas condicionescromatográficas
Paraconseguirunaadecuadaresolucióndelos picos cromarográficos, se utilizó unacolumnade fase inversa C18 de 15 cm delongitud y 5 mm de tamaño de partícula(Herranz et al, 1984, 1985). Se eligió unacolumnade longitud intennediadado que lascolumnasde mayor longitudpermitenmejorarlaseparaciónde lospicoscromatográficosperolentiiflcan el análisis,y las columnasde menorlongitudrequierenun menortiempode análisis
pero poseen una menor capacidad dcseparación.Con el fin de aumentarla vidamediadelacolumnase utilizó unaprecolumnaC18(Venemaetat.1983).
El pH de la fase móvil utilizada en estetrabajo de investigaciónfue de 5.67, el cualpennite una adecuada separación de losaminoácidosOPA-derivadosy se encuentradentro de los márgenes tolerados por lacolumna(2<ZpH<8).Dadoqueladerivacióndelas muestrasrequiereun pH de 9.5 (Allison yShoup, 1984),previamentea suinyecciónse leañadieron a las muestras5 mM de ácidoacéticoal 5% conel fin de evitar lapérdidadesílice delacolumna(Cobo, 1990).
1.2.3.De la variabilidad delmétododeanálisis
El método de análisis de aminoácidosporHFLC acopladoa detectorestanto de fluores-cencia como electroquñnicoses un métodosensibley reproducibleparael estudiode losnivelesendógenosde aminoácidos(VenemaetaL, 1983; Peinadoet al, 1986). El métodocumple las condicionesde linealidad entre 1pmoly 10 nmolesde aminoácidospor muestray paravolúmenesde muestracomprendidosentre 10 y 500 g (Venema el aL, 1983;Peinadoel al., 1986). Las concentracionesdeaminoácidos presentes en las muestraanalizadasen este trabajo (0.01-1 pM), asícomo losvolúmenesdemuestrautilizados(20
seencuentrandentrodel rangoen el queelmétodo cumple la condición de linealidad.Además, previo a los experimentos, seconfirmótal condició,t
84
Discusión
¿ACERCADELOSRESULTADOS
2.1. INTEACCIÓAJDENEUROflRANSMISORESENELRS7RIADODELI RATI
La aplicación intracerebralde un agonistade losreceptoresdopaminérgicosDl y D2, laapomorfma,produjo,en el estriadode la rataadultajoven, un aumentode la concentraciónextracelularde GLU y GABA.
El aumento de las concentracionesextracelularesdeGLU en el estriadode la ratatraslaaplicación de un agonistadopantinérgicoha sido descrito previamente por nuestrolaboratorio utilizando la misma técnica(Expósitoel aL, 1994). TambiénGodukliin elaL (1984), utilizando la técnica de push-pull(aunqueconvariasdiferenciasen su aplicacióncon respectoa la utilizada por nosotros)handescritoun aumentode las concentracionesdeGLU tras la aplicación de apomorfina a ladosisde 100 1iM. asícomotraslaaplicacióndeDA. El aumento de las concentracionesextracelulares de GABA en el estriado de larata tras la estimulaciónde receptoresde DA(concretamentede receptoresDl) tambiénhasido descrito previamente (Girault el aL,1986b).
En oposición a los resultados que sepresentanen estaTesisDoctoral, YamamotoyDavy (1992) y Donzanti el aL (1993), utili-zandola técnicade microdiálisis,han descritoquela aplicacióndeagonistasselectivosde losreceptoresde DA Dl y D2 en el estriadonoproducenningún cambio significativo en lasconcentraciones extracelulares de GLU yGABA en condicionesbasales.La explicacióna esta discrepanciaentre nuestroresultadosylos descritospor estos autorespuede encon-trarse en la diferente manipulación de la neuro-transmisión dopaminérgicautilizada. Puestoque en el trabajo citado se utilizan agonistasselectivos de los receptores dopaminérgicos, elefecto estudiado es el de la estimulación de unosolo delostipos dereceptoresdopaminérgicos.En nuestrotrabajo, sin embargo,se utiliza unagonista no selectivo de los receptores de DA,por lo queel efectoobtenidoes el resultadodela estimulaciónsimultáneade varios tipos dereceptoresdopaminérgicos.Estehechopareceindicar que los efectos de la estimulaciónsimultánea de varios tipos de receptores de DApuedenser cualitativamentediferentesde losefectos de la estimulación de cada uno de esostipos de receptorespor separado.
85
Discusión
Aunque esta posibilidad no ha sidoestudiada por nosotros, otros autores handescrito hechos que la apoyan. Porejemplo, seha descrito que la conducta inducida por laestimulaciónconjunta de los receptores Dl yD2 es diferente de la inducida por la esti-mulación de estos receptores por separado(Koshikawa el aL, 1991). También se hadescrito que los efectos postsinápiieos de laestimulaciónselectivadelos receptoresD2 sondiferentes de los obtenidos tras la estimulaciónsimultánea de los receptoresDI y D2 (Wachteldat., 1989).
