heterologous protein production in methylotrophic yeasts

10
MINI-REVIEW G. Gellissen Heterologous protein production in methylotrophic yeasts Received: 9 May 2000 / Received revision: 20 June 2000 / Accepted: 23 June 2000 Abstract The facultative methylotrophic yeasts Candida boidinii, Pichia methanolica, Pichia pastoris and Han- senula polymorpha have been developed as systems for heterologous gene expression. They are based on strong and regulatable promoters for expression control derived from methanol metabolism pathway genes. An increasing number of biotechnological applications attest to their status as preferred options among the various gene expression hosts. The well-established P. pastoris and H. polymorpha systems have been uti- lized in especially competitive and consistent industrial- scale production processes. Pharmaceuticals and tech- nical enzymes produced in these methylotrophs have either already entered the market or are expected to do so in the near future. The article describes the present status of the methylotrophic yeasts as expression sys- tems, focusing on applied examples of the recent past. Introduction A growing concentration on gene technology has per- meated basic scienti®c research and industrial biotech- nology. The emerging systematic genomics have increased demand for suitable expression systems to analyze and to exploit newly identi®ed target genes. A heterologous gene expression system is chosen with regard to the characteristics and the anticipated appli- cations of the compound to be expressed from the gene of interest. These criteria are predominantly dictated by either an economic rationale, in the case of technical enzyme production, or by safety and authenticity as- pects, in the case of pharmaceutical production Strasser and Gellissen 1998). An ideal system should combine characteristics that suit both sets of demands, providing a low-cost screening and production system for au- thentically processed and modi®ed protein compounds. In this respect, yeasts oer considerable advantages over alternative eukaryotic and prokaryotic systems. The organisms meet safety prerequisites in that they do not harbor pyrogens, pathogens or viral inclusions. The eukaryotic yeasts, including the methylotrophs, are ca- pable of secreting proteins and performing secretion- linked protein modi®cation steps, such as processing and glycosylation. As eukaryotic microbial production sys- tems, they combine ease of genetic manipulation with rapid growth on inexpensive media to high cell densities. Furthermore, as with other microbial production sys- tems, simple production-process monitoring and vali- dation procedures have been developed Sudbery 1994, 1996). Among yeasts, a limited number of species belonging to the genera Hansenula, Candida, Torulopsis and Pichia are capable of growth on methanol as sole carbon source Hazeu et al. 1972; Tani et al. 1978; Barnett et al. 1990). Isolated from soil, rotten fruits and the gut of insects, they were initially considered to be good candidates for the production of single-cell protein SCP) in methanol- containing carbon sources. However, today, this limited scope has been extended and altered with the establish- ment of basic genetic engineering methods. The increasing availability of relevant genetic ele- ments has turned several of these methylotrophic species into powerful expression systems for a growing number of biotechnological applications Sakai et al. 1991; Faber et al. 1995; Gellissen et al. 1995; Hollenberg and Gellissen 1997; Cregg 1999; Raymond 1999). Current applications in recombinant pharmaceutical and enzyme industries include, among others, production of insulin- like growth factor IGF), hepatitis B vaccines, human serum albumin HSA) and phytase Gellissen and Mel- ber 1996; Hollenberg and Gellissen 1997; Kobayashi et al. 1998; Cregg 1999; Gellissen and Hollenberg 1999; Mayer et al. 1999). The production systems depend on Appl Microbiol Biotechnol 2000) 54: 741±750 Ó Springer-Verlag 2000 G. Gellissen Rhein Biotech GmbH, Eichsfelder Strasse 11, 40595 DuÈsseldorf, Germany e-mail: [email protected] Tel.: +49-211-9708937 Fax: +49-211-9708930

Upload: g-gellissen

Post on 14-Jul-2016

214 views

Category:

