Ruhr-Universität Bochum

Prof. Dr. med. Baptist Gallwitz

Dienstort: Eberhard-Karls-Universität Tübingen

Universitätsklinikum

Medizinische Klinik IV

Insulinotrope Wirkung von Gastric Inhibitory Polypeptide

bei Patientinnen nach normalisiertem Gestationsdiabetes im Vergleich zu

stoffwechselgesunden Patientinnen

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin

einer Hohen Medizinischen Fakultät

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Meik Askenas

aus Bielefeld

2007

Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. B. Gallwitz Koreferent: Priv.-Doz. Dr. med. B. Henning Tag der Mündlichen Prüfung: 02.12.2008

Meiner Familie gewidmet

1

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung S. 5

1.1 Die Bedeutung der Inkretine S. 5

1.2 Gastric Inhibitory Polypeptide (GIP) S. 6

1.2.1 Metabolisierung und Eliminierung von Gastric Inhibitory Polypeptide S. 11

1.3 Die entero-insuläre Achse beim Diabetes mellitus Typ 2 S. 12

1.4 Grundlagen und Pathophysiologie des Gestationsdiabetes (GDM) S. 14

1.5 Diagnostisches Vorgehen beim Gestationsdiabetes S. 18

1.6 Komplikationen des Gestationsdiabetes bei Mutter und Kind S. 20

1.7 Fragestellung der Arbeit S. 22

2 Material und Methoden S. 23

2.1 Studienprotokoll S. 23

2.2 Probandinnen-Charakteristika S. 23

2.2.1 Voruntersuchungen und Ermittlung der Einschlusskriterien S. 24

2.3 Durchführung des Versuchs S. 25

2.3.1 Oraler Glukose Toleranztest S. 26

2.3.2 GIP-Bolus-Test S. 26

2.4 Blutentnahmen S. 26

2.5 Aufbereitung der Blutproben zur Hormon- und Glukose-Bestimmung S. 27

2.6 Infusionslösungen S. 27

2.7 Messungen S. 28

2.7.1 Plasma-Glukosekonzentrationen S. 28

2.7.2 Hormonbestimmungen S. 28

2.7.2.1 C-Peptid-ELISA S. 29

2.7.2.2 Insulin-ELISA S. 30

2.7.3 Prinzip des Radioimmuno-Assays S. 31

2.7.3.1 Bestimmung des Gesamt-GIP im Plasma S. 32

2.7.3.2 Quantifizierung von GIP [1-42 Amid] S. 32

2

2.8 Berechnungen S. 33

2.8.1 Statistische Auswertung S. 33

2.8.2 Anthropometrische Berechnungen S. 34

2.8.2.1 Body-Mass-Index S. 34

2.8.2.2 Waist-to-Hip-Ratio S. 35

2.8.3 Berechnung von Insulinresistenz und β-Zell-Funktion S. 35

3 Ergebnisse S. 37

3.1 Probandencharakteristika S. 37

3.2 Klinisch-chemische Laborparameter S. 38

3.3 Ergebnisse des oralen Glukosetoleranztests (oGTT) S. 40

3.3.1 Glukose-Konzentrationen im Plasma nach oGTT S. 40

3.3.2 Insulin-Konzentrationen im Plasma nach oGTT S. 41

3.3.3 C-Peptid-Konzentrationen im Plasma nach oGTT S. 42

3.3.4 GIP-Konzentrationen im Plasma nach oGTT S. 43

3.4 Ergebnisse des GIP-Bolustests S. 45

3.4.1 Glukose-Konzentrationen nach GIP-Bolusgabe S. 47

3.4.2 Insulin-Konzentrationen nach GIP-Bolusgabe S. 48

3.4.3 C-Peptid-Konzentrationen nach GIP-Bolusgabe S. 48

3.5 Ergebnisse Indices für Insulinsensitivität und β-Zell-Funktion S. 49

4 Diskussion S. 51

5 Zusammenfassung S. 60

6 Literaturverzeichnis S. 62

7 Danksagungen

8 Curriculum vitae

3

Abkürzungen

Abb. Abbildung Ala Alanin AP Alkalische Phosphatase Arg Arginin Asn Asparagin Asp Asparaginsäure BMI Body-Mass-Index bzw. beziehungsweise cAMP Zyklisches Adenosin-3`,5`-monophosphat cm Zentimeter C Kohlenstoff CRP C-reaktives Protein Cys Cystein dl Deziliter DPP IV Dipeptidyl-Peptidase IV EDTA Ethylendiamintetraacetat ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay γGT Gamma-Glutamyltranspeptidase

g Gramm GDM Gestational Diabetes Mellitus (Gestationsdiabetes) GIP Gastric Inhibitory Polypeptide, Glucose-dependent Insulinotropic

Polypeptide Gln Glutamin GLP-1 Glucagon-like Peptide 1 Glu Glutaminsäure GLUT Glukosetransporter Gly Glycin GOT Glutamatoxalacetattransaminase GPT Glutamatpyruvattransaminase H Wasserstoff Hb Hämoglobin HbA1c Glykiertes Hämoglobin HCG Humanes Choriongonadotropin HDL High Density Lipoprotein His Histidin HLA Human Leucocyte Antigen HOMA Homeostasis Model Assessment HWZ Halbwertzeit IE Internationale Einheiten IGT impaired glucose tolerance (eingeschränkte Glukose-Toleranz) Ile Isoleucin i.v. intravenös ISI Insulin-Sensitivitäts-Index J Jod kDa Kilodalton kg Kilogramm KG Körpergewicht

4

l Liter LDL Low Density Lipoprotein Leu Leucin li links Lys Lysin m2 Quadratmeter Met Methionin mg Milligramm min Minute ml Milliliter mmHg Millimeter Quecksilbersäule mmol Millimol µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer N Stickstoff NaF Natriumfluorid NIDDM non-insulin-dependent Diabetes mellitus ng Nanogramm O Sauerstoff oGTT oraler Glukose-Toleranztest Phe Phenylalanin pmol Picomol Pro Prolin r Korrelationskoeffizient nach Pearson re rechts RIA Radioimmuno-Assay RR Blutdruck nach Riva-Rocci S Schwefel SD Standardabweichung SEM Standardfehler des Mittelwertes Ser Serin SSW Schwangerschaftswoche Tab. Tabelle Thr Threonin Trp Tryptophan Tyr Tyrosin U Unit (Einheit) u.a. unter anderem Val Valin VIP Vasoaktives Intestinales Peptid WHR Waist-to-Hip-Ratio

5

1 Einleitung

1.1 Die Bedeutung der Inkretine

Die Insulinsekretion nach Aufnahme einer Mahlzeit wird durch hormonale und neurale

Faktoren beeinflusst (Creutzfeld und Ebert, 1985). Daraus entwickelte sich der Begriff

der enteroinsulären Achse, der das regulierende System der gastrointestinalen Peptide

auf die Inselfunkton beschreibt (Creutzfeld, 1979; Abb. 1). Für diese die

Insulinsekretion stimulierenden Substanzen legten Zunz und La Barre 1929 den Begriff

der „Inkretine“ fest (Zunz und La Barre, 1929). Später wurden die beim Menschen

wichtigen Inkretine identifiziert, die im Gastrointestinal-Trakt produziert und nach

Nahrungsaufnahme freigesetzt werden, und die die Insulinsekretion stimulieren

(Creutzfeld, 1987). Der Inkretin-Effekt ist maßgeblich daran beteiligt, dass nach oraler

Gabe von Glukose erheblich mehr Insulin sezerniert wird als der Konzentrationsanstieg

von z.B. intravenös gegebener Glukose allein im Stande wäre. Bereits Anfang des 20.

Jahrhunderts gab es Hinweise darauf, dass Extrakte aus Dünndarmmukosa die

Insulinsekretion stimulieren können (Moore et al., 1906). Eine Quantifizierung des

Effektes und Charakterisierung der verantwortlichen Hormone war jedoch erst mit der

Möglichkeit der radioimmunologischen Messung der Insulinkonzentrationsverläufe

möglich.

Zu den Inkretin-Hormonen zählen neben Gastric Inhibitory Polypeptide (GIP) bei

anderen Spezies auch Sekretin, Vasoaktives Intestinales Peptid (VIP), Cholezystokinin

(CCK), Gastrin-Releasing Peptide (GRP) und Glucagon-like Peptide (GLP-1) (Unger

und Eisentraut, 1969; Ebert und Creutzfeld, 1987; Dupré, 1991), jedoch nehmen

hinsichtlich der Stimulierung der Insulinsekretion lediglich GIP und GLP-1 beim

Menschen eine wichtige Stellung ein (Nauck et al., 1989; Kreymann et al., 1987).

6

Abb. 1: Die entero-insulinäre Achse. CHO: Kohlenhydrate, AA: Aminosäuren, FA: Fettsäuren.

Aus: Creutzfeldt (1979): The incretin concept today. Diabetologia 16, 75-85.

1.2 Gastric Inhibitory Polypeptide (GIP)

Kosaka und Lim demonstrierten anhand der i.v.-Gabe eines Extraktes der porcinen

Dünndarm-Mukosa die Inhibierung der Magensäuresekretion und Magenentleerung,

worauf sie diese Substanz als „Enterogastron“ bezeichneten, das später als Gastric

Inhibitory Polypeptde (GIP) identifiziert wurde (Kosaka und Lim, 1930). In weiteren

Studien wurde darüber hinaus in Tierversuchen eine Inhibierung der Pepsin- und

Gastrinsekretion und der Peristaltik von Antrum und Korpus des Magens durch porcines

GIP nachgewiesen (Pederson und Brown, 1972).

Johnson und Grossman (Johnson und Grossman, 1969) definierten den Begriff

„Enterogastron“ später für sämtliche Hormone, die durch einen physiologischen

Stimulus aus der Dünndarm-Mukosa freigesetzt werden und ähnliche Effekte auslösen,

wie z.B. Sekretin, Enteroglukagon und Peptid YY (Wolfe und Soll, 1988). GIP wurde

aus porciner Dünndarmmukosa erstmals 1969 isoliert (Brown et al., 1969). Die

cholinerge Stimulation mit Bethanechol, ein selektiv auf die glatte Muskulatur des

Darmes wirkender Carbaminsäureester, verhindert die säureinhibierenden

Eigenschaften des GIP (Soon-Shiong et al., 1984). Zunächst wurde GIP daher als

“Gastric Inhibitory Polypeptide“ bezeichnet, um seine Funktion als Inhibitor der

7

Magensäuresekretion zu verdeutlichen. Da dies jedoch bisher nur im Tierversuch

nachgewiesen werden konnte, erhielt es als Inkretinhormon das Synonym „Glucose-

dependent Insulinotropic Polypeptide“. Eine Arbeit von Meier et al. 2004 konnte beim

Menschen keinen hemmenden Effekt von GIP auf die Magenentleerung nachweisen

(Meier et al., 2004a). Die maßgebliche Wirkung von GIP beim Menschen besteht

hingegen in einer Stimulation der Insulinsekretion (Pederson und Brown, 1978).

Zusammen mit Glukagon-like-Peptide-1 (GLP-1) trägt GIP zu etwa 60 % der

postprandialen Insulinsekretion bei. Eine signifikante insulinotrope Wirkung kann das

Hormon aber nur im hyperglykämischen Bereich entfalten (Dupré et al., 1973; Nauck et

al., 1986a).

Buffa et al. (1975), Solcia et al. (1975) und Capella et al. (1976) identifizierten die GIP-

produzierenden Zellen als granulahaltige K-Zellen. Die höchste Konzentration an GIP

findet man im Jejunum (Bloom, 1974). K-Zellen sind in besonders hoher Dichte in den

mittleren Abschnitten des Duodenums bis ins Jejunum lokalisiert (Polak et al., 1973),

auch wurden beim Menschen Zellen bis ins terminale Ileum gefunden (Ferri et al.,

1983; Thomas et al., 1977).

Brown und Dryburgh entschlüsselten die Sequenz des Hormons mit 43 Aminosäuren

(Brown und Dryburgh, 1971) (Abb. 2).

Dipeptidylpeptidase IV

⇓⇓⇓⇓

[TYR]~[ALA]~[GLU]~[GLY]~[THR]~[PHE]~[ILE]~[SER]~[ASP]~[TYR]~ [SER]~[ILE]~[ALA]~[MET]~[ASP]~[LYS]~[ILE]~[HIS]~[GLN]~[GLN]~ [ASP]~[PHE]~[VAL]~[ASN]~[TRP]~[LEU]~[LEU]~[ALA]~[GLN]~[LYS]~ [GLY]~[LYS]~[LYS]~[ASN]~[ASP]~[TRP]~[LYS]~[HIS]~[ASN]~[ILE]~ [THR]~[GLN] Abb. 2: Aminosäuresequenz der humanen Form von Gastric Inhibitory Peptide (modifiziert nach

Moody et al., 1984). Der Pfeil verweist auf die Position, an der in vivo die Spaltung durch das Enzym

Dipeptidyl-Peptidase IV erfolgt (Kieffer et al., 1995; Mentlein et al., 1993).

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Das humane GIP-Gen ist auf dem kurzen Arm des Chromosoms 17 (17q21.3-q22)

lokalisiert (Inagaki et al., 1989). Unmittelbar upstream des GIP-Gens liegt ein Promoter,

der die Genexpression gewebespezifisch und glukoseregulierend kontrolliert.

Abb. 3: Lokalisation des humanen GIP-Gens auf dem kurzen Arm des Chromosoms 17. Die Pfeile geben

den Bereich des Chromosoms an, der für GIP kodiert. Bildmaterial mit freundlicher Genehmigung von

GeneCards.org am 05.11.2006 (Quelle: www.genecards.org/pics/loc/GC17M044390.GIP.png).

Die radioimmunologisch messbaren GIP-Konzentrationen im Plasma sind bei

nüchternen Versuchspersonen niedrig und steigen nach Mahlzeiten (Kuzio et al., 1974),

isolierter oraler Gabe von Glukose (Cataland et al., 1974), anderen Zuckern (Sykes et

al., 1980), Aminosäuren - hier besonders nach einem Gemisch der Aminosäuren

Arginin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin und Threonin (Thomas et al., 1976 und

1978) - sowie Fetten (Brown et al., 1974) deutlich an. Da die Magenentleerung durch

Proteine in der Nahrung verzögert wird, ist bei gleichzeitiger Aufnahme von Glukose in

Verbindung mit Proteinen der postprandiale Glukose-Plasmaspiegel deutlich

vermindert, obwohl auch Proteine die Sekretion von Inkretinen und die

glukoseunabhängige Insulinausschüttung fördern (Karamanlis et al., 2007).

Bei fettreichen Mahlzeiten sind zwei Maxima der GIP-Sekretion messbar (Brown,

1974). Nach der verzögerten Antwort der GIP-Freisetzung auf Fette werden im

Gegensatz zur Glukose-Ingestion größere Mengen GIP sezerniert (Brown und Otte,

1978), die auch am ehesten auf die verzögerte Magenentleerung bei fettreichen

Mahlzeiten zurückzuführen sind. Die nach Lipolyse entstehenden langkettigen

Fettsäuren stellen den Stimulus für die GIP-Freisetzung dar (O`Dorisio et al., 1976;

Sirinek et al., 1974). Darüber hinaus stimuliert GIP die Glukagonsekretion (Opara und

Go, 1991; Meier et al., 2003).

Das N-terminale Ende des GIP-Moleküls ist für die Rezeptorbindung des Hormons

verantwortlich (Gallwitz et al., 1993). Über die Bindung an den G-Protein-gekoppelten

GIP-Rezeptor wird eine Signalkaskade aktiviert, bei der über eine Änderung des

9

Membranpotentials eine Aktivierung der Adenylatzyklase bewirkt wird, was zu einer

konzentrationsabhängigen Erhöhung der intrazellulären Kalzium- und cAMP-Spiegel

und schließlich zu einem Effektorsignal (in diesem Fall die Insulinsekretion) führt

(Gespach et al., 1984; Amiranoff et al., 1985; Siegel und Creutzfeld, 1985; Gromada et

al., 1995; Ding und Gromada, 1997). Der GIP-Rezeptor ist ligandenspezifisch, d.h. GIP

lässt sich nicht durch andere Hormone, wie z.B. GLP-1 [7-36 Amid], vom Rezeptor

verdrängen. Der Rezeptor ist ein Protein mit 64 kDa (Couvineau et al., 1984) und wird

von pankreatischen Inselzellen, Darmepithel, Fettgewebe, Herzmuskelzelle, von der

Hypophyse, im Knochenmark, in der Nebennierenrinde und im Gehirn gebildet

(Fehmann et al., 1995a). Molekulargenetische Studien wiesen Variationen in der

Sequenz des GIP-Rezeptors nach, die jedoch ohne klinische Relevanz blieben (Kubota

et al., 1996; Almind et al., 1998). GIP [1-42 Amid] und GLP-1 [7-36 Amid] zeigen

einen additiven Effekt auf die glukoseabhängige Insulinfreisetzung (Siegel et al., 1992;

Nauck et al., 1993c), jedoch ist GLP-1 [7-36 Amid] in seiner Wirkung bezüglich

Signalinduktion und insulinotropem Effekt um ein Hundertfaches potenter (Kieffer und

Habener, 1999).

GIP kann über eine Depolarisation der β-Zellen Kalium- und Kalziumströme

modulieren (Ding und Gromada, 1997; Béguin et al., 1999) und vermittelt hierdurch

seine insulinotrope Wirkung. Ferner stimuliert es die Transkription und Translation des

Proinsulin-Gens (Fehmann und Göke, 1995b) sowie die Expression

zellmembranständiger Glukosetransporter und der Hexokinase in den β-Zellen (Wang et

al., 1996).

