Historia del CRISPR/Cas9El sistema CRISPR/Cas9 es un mecanismo de defensa adaptativa utilizado por Archea y bacterias para degradar material gentico extrao. En estos organismos, el material gentico extrao de un bacterifago es integrado en el loci CRISPR (1,2). Este nuevo material, tambin conocido como espaciador, genera un fragmento de secuencia especifica que ser utilizado como resistencia contra futuras infecciones del bacterifago. Estos fragmentos de secuencia especifica se traducen en CRISPR ARNs cortos (crRNAs) y funcionan como gua para dirigir la excisin del ADN invasor complementario, mediante actividad nucleasa de la protena CRISPR- asociada (Cas) codificada tambin en el loci CRISPR (1,2). La nucleasea Cas9 del sistema CRISPR tipo II tiene un dominio de unin al ARN, y un lbulo hlice alfa (REC), un lbulo de nucleasa que incluye, RuvC y HNH para la escisin del ADN y un motivo adyacente protospacer (PAM) que interacta con (1,2). crARN forma un complejo con la nucleasa Cas9 mediante unin de la hlice alpha con el Lbulo REC y genera mltiples puentes con la columna de crARN (1,2,3).Tras la unin de crRNA a Cas9 la conformacin de la nucleasa Cas9 se modifica generando un canal que permite la unin al ADN (% link_1%,% link_2%,% link_3%). El complejo Cas9 / crRNA analiza el ADN en busca de un motivo PAM (5'-NGG) (% link_4%,% link_5%,% link_6%). El reconocimiento de un motivo de PAM induce un desenrollamiento del ADN que permite al crRNA buscar el ADN complementario adyacente al motivo PAM. Cuando Cas9 se une a un motivo PAM adyacente a una secuencia de ADN complementaria a la de crRNA, la hlice puente dentro del lbulo REC crea un heterodplex de ARN-ADN con el ADN diana (% link_3%,% link_4%,% link_7%). El reconocimiento del sitio PAM est implicado en la activacin de los dominios HNH y RuvC lo que produce la rotura de la doble cadena (DSB) del ADN diana, esto lleva a la degradacin del ADN (% link_1%,% link_2%,% link_5%,% link_8%) . Si el crRNA no es complementario, Cas9 se libera y busca otro sitio PAM (% link_7%). La rotura del ADN diana pueden ser reparado mediante el mecanismo conocido como Recombinacin no homloga (NHEJ), que introduce o elimina nucletidos, generando errores, o a travs de Recombinacin homloga (HDR), que puede ser utilizado para introducir marcadores en sitios especficos del genoma (% link_2%,% link_9%,% link_10%). Este mecanismo CRISPR /Cas9 puede ser utilizado en ingeniera genmica de varios sistemas, incluyendo las clulas de mamferos.Rotura de la doble cadena (DSB) dirigida por CRISPR/Cas9