Por tanto, es posible que la discrepanciaque existe entre los resultados descritos por elgrupo de Yamamoto (Yamamoto y Davy,1992; Donzanti elal 1993) y los de esta TesisDoctoral pueda explicarse en fUnción de lapresencia, en nuestros experimentos, de unainteracción entre los receptoresDl y losreceptores D2.
2.1.1. InteracciónDA-GLUenelestriadode la rata
Nuestros resultados muestran que laestimulación simultánea de los receptores Dl yD2 en el estriado de la rata produce unaumento de la concentración extracelular deGLU. Este trabajo no ha estudiado losmecanismos mediante los cuales se puedeproducir este efecto. Sin embargo, losconocimientos que se tienen sobre la histologíay la neuroquimica del cerebro de la rata nospermiten discutir varias posibilidades.
El aumento de las concentracionesextraceluiares de 0133 en el estriado tras laaplicacióndel agonistadopaminérgicoapomor-fina puedeser debido a un aumentode laliberación de OLU (exocitóticao citoplas-matica)o a unadisminucióndela recaptacióndeGLU.
2? 1.1.1 ¿Liberaciónde(jLUo inhibicióndesurecaptación?
Algunos autores, utilizando técnicas ni
viet-o, han descritocómola apomorfinapuedeinhibir larecaptacióndeOLU (Nieoullonceal.,1982). Aunquelos resultadospresentadosenesta Tesis Doctoral podrían ser explicadosatravésdeestaaccióndelaapomorfina,estudiosprevios de nuestro laboratorio parecencontradecir esta posibilidad. De hecho,Expósito el al. (1994) han descrito que lamicroinyección previade un inhibidor de laglutamina-sintetasa(la metionina-sulfoximina)produce una disminución dramática de lasconcentracionesextracelulares de GLN y,también, la desaparicióndel aumentode laconcentración de QLU inducida porapomorfina Estos resultadosparecensugerirque el aumentode la concentraciónde GLUinducido por apomorfina necesita de lapresenciade GLN (y, por tanto, de la sigtesisde GLU). De ello podría deducirseque esteaumento de OLlA procede más de unaliberaciónde GLU quede unadisminucióndesurecaptación.
2.1.1.2.LiberacióndeGLU¿vesicularocitoplasnzótica?
Comosehaexpuestoenla Introduccióndeesta Tesis Doctoral, la liberación de GLUdesdela terminaciónnerviosapuedeproducirsea travésde mecanismosdependientesde Ca2~(exocitosis de las vesículaspresinápticas)omediantemecanismosindependientesde C?(inversióndel sentidodel transportede GLU),auncuandoeste último mecanismono ha sidobien demostradoen estudios iii vivo (verNicholls, 1989y Levi y Raiteri, 1992).En estaTesis Doctoral no se ha estudiado ladependenciade Ca2* de la liberacióndel GLUinducida por apomorfina Sin embargo,Godukhin et al. (1984) han descrito que el
86
I)iscusión
aumentode la concentraciónde GLU tras laaplicación de 100 pM de apomorfinano variacuandoen el medio de perfUsión el Ca2~ essustituidopor Co2X pero sí disminuyecuandoel Ni es sustituido por colina. Aunque la dosisutilizada por estos autoreses un orden demagnitudsuperior a la utilizada por nosotros,estos resultados parecen sugerir que laapomorfina produce un aumento de laconcentración de GLU a través de unmecanismo dependiente de Ni peroindependientede Ca2. Por tanto se podríaconcluir que la apomorfina induce unainversióndel sentidodel transportede GLU anivel de las membranasde la tenninaciónnerviosayio delascélulasglialescircundantes.
El mecanismo mediante el cual laapomorfina produce esta inversión deltransportede GLU esdesconocido.Sí se puedesugerir, sin embargo,que tal mecanismoestámediado por la activación de receptoresdopaminérgicos,ya quetanto Godukhin el al.(1984) como nosotros(Expósitoel al., 1994)hemosdemostradoque la liberaciónde GLUinducidapor apomorfinaes atenuadapor laaplicación previa del antagonistadopaminer-gicohaloperidol.