Weitere anabole Funktionen sind die Aktivierung der Lipoproteinlipase im Fettgewebe,

Hemmung der Glykogenolyse in der Leber und Hemmung der Glukose-Freisetzung

(Beck, 1989).

Daneben übt GIP auch eine modulierende Mediatorfunkton im Knochenstoffwechsel

aus. So werden GIP-Rezeptoren in Osteoblasten exprimiert. GIP supprimiert den Abbau

von Knochengewebe in vitro durch Aktivitätshemmung der Osteoklasten. Im Hinblick

auf die herabgesetzte Wirksamkeit von GIP beim Diabetes mellitus Typ 2 könnte so der

mit dem bei Patienten mit Typ-2-Diabetes erhöhte Knochenumsatz erklärt werden

(Zhong et al., 2007). Auch die Stromazellen des Knochenmarks bilden GIP-Rezeptoren.

Mit dem Alter nimmt die Expression ab. Aktueller Stand der Forschung ist es, GIP

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dafür zu nutzen, mit einer exogenen Zuführung von GIP einen altersabhängigen

Knochenabbau und dem Erhalt der Knochendichte vorzubeugen (Ding et al., 2007).

Da GIP als wichtiges Inkretinhormon identifiziert wurde, wurde daraufhin versucht, den

Anteil von GIP am Inkretineffekt zu quantifizieren.

Hierzu wurde die Insulinsekretion nach oraler Glukosegabe mit der intravenösen

Infusion von GIP und Glukose verglichen. Erstaunlicherweise führte die exogene

Zufuhr von porcinem GIP und Glukose zwar zu messbaren Anstiegen der Plasma-

Glukosekonzentrationen und der GIP-Immunoreaktivität, die auch den Verläufen nach

oraler Glukosegabe weitgehend ähnelten, der hierdurch ausgelöste Anstieg der

Insulinkonzentrationen erreichte aber bei weitem nicht die gemessenen Konzentrationen

wie nach oraler Glukosegabe. Nur durch erheblich höhere Glukose- und GIP-

Infusionsraten konnte eine Steigerung der Insulinsekretion bewirkt werden, die die

Größenordnung der Insulinsekretion nach oraler Glukosegabe erreichte.

Jörnvall et al. entdeckten 1981, dass sich die Aminosäuresequenz des GIP aus

menschlicher Dünndarmmucosa hinsichtlich zweier Positionen (Aminosäuren 18 und

34) vom porcinen GIP unterschied (Jörnvall et al., 1981). Dies erklärt, dass in

Radioimmunoassays, deren Antikörper durch Immunisierung mit porcinem GIP

gewonnen wurden, GIP der humanen Sequenz nicht mit der gleichen Affinität an diese

Antikörper bindet (Amland et al., 1984).

Weiterhin bestehen Ähnlichkeiten zu den Aminosäure-Sequenzen von porcinem

Glukagon, GLP-1, Sekretin und Vasoaktivem Intestinalem Peptid (VIP), mit dessen

Antisera Polak et al. Kreuzreaktionen mit Antisera des porcinen GIP nachweisen

konnten (Polak et al., 1973, aus Addendum des Artikels).

Um die Wirksamkeit von GIP in physiologischen Konzentrationen zu charakterisieren,

sollten insulinotrope Effekte von GIP der humanen Aminosäuresequenz untersucht

werden. Endogen sezerniertes und exogen verabreichtes GIP sollten die gleiche

Immunreaktivität haben, der Radioimmunoassay wird mit GIP der humanen Sequenz

kalibriert: Die intravenöse Infusion von synthetischem humanen GIP in einer Dosierung

von 1 pmol . kg-1 . min-1 hebt die zirkulierenden GIP-Konzentrationen in den Bereich an,

wie er nach oraler Glukosegabe bei gesunden Normalpersonen durch endogene

Sekretion erreicht wird (Nauck et al., 1993c).

11

1.2.1 Metabolisierung und Eliminierung von Gastric Inhibitory Polypeptide

Die Dipeptidyl-Peptidase IV (DPP IV) ist eine hochspezifische Aminopeptidase, die

Dipeptide von den Peptiden N-terminal abspaltet, die Prolin (z.B. Substanz P) oder

Alanin (z.B. Gastrin Releasing Factor) in Position 2 des N-Terminus aufweisen

(Mentlein, 1988; Demuth und Heins, 1995). Die Affinität zu Prolin ist dabei bedeutend

höher als zu Alanin (Heins et al., 1988) und die Länge der Aminosäure-Kette spielt für

die Affinität des Enzyms ebenso eine Rolle (Bongers et al., 1992). Bei der Inaktivierung

von GIP [1-42 Amid] und GLP-1 [7-36 Amid] katalysiert DPP IV den ersten und

geschwindigkeitsbestimmenden Schritt (Mentlein et al., 1993).

Das Enzym DPP IV lässt sich im menschlichen Serum, auf der Oberfläche von

Endothelzellen, Hepathozyten und T-Lymphozyten, Darmepithelzellen sowie auf

Bürstensaummembranen der Niere nachweisen (Loijda, 1979; Elovson, 1980; Mentlein

et al., 1984; Nausch und Heymann, 1985; Mc Caughan et al., 1990; Yaron und Naider,

1993). Intaktes GIP wird ebenso wie GLP-1 primär hepatisch durch DPP IV inaktiviert

(Deacon, 2004). Die endgültige Clearance der GIP-Metabolite findet jedoch vorwiegend

in der Niere statt (O’Dorisio et al., 1977). Entsprechend ist die finale Eliminierung der

Metabolite bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz verzögert (Meier et al.,

2004 b). Durch sukzessive Spaltung erfolgt in vitro durch Aminopeptidasen die weitere

Degradierung des GIP [3-42 Amid] und führt zu den Spaltprodukten GIP [8-42 Amid],

[11-42 Amid], [12-42 Amid], [13-42 Amid], [15-42 Amid], [18-42 Amid], [21-42

Amid] und [22-42 Amid] (Pauly et al., 1996).

Die biologische Halbwertzeit (HWZ) von GIP liegt im Tierversuch bei annähernd 2 min

(Kieffer et al., 1995). Die Halbwertzeit von GIP beim Menschen nach exogener

Infusion wird mit durchschnittlich 20 Minuten beziffert (Elahi et al.; 1979; Sarson et al.;

1982; Kreymann et al., 1987; Nauck et al., 1993c). Diesen Bestimmungen liegen

allerdings Assays zugrunde, die mit dem C-terminalen Ende des GIP-Moleküls

reagieren und somit auch die oben erwähnten Spaltprodukte messen. Da für aktives GIP

[1-42 Amid] bisher noch kein spezifischer Assay verfügbar ist, existieren auch noch

keine Daten über die Plasma-HWZ des intakten Moleküls.

Tyr-Ala als N-terminales Ende des GIP-Moleküls ist für die Freisetzung von Insulin

notwendig (Schmidt et al., 1986 und 1987). Nach Spaltung durch DPP IV zu GIP [3-42

12

Amid] zeigten sich auch bei hohen Blutglukose-Spiegeln dieses Metaboliten keine

insulinotrope Aktivität (Jörnvall etg al., 1981), das Spaltprodukt GIP [3-42 Amid] wirkt

sogar antagonistisch am GIP-Rezeptor (Gault et al., 2002). Die Hemmung der DPP IV

bewirkte im Tierversuch eine Verbesserung der Glukosetoleranz (Deacon et al., 1998;

Pauly et al., 1999, Deacon et al., 2001). Der Austausch der Aminosäure an Position 2

des GIP-Moleküls bewirkte im Tierversuch eine längere biologische Aktivität, da dieses

modifizierte Molekül nicht von DPP IV hydrolysiert wird (Hinke et al., 2002).

1.3 Die entero-insuläre Achse beim Diabetes mellitus Typ 2

Die pathophysiologische Grundlage eines Typ 2-Diabetes besteht in einer Kombination

aus Störungen der Insulinsekretion und einer verminderten Wirksamkeit von Insulin auf

den Glukosestoffwechsel, der sogenannten Insulinresistenz (Olefski, 1981; DeFronzo et

al., 1985). Der Insulingehalt der Langerhans-Inselzellen des Pankreas ist nur gering

reduziert (Rahier et al., 1983). Trotzdem wird nach physiologischer (Polonsky et al.,

1986) oder pharmakologischer (Ward et al.,1986) Stimulation nur zögerlich Insulin

sezerniert (sog. Sekretionsstarre) (Pfeiffer, 1969). Durch die nicht zeitgerechte und

damit den metabolischen Bedürfnissen zu spät erfolgende Insulinabgabe kann die

Glukosehomöostase nicht aufrecht erhalten werden (Basu et al., 1996), was sich

klinisch-chemisch in erhöhten Blutzuckerspiegeln niederschlägt. Der Sekretionsdefekt

des Diabetes mellitus Typ 2 betrifft vorrangig die glukosestimulierte Insulinfreisetzung

(Brunzell et al., 1976; Ward et al., 1986).

Da der Inkretin-Effekt einen hohen Stellenwert in der Insulinsekretion nach oraler

Glukosegabe einnimmt (Perley und Kipnis, 1967; Nauck et al., 1986a; Nauck et al.,

1986b; Shuster et al., 1988; Tillil et al., 1988), ist auch die Sekretion und Wirkung der

Inkretine beim Diabetes mellitus Typ 2 eingehend untersucht worden.

Während GLP-1 bei Patienten mit Typ-2-Diabetes weiterhin als Inkretinhormon aktiv

bleibt, verliert GIP bei Typ-2-Diabetes unter Hyperglykämiebedingungen seine

insulinotrope Wirkung (Nauck et al., 1993a). Daraus leitete sich die Hypothese her, dass

der Typ-2-Diabetes durch eine Inhibierung der Expression des GIP-Rezeptors

charakterisiert ist, was folglich zu einem verminderten Inkretin-Effekt führt (Nauck et

13

al., 1986 b; Holst et al., 1997). Dies wurde auch durch weitere Beobachtungen an

diabetischen Ratten untermauert (Lynn et al., 2001). Ferner legen eine verstärkte

Genexpression bei diabetischen Ratten und damit einhergehende erhöhte GIP-

Serumspiegel die Vermutung nahe, dass bei Diabetes eine chronische

Desensibilisierung des GIP-Rezeptors induziert wird, was zu einer beeinträchtigten

Insulinsekretion führt (Tseng et al., 1996).

Die beim Typ-2-Diabetiker charakteristische Insulinresistenz ist auch bereits bei

gesunden erstgradig Verwandten zu finden (Vauhkonen et al., 1998; Ishikawa et al.,

1998; Elbein et al., 1999), bei denen der insulinotrope Effekt von GIP bei sonst noch

normaler Glukosetoleranz bereits vermindert ist (Meier et al., 2001). Sie haben generell

eine Hyperinsulinämie, die ihnen eine gewisse Kompensation gegenüber der peripheren

Insulinresistenz ermöglicht (Henriksen et al., 1994; Osei und Cottrell, 1994).

GIP ist bei Typ-2-Diabetikern im Vergleich zu Stoffwechselgesunden trotz erhaltener

Sekretion zu mehr als 50 % ohne insulinotrope Aktivität. Dies wurde sowohl unter der

intravenösen Gabe von porcinem (Amland et al., 1985; Jorde und Burhol, 1987;

Krarup et al., 1987) wie auch humanem GIP (Nauck et al., 1993a) in annähernd

physiologischen Spiegeln beschrieben, so dass, im Gegensatz zu Stoffwechselgesunden,

fast die gesamte Insulinsekretion allein durch die postprandiale Hyperglykämie

vermittelt wird.

Bei der Untersuchung einer größeren Anzahl von Typ-2-Diabetikern wurde jedoch auch

deutlich, dass die GIP-Antwort nach Mahlzeiten bei Typ-2-Diabetikern sehr variabel

sein kann (Krarup et al., 1987). Gegenüber Kontrollpersonen mit normalem

Glukosestoffwechsel wurden beim Typ-2-Diabetes sowohl reduzierte als auch über das

normale Maß hinausgehende GIP-Anstiege gefunden (Ebert und Creutzfeldt, 1980).

Inwieweit das individuelle Sekretionsmuster genetisch determiniert ist oder von

Variablen wie Ernährungsgewohnheiten abhängt, ist nicht bekannt. Es ist jedoch klar,

dass eine fehlende GIP-Sekretion nicht die alleinige Ursache der gestörten

Insulinsekretion beim Typ-2-Diabetes sein kann.

Im Gegensatz zu GIP ist exogenes GLP-1 in der Lage, bei Typ-2-Diabetikern den

Blutzucker bis in den euglykämischen Bereich abzusenken (Nauck et al., 1993 b; Nauck

et al., 1993 c). Dieser Effekt wird über die insulinotrope Wirkung des GLP-1 vermittelt,

die auch bei Typ-2-Diabetikern noch weitgehend erhalten ist (Nauck et al., 1993 a;

Nauck et al., 1993 b; Nauck et al., 1993 c). GLP-1 wird auch beim Typ-2-Diabetes nach

14

oraler Aufnahme von Glukose und nach Mahlzeiten regelrecht sezerniert (Crockett et

al., 1976; May und Williams, 1978; Nauck et al., 1986 b; Jones et al., 1995; Toft-

Nielsen et al., 2001; Vilsbøll et al., 2001)

In einigen Studien wurden gegenüber Normalpersonen unveränderte GIP-Anstiege

gefunden (Nauck et al., 1986 b), andere Untersuchungen berichteten über eine

gesteigerte GIP-Sekretion (Crockett et al., 1976), eine weitere Studie berichtet sogar

über erniedrigte GIP-Anstiege (Toft-Nielsen et al., 1999). Jones et al. (1989) zeigten

darüber hinaus, dass exogen appliziertes GIP aufgrund des erhöhten

Nüchternblutzuckerspiegels bei Diabetikern eine Insulinsekretion stimulieren kann.

1.4 Grundlagen und Pathophysiologie des Gestationsdiabetes (GDM)

Der Gestationsdiabetes (GDM - Gestational Diabetes Mellitus) ist definiert als eine

Glukosestoffwechselstörung mit erhöhten Glukosekonzentrationen, die erstmals

während einer Schwangerschaft entdeckt wird (Metzger und Coustan, 1998). Die

Definition trifft sowohl für einen insulinpflichtigen als auch einen diätetisch

behandelten Diabetes zu, und wenn der Zustand nach der Schwangerschaft weiter

besteht. Es schließt nicht die Möglichkeit aus, dass eine nicht erkannte

Glukoseintoleranz bereits vorher bestand oder begleitend mit der Schwangerschaft

begann.

Je nach Population und diagnostischen Möglichkeiten beträgt die Prävalenz des GDM

0,15-14 %, also durchschnittlich 7 % (Dooley et al., 1991; Tamas und Kerenyi, 2001,

American Diabetes Association, 2003). Laut Daten der „National Diabetes Data Group“

(1979), die unter anderem von Hadden (1985), Freinkel et al. (1985) und Gabbe (1986)

bestätigt werden konnten, entwickeln durchschnittlich etwa 2-3 % der Schwangeren

weltweit einen GDM. Bei den übrigen 97-98 % der Frauen zeigt sich während der

Schwangerschaft zwar eine verminderte Glukosetoleranz, diese ist jedoch nach Geburt

des Kindes rückläufig. Es werden daher insbesondere die Plazentahormone für die

abnehmende Insulinsensitivität der Zellen verantwortlich gemacht (Buchanan und

Xiang, 2005).

Bereits innerhalb weniger Jahre nach der Geburt entwickelt ein Großteil der Frauen mit

GDM eine Glukoseintoleranz (IGT), etwa 10 % einen Diabetes mellitus Typ 2. Das

Risiko, innerhalb der kommenden 11 Jahre einen Diabetes mellitus zu entwickeln, liegt

15

laut Langzeitstudien sogar bei 70 % (Kjos et al., 1990 b; Kim et al., 2002). Bei

Nachweis von Autoantikörpern gegen Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD65) bzw.

Inselzellen des Pankreas entwickeln 100 % der Patientinnen innerhalb von 34 Monaten

nach Geburt einen Diabetes mellitus Typ 1 (Mauricio et al., 1996).

Ein erhöhtes Risiko besteht besonders bei Frauen in einem Alter über 25 Jahren, und

Frauen, die bereits selbst in einer früheren Schwangerschaft einen GDM entwickelt

hatten. Je nach Kontinent und Rasse zeigt sich ein Wiederauftreten in 30-69 % der Fälle

(Grant et al., 1986; Philipson und Super, 1989; Gaudier et al., 1992; Kjos et al., 1995;

Moses, 1996; Major et al., 1998) zu Ungunsten der dunkelhäutigen Populationen (z.B.

Afro- und Lateinamerikanerinnen). Das relative Risiko, einen GDM zu entwickeln, ist

für Schwarze (3,3 %) und Lateinamerikanerinnen (4,4 %) höher als bei Weißen (2,7 %).

Bei Asiatinnen (10,5 % bzw. 9,2 %) ist es jedoch am höchsten (Dooley et al.,1991;

Cheung et al., 2001). Bei der Beurteilung ist die Immigration und das damit verbundene

soziale Umfeld, die medizinische Versorgung und die Veränderung der

Ernährungsgewohnheiten zu berücksichtigen.