Documents


1 download

TRANSCRIPT

�����������

�� ���������

����������� ������ �� ������ �� ������������� ����

��� � � ��� ���� � ��� �������� �� ��� ���� ���� � �� ��� ����

���� � !��"����� #� �"����� � ����� ���������������$ ���� �� ������� ���� ��� ���� �� ���������� ��������� �� %� �"�� �� ����#� !�� ���"�&��� &� '�������( � � �� %�� �� �����&�� �&�"���%" ���#���� !�� '������� �����" ��� !��# #� ���" #��%�"��# ��� )�� &��( ���������& ��#%� �! %��� ��"�&��" ���"������������ �� � �� ������ �� ��!�� ������� �#��& � ������� &� '������� ����( � )""����%"�� �� ��� ���� �� �� ��������� ����#� �� %� ����"�* �� ����""� �#������ �� �������� �� ������"���" ��� ����� ������( + ��#�����"� �� � ����" �*�#� ��� � �� � � #� �"����� � ���� � �"�� � ��� � #��,� �� �� '�� �� ��� �� � ��� !����( � ����" ���%� � ����������� �! � #� �"����� � ����� �� '������� �����#�$ !�����& �� ���"� '�#�"� �! � ��� ����(

����� ������

� &��)��& ���������� �� &� � ��"�&� �� ���#�� %��� �����- ���� �� �� ������" %��� ���"�&�( � #�&��& ����#��� &��#�� ������� #�� !�� �����%" '������� ����#� �����"�* �� �� '�"��� �)"� � ���- ���&� &��( � ���"�&��� &� '������� ����# �� ��� )�� �&�� �� � ���������� �� � �������� ���"�������� �! � �#���� �� % '���� !��# � &��! ������( � � ������ �� �� �#�����"� ���� %��� � �� ���#� �������"$ �� � �� �! � ���"�*�# ��� �����$ �� %� ��!�� �� ��� ������ ������$ �� � �� �! � ��#�����" ��� ����� ./������

�� 0""���� 1��23( �� � �" ����# � ��" �#%�� ���������� � �� ���� %�� ��� �! #�� �$ ����� ��&� "�)���� �����& �� ��� ����� ����# !�� ���� ����""� ����� �� #� �- ������ �#���� �(�� � �� ����$ ����� �4� ���� ��%" � �����&� ����"������� �,������ �� ���,������ ����#�( � ��&����#� #� ��!�� ���5������ �� � �� � � � ��� ��%�� ����&��$ ��� �&�� �� ����" ��"������( � �,������ �����$ ��"� ��& � #� �"����� �$ �� ����%" �! �����& ������� �� ��!��#��& �������"��, ������ #� �-����� ����$ �� �� �������& �� &"����"�����( �� �,������ #���%��" ��� ����� �����#�$ � � �#%�� �� �! &��� #�����"����� )�� ���� &��)� �� ��'����� # �� �� �& "" ������(6��� �#��$ �� )�� �� � #���%��" ��� ����� �����#�$ ��#�" ��� ����������� #��������& �� ��"�� ����� ��� ��� �� %� �"�� ./� %�� 1��7$1��83(

�#��& �����$ � "�#�� ��#%� �! ���� %"��&��&�� � &��� ���������� �������� ���������� �� ������ ���%" �! &��)� �� #� ���" �� ��" ��%�� ����.9�*� � �"( 1�:�; ���� � �"( 1�:2; <����� � �"( 1���3(���"�� !��# ���"$ ����� !����� �� � &�� �! �����$� � )� ������""� ���� � �� % &�� �� � ��� !��� ��� ����� �! ���&"�"" ������ ./=+3 �� #� ���"���������& ��%�� �����( 9�)��$ �� ��$ � �� "�#�� ��� �� %� '�� �� �"�� )�� � ���%"�� �#�� �! %��� &��� �&�����& #� � �(

� �������& ����"�%�"��� �! �"���� &��� "�#��� �� ���� ����" �! � � #� �"����� � �������� ��)�!�" '������� ����#� !�� � &��)��& ��#%��! %��� ��"�&��" ���"������� ./�,�� � �"( 1��1;6�%� � �"( 1��>; 0""���� � �"( 1��>; 9�""�%�& �� 0""���� 1��:; =�&& 1���; ���#�� 1���3( =��������"������� �� ��#%����� � ��#�����" �� �*�#�� ������ ��"� $ �#��& �� ��$ ��� ����� �! ����"���"�, &��)� !���� .�063$ ������� < �����$ �#�����# �"%�#�� .9/�3 �� � ���� .0""���� �� �"�%� 1��8; 9�""�%�& �� 0""���� 1��:; ?�%���� �� �"( 1��2; =�&& 1���; 0""���� �� 9�""�%�& 1���;���� � �"( 1���3( � ��� ����� ����#� �� ��

���" ����%��" <��� ��" .����3 >7� :71@:>� � /����&����"�& ����

0( 0""����� �� <��� 0#%9$ �� �!" � /����� 11$7�>�> A�B ��" ��!$ 0�#����#��"� &""����C� ��%��� D�#�����(�#�"(� E7���11��:�2��:6�'� E7���11��:�2���

�����%" ��� ������� �� 4��� �#������ #���"� ��� !��# &�� �! � #� ���" #��%�"��# ��� �)��( 6��� �#��$ �� #� �"����� � �����$ ������� !�� �����!��#����� �� ���%"� ���&��� ���� � &��#$ ����� ��& !�� � �������� ��� ����� �����(

���������

� !��"����� #� �"����� � ���� ���� � �� %"��&�� � !��� &��� �������� ���������� ���� �� ���������� �! � /� ���#���� � ��%!�#�"� � �� ����- #� ���" ���"�*����� ��� )�� .�&"� � �"( 1�2�;0"��� �� /� %�� 1�223( � ������" ������� ��,�"� �� ����"�* #���%� ��$ ���'���#�$ !�""�) %� ��%�5��� #��%�"� ���� �� � ����"��#( �� ����" ���� � ���'���#� �� �� �'� �* %� ���-�'� ��� �� &���� !��#�" � �� � ��&� ����'� $ ) � �� �#��� �� )��� �� #�"�"���'�&� %� � ���'���#�" ���"��( 0�� �� ��& � �'� ��� �� %� � ���- �� "�� !��# � !������� ���% �( � �)� ���� ����� �� ���� ���� �� �� �� ������� ������ �)� &��$ ��&��� ���� �� ���� .=�&& � �"( 1�2�3 �� ���� �� ���� .�"� �" ���"�*��& &�; ���#�� � �"( 1��23$������"�$ )�� ��'1� �� ��&1� %��& � �#������"� �" �'� ���( �� � �� �! �� ��������� �� �� ��������$ � ���&" &���'� �� �� ������ ��.#� ���" �'� ��; F %�� � �"( 1�2>3 �� ��!�.�"� �" �'� ��; /�,�� �� ���� 1���3$ ������"�(

6��#�" � &���� %� � �'� �� ������ ����� %�� � �����"� ����#�"����� ��� )�� �� ��" ��&� �� � ����#�"����� ��� )�� !�� &������� �!%��#���( � ������" ,� ������ �! � "���� ��� )�� �����"�* %� � ���'���#�" � � ��'����� ���� ��.A9�/3$ ��" ��& � � ��'����� �� &"���" � � ���� ��� �� �� � �����,��"�� ������ %�)�!��#�" � �� '�"�"���>�� ��� ��( � � =�

�#���� � �� !��� � ����#�"�� )�� �� � �����"(A� � ��'����� �� � ��� ���"�� %� � � � ��'������ ,����( �� � ��%�5��� �" �"�� ������ )�� &"���" � ���� ��� �� �� !��#� !������1$8�%��� ��� ��$ ) � �� ����� �� !������8�� ��� ��%� � � ��� ����( G�"�"���>�� ��� �� �� �&���� %� � ����� � ��� �� �" ��#������& �������" �"��$ �����,��"��$ ����� � ��� �� ���#����� ��#��� �������( H� � �� �! � &"���" � � ���� ��� �� &���� �� '�"��� !�� %��#���!��#����� %� ���� �� ������� �! &"����&����(��� �� � ����#�"����� ��� )��$ � !��#�" � �����%�"�* �� �)� ��%�5��� � ��&��� �������(�� � -��� ���$ !��#�" � �� �'� �* �� !��#�� %�� !��#�" � � ��&��� .6FA3$ ) � �� ��%��5���"� �'� �* �� ��%�� ��'� %� � !��#�� �� ��&��� .6�A93 .6�&( 13(