No está clara la forma en la que unaactivación de los receptoresde DA podríamodificar el transportador de GLU. Sinembargo,recientementese ha sugeridoque eltransportadordeOLU puedeestarreguladoporfosfatasasy proteina-kinasas(ver la revisióndeDanbolt, 1994),por lo quela fosforilación deprotemasque se producetras la activación dereceptoresde DA podría actuartambiénsobreeltransportadordeGLU. Por otraparte,Leví yRaiteri (1992) han sugeridoque la liberaciónde OLU y GABA inducidapor agonistasdelOLU puedeproducirse,en parte,atravésdelainversiónde sus transportesdebido a que lapropia excitación neuronalproduceentradade
Ni. Es posiblepuedajugar unconcentracionesCABA inducido
que este mismo mecanismopapel en el aumentode lasextracelulares de GLU y
porapomorfina
La hipótesis de que la apomorfinaproduzcasu efecto sobrelas concentracionesde <RUa través de la activación de receptoresde DA sc opone a las observacioneshistológicasquedescriben,en el estriadode larata, la ausencia(o muy escasapresencia)desinapsisaxo-axónicasy, por tanto, de unaconexión directa entre los axonesglutamatérgicosprocedentesdela cortezay losaxones doparnínérgicos procedentes delmesencéfalo(ver Kornhuber y Komhuber,1983). Para explicar esta discrepaciase hasugeridola presenciade receptoresde DA enlosaxonesquecontienenGLU a pesarde queno existansinapsisentreellos. Estosreceptoresestarían,por tanto, fUera del confinamientoespacialde las sinapsis,en el marcode lo quese conoce como «neurotranmísiónvolumélrica»(paraunarevisiónextensadeesteconceptose puede consultar Fuxe y Agnarí,1991). En el estriado se ha invocadopreviamente la existencia de este tipo detransmisión neural para explicar ciertosfenómenosque no puedenser entendidosconlas descripcionesclásicas(ver p. ej. García-Muñoz el al., 1991). Además, algunosresultadosexperimentaleshan confirmado laexistenciade receptoresparaDA fUera de lassinapsis que poseenuna alta afinidad por laDA (ver Díazel aL. 1995). De confirmarselaexistencia de receptorespara la DA en lasterminaciones nerviosas procedentesde lacorteza(hechoqueha sido objetode discusióndurante la última década ver Konihuber yKornhuber,1986; Trugmanel al., 1986; Joycey Marshall, 1987; Maurael al, 1988) podríaser fácilmente explicable el efecto de laapomorfinasobrela liberaciónde GLU por elmecanismoantesmencionado.
87
Discusión
GLU
Fig. 2& Representaciónesquemáticadelaconvergenciaqueexisteentrelasterminacionesglutamatérgicas(GLU) procedentesdela cortezaylas tenninacionesdopaminérgicas(DA)procedentesdelmesencejalosobrelasneuronasespinosasgabérgicasdelestriadodela rata Losrectángulosnegrosrepresentanlosreceptoresdopaminérgicos(sediscutesupresenciaenlasterminacionesglutamatérgicas).Losóvalosgrisesrepresentanlosreceptoresglutamatérgicos(sediscutesupresenciaenlasterminacionesdopaminérgicos).BasadoenSmithyBolam, 1990yParentyHazrat¿ 1995.
21.1.3.Liberacióncuoplasmáticade GLU¿deorigenneuronalo deorigenglial?
Comoya se ha comentadoen el apartadoque discute la utilidad de las técnicas deperfUsión intracerebral, estas técnicas nopuedendilucidar el origen celular(neuronaloastrocitario)de los aminoácidosrecogidos.Sinembargo, los datos discutidos aquí sugierenque el aumento de 0W producido por laapormorfinase producecomoconsecuenciadela inversióndel sentidodel transportede GLU.Puestoqueel transportedeGLU tiene lugardeforma predominanteen las célulasgliales, sepuede sugerir que el GLU liberado por laapomorfinaesdeorigenglial.
Comoya se ha comentado,el efectode laapomorfinasobre la liberaciónde GLU está
mediadopor la estimulaciónde receptoresdeDA. Por tanto,paraquela hipótesisdel origenglial del GLU seaconsistentees necesanoqueexistanreceptoresdeDA en las célulasguaJes.Este hecho ha sido, efectivamente,descrito(Hósli y Hñsli, 1986). La forma en que laestimulación de receptoresde DA en losastrocitospuedaregularel transportede OLUno está clara. Sin embargo,como ya se hadiscutido, el hechode que el transportadordeGLU posea un lugar susceptible defosforilación(ver la revisiónde Danbolt, 1994)indicaquepuedeexistir unaregulaciónde estetransportador a través de los segundosmensajerosactivadospor losreceptoresde DA.Además,un mecanismosemejanteya ha sidodescrito para los receptoresde noradrenaiina(ver Hansson,1991).
espacio
extracelular
APO
tGLU
GLU
PK
tAMPCastrocito
flg. 29.Hipótesisdela regulacióndopaminérgicadeltransporteglial deglutamato.La activacióndereceptoresdopaniinérgicosdela membranadelosastrocitospodriaregular la moléculatransportadoradeácidoglutámicoinvirtiendoelsentidodel transportedeéste.AC: adenilato-ciclasaAPO:apomorfina;Os:proteinaOestimuladora;¡>1<: proteina-kinasas;r-DA:receptordopaminérgico;t-GLU: transportadordeglutamato.BasadoenHansson,1991.
88
Discusión
En definitiva, por todos los datosdiscutidos hasta aquí, sugerimos que laapomorfina produce una aumento de lasconcentraciones de GLUen el estriado de larataatravésde laestimulacióndereceptoresdeDA situadosen los astrocitosque producelamversíóndel transportedeGLU.