Des Weiteren besteht ein hohes Risiko bei Frauen, in deren Familie ein Diabetes

bekannt ist, und bei Frauen, welche in vorausgehenden Schwangerschaften keinen

GDM entwickelt hatten. Ebenso fördert eine Adipositas die Entstehung eines GDM

(Sacks et al., 1995; Clark et al., 1997). Laborchemisch zeigen sich häufig vor

Nahrungsaufnahme Zeichen eines metabolischen Syndroms in Form von hohen

Konzentrationen an Aminosäuren (Kalkhoff, 1991), Lipiden (Knopp et al., 1992), C-

Peptid (ein Spaltprodukt des Proinsulins) und Insulin und niedrigem

koronarprotektivem “High Density Lipoprotein” (HDL), sowie zwei Stunden nach

Glukosebelastung erhöhten Spiegeln an Insulin, Triglyzeriden, β-Hydroxybutyrat und

freien Fettsäuren (Clark et al., 1997). Dieser Risikogruppe wird zu Beginn und

zwischen der 24. und 28. SSW die Durchführung eines oGTT empfohlen (American

Diabetes Associaton (2002)).

Physiologisch führt eine Schwangerschaft gewichtsunabhängig im letzten Trimenon

durch Hormonveränderungen zu einem Verlust der Insulinsensitivität von ca. 66 %.

Physiologischerweise verläuft die Insulinsekretion nach Nahrungsaufnahme in zwei

Phasen. Eine erste Insulinausschüttung findet innerhalb der ersten fünf Minuten statt.

Die zweite Phase verläuft über die Dauer der Resorption. Die verminderte

Insulinsensitivität wird mit einem dreifach höheren Anstieg an Insulin in beiden Phasen

der Insulinantwort kompensiert (Buchanan et al., 1990 a).

16

Pathophysiologisch herrscht bei GDM eine begrenzte Kapazität der pankreatischen β-

Zellen vor, um die Insulinresistenz zu kompensieren (Yen et al., 1971; Xiang et al.,

1999), wobei bereits im 2. Trimester der Schwangerschaft eine geringere

Insulinsensitivität gemessen werden kann, bevor sich durch metabolische

Veränderungen im letzten Drittel der Schwangerschaft die Insulinresistenz entwickelt

(Catalano et al., 1993). Dieses β-Zell-Defizit ist mit den frühen Stadien eines Typ-2-

Diabetes vergleichbar. Ebenso werden bereits bei bestehender Glukoseintoleranz (IGT)

erhöhte Proinsulin-Spiegel als Antwort auf den β-Zell-Defekt gefunden (Swinn et al.,

1995). Bei Frauen mit einem GDM lassen sich noch postpartum ähnlich wie bei

Personen mit Typ-2-Diabetes ein Anstieg des Proinsulins gegenüber Insulin nachweisen

(Ward et al., 1987; Persson et al., 1991), d.h. Frauen mit GDM haben nach der

Schwangerschaft eine relative verminderte Insulinsekretion bei verminderter

Insulinsensitivität (Damm et al., 1996). Addierend kommt hinzu, dass die

Glukoneogenese, die basale, endogene Glukoseproduktion, erhöht ist (Xiang et al.,

1999; Buchanan et al., 1999; Catalano et al., 1999).

Da Insulin die Fähigkeit besitzt, die Lipolyse zu steigern, sind durch die Insulinresistenz

und den erhöhten Insulinspiegel die freien Fettsäuren bei Frauen mit GDM im Blut

erhöht (Xiang et al., 1999). Frauen mit Gestationsdiabetes besitzen in Fastenzeiten

jedoch keine erhöhte Neigung zur Ketose (Buchanan et al., 1990 b), da möglicherweise

der hohe Insulinspiegel die Umwandlung freier Fettsäuren in Ketone dämpft.

Nach oraler Gabe von Glukose entwickeln Frauen mit GDM in der späten

Schwangerschaft eine Hyperglykämie trotz einer parallel bestehenden Hyperinsulinämie

(Kalkoff et al., 1964). Es herrschen also eine verzögerte Glukoseverteilung und eine

fehlende insulinotrope Wirkung vor.

Es gibt ebenfalls Beobachtungen, dass in der späten Schwangerschaft trotz hoher

Insulinspiegel die Glukoneogenese aktiviert wird, was vermutlich im Rahmen der

Bedürfnisse im feto-plazentaren Kreislauf geschieht (Catalano et al., 1993), wobei bei

Probandinnen mit GDM unter intravenöser Insulingabe die Glukoneogenese nur zu 80%

supprimiert wird, bei der Kontrollgruppe jedoch fast gänzlich zu 95 %. Auch dies trägt

zur Hyperglykämie bei GDM bei.

Laborchemisch zeigten sich in unterschiedlichen Studien sowohl verminderte und

verzögerte (Lambert et al., 1966; Tryner et al., 1967; Yen et al., 1971; Kühl und

Hornnes, 1986) (d.h. der “Insulin Index”, die Insulinmenge auf einen Glukose-Stimulus,

17

ist vermindert), wie auch erhöhte Insulinantworten (Carrington und Williams, 1966), die

durch Faktoren wie Alter, Gewicht und Parität beeinflusst werden können.

Der GDM bedingt außerdem eine Veränderung der schwangerschaftsabhängigen anti-

insulinären Hormone, eine metabolische Stresssituation, die eine vorbestehende

Insulinresistenz und Defekte der β-Zellfunktion im Verlauf des GDM verstärkt,

wodurch der Kompensationsmechanismus besonders in der ersten Phase der

Insulinantwort ausfällt (Kühl et al., 1985; Buchanan et al., 1990 a; Cousins, 1991). Er

wird als ein prädiabetisches Stadium und bedeutender Vorbote für die Entwicklung

eines Typ-2-Diabetes bei den betroffenen Individuen betrachtet (Damm et al., 1992). Da

sich postpartal die Insulinantwort normalisiert, wird pathophysiologisch im Rahmen des

GDM eine selektive Verminderung der β-Zell-Glukorezeptor-Sensitivität vermutet

(Cerasi et al., 1972). Als Begleitphänomen zeigten Frauen mit GDM in Studien von

Buchanan et al. und Peters et al. eine Gewichtszunahme (Buchanan et al., 1998; Peters

et al., 1996). Die Probandinnen dieses Kollektivs wiesen vor der Schwangerschaft die

geringsten Body-Mass-Indices (BMI) auf, nahmen in der Schwangerschaft prozentual

mehr Gewicht zu, und zeigten noch 6 Monate nach der Geburt die höchste Zunahme

gegenüber den Kontrollprobandinnen.

Die Beobachtungen, dass Gewichtszunahme und auch eine weitere Schwangerschaft

(Peters et al., 1996) das Risiko eines Typ-2-Diabetes nach GDM erhöht, lässt vermuten,

dass die Insulinresistenz den Rückgang der β-Zell-Funktion beschleunigt, was

schließlich zum Diabetes mellitus führt. Die Pathophysiologie des Typ-2-Diabetes

betrachtend, trägt auch diese Erkenntnis zu dessen Entwicklung bei.

Weitere Arbeiten zeigten, dass auch der Tumor-Nekrose-Faktor (TNFα) eine wichtige

pathogenetische Rolle zu spielen und die Progression des GDM entscheidend zu

beeinflussen scheint, da Frauen mit GDM erhöhte Spiegel dieses Faktors aufweisen

(Coughlan et al., 2001).

Die genannten Beobachtungen lassen zwei Formen des GDM erkennen: zum einen die

normale, physiologische Insulinresistenz der späten, katabolen Schwangerschaft und die

mehr chronische Insulinresistenz, die bereits in der frühen Schwangerschaft eine

Hyperglykämie bedingt, und aus der sich postpartum der Typ-2-Diabetes entwickelt

(Martin et al., 1992). Die chronische Insulinresistenz persistiert über die

Schwangerschaft hinaus (Buchanan et al., 1998), was in Kombination mit einer

verminderten β-Zell-Funktion das Risiko für die Entwicklung des Typ-2-Diabetes

18

darstellt. Eine geringe Insulinantwort auf oral aufgenommene (Damm et al., 1992) oder

intravenös applizierte (Buchanan et al., 1998) Glukose und ein hoher Insulinspiegel

(Charles et al., 1991) oder eine geringe β-Zell-Antwort (Buchanan et al., 1998) während

der Schwangerschaft ist postpartal für einen Typ-2-Diabetes prädiktiv. Buchanan et al.

(Buchanan et al., 1998) zeigten, dass die Erste-Phase-Antwort der β-Zellen bei Frauen

mit eingeschränkter Glukosetoleranz (IGT) postpartal auf intravenös applizierte

Glukose zu 52 % reduziert war. Lediglich die Glukoseverwertung kehrte auf das

ursprüngliche Niveau zurück. Ebenso ist zusätzlich auch die zweite Phase der

Insulinantwort betroffen, was eine mangelnde Adaptation der β-Zellen gegenüber der

Insulinresistenz vermuten lässt (Ward et al., 1985; Catalano et al., 1999).

Frauen mit einer normoglykämischen Stoffwechsellage und einem GDM in der

Anamnese sind weniger insulinresistent als Frauen, die aktuell an einem GDM erkrankt

sind, aber insulinresistenter als Frauen aus der Kontrollgruppe ohne GDM.

1.5 Diagnostisches Vorgehen beim Gestationsdiabetes

Bei jeder schwangeren Frau sollte entsprechend den Leitlinien und Empfehlungen der

Deutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe e.V. in der Bundesrepublik

Deutschland eine Untersuchung auf einen Gestationsdiabetes (GDM) durchgeführt

werden. Dazu sollte entweder eine einzeitige Untersuchung mit einem 75-g oGTT

zwischen der 24. und 28. SSW oder ein Screening-Test mit 50 g Glukose durchgeführt

werden, der bei pathologischem Ausfall durch einen 75-g oGTT komplettiert werden

muss (zweizeitige Untersuchung). Die Bestimmung der Glukose im Urin als Screening-

Parameter ist obsolet. Bei Vorliegen von mindestens einem Risiko-Faktor für GDM,

wie Adipositas mit einem Body-Mass-Index vor der Schwangerschaft von mindestens

27 kg/m², Diabetes bei erstgradig Verwandten, Gestationsdiabetes in einer

vorangehenden Schwangerschaft, nach Geburt eines makrosomen Kindes mit mehr als

4.500 g, nach Totgeburt oder habitueller Abortneigung, sowie schweren kongenitalen

Fehlbildungen in einer vorangehenden Schwangerschaft sollte der oGTT schon im

ersten Trimenon der Schwangerschaft durchgeführt werden. Bei unauffälligem Ergebnis

in dieser Risiko-Gruppe ist der oGTT zwischen der 24. und 28. SSW angezeigt. Bei

erneut unauffälligem Resultat soll der oGTT letztmalig zwischen der 32. und 34. SSW

wiederholt werden.

19

Bewertet werden bei dem einzeitigen oGTT die Blutglukose-Messergebnisse vor dem

Test (nüchtern) sowie eine und zwei Stunden nach Ende des Trinkens der Testlösung.

Ein GDM liegt vor, wenn mindestens zwei der drei Grenzwerte in Tabelle 1 erreicht

oder überschritten werden.

Tab. 1: Diagnose eines Diabetes mellitus anhand eines oralen Glukosetoleranz-Tests (Grenzwerte für

kapilläre und venöse Plasmaglukose, nasschemische Labormethode) nach Carpenter und Coustan (1982)

und entsprechend den Leitlinien der Deutschen Diabetes Gesellschaft (DDG) (2007).

Messzeitpunkt

kapilläres Vollblut venöses Plasma

(nach Carpenter und Coustan)

venöses Plasma

(nach DDG)

(mg/dl) (mmol/l) (mg/dl) (mmol/l) (mg/dl) (mmol/l)

Nüchtern ≥ 90 ≥ 5,0 ≥ 95 ≥ 5,3 ≥ 90 ≥ 5,0

nach 60

Minuten ≥ 180 ≥ 10,0 ≥ 180 ≥ 10,0 ≥ 165 ≥ 9,2

nach 120

Minuten ≥ 155 ≥ 8,6 ≥ 155 ≥ 8,6 ≥ 140 ≥ 7,8

Erreicht oder überschreitet nur ein Wert die oben angegebenen Grenzen, so liegt per

Definition eine eingeschränkte Glukosetoleranz (IGT) vor.

Die Blutglukosewerte nach 60 und nach 120 Minuten aus venösem Plasma

unterscheiden sich nach den aktuellen Leitlinien der Deutschen Diabetes Gesellschaft

(DDG) (Kerner und Brückel, 2007) von denen Leitlinien der Deutschen Gesellschaft für

Gynäkologie und Geburtshilfe e.V. nach Carpenter und Coustan (1982).

HbA1c und Fructosamin sind für Screening und Diagnostik des GDM aufgrund

möglicher falsch negativer Ergebnisse ebenso nicht geeignet wie einzelne Nüchtern-

oder Gelegenheits-Blutglukosewerte.

Eine eingeschränkte Glukosetoleranz, gekennzeichnet durch Erreichen oder

Überschreiten nur eines Grenzwertes im oGTT, kann mit einer dem GDM

20

vergleichbaren fetalen/neonatalen Morbidität einhergehen, ohne dass hiermit die

Diagnosekriterien eines GDM erfüllt sind.

International gültige Richtlinien zur Diagnostik des Gestationsdiabetes liegen nicht vor.

Es wird weiterhin kontrovers diskutiert, ob ein selektives, auf Risikofaktoren

basierendes Screening eine ausreichende Vorsorge bietet, oder ob sich jede schwangere

Frau einer Untersuchung auf Gestationsdiabetes unterziehen sollte. Poyhonen-Alho et

al. zeigten 2005, dass ein universelles Screening mit 50 g Glukose in der Lage ist, eine

höhere Anzahl von Frauen mit Gestationsdiabetes zu identifizieren als eine auf

Risikofaktoren basierende Diagnostik.

1.6 Komplikationen des Gestationsdiabetes bei Mutter und Kind

Folgen eines unbehandelten GDM sind auf mütterlicher wie kindlicher Seite zu finden.

Beweise dafür, dass eine maternale Hyperglykämie einen Risikofaktor für fetale

Morbidität darstellt, lieferte eine Studie 1995 anhand von 3637 Geburten bei Frauen

ohne GDM (Sermer et al., 1995). Risiken für die Schwangere sind insbesondere

erhöhtes Auftreten von hypertensiven Entgleisungen und Präklampsie (Joffe et al.,

1998; Roberts, 1998). Seitens des Kindes stehen Komplikationen während der Wehen

und der Entbindung (Naylor et al., 1996; Persson et al., 1998) sowie die fetale

Makrosomie (Jang et al., 1997; Langer et al., 1988), die durch das Übermaß an

Glukosezufuhr an den Fetus resultiert, im Vordergrund. Desweiteren bestehen ein

erhöhtes Risiko des intrauterinen Fruchttodes in den letzten 4-8 Wochen der

Schwangerschaft bzw. Totgeburt (O´Sullivan et al., 1973), erhöhtes Auftreten von

kongenitalen Anomalien (Hod et al., 1991; Schaefer et al., 1997), IRDS

(Atemnotsyndrom des Kindes) durch Supprimierung der Surfactantproduktion seitens

der Hyperinsulinämie (Schwartz, 1990; Kjos et al., 1990 a; Piper et al., 1993), und sich

daraus ergebende neonatale Risiken, wie Hypoglykämie bei Hyperinsulinismus

(Hofmann et al., 1990), Ikterus bei Hyperbilirubinämie, Polyzythämie und

Hypokalzämie, welche bei 25 % der Kinder selbst bei effektiver, diätetischer Therapie

zu finden sind (Hod et al., 1991). Bei 85 % der Kinder tritt eine oder mehrere dieser

Symptome auf (Gabbe et al., 1977). Hypoglykämie und Polyzythämie können u.U. zu

neurologischen Schäden und einer Nierenvenenthrombose führen. Das Risiko der

21

Kinder, eine chromosomale Anomalie zu erleiden, ist 8-fach erhöht (Moore et al.,

2002). Mit steigendem maternalem Blutglukosespiegel steigt das Risiko für den Fetus

kontinuierlich an. Die Höhe der maternalen Hyperglykämie korreliert mit dem

Geburtsgewicht des Kindes (Jang et al., 1997). Die Makrosomie tritt bei 20-30 % der

Kinder auf, deren Mütter einen GDM entwickelten (Homko et al., 1995). Studien mit

makrosom geborenen Kindern geben Hinweise darauf, dass bei Entwicklung eines

GDM morphologische Veränderungen der kindlichen Inselzellen auftreten, die zu

einem Typ-2-Diabetes im Erwachsenenalter führen können (Fowden et al., 2001). Die

Rate an Kaiserschnitten liegt bei der Gruppe der Frauen mit GDM doppelt so hoch wie

bei Frauen ohne GDM (Naylor et al., 1996).

Frauen mit GDM haben nach der aktuellen Studienlage ein Risiko von bis zu 70 %

innerhalb von 5-15 Jahren einen Typ-2-Diabetes zu entwickeln (Damm et al., 1992;

Dornhorst et al., 1990; Kjos et al., 1995; Tamas et al., 2001; Kim et al. 2002). Dies ist

besonders vom Nüchternblutzuckerwert ein Jahr postpartum abhängig (Metzger et al.,

1985; Damm et al., 1992). Frauen mit einer früh auftretenden postpartalen

Glukoseintoleranz zeigten bereits in der frühen Schwangerschaft eine Hyperglykämie

(Buchanan et al., 1998). Der Grad der Hyperglykämie und das Ausmaß der β-Zell-

Dysfunktion in der späten Schwangerschaft sind für die Entwicklung eines Diabetes

nach GDM ausschlaggebend (Buchanan et al., 1999).