0��)� �� �4��� ��%�� ����� ���"�� �� ������������� �! �����""�"�� ������ ��#�"�����( ��#� ���"�&��)� ""�$ ,� �*�#� �! � #� ���"#��%�"��# ��� )�� �� ����� �� "��& �#�����$

����""� � �'� ���$ � �)� � ��&���� �� A9�/ #����� �%��( �� #� ���"�&��)� ���������� �"���� �! #� �"����� � �����$ �"� �" �'� ���� �������� �� �� ��I �! ����" "" ������$ �� 6�A9 �� A9�/ �� �� ��I( � ��$ � ���� ��� �!� � ,� �*�#� �� ��%J� �� � �����" # ����# ��#�� %� � ��%�� �#���� �! � �"���# ��#( 9�& ���'���#�$ � ""�"�� �#����#���!�� � ������" ���� �! #� ���" #��%�"��#$ �� ��,�� �� 2�I �! � "" ��"�# �� � � � �� �������! �& �*�# ��� �����( ��*�# ���� ��� �� ������"" �� � �������������" "�"( � �����& �� �&�"���%" ���#��� �������� �! � ������ &�� �� %� ��������� �� �������� �����" "#���!�� ���"�&��� &� '�������$ ������"��"� � ����#���� �! � �"� �" �'� �� &�� ���� .�� ��� ����3����� .�� �� ������3� ��!� .�� ��������3 �� ��

���� � � #� ���" ���"�*����� ��� )�� �� ��� �#����#���"�*������ �� #� �"����� �( ��� ���" �� �'� �* %� �"� �" �'� ��� ��&���� !��#�" � �� � ��&� ���'� ( � � ��'� � ��&����'� �� �#��� �� )��� �� �'�&� %� ���"��( "� #��� ��� ����#�"����� ��� )�� � !��#�" � �� �'� �* %� �)���%�5��� � ��&��� ������� �� ��%�� ��'� $ ���"�* %�� !��#�" � � ��&��� .6FA3 �� � !��#�� � ��&���� .6�A3( $ 6�� ����#�"����� � !��#�" � ���� )�� '�"�"���>�� ��� �� .G�>+3 %� � ����� �! � � ��'����� ���� ��.A�/3 �� &���� � =� �#���� � &"���" � ���� ��� ��.0�+3 �� � � ��'����� .A9�3( % A9� �� � ��� ���"�� %� � � ��'����� ,���� .A�?3 �� � � ��'����� � ��� ��.A9�+3( & 0�+ �� A9�+ ��" �� �� �" �"�� ������ !�����1$8�%�� ��� �� .6<+3( ' �� !��� � ���� !����� 8�� ��� �� �� -��""� '�"�"���>�� ��� �� �� &���� ( � &�� �! � #� ���"���"�*����� ��� )�� �! � !��� #� �"����� � ���"�� �� �������* �� !�� �� �� ��� �� � -&�� �� � �������� �! � �*�#�� � �� � ��& !��( / �'� !�� !��� � ��!��#�����

:7�

.�� ���������3( �� � �����$ ()!� .!��#�" � � � ��&���3 ���#��� �� ����"�%" �� �� ��� ���� ./ �� �"( 1��23$ �� %�� !�*� . � � ��'����� ���� ���3 �� ( ! .!��#�� � ��&���3 ���#���� ���� �������� ./�,�� � �"( 1��>$ 1��83 �� �� ���������.9�""�%�& �� 0""���� 1��:3� �"" �! � � ���#���������� �����%" &��� �#������ � �� �� % ����"��%" !�� � �����" �! ���"�&��� &� '��������� ����#� %�� �� � ������ #� �"����� � ����(A���� � �� �%����� �"������ �� �� � ����"�&��"��#�"������$ � � �� �#������� �4��� �#��& � !��� ���� )�� ���� �� � ��%�������� �� ���&�"����� �! �*�# ���� ���( � �" ���� ���� �� ���� ���#��� ��������� �����&"� �� � �� � ���� �! #� ���"$ �& "�"� �! '������� ���� ��������� �� %� �%��� ����& �� �� ( ! )�� &"���" �� &"��� �� ���������� �#�����(� &"�������������� ! ��& #� .�(( � "�#�� �����"#������� �! � !�#���� �"��� )�� &"���3 �����"� �� ��" � �! #�� � �� 1�(> &�" � ���� .����� �"( 1���; � �"�� KK=�� '�#�"� �! ��� ����� ������� %�� �� #� �"����� �LL3( �� �� ��� ���� � ()!� .!��#�" � � ��&���3 ���#��� ��%� ���% �� %��& �����&"� �� � %� #� ���" ���#%������� )�� �##����# ��"!�� �� �����&� ����$�� #� �"�#�� )�� &"��� �� ��" ��%�� ���� ./ �� �"( 1��23( � #� ���" #��%�"��# �! � !���#� �"����� � �� ��##���* �� 6�&( 1$ �� �����&� ���- �� ������* &�� �� � �������� �! � �������� &� ��� ���(