2.1.1.4Otrasposibilidades
Las posibilidades hasta aquí discutidashacenreferenciaúnicamentea la hipótesisdequelaapomorfinaproduzcaunaliberacióndeGLUa través de la inversión del sentido de sutransporte. Sin embargo, puesto que estahipótesis, aunque la más probable, no estáenteramentedemostrada,no podemosdescartarla posibilidad de que el aumento de laconcentración de GLU inducido por laapomorfina proceda de una liberaciónexocitótica presináptica. En todo caso, laapomorfinaproduciríaesteefectoatravésdelaestimulación de receptores de DA (ver másarriba). Por tanto, esta hipótesises, también,inconsistentecon la ausenciade conexionessinápticas entre las terminacionesdopami-nérgicas y glutamatérgicasdel estriado. Sepuedendar dos explicacionesa esta aparentecontradicción.Unarefierea laexistenciade unmecanismo«volumétrico»detransmisión(estaexplicaciónha sido discutidamásarriba). Laotra refiere a la activación de una vía neurallarga. Esta vía neural estaría formada por lasneuronasgabérgicas,quepresentanreceptorespara DAy que proyectan a núcleo pálido; lasneuronasgabérgicasde éste, que, a su vez,estabkcen smapsis con neuronas glutama-térgicasdel tálamoy, finalmente,las neuronastal Amicas que, ya sea directamente (existenterminaciones talárnicas en el estriado), ya através de sus conexiones con la corteza frontaly desde ésta con el estriado, pueden inducir laliberación presináptica de (3LU en estaestructura.
21.2 InteracciónDA-GABAen elestriadodela rata
Nuestros resultados muestran que laaplicación del agonista dopaminérgicoapomorfinaen elestriadode la rataproduceunaumentode la concentraciónextracelulardeCABA.
El aumentodela concentraciónde GABAtras la aplicación de apomorfina puede serproducidopor un aumentode la liberacióndeCABA o por una disminución de larecaptacióndeCABA.
Este trabajo no ha estudiado losmecanismosmediantelos cuales se produceeste efecto. La bibliografla tampoco aportadatos acerca de la dependencia iónica delaumento de CABA inducido por agomstasdopaminérgicos in vivo. Por tanto, seríannecesariosexperimentosin vivo queestudiasensi esteaumento de CABA es dependientede
y de NC En todo casosepuedendiscutirvarias posibilidades.
La presenciade receptoresde DA en lasneuronasgabérgicasdel estriadosugierequelaapomorfina, estimulando directamenteestosreceptores, produce excitación de estasneuronasy liberaciónpresinápticade CABA,ya seavesicular(dependientede Ca2~), ya seacitoplasmática (por inversión del sentido de sutransporte). Estudios in vitro han demostradoque la aplicación de DAa dosis superiores a 10pM, produce una liberación de CABAa travésde su transportador(Bematb y Zigmond,1989). Dado que las dosis de apomorfinautilizadas por nosotros son del mismo orden demagnitud que las utilizadas en el trabajodescrito,y quelaapomorfinatieneunaafinidadpor los receptoresde DA semejantea la de lapropia DA, se podria sugerir que el efectoobservadopor nosotrosen las concentracionesextracelularesde CABA se debe,también, a
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Discusión
una inversión del sentido del transporte deCABA.
Por otra parte, el hecho de que laapomorfina produzca un aumento de laconcentraciónde GLU (ver másaruba)y deque la estimulación de receptoresde OLUproduzcaunaliberaciónde CABA (Moran etal, 1993; Young y Bradford, 1993) sugierequela apomorfinatambiénpuedeproducir unaumento de la concentración de CABAmediante la liberación previa de GLU. Labibliografla no nos permitediscutir estepuntomásallá.La realizaciónde expeninentosen losque, de forma simultánea, se estimulasenreceptoresde DA y se bloqueasenreceptoresde (1LU podría ayudamos a determinar cuál deestas dos hipótesis es cierta.
2.2.INTERACCIÓNDENEUROTRANSMISORESENLA CORTEZIPREFRONTALVELARATA
La aplicaciónintracerebralde un agonistade los recepores dopaminérgicos Dl y D2, laapomorfina,produjo, en la cortezaprefrontalde la rata adulta joven, un aumentode laconcentraciónextracelularde GLU y CABA.Estos resultados no han sido descritospreviamenteenla literatura.
221. InteracciónDA-GLUenla cortezaprefrontaldela rata
Nuestros resultados muestran, por primeravez, que la estimulación de los receptores deDA en lacortezaprefrontalde la rataproduceun aumento de la concentración extracelular deCLU.
El aumento de la concentración de CLI]tras la estimulaciónde los receptoresde DApuededeberseaun aumentodesu liberaciónoauna disminuciónde su recaptación.En estetrabajo no se han estudiadolos mecanismoscelularesimplicadosen esteefecto.Puestoqueésta es la primera descripción de estefenómeno,labibliograflatampocoaportadatos
que puedan ayudarnos a comprenderestosmecanismos. Seria necesario realizarexperimentosparaestudiarsi el aumentode lasconcentracionesde CLI] en la cortezaprefrontal sedebea unaliberaciónvesicularocitoplasmática.