Einige Autoren berichteten über das Auftreten von Diabetes mellitus Typ 1 im Sinne

eines Autoimmun-Mechanismus mit zirkulierenden Antikörpern gegen die

pankreatischen Inselzell-Antigene postpartal in einer Größenordnung von etwa 2 %

(Freinkel et al., 1985; Buchard et al., 1987; Catalano et al., 1990; Damm et al., 1994;

Petersen et al., 1996).

Bei etwa 10 % der Schwangeren mit GDM finden sich bereits Antikörper gegen β-Zell-

Antigene (Damm et al., 1994; Catalano et al., 1990). Antikörper scheinen postpartum

häufiger nach Behandlung des GDM mit Insulin (29 %), statt ausschließlich mit Diät

(11 %), aufzutreten. Ebenso treten sie bevorzugt bei schlanken Frauen auf. Die

Wahrscheinlichkeit, einen Typ-1-Diabetes postpartal zu entwickeln, wächst mit dem

positiven Nachweis mehrerer, unterschiedlicher Antikörper-Spezies während der

Schwangerschaft (Füchtenbusch et al., 1997).

Molekulargenetisch sind darüber hinaus beim GDM die HLA-Antigene DR3 und DR4

erhöht, deren Assoziation mit dem Typ-1-, jedoch nicht mit dem Typ-2-Diabetes,

bereits bekannt ist (Freinkel et al., 1985).

22

Insulin induziert die Translokation von Glukosetransporter(GLUT)-Proteinen. Bei

Frauen mit GDM zeigen Adipozyten im Gegensatz zu Muskelzellen einen Defekt in der

insulinvermittelten Translokation von GLUT4, die nicht bei normalen Schwangeren

auftreten, so dass hier ein anderer Mechanismus im Rahmen der Resistenz wirken

könnte (Garvey et al., 1992, 1993).

In der Schwangerschaft ist jedoch der Glukosetransport in den Skelettmuskel generell

vermindert, GDM in Kombination mit Adipositas verstärkt diesen Effekt noch

zusätzlich am ehesten durch eine Verschlechterung des Insulin-Signaling. Da dieser

Zustand in den meisten Fällen über die Schwangerschaft hinaus persistiert, ist zu

überlegen, ob nicht eine genetische Komponente im Rahmen der Insulinresistenz der

Muskelzellen betehen könnte, die später Ursache eines Diabetes mellitus Typ 2 ist

(Friedman et al. 1999).

1.7 Fragestellung der Arbeit

Bei der Pathogenese des Diabetes mellitus Typ 2 spielen unterschiedliche genetische

Faktoren eine Rolle, die zu einer Insulinresistenz führen. Ferner ist der Inkretineffekt

bei Typ-2-Diabetes eingeschränkt. Hierzu trägt vor allem eine verminderte oder

aufgehobene insulinotrope Wirkung des Inkretinhomons GIP bei. Der Mechanismus der

verminderten GIP-Wirkung ist nicht vollständig aufgeklärt, hier können genetische

Effekte, die die GIP-Wirkung beeinträchtigen, wirksam sein, ebenso können generelle

Sekretionsdefekte der β-Zellen eine Rolle spielen.

Ziel der vorliegenden Studie war es, die insulinotrope Wirkung von GIP bei aktuell

normoglykämen Patientinnen nach vorbestehendem Gestationsdiabetes zu untersuchen

und den Vergleich zu stoffwechselgesunden Patientinnen darzustellen. Diese

Untersuchung soll auch dazu beitragen, den GDM bezüglich seiner Ähnlichkeit zum

Typ-2-Diabetes näher zu charakterisieren.

23

2 Material und Methoden

2.1 Studienprotokoll

Das Studienprotokoll mit der Registriernummer 1615 wurde vor Studienbeginn von der

Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum bezüglich

ethischer und rechtlicher Aspekte begutachtet und anerkannt.

Mit Schreiben vom 17.01.2001 bestanden keine Bedenken gegen die Durchführung der

Studie in der vorgelegten Form.

2.2 Probandinnen-Charakteristika

Es nahmen 45 freiwillige weibliche Versuchspersonen an der Studie teil, die vor

Studienbeginn über Inhalt und Ablauf der Versuchsreihen informiert und aufgeklärt

wurden, und die vor der Versuchsdurchführung ihre schriftliche Zustimmung erteilten.

Alle Probandinnen wiesen einen guten Gesundheits- und einen guten Allgemeinzustand

auf, insbesondere bestand bei keiner der Probandinnen eine Stoffwechselerkrankung

und keine der Probandinnen erhielt eine häusliche Medikation, die den

Glukosestoffwechsel beinflussen könnte. Zum Ausschluss einer bestehenden

Schwangerschaft wurde Urin auf Humanes Choriongonadotropin (β-HCG) untersucht.

Zwei Kollektive wurden in der Studie untersucht.

Für das erste Kollektiv wurden 24 Probandinnen rekrutiert, die während der

Schwangerschaft einen Gestationsdiabetes und zum Zeitpunkt der Durchführung der

Versuchsreihe eine normoglykäme Stoffwechsellage aufwiesen (im folgenden

Gestationsgruppe genannt). Die Diagnose eines Gestationsdiabetes wurde zwischen der

20. und 32. Schwangerschaftswoche durch einen oralen Glukose-Toleranztest gestellt.

Des Weiteren galt ein Abstillen der Probandinnen als Bedingung, und die Geburten

lagen mindestens 12 Monate zurück. Im Durchschnitt lagen zwischen der

Schwangerschaft und dieser Studie ein zeitliches Intervall von 4,7 Jahren (55,8

Monate). Eine Glukoseintoleranz und erstgradig verwandte Diabetiker konnten in der

Gestationsgruppe toleriert werden.

24

Vier Probandinnen wiesen in dem oralen Glukose-Toleranztest des ersten Studientages

einen bisher unbekannten manifesten Diabetes mellitus Typ 2 auf, so dass diese für die

weitere Versuchsreihe nicht zur Verfügung stehen konnten. Bei acht Probandinnen

waren je ein erstgradig Verwandter Typ-2-Diabetiker, bei weiteren drei Frauen dieser

Gruppe ein zweitgradig Verwandter eruierbar.

20 Probandinnen erfüllten die Voraussetzungen für die Aufnahme in die Studie.

Abgesehen von vier Frauen der Gestationsgruppe, die während der Schwangerschaft

aufgrund eines Gestationsdiabetes insulinpflichtig wurden, waren die Probandinnen in

ihrer Schwangerschaft diätetisch eingestellt. Keine der Probandinnen benötigte von dem

Tag der Geburt ihres Kindes bis zum Zeitpunkt der Studienteilnahme eine Behandlung

bezüglich einer hyper- oder hypoglykämischen Stoffwechsellage. Eine Probandin litt

unter einer arteriellen Hypertonie.

Zwei Probandinnen gebaren je ein makrosomes Kind mit einem Geburtsgewicht von

über 4500g (4650 bzw. 4680g). Eine Probandin gebar Zwillinge, deren Geburtsgewichte

jeweils unter 3000g lagen (2670 und 2910g).

Die zweite Kohorte bestand aus 21 Kontrollprobandinnen, die entweder während ihrer

Schwangerschaft normwertige Blutzucker-Spiegel oder bisher keine Gravidität

aufwiesen (im folgenden Kontrollgruppe genannt). Eine familiäre Diabetesbelastung

bestand nicht. Eine Probandin der Kontrollgruppe wies einen manifesten Diabetes

mellitus auf. Auch hier erfüllten also 20 Probandinnen die Voraussetzungen für die

Aufnahme in die Studie. Elf Frauen dieser Kontrollgruppe gebaren wenigstens ein Kind,

neun Frauen waren Nullipara.

Im Durchschnitt wies die Gesamtzahl der Probandinnen eine Geburtenzahl von 1,8 auf.

2.2.1 Voruntersuchungen und Ermittlung der Einschlusskriterien

Vor Versuchsbeginn wurden alle Probandinnen mit Hilfe eines standardisierten

Anamnesebogens erfasst und untersucht.

Anamnestisch wurden neben Daten zur Person Vorerkrankungen der Probandin,

Geburtsdatum und Gewicht des Kindes sowie, falls die Anamnese dies wiedergab,

Stoffwechselerkrankungen oder Todesursachen erstgradig verwandter Personen notiert.

25

Darüber hinaus wurde eine aktuelle Medikamentenanamnese erfragt, um Interaktionen

von Arzneimittelwirkstoffen mit dem Glukosestoffwechel auszuschließen.

Die körperliche Untersuchung bestand in der Erfassung von Körpergewicht und –größe

zur Berechnung des Body-Mass-Index (BMI), Bauch- und Hüftumpfang zur

Bestimmung der Waist-to-Hip-Ratio und der Messung des arteriellen Blutdrucks.

Außerdem wurden Indices für diabetesbedingte Folgeerkrankungen wie Reflexstatus

(Patellar- und Achillessehnen-Reflexe beidseits), Vibrationsempfinden mittels einer

skalierten Vibrationsgabel (Bestimmung des Vibrationsempfindens in Achtel-Schritten

zur Abschätzung des Grades einer diabetischen Neuropathie) im Bereich der Malleoli

mediales dextra et sinistra, sowie Fußpulse im Bereich der Arteria dorsalis pedis

beidseits untersucht.

Sofern die Ergebnisse eines während einer Schwangerschaft durchgeführten oralen

Glukose-Toleranztestes (oGTT) zur Verfügung standen, wurden diese in den

Anamnesebogen aufgenommen.

2.3 Durchführung des Versuchs

Aufbau und Durchführung des Versuchs waren für beide Probandinnengruppen

identisch.

Sämtliche Versuche wurden jeweils morgens nüchtern durchgeführt. Die Probandinnen

hatten seit mindestens zehn Stunden keine Nahrung zu sich genommen und erschienen

an zwei nicht aufeinander folgenden Versuchstagen. Für beide Versuchsreihen nahmen

die Probandinnen eine sitzende Position ein.

Nach Erhebung von Anamnese und körperlicher Untersuchung wurden Blutentnahmen

durchgeführt, mit denen die klinisch-chemischen Laborparameter der Leber- und

Nierenfunktion und des Fettstoffwechsels im Serum bestimmt wurden. Des Weiteren

wurden die Werte des Blutbildes, des glykolysierten Hämoglobins (HbA1c) und das C-

reaktive Protein (CRP) zum Ausschluss einer entzündlichen Erkrankung ermittelt.

26

2.3.1 Oraler Glukose-Toleranztest

Am ersten Versuchstag erfolgte ein nach WHO-Kriterien standardisierter, oraler

Glukose-Toleranztest (oGTT) mit 75g Glukose (Dextro O.G-T., Roche Diagnostics,

Mannheim, Deutschland) zur Abschätzung der Glukosestoffwechsellage der

Probandinnen. Diese Glukoselösung war innerhalb von 5 Minuten von der Probandin

aufzunehmen. Voraussetzung für die weitere Teilnahme an der Studie war in der

Kontrollgruppe eine normale Glukosetoleranz. In der Gestationsgruppe war jedoch eine

eingeschränkte Glukosetoleranz (IGT) akzeptabel, Hinweise für einen manifesten

Diabetes mellitus führten zum Ausschluss der Probandin (Tabelle 1).

2.3.2 GIP-Bolus-Test

Sofern die Probandinnen sämtliche Einschlusskriterien des oralen Glukose-

Toleranztestes erfüllten, nahmen die Probandinnen am zweiten Versuchstag teil.

Dieser beinhaltete die Durchführung des sogenannten „GIP-Bolus-Tests“, bei dem den

Probandinnen Gastric Inhibitory Polypeptide (GIP) der humanen Sequenz von 20 µg/ml

pro kg KG im Bolus intravenös injiziert wurde, um die insulinotrope Antwort auf die

GIP-Gabe zu untersuchen.

2.4 Blutentnahmen

An beiden Versuchstagen wurde den Probandinnen mittels Venenpunktion zunächst

eine Verweilkanüle (Vasofix Braunüle 18G, Braun, Melsungen, Deutschland) unter

Bevorzugung der Vena cubiti eines Unterarms gelegt, durch die die Blutentnahmen

erfolgten.

Am kontralateralen Arm wurde am zweiten Versuchstag zur Bolusinjektion des

exogenen Hormons zusätzlich eine Verweilkanüle am Unterarm (Vasofix, 18G, Braun,

Melsungen, Deutschland) platziert. Nach der Entnahme von zwei basalen Blutproben (-

5 und 0 min), erfolgte die Injektion des GIP im Bolus. In Abständen von 1, 3, 5, 10, 15,

20 und 30 min erfolgten weitere Blutentnahmen.

27

2.5 Aufbereitung der Blutproben zur Hormon- und Glukose-Bestimmung

Die Blutproben zur Quantifizierung von Insulin, C-Peptid und GIP wurden mit 9ml -

Plasma-Monovetten (1,6 ml Kalium-EDTA/ml Blut, Firma Sarstedt, Nümbrecht,

Deutschland) entnommen, denen zuvor 360 µl als Proteinase-Inhibitor Aprotinin

(Trasylol 500.000 KIE, Bayer, Leverkusen, Deutschland) zugesetzt wurde. Alle

Blutproben wurden nach Lagerung auf Eis umgehend 10 Minuten bei 4-6°C

zentrifugiert (3600 U/min). Jeder Blutentnahme folgte außerdem zeitgleich jeweils die

Entnahme einer kapillaren Blutprobe (ca. 100 µl) aus einem zuvor mit Finalgon®

(Nonivamid 4 mg/g, Nicoboxil 25 mg/g) hyperämisiertem Ohrläppchen in NaF-

bestückte Entnahmegefäße (Microvette CB 300 FH, 1 mg Fluorid und 15 IE Heparin /

ml Blut, Firma Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland), aus denen nach Zentrifugieren der

Glukosespiegel im Blut gemessen wurde (Beckman Eppendorf Tischzentrifuge, 30

sec.). Alle Glukosemessungen wurden in kapillarem Blut durchgeführt, da so praktisch

identische Werte wie in arteriellem Plasma gemessen werden (Whichelow et al., 1967;

Förster et al., 1972).

Nach Zentrifugieren wurden Plasma-Portionen von 3 x 0,5 ml und 2 x 1,0 ml

abpipettiert und bis zum Zeitpunkt der genannten Messungen bei –28°C eingefroren.

2.6 Infusionslösungen

Die synthetisch hergestellte GIP-Stammlösung (bezogen von der Firma PolyPeptide

Laboratories GmbH, Wolfenbüttel, Deutschland), Chargennummern C-0229 bzw. E-

0517, wurde unter sterilen Bedingungen hergestellt und abgefüllt. Der Netto-

Peptidanteil, der den Gewichtsanteil des Peptids am Bruttogewicht des eingewogenen

Materials angibt, bezifferte sich auf 80,25 bzw. 80,30 %. Die HPLC-Analyse des

Herstellers belegte jeweils eine Reinheit von > 99 %. Bis zur Verwendung wurde die

Hormonlösung bei -28°C gelagert und erst 30 Minuten vor Applikation aufgetaut.

Für die Bolusapplikation der Peptidlösung wurde für die Verdünnung eine Trägerlösung

hergestellt. Dazu wurden 95 ml physiologischer Kochsalz-Lösung 5 ml 20 %-ige

Humanalbuminlösung (Human-Albumin 20 % Behring, salzarm, Infusionslösung,

Marburg, Deutschland), Chargennummer 941109630A, zugesetzt, so dass man eine 1%-

28

ige Albuminlösung erhielt. Diese Stammlösung wurde unter einer Sterilbank durch

Nitrozellulosefilter (0,2 µm, Sartorius, Göttingen, Deutschland) filtriert und in sterile

Durchstechampullen abgefüllt. Für die Applikation wurde die Stammlösung 5-fach mit

der 1 %-igen Albuminlösung verdünnt. Eine Probe dieser gewonnen Lösung wurde zur

späteren radioimmunologischen Messung als Qualitätssicherung asserviert.

Zum Ausschluss einer bakteriellen Kontamination wurden Proben der Verdünnungen

auf Standardnährböden kultiviert. Bei keiner Probe ließ sich ein Bakterienwachstum

nachweisen. Darüber hinaus wurde mittels Limulustests eine Pyrogentestung

durchgeführt (Mikrobiologisches Labor Dr. J. Balfanz, Münster, Deutschland). Die

Endotoxinkonzentration betrug 1,61 EU/ml bzw. 0,08 IU/ml (Grenzwert 3 EU/ml).

2.7 Messungen

2.7.1 Plasma-Glukosekonzentrationen

Die Werte der Glukosekonzentationen wurden nach dem Prinzip der Glukose-Oxidase-

Methode mit Hilfe eines „Beckman-Glucose-Analyser 2“ (Beckman Instruments,

München, Deutschland) ermittelt. Nach Eichung des Glucose-Analysers wurden 10 µl

des Plasmas abpipettiert und dessen Glukosegehalt gemessen. Zwischen Beginn der

Blutentnahme und Ausgabe des ersten Messwertes lagen etwa 75 Sekunden. Bei

wiederholter Messung einer Probe lag der Variationskoeffizient bei unter 2 %.

2.7.2 Hormonbestimmungen

Die Hormon-Konzentrationen von GIP, C-(connecting)-Peptid und immunreaktivem

Insulin (IR-Insulin) wurden in Doppelbestimmung mit Hilfe von spezifischen Immuno-

Assays ermittelt.

Immunreaktives Insulin bezeichnet den mit Hilfe von Antikörpern gegen Insulin

messbaren Anteil des zirkulierenden Insulins und der insulinähnlichen biologischen

Aktivität.