+��#���� ��� !��# � �� ��� !��# #� ���"#��%�"��# &�� �� �"�� % ���"�* !�� M��� ����"�&��� &� '������� �� � ������� #� �"����� ����� ����( � � ��"� � ���� ���#��� ���� ��� ���� .���� �# � �"( 1��:; A����& � �"( 1��23�� � ���� ./� � � �"( 1���%3 �� � �� ���#���.=�' � �"( ����3 �� �� ��������� �� ����������"#���( �� �� ���������� ���#���� ��� !��#������ ����#�"����� ��� )�� &�� �� ����"�%" ��).<���� � �"( 1���3 �� )"" �� � �� �"���8�� ��� ������ �� .��*�+� ��� ���#��� .��� �� � �"(1���3( � ��*�� ��� ���#��� �� ������"��"� ���������; �� "���� '""�� "�"� �! ���"�&��� &�'������� �� ���#�" �� "��� �#�������.=( �#�"$ ������" �##��������3(

������������ ���� ���� �� ������� ��������

�����!��#����� ��� ��� !�� #� �"����� � ����#�"�� #� � � ��#�"��"� ���% !�� �� � �����$��"� ��& *� ���,�����( � � �� % �����!��# ����&) �"�"" #� � �$ )�� � ����� �! +�0 .=�&& � �"(1�2>; A� #� � �"( 1��13$ �� %� "����������� .6�%�� �"( 1��73( +"��#� � �� �� � ���&� �� ���- &���#� "�� �� ��� �#"� ���&��� ( �� �� ��� ���� !���&�A�� �� ���&� �� � ���� �� � �-*# &��.=�&& 1���3$ �� �� �� ������ �� � ���� &�.���#�� 1���3( �� #��� ��#%����� �� ���������

�������$ !���&� A�� �� ��� �#"� ���&��� ����&��.*��5��� ��%����& ���"�� �"��#� � !�� ������!��#����� .9�""�%�& �� 0""���� 1��:3( ���&� ���&������ �� % � �� %� �#�"�&��� ��#%�������� ����& � ��/�.�" "��� !�� ��������������&������ .�&�� ���� � �"( 1��>3( H� � ���&� �5�����"� ��.*"% .�&�� ���� � �"( 1���; /� � � �"(1����3$ � )0�� &� .�&�� ���� � �"( 1���3 �� � �A�� "���� .=�' � �"( ����; �( ?"�%�� $ ������"�##��������3( �����!��#������ �� �� ��������������""� ���"� �� � ������ �! �� ��� ��"$ #������""����%" ������� ��������& ���&" �� #�"���" ���� �! � '������� ����� �� � � �������" �����&#��( ���� �# #�"���"���� ���&������ �� % !�� �� � ����"���'����� � �� ��������� ������ �<11 %� � ��5�� �! �����&� �� � �"��� �� ������ �! ��� ��������� �� *� ���,������ ��� �.�" &� �������( � ��.* �5�� �� % '"� .0��*,� �"( 1��>3 �� �� % ����� .9�""�%�& �� 0""����1��:3( � �� �����&��& ��� �� !��� �#�� "� � ��#������""� ���%" �������( ����M��� �����&��& �#� ������� !�� � ��� ��#%� ��&� �� �����%�"�����%��� �� � !) ��� .0�"%�� � �"( 1��7; <�& ������ �"( 1��>3( /��- �5��� "��� �)�����# �!� ��.*"% �� �� %� ���% �� ����� ��&�"��#� #������� �� ���&������ ���� � &��# �!�� ��������� AF�1 )�� ��� ����& ��� �"��#� ���%��"�*����� ��� �� ./� � � �"( 1��83( +����������& �!�"��#� � �� % ��N�� %� � ���� �! *� ����,������ ��� ����5��� .<�& ����� � �"( 1��23(� �� �! � %�����" ��� &� !�� �� � !������ ���#��� � �� "���� 0712 ������� �� % �������� �� �� !�� ������#%�������"" ���&������� �! ���"�&��� A�� �� � �� ������ ./� � � �"(1���%3( � ���& �! �"��#� � ��%����& �4��� �"����� #��,�� �� % �� �� �"� !�� "�)$ #� ��� �� �& ��� ��#%�� .�&�� ���� � �"( 1���3(