En todo caso, el aumento de laconcentraciónde CLI] tras la estimulacióndelosreceptoresde DA enlacortezaprefrontaldela rataresultacoherentecon los conocimientosque se tienen sobre la histología yneuroquimicade esta región cortical. Así, sesabequelasterminacionesdopaminérgicasqueproceden de áreas mesencefálicasformansinapsis con las neuronas p¡ramidalesglutamatérgicasde la cortezaprefrontal (VanEdenetaí,1987; SéguélaetaL, 1988; Verneyet al., 1990) y que estasneuronaspresentanreceptoresDl en sus dendritas(Retauxel al,1991a)y receptores11)2 enlasterminacionesdesus ramasaxonalesrecurrentes(Retauxet al,1991b).Thierry etaL (1986)hansugeridoquelosreceptoresDl son excitadoresen lacortezaprefrontaldelaratamientrasquelosreceptoresD2 son inhibidores. Además, resultadospreviosdenuestrolaboratoriomuestranqueelaumentode laconcentraciónde GLU inducidoporapormofinase atenúatrasel bloqueodelosreceptoresdeDA con haloperidol.Todosestoshechosnos hacensugerir que la apomorfinainduce un aumentode la concentracióndeCLU en la corteza preftontal mediante laestimulaciónde receptoresDl situadosen lasdendritasde lasneuronaspiramidales.
El hecho de que la aplicación deapomorfina produzca un aumento de laconcentraciónde CLU sólo a unade las dosisutilizadas (la intermedia) es de dificilexplicación, dado lo semejantesque son lasdosis que producen efectos adversos. Sinembargo, se pueden discutir variasposibilidades.
90
Discusión
La apomorfina es un agonista de losreceptoresdopaminérgicosDl y D2. Comoyasehacomentado,los efectosde laestimulaciónsimultáneade varios tipos de receptoresde unneurotransmisor(en estecaso la DA) puedensercualitativamentediferentesdelosefectosdela estimulaciónde cadauno de esostipos dereceptorespor separado(ver elapartado2 1 deeste capítulo).Aunqueesta posibilidadno hasido estudiadapornosotros,se puedeespecularacercadel hechode queel efectoobtenidotraslaaplicación deapomorfinaseael resultadodeun balanceentre losefectosde ambostipos dereceptores.
La existenciade interacciones múltiplesentrediferentesneurotransmisoresen lacortezaprefrontal puede contribuir, también, a laexistenciade un efectodela apomorfinasobreel CLI] en un rangotan estrechode dosis. Dehecho, la apomorfina produce también unincrementode la concentraciónextracelulardeCABA (estaTesis), cuyos efectos sobre lasteralinacionesglutamatérgicasson inhibidores.Además,el efectoinhibidor de laDA sobrelasneuronaspiramidalesde la cortezaprefrontaldescntoclasicamente(ver p. ej. Mora el al,1976) estámediado, en parte, por neuronasgabérgicas(Pirot el aL, 1992). De hecho, laestimulacióndereceptoresde DA enla cortezaprefrontal produceun aumentode la tasa dedisparo de potenciales de acción de lasneuronasgabérgicasy un incremento de lospotencialespostsináptieosinhibidoresmedidosen las neuronaspiramidalesque son expresiónde la actividad de las neuronasgabérgicas(Penit-Soriael al., 1987). Todo ello sugierequelos efectosdelaapomorfinasobreel CLI]podrian estar modulados por el CABAliberado.Por tanto, la interacciónentreDA yCABA podría contribuir a explicar laexistenciadeun efectode la apomorfinasobreelCLI] enun rangotanestrechodedosis.
2.22. InteracciónDA-CABAen la cortezaprefrontaldela rata
Nuestrosresultadosmuestran,por primeravez, que la estimulaciónde los receptoresdeDA en la cortezaprefrontalde la rataproduce,in vivo, un aumento de la concentraciónextracelulardeCABA.
El aumentode la concentraciónde CABAtras la estimulaciónde los receptoresde DApuededeberseaun aumentode suliberaciónoauna disminuciónde su recaptación.En estetrabajo no se han estudiadolos mecanismoscelularesimplicadoseneste efecto.Puestoqueesta es la primera descripción de estefenómeno,labibliograflatampocoaportadatosque puedanayudarnosa explicar este hecho.Seria necesario realizar experimentos paraestudiarsiel aumentodelasconcentracionesdeCABA en la cortezaprefrontal se debea unaliberaciónvesicularo citoplasmática.