29

2.7.2.1 C-Peptid-ELISA

Durch proteolytische Spaltung des Proinsulins entstehen Insulin und das C-Peptid (Abb.

4). Insulin wird während der Passage durch die Leber zu ca. 60 % eliminiert (Ferrannini

und Cobelli, 1987). Nach einer Mahlzeit variiert die hepatische Elimination zwischen

Basalzustand und der Stimulierung der Insulinsekretion (Gibby und Hales, 1983; Eaton

et al., 1983; Tillil et al., 1988). Die metabolische Clearance des C-Peptids ist eine

konstante, von gerade herrschenden physiologischen C-Peptid-Plasmakonzentrationen

unabhängige Größe (Polonsky et al., 1986), und ist im Gegensatz zur Insulin-Clearance

von Vorgängen und Faktoren, wie einer Einnahme und Resorption einer Mahlzeit oder

Glukose-Gabe, nicht zu beeinflussen (Licinio-Paixao et al., 1986). C-Peptid und Insulin

werden als Spaltprodukte der Prozessierung des Proinsulins in äquimolarer Menge von

den pankreatischen ß-Zellen sezerniert (Rubenstein et al., 1969; Horowitz et al., 1975;

Van Cauter et al., 1992; Hovorka und Jones, 1994). Der hepatische Abbau des C-

Peptids ist vernachlässigbar gering (Polonsky et al., 1983; Bratusch-Marrain et al.,

1984), so dass es möglich ist, die Sekretion des C-Peptids in den portalen Kreislauf

anhand peripher gewonnener Blutproben abzuschätzen (Polonsky und Rubenstein,

1984; Polonsky et al., 1986).

Abb. 4: Aufbau des Proinsulins. Die Balken und Pfeile markieren die Bindungsstellen, an denen die Spaltung in C-Peptid und Insulin erfolgt.

30

Die Messung von C-Peptid erfolgte mit einem Enzym-Immunoassay (ELISA), das als

Kit käuflich erworben wurde (DAKO C-Peptide, DAKO Ltd., Cambridgeshire,

Großbritannien). Die Kalibrierung wurde mit einem synthetischen hergestellten,

humanen C-Peptid durchgeführt. Der Immunassay basiert auf zwei monoklonalen

Antikörpern aus der Maus. Das C-Peptid aus Patientenprobe bzw. Standard bindet

zunächst an einen auf einen auf der ELISA-Platte immobilisierten Anti-C-Peptid-

Antikörper. Im nächsten Schritt werden die ungebundenen Proteine durch einen

Waschschritt entfernt. Danach wird die Platte mit einem weiteren Anti-C-Peptid-

Antikörper inkubiert, an den Peroxidase gekoppelt ist. Dann wird überschüssiger

Antikörper durch einen Waschschritt entfernt. Das gebundene Konjugat wird durch

Reaktion mit einem Substrat der Peroxidase (3,3‘,5,5‘-Tetramethylbenzidin)

detektierbar gemacht. Die Farbentwicklung wird durch Ansäuern nach einer definierten

Zeit gestoppt. Anschließend wird die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 450 nm

gemessen. Die optische Dichte ist proportional der C-Peptid-Konzentration in der

Probe. Da auch das ungespaltene Proinsulin die C-Peptid-Kette enthält, wird auch

unprozessiertes Proinsulin vom ersten Antikörper erkannt (Kreuzreaktivität mit

Proinsulin).

Die kleinste nachweisbare C-Peptid-Konzentration betrug 0,45 ng/ml. Proben mit C-

Peptid-Konzentrationen größer 13 ng/dl mussten zunächst mit Nullstandard im

Verhältnis 1:10 verdünnt werden. Der Intra-Assay-Variationskoeffizient lag zwischen

3,3 und 5,7 %, der Inter-Assay-Variationskoeffizient zwischen 4,6 und 5,7 %.

2.7.2.2 Insulin-ELISA

Die Messung von humanem, immunreaktivem (IR-)Insulin erfolgte mit einem käuflich

erworbenen Mikropartikel-Enzym-Immunoassay (MEIA Abbott IMx®Insulin, Abbott

Laboratories, Wiesbaden, Deutschland), dessen Partikel mit monoklonalen Maus-

Antikörpern, welche sich gegen das Insulin-Molekül richten, beschichtet sind. Die

Kalibrierung erfolgt mit humanem rekombinantem Insulin. Die Antigen-Antikörper-

Komplexe werden auf eine Glasfiber-Matrix transferiert. Nach Entfernung

ungebundener Bestandteile durch Waschen der Matrix wird der zweite Antikörper, der

mit Alkalischer Phosphatase gekoppelt ist, auf die Matrix gegeben. Nach erneuter

31

Waschung wird das Substrat 4-Methylbelliferyl-Phosphat hinzugefügt. Anschließend

erfolgt die Messung der Fluoreszenzemission mittels eines Messsystems für MEIA.

Der „IMx Insulin Assay“ weist keine Kreuzreaktivität mit Proinsulin (< 0,005 %) auf.

Eine andere potentielle Störquelle besteht durch Anti-Insulin-Antikörper, wie sie bei

Patienten auftreten können, die mit Rinder- oder Schweine-Insulin behandelt wurden.

Die errechnete Empfindlichkeit des Assays lag um 1.0 mU/l. Der Intra-Assay-

Variationskoeffizient lag bei etwa 4 %.

2.7.3 Prinzip des Radioimmuno-Assays (RIA)

Das Prinzip der immunologischen Hormonbestimmung nach Berson und Yalow

(Berson und Yalow, 1962) ist ein Verfahren, das in unterschiedlichsten Varianten

Plasmahormonbestimmungen mit hoher Spezifität und Sensitivität liefert.

Das Verfahren beruht darauf, dass eine konstante Menge markierten Hormons, das als

Tracer dient, mit einer unbekannten Menge nicht-markierten Hormons um einen für das

Hormon spezifischen Antikörper kompetitiv konkurriert. Folglich bestimmt die nicht

definierte Menge an nicht-markiertem Hormon den sich an den Antikörper koppelnden

Anteil des markierten Hormons.

Die Markierung des Antigens erfolgt durch Einführung eines radioaktiven Isotops. Die

Konzentration an markiertem Hormon kann anschließend durch

Radioaktivitätsmessungen anhand einer Standardkurve mit bekannten Konzentrationen

an unmarkiertem Hormon bestimmt werden. Eine Trennung des freien und gebundenem

Hormons wird meist mittels Adsorption des freien radioaktiven Hormons an Aktivkohle

oder Ionenaustauscher erreicht.

Je höher die Konzentration unmarkierter Hormone ist, desto mehr markierte Tracer-

Moleküle werden vom Antikörper verdrängt. Nach Trennung wird die Radioaktivität

der Fraktion an freiem markiertem Hormon gemessen.

Trotz der hohen Sensitivität und Spezifität können jedoch auch Hormonvorstufen oder

Metabolite an den jeweiligen Antikörpern binden sofern sie die für die Antikörper-

Bindung notwendige Peptidsequenz beinhalten.

32

2.7.3.1 Bestimmung des Gesamt-GIP im Plasma

Die Messungen der Gesamt-GIP-Konzentrationen erfolgten durch zwei

Radioimmunoassays. Als Standard wurde für die Untersuchungen synthetisch

hergestelltes, humanes GIP verwendet. Hierzu wurde das an Albumin gekoppelte

Antiserum R65 aus Kaninchen verwendet, welches sich gegen das C-terminale Ende

des intakten GIP [1-42 Amid]-Moleküls und gegen das N-terminale Ende von GIP [3-

42 Amid] richtet (Krarup und Holst, 1984). Dadurch wurde die Gesamt-GIP-

Konzentration aus dem biologisch aktiven GIP [1-42 Amid] und dem durch N-terminale

Proteolyse seitens des Enzyms Dipeptidyl-Peptidase IV aus dem aktiven Hormon

entstehende GIP [3-42 Amid] gemessen. Die untere Nachweisgrenze des C-terminalen

Assays lag bei weniger als 2 pmol/l. Der Intra-Assay-Variationskoeffizient betrug etwa

6 %. Der Inter-Assay-Variationskoeffizient lag bei etwa 8 %.

125J-markiertes, synthetisches, humanes GIP diente in dem Radioimmunoassay als

Tracer (Amersham Pharmacia Biotech Ltd., Little Chalfont, Buckinghamshire,

Großbritannien), die Koppelung von 125Jod und GIP erfolgte mittels Chloramin-T

(Nakamura et al., 1977), und die Trennung von überschüssigem freien 125Jod mittels

isokratischer „High-Performance-Liquid-Chromatography“ (Nucleosil C-18-Säule,

0,1% Trifluoressigsäure, 20% Acetonitril). Der beim Assay vom Antiserum verdrängte

Tracer wurde an plasmaüberzogene Aktivkohle (Merck, Darmstadt, Deutschland)

adsorbiert.

2.7.3.2 Quantifizierung von GIP [1-42 Amid]

Die Messung des biologisch aktiven GIP [1-42 Amid] wurde ebenfalls mittels eines

Radioimmunoassays durchgeführt. Hierzu wurde der polyklonale Antikörper 98171

verwendet, welcher gegen das Fragment GIP [1-10 Amid] gerichtet ist. Als Tracer

wurde erneut 125J-markiertes synthetisches, humanes GIP (Amersham Pharmacia

Biotech Ltd., Litle Chalfont, Buckinghamshire, Großbritannien) verwendet. Als

Standard diente wiederum kaltes, humanes GIP (Peninsula Laboratories Europe Ltd., St.

Helens, Merseyside, Großbritannien). Die Trennung von freiem und

antikörpergebundenem Tracer wurde erneut mit plasmaüberzogener Aktivkohle (Merck,

33

Darmstadt, Deutschland) durchgeführt. Zum Assay-Puffer wurde Valin-Pyrolidid in

einer Endkonzentration von 0,01 mmol/l hinzugefügt, was die Degradierung des aktiven

GIP [1-42 Amid] während der Inkubationen im Verlauf des Assays verhinderte. Die

untere Nachweisgrenze für aktives GIP lag bei 5 pmol/l. Der Standardbereich umfasste

Konzentrationen von 5-320 pmol/l.

Die Intra- und Inter-Assay-Variationskoeffizienten lagen bei 6 bzw. 10 %.

Kreuzreaktivität mit dem durch Proteolyse entstandenen GIP [3-42 Amid] lag bei <

0,1%.

2.8 Berechnungen

2.8.1 Statistische Auswertung

Alle Daten der Probandencharakteristika wurden als Mittelwert ± Standardabweichung

(SD), die experimentellen Ergebnisse wurden als Mittelwert ergänzt durch den

Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben.

Alle statistischen Berechnungen und Unterschiede zwischen verschiedenen

Probandengruppen im Zeitverlauf wurden mittels einer Varianzanalyse für

Messwiederholungen („repeated measures analysis of variance“, ANOVA) berechnet.

Zur Berechnung wurde die Software „Statistica“, Version 5.0, der Firma Statsoft

Europe, Hamburg, Deutschland mit Genehmigung verwendet.

Zur Darstellung der Signifikanz von Daten wurde der p-Wert berechnet. Der p-Wert

(von „probability“ = Wahrscheinlichkeit) bezeichnet den mit einem statistischen Test

errechneten Wahrscheinlichkeitswert, der aussagt, dass kein Unterschied zwischen

verschiedenen Gruppen oder Verfahren existiert (Nullhypothese). Je kleiner diese

Irrtumswahrscheinlichkeit, also der p-Wert, ist, desto sicherer bzw. signifikanter ist das

Ergebnis. Für alle p-Werte wurde ein Signifikanzniveau von p ≤ 0,05 als signifikant

angesehen.

Die Varianzanalyse erstellt drei verschiedene p-Werte, welche Auskunft über die

Signifikanz von Unterschieden geben. Dabei wird zwischen sogenannten

„Zwischensubjekt-Effekten“ und „Innersubjekt-Effekten“ unterschieden. Es werden drei

Signifikanzen angegeben:

34

(A) Zwischensubjekt-Effekt: Dieser Wert beschreibt den Unterschied zwischen den

Gruppen zu einem Zeitpunkt.

(B) Innersubjekt-Effekt Zeit: Prüft, ob die Kurven einer Kinetik unterliegen, d.h. ob

sie zu einem Zeitpunkt ansteigen oder fallen. Ein Plateau-Verlauf widerspricht

einer Signifikanz.

(AB) Innersubjekt-Effekt Zeit * Gruppe: Parallelitätshypothese. Vergleich der Daten

der beiden Beobachtungsgruppen im Hinblick auf den zeitlichen Verlauf. Dieser

Effekt kann z.B. von Bedeutung sein, wenn zwei Kurven identisch aussehen,

aber zeitlich versetzt verlaufen.

Im Falle signifikanter Ergebnisse der Kategorien A oder AB (p ≤ 0,05) wurde für jeden

einzelnen Zeitpunkt eine einfache Varianzanalyse (one-way-ANOVA, ein

parametrischer Signifikanztest für drei oder mehr voneinander unabhängigen

Wahrscheinlichkeitsverteilungen) durchgeführt. Das Berechnungsverfahren ermittelt

durch Analyse der einzelnen Varianzen, ob die Wahrscheinlichkeitsverteilungen, aus

denen die Stichproben stammen, den gleichen oder einen differenten Erwartungswert

besitzen. Ein Wert unterhalb des Signifikanzniveaus besagt, dass mindestens zwei der

Erwartungswerte der Wahrscheinlichkeitsverteilung unterschiedlich sind.

Alle Daten wurden mit „Microsoft EXCEL“ Version 3.0 berechnet. Statistische

Analysen erfolgten mit der Software NCSS, Version 5.01, Jerry Hintze, Keysville,

Utah, U.S.A. Regressionsanalysen wurden mittels GraphPad Prism dargestellt.

2.8.2 Anthropometrische Berechnungen

2.8.2.1 Body-Mass-Index

Mittels Daten für Größe und Gewicht wurde der „Body-Mass-Index“ (BMI) wie folgt

berechnet:

BMI [kg/m2] = Gewicht [kg] / (Größe [m])2

35

2.8.2.2 Waist-to-Hip-Ratio

Mittels Daten für Bauch- und Hüftumfang wurde die „Waist-to-Hip-Ratio“ (WHR) wie

folgt berechnet:

WHR = Bauchumfang [cm] / Hüftumfang [cm]

2.8.3 Berechnung von Insulinresistenz und β-Zell-Funktion

Insulinresistenz und β-Zell-Funktion wurden mit Hilfe des sogenannten HOMA-

Modells („homeostasis model assessment“) (Matthews et al., 1985), des Insulin-

Sensitivitäts-Index (ISI) nach Stumvoll (Stumvoll et al., 2000) sowie des Matsuda-

Index zur Abschätzung der Insulinsensitivität (ISI) (Matsuda und DeFronzo, 1999)

errechnet.

Grundlage des HOMA-Modells, dessen verlässliche Funktionalität wiederholt bestätigt

wurde (Katsuki et al., 2001), ist die Annahme, dass zwischen der Leber und den β-

Zellen des Pankreas ein Rückkopplungsmechanismus besteht. Während die

Insulinsekretion von der Plasmaglukosekonzentration abhängig ist, wird die

Glukosekonzentration von Glukoneogenese und Glykolyse beeinflusst. Der Grad der

Insulinresistenz und die β-Zell-Funktion wirken sich so auf die Plasmakonzentrationen

für Insulin und Glukose aus.

Das HOMA-Modell bietet einen einfach zu bestimmenden Insulinresistenz-Index. Ein

dem HOMA-Modell zugrunde liegender Algorithmus errechnet nach Eingabe der

gemessenen Insulin- und Glukose-Plasmakonzentrationen die dazugehörigen Werte für

Insulinresistenz und β-Zell-Funktion. Unter der Annahme, dass ein „Normalkollektiv“

aus Individuen besteht, die unter 35 Jahre alt und normalgewichtig sind, werden die

Werte für Insulinresistenz und β-Zell-Funktion mit 1,0 bzw. prozentual mit 100 %

festgelegt. Unter Heranziehen der basalen Nüchterninsulin- und Nüchternglukosewerte

werden Insulinresistenz und β-Zell-Funktion nach Matthews et al. (Matthews et al.,

1985) mittels folgender Formeln berechnet:

Insulinresistenz (IR) = (Insulinbasal ) [mU/l] / (22,5 x e –ln (Glukose basal ) [mmol/l] )

36

Ein niedriger Wert steht für eine hohe Insulinsensitivität, hohe Werte eher für eine

Insulinresistenz.