Modificaciones en el Genoma tras la rotura de la doble cadena (DSBs) pueden realizarse con meganucleasas, Nucleasas con dedos de Zinc (ZF) transactivator-like effectors (TALEs), que reconocen secuencias de ADN, sin embargo cada uno tiene sus limitaciones. Las meganucleasas no permiten un reconocimiento especifico entre nucleasas y ADN (2). Las otras dos opciones, ZFs y TALEs, son difciles de disear y reconocen un mximo de 3 nucletidos de ADN (2). Las guias de ARN de una cadena (sgRNAs) que actan como crRNAs son fciles de disear y pueden expresarse junto con la nucleasa Cas9 en un mismo vector para hacer diana en secuencias especificas del ADN y realizar las modificaciones del genoma. El sistema CRISPR/ Cas 9 tiene adems mayor sensibilidad y es ms eficiente cuando se usa para detectar pequeas horquillas de ARN.A significant advantage of using the CRISPR/Cas9 system to induce DSB in genomic DNA is its high level of efficiency. However, this efficiency can be clouded by a number of off-target effects, thereby reducing the specificity of CRISPR/Cas9 editing. Specificity can be improved by using a CRISPR double nickase system, whereby a pair of plasmids, each encoding a Cas9 (D10A) nickase mutant (Cas9n) are directed to a distinct, site specific region in the genomic DNA by a target-specific guide RNA (12). Each Cas9n/sgRNA complex creates only one nick in the DNA strand that is complementary to the guide RNA (12). Each pair of guide RNAs are offset by approximately 20 bp and recognize target sequences located on opposite strands of the target DNA. The double nick created by the pair of Cas9n/sgRNA complexes mimics a DSB (12). Thus, the use of paired-guide RNAs allows for increased specificity of Cas9-mediated gene editing, while maintaining a high level of efficiency (12).In addition to genome editing, the CRISPR system has been engineered to allow for robust activation of endogenous gene expression (13). Several components of the CRISPR system have been modified to generate the synergistic activation mediator (SAM) complex that results in a highly efficient and specific transcription activation system (13). One component of the SAM complex that is modified is the Cas9 nuclease. In the SAM system, the catalytic domains of Cas9 have been deactivated and the resulting dCas9 is fused to a transcription activation domain (VP64). Directed by a target specific guide RNA (sgRNA), the dCas9-VP64-sgRNA complex targets the -200 bp region from the Transcriptional Start Site (TSS) of endogenous genes to upregulate gene expression (13). To further enhance transcription, the sgRNA has been modified by appending a minimal hairpin aptamer to the tetraloop and stem loop 2 (13). This aptamer on the sgRNA selectively binds dimerized MS2 bacteriophage coat proteins (13). Fusing the MS2 proteins to p65 and HSF1 transactivation domains allows the resulting MS2-P65-HSF1 fusion protein to enhance the recruitment of transcription factors, thereby improving the potency of dCas9-mediated gene activation (13). Activation products are supplied as both standard plasmids for transfection and lentiviral plasmids for lentiviral packaging and transduction, for efficient delivery of the SAM Transcription Activation System into all cell types (13).

Plsmido CRISPR/Cas9

Detalles de productos CRISPR/Cas9: 20 g, hasta 20 transfecciones Plsmidos para Knockout (KO) CRISPR/Cas9 consisten en un conjunto de tres plsmidos con la nucleasa Cas9 y una guia de ARN de 20 nucletidos (gRNA) diseados para una mxima eficiencia del Knockout Las secuencias del gRNA provienen de la biblioteca genmica GeCKO (v2) y dirigen a la protena Cas9 para producir la rotura de la doble cadena (DSB) en el ADN genmico (11) KO Plsmidos CRISPR/Cas9 se encuentran disponibles para genes humanos (h) y de ratn (m). Ejemplo de nomenclatura:p53 CRISPR/Cas9 KO Plasmids (h)para humano op53 CRISPR/Cas9 KO Plasmids (m)para ratnCRISPR / plsmidos Cas9 KO disponibles para los genes humanos y de ratn se indican con el (h) o (m) la designacin en el nombre del producto. Ejemplo:CRISPR p53 / Cas9 KO plsmidos (h)para el hombre oCRISPR p53 / Cas9 KO plsmidos (m)para ratn Proporcionado como un plsmido purificado de ADN listo para la transfeccinProductos Complementarios para plsmidos CRISPR/Cas9 Hay disponibles adecuados anticuerpos control Reactivo de Transfeccin Ultracruz,sc-395739 Medio para Plsmidos de Transfeccin de shARN,sc-108062 Plsmido control CRISPR/Cas9,sc-418922

Plsmidos HDR

Descripcin de los Plsmidos de HDR: El plsmido HDR proporciona una plantilla especfica para la reparacin del ADN tras la DSB. Cuando se co- transfecta con el plsmido CRISPR/ Cas 9, el plsmido HDR incorpora el gen de resistencia a Puromicina para seleccionar las clulas en las que la escisin de AND inducido por Cas9 ha tenido lugar.Detalles de productos HDR: 20 g, hasta 20 transfecciones Plsmido HDR especficos de diana se recomiendan para la co- transfeccin con Plsmido CRISPR/ Cas9 para el mismo gen y la misma especie HDR Plasmid consists of a pool of 2-3 plasmids, each containing a homology-directed DNA repair (HDR) template corresponding to the cut sites generated by the corresponding CRISPR/Cas9 KO Plasmids Cada plantilla HDR contiene dos brazos homlogos de 800 pares de bases diseados para unirse especficamente al ADN genmico que acompaa el sitio de ruptura de la doble cadena de ADN, inducida por Cas 9 Cada plsmido HDR inserta un gen de resistencia a puromicina para permitir la seleccin de clulas con un knockout (KO). Cada gen de resistencia a puromicina esta flanqueado por dos sitos LoxP que permiten un posterior procesamiento con el vector Cre Cada plsmido HDR contiene tambin RFP para una confirmacin por visualizacin de la transfeccin. Proporcionado como un plsmido purificado de ADN listo para la transfeccinProductos Complementarios para plsmidos HDR: Reactivo de Transfeccin Ultracruz,sc-395739 Medio para Plsmidos de Transfeccin de shARN,sc-108062 Dihidrocloruro de puromicina:sc-108071 L-755,507,sc-204045