A���� � ���� �! � ��.* �5��$ �"��#� ��� ���&��� ���� � �� ��������� ��� ��#���#(/������ )�� �� �� 1�� ���� �� %� � ���- (.9�""�%�& �� 0""���� 1��:3( 6��� �#��$ ����"&�� �� % ��'���� �� �� ��������� %� �"���&#�� � �� � ���&" '������� ����� �� � �����!���#����� ����( �� � �� )��$ ������� �� %� &���� � �� ��� � !�������" �#�� #�&"�%�� .0�"%��� �"( 1��73( �"�������"�$ '������� ������ �� %�����!�� �� ��%�5��� �����!��#����� ���� ����& �4��� #��,� &�� !�� �"����( O���& � �� ������� $ ������� �� % ���"�� � �� ��%�� �4���&�� �� � -' ������#%� �����( ���"���& !��# � �-' ��� ��#%��$ � &�� ���&� �� �� ��� ������ �! �4��� ��#%����� ������� �� % �����& (� �� #�,� !���%" � ��� ����� �! �#�"' �#������ �������� �� �� #�' ������� < �����"�.����)�* � �"( 1��13 �� )"" �� � ������ �! �)#��%�"� ��� )��� ����� ���& �����%" ��#%������*�#� �� �� ����#�" ���� ��#��� ����� .0""����� �"( 1��83( A���� �#�"�&��� ��#%������� )�� "�����* ��#%����� A��$ #�"���" ���� �� �"��

:7�

% ����� �� �� ��� ���� �� �� �� ������( O� �� ������ �� %� !��� �� �� � �������" �����&#��.� ��, � �"( 1��13(

������������

P���� �� ���%" �! � ��& %�� $ H� �� ��"��, ��%� � ���� �� ������ �������( 9�)��$ � �� ����%�"��� �� "�#�� �� � � ����� �! #����� ��"� �� � ��&"����"����� �� �� � �� �! ��"��, &"����"������; �� � �� �! H�&"����"�����$ � �"�&��� ��� ��� �#��� ��""� �! #����� .0� � �"( 1��1;=�&& 1���3( � �� �������� )�� � ��������� �� #�#�#�"� �� ) � � ������ �! ��&��� ��"� ��& &�"����$1����"&�"�����#�� �� ���"� �� �� � ( � ��$� &���" �� �! ���� '������� ����#� �� ������ �� ����&"����"�� ������� �� �� � �� ��� �� ) � �� ��� ��� #�##�"������� &"����"����� �� ��� �������( �06�1$ ) � �� ��� &"����"�� �� �#���$ )��!��� �� % H�&"����"�� �� ��# '��� ) � '����� �� � �� ��� ���� ��� .<���"� 1��23( H�"� �"�#�� ��#%� �! �#������� &"����"����� ��� ��������& � ������� ����� �� !�� ���"�&��� &�'������� '��� .?��& � �"( 1��2; 0##�"" �� ���#%"1���3( �� �"����� � ����� �� ' �%�� ��# � ������&� ��� *� ���,����� �� � �� ����( � �� �� ���)�� � ���&"����"����� �%��� �� � %�,�L� ���� ��"�� ������� �� #� �"����� � ���� .0����� �� �� ��� 1�2�; ���#%" � �"( 1��1; �������� � �"(1��2; <��� ��� �� =���""��� 1���3$ �"� ��& '�#��"� �! ���&"����"�� ��#%����� ������� �� %� ���% !�� %�� �� ��� ���� .�(( 9�� &� 1��; /���� �"( 1����3 �� �� ��������� .6""��&� � �"( 1��13(6�� �� ��� ���� �� �� %� � �)� �� ����" '�#�"�� �� � � ����� �! � ��#���" #������ ���� %��1$� "��,�&� ����� �! � �1$� "��,�&� !�5���"��%��� �� *� ���,����� .�������� � �"( 1��23$ ) � �� ���� � �� % �""�&�� .��,��� � �"( 1��83(��#���" � ����� �! #����� �� ��� %� ���"�* ��!�� �� � #� �"����� �(