β-Zell-Funktion [%] = 20 x (Insulinbasal) [mU/l] / [(Glukosebasal) [mmol/l] – 3,5]

Ein weiterer wichtiger Parameter ist der Insulin-Sensitivitäts-Index (ISI) nach Stumvoll

(Stumvoll et al., 2000). Er berechnet sich anhand der nachfolgenden Formel. In die

Berechnung gehen zusätzlich zum HOMA-Modell Body-Mass-Index (BMI) und die im

Rahmen des oralen Glukose-Toleranz-Tests (oGTT) zu den entsprechenden Zeitpunkten

ermittelten Plasmainsulin- und Plasmaglukose-Konzentrationen ein:

ISIStumvoll= 0,226 - 0,0032 x BMI - 0,0000645 x InsoGTT 120 min – 0,00375 x GlcoGTT 90 min

BMI = Body-Mass-Index

InsoGTT120min = Plasmainsulin-Spiegel 120 min nach Aufnahme der oralen Glukose

GlcoGTT90min = Plasmaglukose-Spiegel 90 min nach Aufnahme der oralen Glukose

Der Matsuda-Index zur Abschätzung der Insulinsensitivität (ISI) nach Matsuda und

DeFronzo (Matsuda und DeFronzo, 1999) schließt die Insulin- und

Glukosekonzentrationen zum Zeitpunkt Null des oralen Glukosetoleranztests

(Nüchterninsulin und Nüchternglukose) und die Mittelwerte der Konzentrationen zur

jeweiligen Zeit t (in dieser Studie Blutabnahmen bei 0, 30, 60, 90, 120 min) während

des Tests in die Berechnungen ein. Dieser Index beschreibt sehr gut die

Insulinsensitivität der Gewebe und korreliert eng mit den Daten aus dem euglykämisch-

hyperinsulinämischen Clamp-Test (Matsuda, 1999). Des Weiteren wurde der Matsuda-

Index hinsichtlich seiner analytischen Relevanz bereits bestätigt (Kirwan et al., 2001)

und im Folgenden für weitere Studien verwendet. Er lässt sich wie folgt berechnen:

ISIMatsuda=10.000/√[(FPG x FPI) x (mGlcoGTT x mInsoGTT)]

FPG =Nüchternglukosekonzentration (mmol/l) FPI =Nüchterninsulinkonzentration (mU/l) mGlcoGTT =Mittelwert der Glukosekonzentrationen zur jeweiligen Zeit t des oGTT (mmol/l) mInsoGTT =Mittelwert der Insulinkonzentrationen zur jeweiligen Zeit t des oGTT (mU/l)

37

3 Ergebnisse

3.1 Probandinnencharakteristika

Entsprechend Tabelle 2 ergaben sich hinsichtlich des Alters zwischen den untersuchten

Probandinnengruppen keine signifikanten Unterschiede. Auch zeigten sich in den

Voruntersuchungen keine statistisch-signifikanten Divergenzen bezüglich der

systolischen und diastolischen Blutdruckwerte. Jedoch wiesen die Probandinnen mit

vorbestehendem Gestationsdiabetes signifikant höhere Body-Mass-Indices auf als die

Probandinnen der Kontrollgruppe (p = 0,01).

Das Geburtsgewicht der Neugeborenen, deren Mütter einen Gestationsdiabetes

entwickelten, war signifikant höher als das der Kinder der Probandinnen der

Kontrollgruppe (p = 0,04).

Hinsichtlich des Vibrationsempfindens wies keine der Probandinnen der

Gestationsgruppe pathologische Auffälligkeiten auf. In der Kontrollgruppe jedoch

zeigten drei Probandinnen einseitig reduziertes Vibrationsempfinden bis 5/8, eine

Probandin in dieser Gruppe sogar beidseits eine Hypästhesie von 5/8. In allen vier

Fällen blieb die Genese unklar. In der Gestationsgruppe ließ sich bei zwei Probandinnen

der Achillessehnenreflex nicht auslösen, bei einer Probandin konnte dieser auch auf der

kontralateralen Seite nicht ausgelöst werden. Bei einer weiteren Probandin ließ sich

zusätzlich auf der gleichen Seite der Patellarsehnenreflex trotz Bahnung nicht

reproduzieren. Das Vibrationsvermögen war bei dieser Probandin aber vollständig

erhalten.

Bei den übrigen Probandinnen fanden sich hinsichtlich der körperlichen

Untersuchungen keine besonderen Auffälligkeiten. Die Charakteristika der

Probandinnen sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

38

Tab. 2: Charakteristika der untersuchten Probandinnen

Mittelwerte ± SD *: ANOVA

3.2 Klinisch-chemische Laborparameter

Laborchemisch zeigten sich bei den Probandinnen, die nach anamnestischen Angaben

unter wenigstens einer Schwangerschaft einen Gestationsdiabetes entwickelten, im

Nüchternzustand höhere Werte für Transaminasen und γ-GT. Diese lagen aber noch im

Referenzbereich.

Die Probandinnen der Gestationsgruppe wiesen bei vergleichsweise ähnlichen Gesamt-

Cholesterinwerten bedeutend niedrigere HDL-Cholesterin-Konzentrationen (p = 0,041)

gegenüber den Kontrollprobandinnen auf.

Bei einer stoffwechselgesunden Probandin der Gestationsgruppe zeigten sich erhöhte

Leberwerte (GOT 69 U/l, GPT 132 U/l, γ-GT 49 U/l). Aufgrund mangelnder

Compliance der Probandin konnte keine weitere Diagnostik durchgeführt werden. Die

Genese blieb unklar.

Bei einer weiteren Probandin der Gestationsgruppe zeigte sich zunächst klinisch-

chemisch eine isolierte Thrombozythopenie (81000/µl), die sich bei der

Parameter [Einheit] Gestationsgruppe Kontrollgruppe p-Wert*

Alter [Jahre] 36,2 ± 5,1 37,5 ± 7,9 0,57

Gewicht [kg] 71,8 ± 13,7 63,1 ± 9,7 0,03

Größe [cm] 167 ± 6 169 ± 4 0,25

BMI [kg/m2] 25,9 ± 5,1 22,2 ± 3,2 0,01

Waist-to-Hip-Ratio 0,80 ± 0,1 0,80 ± 0,1 0,081

RR systolisch [mmHg] 114 ± 15 110 ± 12 0,4

RR diastolisch [mmHg] 72 ± 12 71 ± 11 0,68

Vibrationsempfinden [li] 7,1 ± 0,5 6,7 ± 0,9 0,59

Vibrationsempfinden [re] 7,2 ± 0,7 6,5 ± 0,9 0,017

Geburtsgewicht des Kindes [g] 3615 ± 661 3165 ± 289 0,046

39

Kontrollbestimmung nicht bestätigte, und die am ehesten auf die Einnahme von

Acetylsalizylsäure zurückzuführen war.

Gegenüber der Kontrollgruppe konnten sich keine signifikant höheren HbA1c-Werte (p

= 0,71) als bei Frauen mit einem ehemaligen Gestationsdiabetes nachweisen lassen.

Bei den übrigen Probandinnen fanden sich hinsichtlich der klinisch-chemischen

Untersuchungen keine besonderen Auffälligkeiten. Es bestand zum Zeitpunkt der

Versuchsdurchführung bei keiner der Probandinnen eine Gravidität.

Hinsichtlich Leukozytenzahl, Hämoglobin, Hämatokrit, Thrombozyten-Konzentration,

Bilirubin, GOT, GPT, Alkalischer Phosphatase, γ-GT und LDL-Cholesterin fanden sich

keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen. Die Mittelwerte der

Laborwerte sind in Tabelle 3 aufgeführt.

40

Tab. 3: Ergebnisse der klinisch-chemischen Untersuchung

Parameter [Einheit] Gestationsgruppe Kontrollgruppe p-Werta

Hämoglobin [g/dl] 13,2 ± 1,0 13,4 ± 0,7 0,55

Hämatokrit [%] 40,0 ± 2,3 40,3 ± 2,0 0,58

Thrombozyten [/nl] 238,0 ± 56,6 256,6 ± 42,9 0,26

Kreatinin [mg/dl] 0,7 ± 0,1 0,8 ± 0,1 0,16

Bilirubin [mg/dl] 0,5 ± 0,2 0,5 ± 0,2 0,71

GOT [U/l] 11,8 ± 13,3 9,1 ± 1,9 0,39

GPT [U/l] 17,0 ± 26,9 9,2 ± 3,6 0,22

AP [U/l] 98,2 ± 32,1 90,4 ± 26,3 0,42

γγγγ-GT 15,6 ± 11,8 8,3 ± 2,6 0,02

Cholesterin [mg/dl] 194,2 ± 26,3 195,1 ± 31,0 0,92

HDL-Cholesterin [mg/dl] 46,9 ± 18,8 59,1 ± 16,6 0,04

LDL-Cholesterin [mg/dl] 126,5 ± 37,4 122,0 ± 31,7 0,69

Triglyzeride [mg/dl] 114,4 ± 49,7 84,2 ± 50,1 0,07

CRP [mg/l] 2,5 ± 4,8 2,6 ± 4,2 0,91

HbA1c [%]c 5,5 ± 0,4 5,6 ± 0,6 0,71

Nüchtern-Plasmaglukose [mg/dl] 102,9 ± 7,3 138,5 ± 23,5 0,53

120-min-Plasmaglukose [mg/dl] 101,2 ± 8,6 125,1 ± 15,7 0,05

Mittelwert ± SD

a: ANOVA b: 120 min nach 75 g oraler Glukose c: Normbereich: 4,8-6,0 %

3.3 Ergebnisse des oralen Glukose-Toleranztests (oGTT)

3.3.1 Glukose-Konzentrationen im Plasma nach oraler Glukosebelastung (oGTT)

Zum Zeitpunkt –5 min und 0 min wurde jeweils ein Basiswert des

Nüchternblutzuckerspiegels bestimmt. Beide Studiengruppen wiesen zu diesen

Zeitpunkten nahezu identische Nüchternblutzuckerspiegel auf (Abb. 5). Nach oraler

Aufnahme von 75 g Glukose in standardisierter Form zeigten sich in der Zeit zwischen

60 und 120 Minuten bei Probandinnen der Gestationsgruppe signifikant höhere

Plasmaglukosespiegel als bei den Probandinnen der Kontrollgruppe (p = 0,0086).

41

Bei zwei Probandinnen zeigte sich eine Glukoseintoleranz, vier Probandinnen konnten

aufgrund eines nachgewiesenen manifesten Diabetes mellitus Typ 2 nicht weiter an der

Studie teilnehmen. Alle Probandinnen der Kontrollgruppe wiesen entsprechend den

Forderungen des Studienprotokolls und den Leitlinien der American Diabetes

Association (1997 und 2002) eine regelrechte Glukosetoleranz auf.

A: p = 0,0086; B: p < 0,0001; AB: p = 0,0051

Abb. 5: Darstellung der Glukose-Plasmakonzentrationen vor und nach Einnahme von 75 g standardisierter Glukose zum Zeitpunkt 0 min bei 20 Frauen mit ehemaligem Gestationsdiabetes (blaue Symbole) und 20 Probandinnen der Kontrollgruppe (rote Symbole). Angaben als Mittelwerte ± SEM. P-Werte sind gekennzeichnet als Unterschiede zwischen den Gruppen (A), Unterschiede durch Zeit (B) und Unterschiede infolge der Interaktion zwischen Gruppen und Zeit (AB). Mit Stern markierte Datenpunkte kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen zu einem bestimmten Zeitpunkt (p ≤ 0,05).

3.3.2 Insulin-Konzentrationen im Plasma nach oraler Glukosebelastung (oGTT)

Bereits vor Gabe der standardisierten Glukose ließ sich bei den Frauen der

Gestationsgruppe im Verhältnis zu den Probandinnen der Kontrollgruppe ein signifikant

erhöhter Insulin-Plasmaspiegel nachweisen (p < 0,05, Abb. 6). Der Unterschied nahm

nach Aufnahme von 75 g Glukose noch deutlicher zu. Besonders nach 90 und 120

Minuten der Versuchsreihe entstand eine Schere zwischen den Versuchsgruppen mit

einer signifikanten Größe von p = 0,03.

42

A: p = 0,08; B: p < 0,0001; AB: p = 0,03

Abb. 6: Darstellung der Insulin-Plasmakonzentrationen vor und nach Einnahme von 75 g standardisierter Glukose zum Zeitpunkt 0 min bei 20 Frauen mit ehemaligem Gestationsdiabetes (blaue Symbole) und 20 Probandinnen der Kontrollgruppe (rote Symbole). Angaben als Mittelwerte ± SEM. P-Werte sind gekennzeichnet als Unterschiede zwischen den Gruppen (A), Unterschiede durch Zeit (B) und Unterschiede infolge der Interaktion zwischen Gruppen und Zeit (AB). Mit Stern markierte Datenpunkte kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen zu einem bestimmten Zeitpunkt (p ≤ 0,05).

3.3.3 C-Peptid-Konzentrationen im Plasma nach oraler Glukosebelastung

(oGTT)

In ähnlicher Weise wie die beschriebene Insulin-Plasmakurve ist eine Entwicklung der

C-Peptid-Konzentrationen nach peroraler Glukosegabe zu beobachten (Abb. 7). Auch

hier sind in der Zeit zwischen 90 und 120 Minuten der Versuchsreihe signifikant höhere

C-Peptid-Spiegel in der Gestationsgruppe zu bestimmen als bei den Frauen der

Kontrollgruppe (p = 0,0094).

43

A: p = 0,19; B: p < 0,0001; AB: p = 0,0094

Abb. 7: Darstellung der C-Peptid-Plasmakonzentrationen vor und nach Einnahme von 75 g standardisierter Glukose zum Zeitpunkt 0 min bei 20 Frauen mit ehemaligem Gestationsdiabetes (blaue Symbole) und 20 Probandinnen der Kontrollgruppe (rote Symbole). Angaben als Mittelwerte ± SEM. P-Werte sind gekennzeichnet als Unterschiede zwischen den Gruppen (A), Unterschiede durch Zeit (B) und Unterschiede infolge der Interaktion zwischen Gruppen und Zeit (AB). Mit Stern markierte Datenpunkte kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen zu einem bestimmten Zeitpunkt (p ≤ 0,05).

3.3.4 GIP-Konzentrationen im Plasma nach oraler Glukosebelastung (oGTT)

Signifikante Unterschiede der Plasmaspiegel von Gesamt-GIP und aktivem GIP [1-42

Amid] waren vor Gabe von 75 g Glukose nicht erkennbar (Abb. 8). Nach

Glukosebelastung war in beiden Gruppen ein fast fünffacher Plasma-Spiegel-Anstieg

der GIP-Plasmakonzentration nachzuweisen. Die maximalen Konzentrationen lagen

nach 30 min bei 60,4 ± 4,7 (Gestationsgruppe, G) und 65,5 ± 5,7 pmol/l

(Kontrollgruppe, K) für Gesamt-GIP (p = 0,51) und 29,8 ± 1,7 (G) und 31,2 ± 1,8

pmol/l (K) für das biologisch aktive GIP [1-42 Amid] in der Gestationsgruppe

beziehungsweise der Kontrollgruppe.

Die Menge an biologisch aktivem GIP [1-42 Amid] stieg bei der Kontrollgruppe noch

an, wogegen es in der Gestationsgruppe deutlich abfiel (p = 0,11).

44

A: p = 0,30; B: p < 0,0001; AB: p = 0,57

A: p = 0,31; B: p < 0,0001; AB: p = 0,11

Abb. 8: Plasmakonzentrationen Gesamt-GIP (GIP [1–42 Amid] und seine Metaboliten) (oberer Teil der Abbildung) und biologisch aktives GIP [1–42 Amid] (unterer Teil der Abbildung) nach Aufnahme von 75 g Glukose zum Zeitpunkt 0 min bei 20 Frauen mit ehemaligem Gestationsdiabetes (blaue Symbole) und 20 Probandinnen der Kontrollgruppe (rote Symbole). Angaben als Mittelwerte ± SEM. P-Werte sind gekennzeichnet als Unterschiede zwischen den Gruppen (A), Unterschiede durch Zeit (B) und Unterschiede infolge der Interaktion zwischen Gruppen und Zeit (AB).

45

3.4 Ergebnisse des GIP-Bolustests

Nach Bolusgabe von 20 pmol GIP/kg KG intravenös erreichten beide Gruppen bis zum

Zeitpunkt 1 min einen etwa ähnlichen Anstieg der GIP-Plasmakonzentrationen (Abb.

9), wobei die Kontrollgruppe eine deutliche, aber nicht signifikant höhere

Spitzenkonzentration an GIP im Plasma verzeichnete als die Gestationsgruppe.

46

A: p = 0,15; B: p < 0,0001; AB: p = 0,97

A: p = 0,041; B < 0,0001; AB: p = 0,30

Abb. 9: Plasmakonzentrationen Gesamt-GIP (GIP [1–42 Amid] und seine Metabolite) (oberer Teil der Abbildung) und biologisch aktives GIP [1–42 Amid] (unterer Teil der Abbildung) nach intravenöser Bolusgabe von 20 pmol GIP/kg KG zum Zeitpunkt 0 min bei 20 Frauen mit ehemaligem Gestationsdiabetes (blaue Symbole) und 20 Probandinnen der Kontrollgruppe (rote Symbole). Angaben als Mittelwerte ± SEM. P-Werte sind gekennzeichnet als Unterschiede zwischen den Gruppen (A), Unterschiede durch Zeit (B) und Unterschiede infolge der Interaktion zwischen Gruppen und Zeit (AB).

47

3.4.1 Glukose-Konzentrationen im Plasma nach intravenöser GIP-Bolusgabe

Die Plasmaglukosekonzentrationen blieben nach Bolusgabe in beiden Gruppen konstant

(Abb. 10) und zeigten ein gleiches Niveau über den Untersuchungszeitraum von 30 min

(p = 0,47).

A: p = 0,038; B: p < 0,0001; AB: p = 0,47

Abb. 10: Glukose-Plasmakonzentrationen nach intravenöser Bolusgabe von 20 pmol GIP/kg KG zum Zeitpunkt 0 min bei 20 Frauen mit ehemaligem Gestationsdiabetes (blaue Symbole) und 20 Probandinnen der Kontrollgruppe (rote Symbole). Angaben als Mittelwerte ± SEM. P-Werte sind gekennzeichnet als Unterschiede zwischen den Gruppen (A), Unterschiede durch Zeit (B) und Unterschiede infolge der Interaktion zwischen Gruppen und Zeit (AB).