Expresin AllicaClulas duploides tienen dos copias de un cromosoma, dos copias de cada gen. Estas dos formas el mismo gen, que no tienen que ser idnticas, se denominan alelos y en cada locus especfico del cromosoma, un individuo posee dos alelos para el mismo gen. En una poblacin, un alelo ocurre con mayor frecuencia y se denomina por ello alelo dominante (wild type) y es generalmente responsable del genotipo wild type. Mutaciones pueden generar nuevos alelos y cada alelo genera un nuevo fenotipo.Como las clulas diploides contiene dos a lelos para la mayora de los genes, rondas adicionales de trasfeccin y seleccin pueden ser necesarias por a obtener un Knock Out del gen diana, para producir un Knockout homozigtico en la poblacin de clulas. Utilizando slo el Plsmido CRISPR/Cas9 se produce reparacin no homloga,Realizar un Western Blot tras la transfeccin con el Plsmido KO CRISPR/Cas 9 es una manera de determinar si se ha efectuado un corte bi-allico o mono-allico en la poblacin de clulas. Aislando clulas individuales obtendremos colonias bi-allicas o mono-allicas. Una vez que estas poblaciones se encuentran en una confluencia adecuada, un Western Blot puede mostrar qu colonias tiene un knockot y cuales un knockdown. Una poblacin con una edicin bi-allica no poseer la protena de inters, mientras que una poblacin con una edicin mono-allica mostrar una reduccin en la cantidad de protena.La co-transfeccin exitosa de un Plsmido especfico de CRISPR/Cas9 con el Plsmido HDR (Reparacin Homloga) dar lugar a la interrupcin gnica dirigida y la reparacin homloga (HDR) del gen diana. Despus de cotransfectar, han de seleccionarse las clulas que han sido modificadas con xito con el gen de puromicina. Esta seleccin permitir tambin la seleccin de una poblacin mixta, mono-allica y bi-allica. El Western Blot ser til para mostrar qu colonias muestras una knockout bi-allico.

Vectores Cre

Descripcin Vector Cre: El Vector Cre expresa la recombinasa Cre, una enzima p1 de bacterifagos que cataliza la recombinacin especifica de ADN entre dos sitios LoxP Cuando el Knockout Plsmido CRISPR/Cas9 se co- transfecta con el plsmido HDR, las clulas que contienen el ADN modificado pueden seleccionarse utilizando el marcador de seleccin insertado durante la reparacin por recombinacin homologa. Tras la seleccin, las clulas pueden transfectarse con el Vector Cre para eliminar el material gentico incluido durante la recombinacin homologa, gen de resistencia a la puromicinaDetalles de productos Vector Cre: 20 g, hasta 20 transfecciones Recomendado para la reparacin del ADN y la seleccin de clulas modificadas satisfactoriamente por el KO plsmido CRISPR/Cas9 y Plsmido HDR El Vector Cre contiene un promotor CMV para iniciar la expresin de la recombinasa Cre proporcionado como un plsmido purificado de ADN listo para la transfeccin Vector Cre,sc-418923Productos complementarios para Vector Cre: Reactivo de Transfeccin Ultracruz,sc-395739 Medio para Plsmidos de Transfeccin de shARN,sc-108062Double Nickase Plasmids

