high performance liquid chromatography -...

Was ist HPLC? Was ist das Besondere? Aufbau Auswertung Möglichkeiten & Varianten der HPLC Zusammenfassung

High Performance Liquid Chromatography(HPLC)

Nicolas Balcazar

Systembiologie -Methodenseminar

WS 08/09FU Berlin

10. November 2008

Nicolas Balcazar

Gliederung

Was ist HPLC?

Was ist das Besondere?Aufgabenstellung und Lösung

AufbauAufbau eines HPLC-Systems

AuswertungWie sieht das Ergebnis einer HPLC aus?

Möglichkeiten & Varianten der HPLCNormalphase, Umkehrphase, Größenausschluss-,Ionenaustausch- und Bioaffinitäts-Chromatographie

Nicolas Balcazar

I High performance (pressure) liquid chromatography.I Sehr leistungsfähige chromatographische Technik zur

Auftrennung und Analyse von Stoffgemischen.I Gehört zur Gruppe der Säulen-Chromatographien.

I Stationäre Phase in Stahlsäule gepackt.I Mobile Phase durch Flüssigkeiten gebildet.

Nicolas Balcazar

Das Prinzip ist nicht außergewöhnlich

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Aufgabenstellung und Lösung

Gliederung

Was ist HPLC?

Nicolas Balcazar

Das Problem

Für gute Auftrennung:I Lange SäuleI möglichst kleine Partikelgröße der stationären Phase

Diese Faktoren verlangsamen die Analyse

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Die Lösung

Hoher Druck, um Eluent durch Säule zu pumpen.Jetzt:

I Kleinere Partikel als stationäre Phase einsetzbarI Hervorragende TrennungI Kurze SäulenI Trennung läuft schneller ab

Nicolas Balcazar

Die Lösung

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Die Lösung

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Die Lösung

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Einige Zahlen

Normale LC HPLC

Partikelgrößen � 100 – 300 µm 3 – 10 µmSäulenlänge 50 – 300 cm 5 – 30 cmSäulen � (innen) 5 – 50 mm 2 – 4 mm

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Aufbau eines HPLC-Systems

Gliederung

Was ist HPLC?

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Vom Schema..

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.. zur Realität

(Foto der Firma Shimadzu)

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bei uns

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Wie sieht das Ergebnis einer HPLC aus?

Gliederung

Was ist HPLC?

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I Detektor misst kontinuierlich am Ende der Säule.I Messwerte als Kurve in Funktion zur Zeit dargestellt.

↪→ Chromatogramm

I Retentionszeit↪→ Eindeutige Stoffzuordnung.

I Fläche unterm Peak proportional zur Konzentrationdes Stoffes.↪→ HPLC liefert dadurch sehr präzise quantitativeErgebnisse.

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Normalphase, Umkehrphase, Größenausschluss-, Ionenaustausch- und Bioaffinitäts-Chromatographie

Gliederung

Was ist HPLC?

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Normalphase HPLCNP-HPLC

I Trennt Analyten nach Polarität auf.I Erste Art von HPLC, die Chemiker entwickelten.I Stationäre Phase: Polar.I Mobile Phase: nicht-polar.I Effektiv für relativ polare Analyte.

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Umkehrphase HPLCRP-HPLC (engl. reversed phase)

I Stationäre Phase: nicht-polar.I Mobile Phase: Wässrig, mäßig polar.I Arbeitet nach Prinzip der hydrophoben Wechselwirkungen.I Strukturelle Eigenschaften des Analyten Moleküls

beeinflussen Retentionszeit.

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Größenausschluss-HPLC

I Auch Gel-Filtrations-Chromatographie genannt.I Trennt Teilchen auf Grund der Größe.I Niedrige Auflösung→ oft für letzten „schliff“ einer

Reinigung verwendet.

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Ionenaustausch-HPLC

I Trennt Ionen (Kationen / Anionen)I Retention auf Grundlage der Anziehung zwischen gelösten

Ionen und den, mit der stationären Phase verbundenen,geladenen Seiten.

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Ionenaustausch-HPLC

I Trennt Ionen (Kationen / Anionen)I Retention auf Grundlage der Anziehung zwischen gelösten

Ionen und den, mit der stationären Phase verbundenen,geladenen Seiten.

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Bioaffinitäts-HPLC

I Trennt Biomoleküle (z. B. Enzyme, Antikörper)I Stützt sich auf die Eigenschaft, dass biologisch aktive

Substanzen, stabile, spezifische und reversible Komplexebilden.

I Beteiligung der gemeinsamen molekularen Kräfte wie:I Van-der-Waals-Wechselwirkung,I elektrostatische Wechselwirkung,I Dipol-Dipol-Wechselwirkungen,I hydrophobe Wechselwirkungen undI Wasserstoff-Brücken-Bindungen.

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Bioaffinitäts-HPLC

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Bioaffinitäts-HPLC

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Bioaffinitäts-HPLC

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Bioaffinitäts-HPLC

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Bioaffinitäts-HPLC

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Bioaffinitäts-HPLC

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Bioaffinitäts-HPLC

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Elutions Möglichkeiten

Isokratische Trennung

I Zusammensetzung dermobilen Phase bleibtkonstant.

Gradiententrennung

I Zusammensetzung dermobilen Phase wirdwährend desTrennungsprozessesgeändert.

I 2. Pumpe und 2. Eluentwerden benötigt.

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Gradiententrennung

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Gradiententrennung

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Zusammenfassung

I Die Chromatographie gehört zu den Verfahren, bei denenStoffgemische untersucht werden, indem man sie in ihreeinzelnen Bestandteile auftrennt.

I Basis der Auftrennung der Stoffe ist die unterschiedlicheVerteilung der Stoffe in zwei Phasen.

I Die mobile Phase (Flüssigkeit) bewegt sich an derI stationären Phase (Feststoff) vorbei und nimmt die Stoffe

dabei unterschiedlich schnell mit.I Bei der HPLC (allg. Säulen-Chromatographie) befindet

sich die stationäre Phase in einer Säule, durch die diemobile Phase fließt.

Nicolas Balcazar

Zusammenfassung

Nicolas Balcazar

Zusammenfassung

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Zusammenfassung

Nicolas Balcazar

Zusammenfassung

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Anhang

Quellen

Michael W. Dong.Modern HPLC for Practicing Scientists.Wiley-Interscience; 1st edition (June 12, 2006).

M. Naczk, F. ShahidiPhenolics in cereals, fruits and vegetables: Occurrence,extraction and analysis.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41(2006) 1523–1542.

I www.med4you.at

I http://HPLCcourse.com

I http://www.LCresources.com/resources/getstart

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Anhang

Fragen?

Nicolas Balcazar

Anhang

Danke!

Nicolas Balcazar

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