En todo caso, ei aumento de laconcentraciónde CABA tras la aplicación deapomorfina en la corteza prefrontal escoherentecon los resultadosobtenidosporotros autorescondiferentestécnicas.Así, sehademostradoque la estimulaciónde receptoresde DA produceliberaciónde CABA fi vitro(Reteuxel al, 1991)y aumentode la tasadedisparo de potenciales de acción de lasneuronasgabérgicas(Penit-Soriael al, 1987).Ello, junto conelhechodequeel aumentodeCABA inducido por apomorfinaes atenuadopor el bloqueode ¡os receptoresde DA conhaloperidol (resultadosno mostradosen estaTesis),sugierequeesteefectoestámediadoporreceptores de DA. Aunque, en nuestroconocimiento, no existen descripcionesquedemuestrende forma consistentela presenciadereceptoresdeDA enlasneuronasgabérgicasde la cortezaprefrontal de la rata, nuestrosresultadosy elhechodeque las terminaciones
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Discusión
dopaminérgicasy gabérgicasconverjansobrelasneuronaspiramidalesde lacorteza,sugierenestaposibilidad.
2.3. INTERACCIÓNDENEUROTRANSMISORES
YENVEfECAllENTÉ)
2.3.1.Sobrelasd4ficultadesdeinterpretacióndelosestudiossobreenvejecimiento
En la investigaciónsobre el procesodeenvejecumniento existen varios factores quecontribuyenacomplicarla interpretacióndelosresultadosqueseobtienen.Entreestosfactorescabe señalar, por ejemplo, las posiblesdiferenciasen el proceso de envejecimientoentrelas especies,y tambiénentrelas razas,delos animalesde experimentaciónempleados.Pero el principal obstáculo con que seencuentranlos estudios sobre envejecimientoreside en la propia dificultad de definir defonnaprecisacuándoempiezala senectud.Lautilización de la edadcronológicacomofactordefinidor de envejecimientono esuna buenamedida De hecho, algunos cambios, oausencia de ellos, descritos en animales“viejos’ puedenserdebidosa utilizar animalesde edad no suficientemente avanzada.Igualmente,el hecho de utilizar animalesdeedad muy avanzada puede llevar aconclusioneserróneas,ya que los resultadospuedenestarsesgadospor la selecciónaquehan sido sometidos dichos individuos. Sinembargo, mientrasno tengamosmarcadoresbiológicosde vejez (si existen),la edades elúnico parámetro de que disponemosparadelimitaresteperiodo.
Unaforma de evitar, en algunamedida,elproblemade detenninarcuándo comienzaelproceso de envejecimiento, es estudiar losparámetrosobjeto de investigaciónen variosgruposdeedad.Porello, enestaTesisDoctoralse han utilizado tres gruposde animalesdediferenteedad:lasratasde2 a3 mesesdeedad
de la razaWistar son animalesadultosy seutilizaroncomogrupocontrol.LasratasWistarde 11 a 14 mesesde edadson animalesqueempiezana perdersucapacidadreproductoraporello seutilizaron comogrupode adultosdeedadavanzadaperoqueno sepuedeconsiderarque hayanentradoya en la vejez. Las ratasWistar de más de 21 meses de edad seutilizaroncomogrupodeanimalesviejos.
Otro aspectoimportantequeinterfiereenlainterpretaciónadecuadade los estudiossobreenvejecimientoes el sesgointroducidoen losresultados por variables ambientalesy porpatologíasasociadas.En algunasocasionesnose puedediscerniracercade siun detenninadocambio se debe al propio envejecimiento,alentornoqueharodeadoal individuo o aalgunaenfermedadconcomitante. En eí caso deltrabajo experimental realizado en esta TesisDoctoral, se deben discutir los resultadosteniendo presente que los animales deexperimentaciónestánsometidosacondicionesno ‘normales”: con poco espacio paradeambular, con comida ad libitwn, contemperaturay humedadambiental estables,etc.; en resumen,en un ambienteque podríadefinirsecomo-pobreen estimulos.Pordecirlode otra forma, cabe preguntarsesi nuestrosresultados sobre envejecimiento se hanobtenidodeanimalessometidosaun envejecer“no normal” y si esto puede influir en lasconclusionesquedebemosextraerdeellos.
Losresultadosqueaquíse discutenacercadel efecto del envejecimiento sobre lainteracción de neurotransmisoresdeben serinterpretadosdesdeestaperspectiva
23.2EfectodelenvejecimientosobrelasconcentracionesextracelularesdeGLU~GABAyGLN
Los resultadospresentadosen esta TesisDoctoral muestran que las concentracionesextracelulares de CLU, CABA y CLN
92
Discusión
obtenidascon nuestro métodoen condicionesbasalesno varían significativamentecon laedadni en elestriadoni en lacortezaprefronta]dela rata
Comoyase ha comentado(verel apanadodcdiscusiónde los métodos),no se hapodidodemostrarde forma consistenteel origende lasconcentracionesde aminoácidosobtenidascontécnicasde perflisión intracerebral(push-pullodiálisis). Por tanto, el análisis de lasconcentracionesextracelularesde aminoácidosduranteelenvejecimientodebeserinterpretadobajo esta perspectiva.En todo caso, debesefíalarseque, aunqueno podemosdeterminarcon seguridad el origen celular de losaminoácidos analizados, el análisis de suconcentraciónextracelularesun indicadorde lacantidaddeGLU y CABA disponibleparaserliberado(ya seaatravésdeexocitosiso atravésdel transportadorneuronaloglial).