Double Nickase Plasmid product details: 20 g, hasta 20 transfecciones Double Nickase Plasmids consist of a pair of plasmids each encoding a D10A mutated Cas9 nuclease and a target-specific 20 nt guide RNA (gRNA) designed to knockout gene expression with greater specificity than its CRISPR/Cas9 KO counterpart Paired gRNA sequences are offset by approximately 20 bp to allow for specific Cas9-mediated double nicking of the genomic DNA, which mimics a DSB One plasmid in the pair contains a puromycin-resistance gene for selection; the other plasmid in the pair contains a GFP marker to visually confirm transfection Double Nickase Plasmids available for human and mouse genes are indicated by the (h) or (m) designation in the product name. Example:p53 Double Nickase Plasmid (h)for human orp53 Double Nickase Plasmid (m)for mouse Proporcionado como un plsmido purificado de ADN listo para la transfeccinSupport Products for Double Nickase Plasmids: Hay disponibles adecuados anticuerpos control Reactivo de Transfeccin Ultracruz,sc-395739 Medio para Plsmidos de Transfeccin de shARN,sc-108062 Control Double Nickase Plasmid,sc-437281 Dihidrocloruro de puromicina:sc-108071

Plsmidos Activadores

Detalles de productos Psmido Activador CRISPR/dCas9: 20 g, hasta 20 transfecciones Los Plsmidos Activadores CRISPR/dCas9 son sistemas mediadores de activacin sinrgica (SAM), sistema de activacin de la transcripcin diseado para incremetar especficamente la expresin gnica. Plsmidos Activadores CRISPR/Cas 9 incluyen los siguientes tres plsmidos, con un radio 1:1:1 : plsmido codificador de la nucleasa Cas 9 desactivada, (D10A y H840A) fusionadas al dominio de transactivacin VP64,; plsmido codificador de la protena de fusin MS2-p65-HSF1 y un plsmido que codifica la secuencia de diana especfica de 20 nt de ARN. Las secuencias de gRNA que se encuentran en el complejo mediador de activacin sinrgica (SAM) CRISPR/Cas 9 proceden de bibliotecas humanas y dirigen el complejo SAM para que se una a lugares que se encuentran a 200 -250 nt aguas arriba del inicio de la transcripcin del gen diana. El sistema SAM proporciona un reclutamiento robusto de factores de transcripcin para la activacin altamente eficiente del gen diana. CRISPR/dCas9 Activation Plasmids available for human and mouse genes are indicated by the (h) or (m) designation in the product name. Example:p53 CRISPR/dCas9 Activation Plasmid (h)for human orp53 CRISPR/dCas9 Activation Plasmid (m)for mouse Proporcionado como un plsmido purificado de ADN listo para la transfeccin. Support Products for CRISPR Activation Plasmids: Hay disponibles adecuados anticuerpos control Reactivo de Transfeccin Ultracruz,sc-395739 Medio para Plsmidos de Transfeccin de shARN,sc-108062 Plsmido control activador CRISPR/dCas9,sc-437275 Blasticidin S HCl solution,sc-495389 Hygromycin B,sc-29067 ZeocinSelection Reagent,sc-496345

Lentiviral Activation Particles

CRISPR/dCas9 Lentiviral Activation Particles product details: Lentiviral Activation Particles encode a synergistic activation mediator (SAM) transcription activation system designed to specifically and efficiently upregulate gene expression via lentiviral transduction of cells (13) The SAM complex binds to a site-specific region approximately 200-250 nt upstream of the transcriptional start site and provides robust recruitment of transcription factors for highly efficient gene activation Lentiviral Activation Particles are supplied as 200 l of transduction-ready viral particles containing the critical elements, present in the three CRISPR/dCas9 Activation plasmids, that are required for targeted gene upregulation:1. Deactivated Cas9 (dCas9) nuclease (D10A and N863A) fused to the transactivation domain VP64, and blasticidin resistance genes2. MS2-p65-HSF1 fusion protein, and hygromycin resistance genes3. Target-specific 20 nt. guide RNA, and a puromycin resistance gene Recommended for use with hard-to-transfect cells CRISPR/dCas9 Lentiviral Activation Particles are available for human and mouse genes, indicated by the (h) or (m) designation in the product name. Example: p53 Lentiviral Activation Particles (h) for human or p53 Lentiviral Activation Particles (m) for mouseSupport Products for CRISPR Lentiviral Activation Particles: Control Lentiviral Activation Particles,sc-437282 Polybrene,sc-134220 Blasticidin S HCl solution,sc-495389 Hygromycin B,sc-29067 Dihidrocloruro de puromicina:sc-108071 Suitable control antibodies are available