48

3.4.2 Insulin-Konzentrationen im Plasma nach intravenöser GIP-Bolusgabe

Die Insulin-Plasmakonzentrationen stiegen nach Gabe von GIP in beiden Gruppen

signifikant an (Abb. 11, p < 0,0001). Unterschiede der Konzentrationen zwischen den

Gruppen waren jedoch nicht nachweisbar (p = 0,99).

A: p = 0,28; B: p < 0,0001; AB: p = 0,99

Abb. 11: Insulin-Plasmakonzentrationen nach intravenöser Bolusgabe von 20 pmol GIP/kg KG zum Zeitpunkt 0 min bei 20 Frauen mit ehemaligem Gestationsdiabetes (blaue Symbole) und 20 Probandinnen der Kontrollgruppe (rote Symbole). Angaben als Mittelwerte ± SEM. P-Werte sind gekennzeichnet als Unterschiede zwischen den Gruppen (A), Unterschiede durch Zeit (B) und Unterschiede infolge der Interaktion zwischen Gruppen und Zeit (AB).

3.4.3 C-Peptid-Konzentrationen im Plasma nach intravenöser GIP-Bolusgabe

Ähnlich der Insulin-Plasmakonzentrationen verhielten sich auch die C-Peptid-

Plasmaspiegel. Gleichwohl sie sowohl in der Gestations- wie auch in der

Kontrollgruppe anstiegen, waren hinsichtlich ihrer Gesamt-Plasmakonzentration keine

Unterschiede zwischen den Gruppen erkennbar (Abb. 12, p = 0,38).

49

A: p = 0,08; B: p < 0,0001; AB: p = 0,38

Abb. 12: C-Peptid-Plasmakonzentrationen nach intravenöser Bolusgabe von 20 pmol GIP/kg KG zum Zeitpunkt 0 min bei 20 Frauen mit ehemaligem Gestationsdiabetes (blaue Symbole) und 20 Probandinnen der Kontrollgruppe (rote Symbole). Angaben als Mittelwerte ± SEM. P-Werte sind gekennzeichnet als Unterschiede zwischen den Gruppen (A), Unterschiede durch Zeit (B) und Unterschiede infolge der Interaktion zwischen Gruppen und Zeit (AB).

3.5 Ergebnisse der Indices für Insulinsensitivität und β-Zell-Funktion

In den Tabellen 4 und 5 sind die Berechnungen der Indices der Insulinsensitivität bzw.

Insulinresistenz und Daten, die die β-Zell-Funktion ausdrücken, zusammengefasst.

Hierbei zeigt die Gestationsgruppe deutliche Hinweise einer Insulinresistenz. Die

Berechnungen des HOMA-Modells ergeben einen signifikanten Unterschied

hinsichtlich einer Insulinresistenz zu Ungunsten der Gestationsgruppe (Tab. 4; p =

0,029). Ebenso sind die Stumvoll- und Matsuda-Indices zur Darstellung der

Insulinsensitivität in der Gestationsgruppe entsprechend vermindert (p = 0,0014 für den

Stumvoll-Index und p = 0,0079 für den Matsuda-Index) (Tab. 4).

50

Tab. 4: Indices der Insulin-Sensitivität

Index Gestationsgruppe Kontrollgruppe p-Wert* Referenz

HOMA-

Insulinresistenz 2,47 ± 0,29 1,67 ± 0,18 0,029 A

Stumvoll-Index 1,106 ± 0,005 1,125 ± 0,003 0,0014 B

Matsuda-Index 3,64 ± 0,29 5,62 ± 0,61 0,007 C

Mittelwerte ± SEM

*: ANOVA

Referenzen: A = Matthews et al., 1985; B = Stumvoll et al., 2000; C = Matsuda et al., 1999

Die β-Zell-Funktion, ebenfalls berechnet durch das HOMA-Modell, gibt mit einem p-

Wert von 0,09 keine signifikante Verminderung der endokrinen Funktion der

Langerhans-Zellen wider. Der Erhalt der Funktion wird anhand der Ergebnisse des

Stumvoll- und des Insulinogenen Index unterstrichen. Hier finden sich keine

signifikanten Größen (p = 0,86 für den Stumvoll-Index; p = 0,64 für den Insulinogenen

Index) (Tab. 5).

Tab. 5: Indices der β-Zell-Funktion

Index Gestationsgruppe Kontrollgruppe p-Wert* Referenz

HOMA-

β-Zell-Funktion [%] 92,1 ± 12,6 66,1 ± 7,3 0,09 A

Stumvoll-Index 656,9 ± 89,1 635,6 ± 80,2 0,86 B

Insulinogener Index

OGTT(30’) 60,1 ± 6,7 65,5 ± 7,5 0,64 D

Mittelwerte ± SEM

*: ANOVA

Referenzen: A = Matthews et al., 1985; B = Stumvoll et al., 2000; D = Selzer et al.; 1967

51

4 Diskussion

In der Vergangenheit wurde in unterschiedlichen Studien über die Veränderungen des

Stoffwechsels beim Gestationsdiabetes berichtet. Besonders die Forschungsgruppe

unter Hornnes und Kühl lieferte wichtige Daten zur Ätiologie und (Patho-) Physiologie

dieser Kreisläufe (Kühl et al., 1985; Kühl und Hornnes, 1986). Darüber hinaus wurde

wiederholt eine reduzierte insulinotrope Wirkung von GIP bei Patienten mit einem Typ-

2-Diabetes beschrieben. Die hierfür zugrunde liegenden Mechanismen sind zu einem

großen Teil noch unklar (Nauck et al., 1993a; Meier et al., 2001). Beachtlich ist dabei

auch, dass bei etwa 50 % der erstgradig Verwandten von Typ-2-Diabetikern mit noch

normaler Glukosetoleranz ebenfalls schon eine verminderte insulinotrope Wirkung von

GIP nachweisbar ist (Meier et al., 2001). Es wird vermutet, dass primär eine

eingeschränkte Insulinsekretion hierfür verantwortlich ist und im Weiteren die

Ausprägunug der Insulinresistenz sowie der Krankheitsprogression des Diabetes

gefördert wird. Für die verminderte insulinotrope Wirkung von GIP könnte zum einen

eine verminderte Expression des GIP-Rezeptors oder eine Veränderung der

Signaltransduktion des GIP-Signals verantwortlich sein, zum anderen könnte ein

genereller Defekt der β-Zellen eine Rolle spielen.

In der Schwangerschaft ist die Sekretion von Inkretinen erheblich vermindert. Bei

normalgewichtigen Frauen mit Gestationsdiabetes zeigt sich postpartum tendenziell ein

Fortbestehen dieses Stoffwechselphänomens. Daneben zeigt sich - besonders bei

übergewichtigen Frauen - während der Schwangerschaft eine verminderte

Insulinantwort nach Aufnahme von Glukose (Hornnes et al., 1981). Die bisherige

Studienlage geht davon aus, dass die Entwicklung eines Gestationsdiabetes nicht auf

diese Stoffwechselveränderung allein zurück zu führen ist. Es ist jedoch eine

Korrelation des während der Schwangerschaft physiologisch ansteigenden

Kortisolspiegels und der damit einhergehenden Verminderung der Glukosetoleranz

nachweisbar, aus der sich die Insulinresistenz entwickelt (Hornnes und Kühl, 1986).

In der vorliegenden Arbeit wurde daher die insulinotrope Wirkung von GIP bei

Probandinnen mit postpartal normoglykämer Stoffwechselsituation nach

vorbestehendem Gestationsdiabetes untersucht. Die Untersuchungen sollten auch

52

helfen, die Frage zu klären, welche Mechanismen dazu führen, dass Frauen mit

früherem Gestationsdiabetes ein deutlich erhöhtes Risiko für die spätere Entwicklung

eines Typ-2-Diabetes haben.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten darauf hin, dass ein wichtiger Faktor der

Insulinresistenz-Entstehung ein erhöher Body-Mass-Index ist. Dieser war in der

Gestationsgruppe signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Mit zunehmendem BMI

stieg proportional die Insulin-Plasmakonzentration nach intravenöser GIP-Bolusgabe.

Dieses Phänomen konnte auch in der Kontrollgruppe bei drei adipösen Probandinnen

beobachtet werden. Des Weiteren fanden sich entsprechend der Insulinresistenz deutlich

höhere Plasmaglukose-Spiegel und C-Peptid-Spiegel in der Gestationsgruppe als

Ausdruck der bestehenden Insulinresistenz. Die höheren Insulin- und C-Peptid-

Antworten nach GIP-Bolusgabe deuten darauf hin, dass bei den untersuchten Frauen

mit ehemaligem GDM zum Zeitpunkt der Untersuchung keine ausgeprägte Störung der

Insulinsekretion vorlag.

Die laborchemischen Daten lieferten ebenfalls Hinweise für eine veränderte

Stoffwechsellage der Probandinnen mit einem Gestationsdiabetes in der Anamnese. So

lagen in der Gestationsgruppe deutlich höhere Triglycerid- und LDL-Cholesterin-

Serumspiegel im Verhältis zu relativ niedrigen HDL-Cholesterin-Spiegeln vor (Tab. 3)

Im Hinblick auf vorliegende Daten einer veröffentlichten Studie von Kautzky-Willer et

al. (Kautzky-Willer et al., 2003), in der ein höherer Fettgehalt in der Skelettmuskulatur

bei Frauen mit einem früheren und insbesondere insulinpflichtigen Gestationsdiabetes

nachgewiesen werden konnte, lassen sich Hinweise auf eine Pathogenese für einen sich

später entwickelnden Diabetes mellitus Typ 2 herleiten. Das vermehrte Angebot freier

Fettsäuren in den Muskelzellen führt infolge eines Anstiegs an intramitochondrialer

Acetyl-CoA zu einer Inhibierung der Pyruvatdehydrogenase und damit zu einer

Anhäufung von Citrat. Hieraus resultiert ein Anstieg der intrazellulären

Glukosekonzentration und eine Abnahme des Glukose-Transports in die Zelle. Darüber

hinaus verursachen freie Fettsäuren und deren Metabolite eine Störung der Insulin-

Signaltransduktionskaskade. Betroffen sind besonders die Insulin-Rezeptor-Substrate

IRS-1 und IRS-2, die weniger effektiv phosphoryliert werden, und die

Phophatidylinositol-3-Kinase (PI-3), deren Phosphorylierung ebenfalls gestört ist.

Hierdurch wird die Translokation des Glukosetransporters GLUT-4 an die Zellmembran

nicht mehr ausreichend gewährleistet und die Glukoseaufnahme in die Zelle gestört.

53

Auf diese Weise wird die Insulinsensitivität vermindert (Randle et al. 1964; Shulman,

2000). Dieser metabolische Mechanismus wird in Abb. 13 veranschaulichend

dargestellt.

Abb. 13: Mechanismus der fettsäureinduzierten Insulinresistenz, modifiziert nach Shulman, 2000.

Abkürzungen: IRS=Insulin-Rezeptor-Substrat; PI3=Phosphatidylinositol-3-Kinase; Acetyl-CoA=

Acetyl-CoenzymA; GLUT=Glukosetransporter; PK=Proteinkinase.

Nach peroraler Aufnahme von standardisierter Glukose-Lösung mit 75 g Glukose zeigte

sich bei den Probandinnen, die mindestens eine Schwangerschaft mit Gestationsdiabetes

angaben, ein signifikant (p ≤ 0,05) höherer Anstieg der Plasmakonzentrationen an

Glukose, C-Peptid und Insulin in dem Untersuchungszeitraum im Vergleich zu den

Probandinnen der Kontrollgruppe. Zur Ermittlung der Insulinresistenz wurde der

Matsuda-Index zur Abschätzung der Insulinsensitivität (ISI) (Matsuda und DeFronzo,

1999), der Insulin-Sensitivitäts-Index (ISI) nach Stumvoll (Stumvoll et al., 2000), sowie

das HOMA-Modell (HOMA-Calculator der University of Oxford, Großbritannien)

verwendet.

Acetyl-

CoA ↑

Fettsäuren

GLUT-4

Glukose

Citrat ↑

PK

Glukose

Citrat-

Zyklus

GLUT-4↓

Insulin

IRS-1/-2

PI3-

Kinase↓

54

Die Berechnungen des HOMA-Modells hinsichtlich einer Insulinresistenz ergaben

deutlich höhere Werte in der Gestationsgruppe als bei den Kontrollprobandinnen. Des

Weiteren errechnete sich für den Matsuda-Index ein p-Wert von 0,007 und für den

Stumvoll-Index ein p-Wert von 0,0014. Daraus ergab sich eine Signifikanz für eine

relative Insulinresistenz und niedrigere Insulinsensitivität bei den Frauen der

Gestationsgruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen (Meier et al., 2005) unterstreichen die Daten

veröffentlichter Studien, in denen ebenfalls über Insulinresistenz und eingeschränkte

Insulinsensitivität bei Frauen mit Gestationsdiabetes in der Anamnese berichtet wurde.

Diese Befunde weisen darauf hin, dass nach Ablauf einer Schwangerschaft mit

Gestationsdiabetes eine Insulinresistenz dauerhaft bestehen bleiben und auch eine

eingeschränkte Glukosetoleranz nach sich ziehen kann.

Ein Parameter zur Quantifizierung der Insulinsekretion nach oraler Glukosegabe ist der

Insulinogene Index oGTT 30’. Ferner wird die β-Zell-Funktion durch das HOMA-

Modell und den Stumvoll-Index sehr gut dargestellt. Hier ergaben sich keine

signifikanten Unterschiede zwischen den beiden untersuchten Gruppen.

Wie den Ergebnissen dieser Studie zu entnehmen ist, konnten entgegen anderen Studien

(Ward et al., 1985) und in Einklang mit einer Studie von Ryan et al. aus dem Jahre 1995

nachgewiesen werden, dass offensichtlich eine signifikante Korrelation zwischen einem

abgelaufenen Gestationsdiabetes und der Entwicklung einer Insulinresistenz (p ≤ 0,05)

besteht. Ein Hinweis für eine verminderte β-Zell-Funktion mit einer eingeschränkten

Insulinsekretion (p > 0,05) fand sich nicht. Offenbar wird die Insulinresistenz durch

eine erhöhte Insulinsekretionsrate kompensiert. Dies wird durch die anhaltend erhöhten

C-Peptidkonzentrationen im Plasma bis 90 Minuten nach oraler Glukosebelastung

gestützt.

Bei der Pathogenese des Typ-2-Diabetes spielt neben der durch genetische Faktoren und

Umweltfaktoren bedingten Entwicklung einer Insulinresistenz auch eine frühzeitige

Funktionseinschränkung der β-Zell-Funktion eine Rolle.

Zur Stützung der These, dass die Entwicklung der Insulinresistenz maßgeblich ist,

konnten Buchanan et al. 2002 durch Gabe des Insulinsensitizers Troglitazon bei Frauen

55

mit stattgehabtem GDM zeigen, dass diese Intervention zu einer Reduktion der Inzidenz

eines Typ-2-Diabetes um ca. 50 % führt. Dies stützt die Hypothese, dass die

Entwicklung der Insulinresistenz der Entwicklung der Insulinsekretionsstörung

vorausgeht. Insulin-Sensitizer wie Troglitazon aktivieren den Zellkern-Rezeptor PPAR

(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) vom Typ γ. Dieser wird daraufhin in den

Kern verlagert, wo er als Transkriptionsfaktor aktiv wird. Dadurch bewirkt PPAR eine

Regulation verschiedener Mechanismen im Kohlenhydrat- und Fettstoffwechsel. Die

Aktivierung erhöht die Empfindlichkeit der Zellen von Leber, Muskulatur und

Fettgewebe für Insulin und wirkt damit einer Senkung der Insulinrestenz entgegen.

Auch die Wirkung von parenteral zugeführtem Insulin wird verstärkt. Fettsäuren und

Glukose werden dadurch besser verstoffwechselt.

Die vorliegenden Untersuchungen zeigen, dass nach einer definierten oralen Glukose-

Belastung bei den Frauen mit anamnestischen GDM im Vergleich zur Kontrollgruppe

eine signifikante Erhöhung der Glukose- und Insulin-Plasmaspiegel während des

zweistündigen Untersuchungszeitraumes persistiert.

Im Vergleich zu vorhergehenden Studien wurde des Weiteren die Konzentration und

das metabolische Verhalten des Inkretinhormons GIP im Plasma untersucht, um dessen

Rolle bei der Entwicklung der metabolischen Veränderungen zu charakterisieren.

Hierbei ergaben sich im Rahmen des oralen Glukose-Toleranztests (oGTT) im

Vergleich zur Kontrollgruppe ein vergleichsweise niedriger GIP-Plasmaspiegel,

insbesondere des aktiven GIP [1-42 Amid]. Dieser Unterschied war jedoch nicht

signifikant. Dennoch ist die messbare Plasma-Konzentration an biologisch aktivem GIP

zwei Stunden nach Glukose-Aufnahme höher als in der Gestationsgruppe.

Nach intravenöser Gabe einer definierten Menge GIP (20 pmol/kg KG) zeigten sich in

den beiden Gruppen keine signifikanten Unterschiede in den Konzentrationsverläufen

von Glukose und Insulin. Es konnten gleichbleibende Plasmakonzentrationen für

Glukose und Insulin sowohl in der Gestations- als auch in der Kontrollgruppe gemessen

werden. In der Kontrollgruppe waren die gemessenen Konzentrationen an biologisch

aktivem GIP [1-42 Amid] signifikant höher (p = 0,041) als Hinweis auf mögliche

Unterschiede in der Spaltung und Metabolisierung des exogen gegebenen GIP.