En relación con el GLU, nuestrosresultadoscoinciden con los trabajos publi-cados previamente por varios laboratorios,utilizando técnicasdiversasy tanto en estriadocomoen cortezaprefrontal(ver p. ej. Dawsonet al., 1989; Cobo el al., 1992; Palinercí al,1994; Sánchez-Prietoet al., 1994; SaransaariyOja, 1994). Este hecho podría interpretarsecomo un reflejo de que las neuronasglutamatérgicasno se venafectadasduranteelproceso de envejecimiento o, si se producemuertede estasneuronas,existenmecanismosquelacompensan.
En relación con el CABA, en nuestroconocimiento,no existentrabajosqueestudienlaconcentraciónextracelulardeCABA duranteel envejecimiento.Nuestroresultadospodríansugerirque lasneuronasgabérgicasno se venafectadaspor el procesode envejecimientoo,en casocontrario,queexistenmecanismosquecompensan una posible pérdida de estasneuronas.Sin embargo,las limitacionestantode latécnicapush-pull(ya comentadas),como
de nuestrométodode análisis de CABA (lasconcentracionesde CABA obtenidas seencuentrancercanasal límite de deteccióndenuestrométodo)no nos permitendiscutir másalláestosresultados.
El mantenimiento de las concentracionesde GLN con elenvejecimientodescutasen estaTesis Doctoral resulta coherente con laestabilidad descrita para los aminoácidosneurotransinisoresCLU y CABA de los queesprecursor. En estudios previos de nuestrolaboratorio se describió la existenciade unaconcentraciónextracelularde(ILN mayoren lacortezaprefrontaly temporalderatasviejasencomparacióncon ratasjóvenes(Cobo el al,1992). Nuestrosresultadosactuales,utilizandoun grupomásdeedady la técnicadepush-pullcontinuo, no confirman aquellos resultadospreliminaresparala cortezaprefrontal
2.3.3. Interaccióndeneurotransmisoresyenvejecimiento:estudiosen elestriadodela rata
Los resultadospresentadosen esta TesisDoctoral muestran que la aplicación deapomorfina produce un aumento de lasconcentracionesde CLU y CABA en elestriadode la ratajoven y que tal efecto seencuentraatenuadoen las ratasde edadmediay viejas.
Aunqueno conocemoslosmecanismosporlosquelaapomorfinaproduceesteaumentodeGLU y CABA en el estriado, la bibliograflanos permite sugerir que está mediadopor laestimulaciónde los receptoresde DA. A lavista de esta hipótesis, la disminución delefecto de la apomorfinasobre las concen-tracionesde CLU y CABA puede explicarsepor unadisminuciónde la cantidadde CLI] oCABA disponiblepara ser liberado (por lasneuronaso por las célulasgliales) o por unadisminuciónde la capacidadde los receptoresdeDA paraserestimulados.
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Discusión
La bibliografia revisada y los datospresentadosen esta Tesis Doctoral sugierenquelacantidaddeCLI] y CABA disponibleenel cerebro se conserva durante el enveje-cimiento(vermásarriba).
Por otra parte,uno de los hechosmejordemostradosenrelación conel envejecimientocerebral es la disminución de la densidaddereceptoresdeDA envariasáreascerebrales.Enconcreto,en relaciónconel estriadode la rata,todoslos autorescoinciden en describir unadisminución de receptores D2 indepen-dientementede la técnicautilizada (ver p. ej.Ciorgi et al., 1987; Hyttel, 1987; 1-lan er aL,1989; Morelli el al., 1990; Muxray yWaddington, 1991; se puede consultar larevisión de Joseph el aL, 1990). Máscontrovertidaes la disminucióndel númerodereceptoresDl, ya que algunos autores ladescriben(ver p. ej. Hyttel, 1987; Morelli elaL, 1990), perootros no la detectan(verp. ej.MurrayyWaddington,1991). Entodocaso,seha sugeridoqueladisminucióndel númerodereceptoresdeDA duranteel envejecimientoseproduce tanto por muerte de neuronasqueexpresanestos receptores(Han el al., 1989)como por disminución de su síntesisen lasneuronassupervivientes(Mesco el aL, 1991;Ciorgi el aL, 1992).
Por otra parte,otros autoreshan descritopreviamenteque otro fenómenoobtenidotrasla aplicación de apomorfina(la inhibición inviti-o de la liberación de acetilcolinainducidapor FC) también se atenúa con el enve-jecimiento(Thompsonel aL, 1984). Tambiénla conducta inducida por la administraciónsistémicade apomorfinaabajasdosis(queestámediadaporreceptores02) disminuyeduranteelenvejecimiento(StoesslelaL, 1989).
A la vistade estosdatosse puedesugerirque el deterioro de la interacciónentre DA,CLI] y CABA en el estriadoproducidopor elenvejecimientose debe, fbndamentalmente,a
la disminución del número de receptoresdeDAenesteáreacerebral
23.4 Interacciónde neurotransmisoresyenvejecimiento:estudiosen la cortezaprefrontalde la rata
Los resultadospresentadosen esta TesisDoctoral muestran que la aplicación deapomorfina produce un aumento de lasconcentracionesdeCLI] y CABA enlacortezaprefrontal de la ratajoven y que tal efectoseencuentraatenuadoen las ratasdeedadmediay nejas.
Aunqueno conocemoslosmecainsmosporlos que la apomorfina produce este aumento deCLI] y GABA en la corteza prefronta], labibliografla nos permite sugerir que estámediadopor la estimulaciónde los receptoresde Dít A la vista de esta lúpótesis, ladisminucióndel efectode laapomorfinasobrelas concentracionesde GLU y CABA puedeexplicarsepor unadisminuciónde la cantidadde CLI] o CABA disponibleparaserliberado(por lasneuronasopor lascélulasgliales)o poruna disminución de la capacidad de losreceptoresdeDA paraserestimulados.
Tanto la bibliografla revisada como losdatos presentadosen esta Tesis Doctoralsugierenque la cantidad de CLU y CABAliberado, tanto en condicionesbasalescomotras la estimulaciónde la liberación de estosneurotransmisoresse mantienea lo largo delenvejecimiento (ver p. ej. Dawson el aL, 1989;Cobo el al., 1992; Palmer el aL, 1994;Sánchez-Prietoce al., 1994; Saransaany Oja,1994).
Por otra parte,aunqueno existen trabajossobrela densidadde receptoresde DA en lacortezaprefrontalduranteelenvejecimiento,sísehadescritounadisminuciónde la respuestaala estimulacióndel receptorDl en la cortezaprefrontalde ratasviejas (Parfltt el aL, 1990).La bibliografla no nospermite determinarsi
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Discusión
estadisminucionen la respuestase debea unadisminucionen la densidadde estosreceptoreso aotrascausas(p. ej unadisminuciónde suafinidado alteracionesen los segundosmensa-jerosactivadosporellos).
Con estos datos se puede sugerir que eldeterioro de la interacciónentreDA, GLU yCABA en la cortezapreftontalproducidoporel envejecimientose debe,fimdamentalniente,a la disminuciónde la respuestaa laestimula-cióndereceptoresde DA enesteáreacerebral.
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CONCLUSIONES
PRIMERA CUARTA
La aplicación intracerebralde apomorfinaproduce un aumento de la concentraciónextracelularde CLU en el estriadode la rataadultajoven. Sugerimosqueesteefectose debeaquela apomorfinaestimulareceptoresde DAsituados en las tenninaciones nerviosasglutamatérgicasy/o en las célulasglialesy estaactivación induce la inversión del sentido deltransportedeCLII
SEGLINDA
La aplicaciónintracerebralde apomorfinaproduce un aumento de la concentraciónextracelulardeCABA en el estriadodela rataadultajoven. Sugerimosqueesteefectosedebea quelaapomorfinaestimulareceptoresde DAcon efecto excitador localizados en lasneuronasgabérgicasdel estriado.
TERCERA
El aumentodelasconcentracionesdeCLUy CABA en el estriado de la rata tras laaplicaciónde apomorfinase ve atenuadocomoconsecuenciadel procesodeenvejecimiento.
La atenuacióndel efectodela apomorfmasobrelasconcentracionesde CLU y CABA sepuedeatribuira ladisminucióndel númerodereceptores de DA en el estriado comoconsecuenciadel procesodeenvejecimiento.
La aplicaciónintracerebralde apomorfinaproduce un aumento de la concentraciónextracelulardeCLU en la cortezaprefrontaldela rataadultajoven. Sugerimosqueesteefectose debe a que la apomorfina estimulareceptores de DA con efecto excitadorlocalizadosen las neuronaspiramidalesde lacortezaprefrontal o en las tenninacionesde lasramasrecurrentesdesusaxones.
QUINTA
La aplicación intracerebralde apomorfinaproduce un aumento de la concentraciónextracelulardeCABA en la cortezaprefrontalde la rata adulta joven. Sugerimosque esteefectose debea que la apomorfinaestimulareceptores de DA con efecto excitadorlocalizadosen las neuronasgabérgicasde lacortezaprefrontal.
SEKFA
El aumentodelas concentracionesdeCLUy CABA en lacortezaprefrontaldela ratatrasla aplicación de apomorfinase ve atenuadocomo consecuenciadel proceso de enveje-cimiento.
La atenuacióndel efectode la apomorfinasobrelas concentracionesdeCLU y CABA sepuede atribuir a una disminución de larespuestaa la estimulación de receptoresdeDA en la corteza prefrontal comoconsecuenciadel procesode envejecimiento.
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