Die untersuchten Probandinnen der Gestationsgruppe wiesen weder unter

Glukosebelastung noch unter Bolusgabe von GIP eine eingeschränkte Glukosetoleranz

auf. Obgleich die Indizes für eine Insulinresistenz in der Gestationsgruppe höher waren,

56

zeigte sich aber kein Unterschied in der β-Zell-Funktion. Die vorliegenden Ergebnisse

stützen die These Buchanans et al. (2002), die besagt, dass eine chronische

Insulinresistenz bereits vor Auftreten eines β-Zell-Defektes besteht und pathogenetisch

einen Diabetes mellitus Typ 2 begünstigt.

Ungeklärt ist, ob Patientinnen mit Gestationsdiabetes im Laufe des Lebens entsprechend

der aktuellen Datenlage in jedem Fall einen Diabetes mellitus Typ 2 entwickeln

könnten. Die Inzidenz der Entwicklung eines Diabetes mellitus Typ 2 nach einer

Schwangerschaft mit GDM liegt je nach Studie bei bis zu 70 % innerhalb von 11 Jahren

(Petersen et al., 1996; Kim et al., 2002).

Die vorliegenden Ergebnisse können keine Prognosen hinsichtlich einer Entwicklung

einer diabetischen Stoffwechsellage für die Probandinnen liefern, da der Zeitraum

zwischen Geburt des Kindes und Teilnahme an dieser Untersuchung durchschnittlich

etwa 4,7 Jahre (55,8 Monate) betrug. Daher erscheint ein weiterer oraler Glukose-

Toleranztest nach dem entsprechenden Intervall sinnvoll, um die dann bestehende

Stoffwechsellage zu verifizieren. Desweiteren kann die Durchführung eines

hyperglykämischen „Clamp-Versuchs“ (Meier et al., 2001), einen möglichen Defekt in

der β-Zell-Funktion eindeutiger erfassen. Hyperglykämische Clamps sind jedoch

aufwändig und invasiv und somit nicht für breitgestreute Routineuntersuchungen

geeignet.

Die Fragestellung dieser Arbeit war es, die insulinotrope Wirkung von GIP bei aktuell

normoglykämen Patientinnen nach vorbestehendem Gestationsdiabetes zu untersuchen

und den Vergleich zu stoffwechselgesunden Patientinnen darzustellen (Meier et al.,

2005). In der Vergangenheit wurde bereits untersucht, inwieweit GIP eine Rolle bei der

Pathogenese des Diabetes mellitus Typ 2 spielt. Nauck et al. konnten nachweisen, dass

der Inkretineffekt bei Personen mit einem Diabetes mellitus Typ 2 herabgesetzt ist und

die exogene Gabe von GIP in vivo bei diesen Personen eine reduzierte Insulinantwort

herbeiführt (Nauck et al., 1986 b; 1993 a). Diese Ergebnisse konnten durch Meier et al.

2001 bei erstgradig Verwandten im Rahmen eines hyperglykämischen „Clamp-

Versuches“ noch erweitert und unterstrichen werden. In der Komplexität der

multifaktoriellen Pathogenese des Diabetes mellitus Typ 2 ist also die reduzierte

insulinotrope Wirksamkeit von GIP ein wichtiger Baustein. Inwieweit jedoch ein

57

Funktionsverlust von GIP oder der β-Zell-Defekt die zentrale Rolle in der Pathogenese

einnimmt, muss durch weitere Untersuchungen näher beleuchtet werden. Zuletzt wurde

GIP als Auslöser einer prodiabetogenen Kaskade mit der Folge eines Diabetes mellitus

Typ 2 verantwortlich gemacht (Nauck et al., 2004).

Nach Gabe von 75 g Glukose zeigte sich in der Gestationsgruppe eine signifikant

schlechtere Glukosetoleranz (Abb. 5 und 6) mit deutlich erhöhten Insulin-

Plasmaspiegeln als Hinweis für eine ausgeprägtere Insulinresistenz als bei der

Kontrollgruppe. Parallel dazu stieg die Plasmakonzentration an GIP eine Minute nach

GIP-Bolus-Injektion in der Kontrollgruppe insignifikant höher an. Die Konzentrationen

an biologisch aktivem GIP [1-42 Amid] waren jedoch in beiden Gruppen nahezu

identisch. Ein genetisch determinierter Unterschied in der Metabolisierung von GIP

lässt sich mangels Signifikanz daher nicht vermuten.

Die Insulin- und C-Peptid-Konzentrationen waren in beiden Gruppe nach Gabe von

exogenen GIP nahezu gleich, so dass aus diesen Ergebnissen ein Defekt des GIP-

Rezeptors oder eine mangelnde Expression des Rezeptors nicht hergeleitet werden

kann. Sämtliche Parameter der β-Zell-Funktion stellten sich normwertig dar. Im

Vergleich zu erstgradig Verwandten von Personen mit Diabetes mellitus Typ 2 (Meier

et al., 2001), die zu 50 % eine Verminderung der insulinotropen Wirkung von GIP

zeigten, kann daher vermutet werden, dass im weiteren Verlauf ein Funktionsverlust der

endokrinen β-Zellen noch folgt.

Die therapeutischen Möglichkeiten eines Diabetes mellitus umfassen gemäß Leitlinien

der Deutschen Diabetes Gesellschaft sowie dem Konsuspapier der amerikanischen und

europäischen Diabetes Gesellschaft zunächst Aufklärung und Schulung im Sinne einer

Umstellung der Ernährung und Intensivierung der Bewegung (Lebensstilintervention)

mit dem Ziel der Gewichtsreduktion. Bei mangelnder Ansprechbarkeit wird im zweiten

Schritt eine Behandlung mit oralen Antidiabetika und im Weiteren die Gabe von Insulin

empfohlen. Eine Vielzahl an Antidiabetika, wie Metformin, Sulfonylharnstoff und

Acarbose, sind in der Behandlung des Diabetes mellitus in der Regel gut wirksam

(Matthaei und Häring, 2007; Nathan et al., 2006).

Es sollten aber neue Antidiabetika gefunden werden, da zum einen die derzeit

verfügbaren Antidiabetika Limitationen haben und zum anderen die Wirksamkeit der

58

gängigen oralen Therapeutika im Krankheitsverlauf abnimmt und im Verlauf Glukose-

Plasmaspiegel und HbA1c-Werte als Zeichen der fortschreitenden Funktionseinbußen

der β-Zellen kontinuierlich zunehmen (United Kingdom Prospective Diabetes Study

Group, 1995).

Die Inkretine besitzen durch ihre insulinotrope Wirkung in der aktuellen Forschung

daher einen hohen Stellenwert, da inkretinbasierte Therapiemöglichkeiten des Typ-2-

Diabetes glukoseabhängig die Insulinsekretion stimulieren und darüber hinaus weitere

günstige Wirkungen aufweisen. In diesem Zusammenhang wurden DPP IV-Inhibitoren,

z.B. Sitagliptin, entwickelt, die die biologische Halbwertszeit der Inkretine, vor allem

von GLP-1, verlängern (Mari et al., 2005) und verstärken (Gallwitz, 2006). DPP IV-

Inhibitoren haben zusätzlich die Eigenschaft, bei Diabetikern den HbA1c-Wert und

Triglyzerid-Serum-Spiegel zu senken und eine glukoseabhängige Insulinsekretion bei

gleichzeitiger Inhibierung der Glukagonsekretion zu fördern (Pratley et al., 2006).

Außerdem scheinen sie einen positiven Einfluss auf die β-Zell-Funktion auszuüben und

trotz Verminderung des basalen Blutzucker-Spiegels um 32 % (Rosenstock et al., 2007)

kein höheres Risiko der Hypoglykämie zu verursachen, wie ein Vergleich mit

Metformin oder Placebo in klinischen Studien zeigten (Gallwitz, 2005).

Im Tierversuch mit neugeborenen Ratten konnte nach Gabe von DPP IV-Inhibitoren

eine Zunahme der β-Zell-Masse um etwa 50 % und eine Vermehrung des Insulingehalts

der Langerhans-Inseln und somit eine Steigerug der β-Zell-Funktion nachgewiesen

werden (Duttaroy et al., 2005).

Da DPP IV auch auf CD26-Lymphozyten exprimiert wird, bleibt abzuwarten, inwieweit

eine ungünstige immunologische Modulierung durch die Hemmung der Enzymfunktion

herbei geführt werden könnte (Villhauer et al., 2003).

Des Weiteren sind DPP IV-resistente GLP-1-Rezeptor-Agonisten, sogenannte

„Inkretinmimetika“ (z.B. Exenatide, Liraglutide) entwickelt worden, welche

entsprechend der Eigenschaften des GLP-1 die glukoseabhängige Insulinbiosynthese

fördern und eine Stimulation der Transkription des Proinsulins bewirken, woraus sich

nachhaltig langfristig eine Stimulierung der β-Zell-Proliferation (Wajchenberg, 2007)

ergibt. Außerdem wird die Magenentleerung verzögert, wodurch sich die

Nahrungsaufnahme reduzieren lässt, um sekundär einer Adipositas vorzubeugen

(Nielsen et al., 2004).

59

Trotz Zulassung von Inkretinmimetika und DPP IV-Inhibitoren bleibt weiterhin die

Entwicklung neuer Antidiabetika wichtiger Forschungsschwerpunkt.

Überlegungen, auch GIP könnte eine Rolle in der Therapie des Diabetes mellitus Typ 2

einnehmen, da es seinen insulinotropen Effekt bei hohen Blutzucker-Spiegeln

ausschöpft und zusätzlich protektiv auf die Langerhansschen Inselzellen wirkt (Trümper

et al., 2002,) müssen zum aktuellen Zeitpunkt verworfen werden, da wiederholt der

Verlust der insulinotropen Eigenschaften von GIP bei Diabetikern nachgewiesen wurde.

Für GLP-1 trifft dieser Wirkungsverlust nicht zu (Nauck et al.,1993a, Meier et al.,

2001), so dass GLP-1 aus diesem Grund das attraktivere Wirkprinzip für die Therapie

des Typ-2-Diabetes aufweist. Neben dem DPP IV-Inhibitor Sitagliptin ist mit Exenatide

auch schon ein erstes GLP-1 ähnliches "Inkretin-Mimetikum" zur Diabetesbehandlung

verfügbar (Gallwitz, 2005).

Hingegen sind GIP-Rezeptor-Antagonisten aktuell im Fokus der Wissenschaft.

Hinweise für eine Nutzbarkeit eines GIP-Rezeptor-Antagonisten zur Behandlung des

Diabetes mellitus Typ 2 liegt in der Tatsache, dass im Mäuseversuch unter Veränderung

der GIP-Struktur an der Position, an der die DPP IV ansetzt (Glu3), besonders

(Lys3)GIP eine erhöhte Resistenz gegenüber DPP IV aufweist, wobei jedoch auch eine

signifikant herabgesetzte Wirksamkeit dieses GIP-Analogons in der intrazellulären

cAMP-Produktion erkennbar ist. Hingegen hat ein Austausch des (Glu3) mit (Ala3),

(Phe3) oder (Tyr3) an Position 3 einen signifikant verminderten Insulin-Plasma-Spiegel

(Gault et al., 2007) zur Folge.

60

5 Zusammenfassung

Fragestellung: Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die insulinotrope Wirkung von

Gastric Inhibitory Polypeptide (GIP) bei aktuell normoglykämen Patientinnen nach

vorbestehendem Gestationsdiabetes (GDM) zu untersuchen und den Vergleich zu

stoffwechselgesunden Patientinnen darzustellen. In beiden Gruppen nahmen jeweils 20

Probandinnen teil. An zwei nicht aufeinander folgenden Tagen wurden ein oraler

Glukosetoleranztest (oGTT) und ein GIP-Bolus-Test, bei welchem den Probandinnen

synthetisch hergestelltes, humanes GIP intravenös appliziert wurde, durchgeführt.

Methoden: In beiden Untersuchungen wurden sowohl die Plasma-Glukose-

Konzentrationen als auch die Insulin- und C-Peptid-Plasmaspiegel zu definierten

Zeitpunkten bestimmt. Nach Gabe von GIP wurden des Weiteren die Plasma-Spiegel

von Gesamt-GIP und biologisch aktivem GIP [1-42 Amid] gemessen.

Ergebnisse: Der oGTT ergab nach Glukosebelastung in der Gestationsgruppe

signifikant erhöhte Glukose-Plasmaspiegel, die Hinweise auf eine relative

Glukoseintoleranz bzw. herabgesetzte Insulinsensitivität geben. Eine signifikante

Einschränkung der β-Zell-Funktion konnte aber nicht beobachtet werden (Anwendung

von Stumvoll- und Insulinogenem Index sowie des HOMA-Modells). Die Probandinnen

der Gestationsgruppe kompensierten die herabgesetzte Insulinsensitivität mit einer

gesteigerten Insulinsekretion.

Im Rahmen des GIP-Bolus-Testes konnten hinsichtlich der Insulin- und C-Peptid-

Sekretion keine Differenzen in den beiden untersuchten Gruppen ermittelt werden.

Diskussion: Der Gestationsdiabetes stellt ein erhöhtes Risiko dar, im weiteren Verlauf

einen Diabetes mellitus Typ 2 zu entwickeln. Die Ergebnisse dieser Arbeit

unterstreichen dieses Risiko, da die ermittelten pathologischen Parameter eine erhöhte

Insulinresistenz nachweisen. Es liegt jedoch kein Defekt in der Wirkung von GIP vor.

Für die Manifestation und Krankheitsprogression eines Diabetes mellitus Typ 2 ist der

Funktionsverlust der β-Zellen verantwortlich. Die Insulinresistenz ist bei den hier

untersuchten Patientinnen mit stattgehabtem Gestationsdiabetes vor der

Insulinsekretionsstörung manifest.

61

Zum aktuellen Zeitpunkt kann jedoch das individuelle Risiko der untersuchten

Probandinnen mit voraus gegangenem Gestationsdiabetes, an einem manifesten

Diabetes mellitus Typ 2 zu erkranken, noch nicht abgeschätzt werden. Aus diesem

Grund sollten ein oGTT respektive ein „Clamp“-Versuch zu einem späteren Zeitpunkt

im Verlauf wiederholt werden.

62

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7 Danksagungen

Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. Baptist Gallwitz für die Überlassung dieses interessanten

Themas und die effektive Unterstützung in der Rekrutierung der Probandinnen.

Danken möchte ich Herrn Dr. med. Juris J. Meier für seine Anregungen und praktischen

Tipps. Er war allzeit ein Ansprechpartner, der mit seiner Geduld und seiner fundierten

Sachkenntnis immer wieder zur Seite stand.

Frau Birgit Baller danke ich für die Unterstützung in den ELISA-Bestimmungen und die nette

Atmosphäre bei den Versuchen.

Ich danke dem Team um Dr. Carolyn Deacon und Dr. Jens J. Holst, Abteilung Medizinische

Physiologie des Panum Instituts der Universität Kopenhagen, Dänemark, für die

Durchführung der Radioimmunoassays zur Messung der unterschiedlichen Molekularformen

von GIP.

Meiner Schwester Dr. Anke Rattenholl danke ich für ihren intensiven Einsatz in der Korrektur

dieser Arbeit und die Diskussion der Thematik aus biochemischer Sicht.

Danken möchte ich Michael Düll für die Rettung und Wiederherstellung dieser Dissertation,

die kurz vor Fertigstellung beinahe im Äther des Computers verschwunden wäre.

Ferner gilt mein Dank allen Probandinnen, ohne die diese Arbeit niemals hätte zu Stande

kommen können sowie den Kolleginnen und Kollegen, die ihre Patientinnen für diese Studie

motivieren konnten.

8 Curriculum vitae

Persönliche Daten:

Meik Askenas

geb. 24.06.1973 in Bielefeld

Familienstand: verheiratet, 1 Tochter, 2 Söhne

Schulbildung:

1979-1983 Grundschule „Am Heeperholz“ in Bielefeld

1983-1992 Gymnasium Heepen in Bielefeld mit Abschluss der Hochschulreife

Zivildienst:

1992-1993 I. Medizinische Klinik der Städtischen Kliniken Bielefeld-Mitte,

Schwerpunkt Diabetologie

Berufsausbildung:

1993-1996 Ausbildung zum Krankenpfleger in den Städtischen Kliniken Bielefeld-Mitte

Hochschulbildung:

1996-2002 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum

09/1998 Ärztliche Vorprüfung

08/1999 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

09/2001 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

04/2002-05/2003 Praktisches Jahr in den Krankenanstalten Gilead in Bielefeld

(Akad. Lehrkrankenhaus der Westfälischen Wilhelms-Universität

Münster)

05/2003 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

Famulaturen:

02-03/1999 Universitätsklinikum Essen - Abteilung für Gastroenterologie und Hepatologie

02-03/2000 Städtische Kliniken Bielefeld-Mitte - II. Medizinische Klinik (Kardiologie)

09/2000 University of Ghana, Korle Bu Teaching Hospital, Accra - Chirurgische Klinik

03/2001 Universitätsklinikum St. Josef Hospital Bochum - Chirurgische Klinik

04/2002 zusätzliches Praktikum im Klinikum Herford - Kinderklinik

Studienbegleitende Tätigkeiten:

10/1996-03/2001 Krankenpflege in den Städtischen Kliniken Bielefeld-Mitte,

I. Medizinische Klinik, Schwerpunkt Diabetologie

Berufliche Tätigkeiten als Arzt:

seit 07/2003 Tätigkeit als Assistenzarzt im Evangelischen Krankenhaus Bielefeld,

Kinderzentrum