��� ����� �� ������ ����

����� !�� &������& ��#%����� #� �"����� ������ �� ���&��� ���� � &��# �! � ������� ����( �� ����� ��� �%��$ ���&������ ���� �� ���� �#"� �� %� �#�"�&��� ��#%�������$ ���&���&� ���"�&��� A�� �� ������"�� &��#� "��( ���� ��&"�$ �"��#� ������� �� &���""� ��&� �� � ��%����& �� "�,��& �5��� !�� ���&� ���&������(�� �� ��� ���� �� �� �� ������ ���&���& �� ��� ���� �! � �)� �"� �" �'� �� &�� �� �� � �-*#"��� .=�&& 1���; ���#�� 1���3( �� �� ���������!���&� A�� �� �� � ��� �#"� ���&��� �� ��� �� -� &��#� "��$ �(( %� ������������"�#������ � ��/�.�" "��� .�&�� ���� � �"( 1��>3$ ��%� ���&���& �� �� �.* �5�� ./� � � �"( 1��83$ ��

� )0�� �� �.�" &� .<���� � �"( 1���3 �� �� � �A�� "���� .=�' � �"( ����; �( ?"�%�� $ ������"�##��������3( �� &���"$ �����!��#����� ����� �� �%�� � �! ����� ��� �� %�����" �5���( � ���,������ ������� �! � � ����� ��%��� �� ��� �� �� ����%���� ������� �5�� !�� �����&����� �� �"���� �� � %�����" ���( /�#�"��"�$ � ���� �������������� � "#��� !�� �"���� �! ���� �����!���#����( � �"���� �5��� �� ��&� �� �#�"�#�� � ������ -���� �! � ����$ �(( �-*# ���� ��� ���� .=�&& 1���3$ �!0� �� �� �� ������.���#�� 1���3$ )0�� �� �.�" �� �� ���������.�&�� ���� � �"( 1��7; 0""���� � �"( 1��>3 �� �.�" �� �� �������� ./�,�� � �"( 1��83( 6��� �#��$ �#����� �"���� #��,�� �� �� $ ��#"� �5�����!����& ������� �� 0712 �� �� ��� ���� ./��� � �"(1���%3 �� �� ��������� .0""���� � �"( 1��83( �� ���% %!��$ 0712 ������� �� % ��&� !��������#%�������"" &� ���&������ �! � %�����"�#���&"���� ���� ��� ������!��� .���3 &� ��!�� �� � !��� �� ���������� ��� ��� ����#��� ./� � � �"( 1���%3( H� � �5��� ��!�������� �� *��� �� �� ��� ���� .��**� � �"( 1��83 �� � "�#��� �� �� ��������� .Q��, � �"( 1��83( ����������� �� ��������� ���� �� � �)� �� 6�&( �$�� � "��� �! �#������ ������ �� �"� �"��#� '�#�"� �� ����� �� ��%" �( � '������� �����!�� ���"�&��� &� '������� �� 5���� )�� �

���� � + ����" #�� �! � ���������� �� ��������� '�����������( � '������� ����� ������� �! � ( ! ���#���.�"�������"�$ � �� ���#���3$ � "����& ��� !�� ���"�&����5��� �� � �� ��#������( � �&#�� !�� �"��#� �����&������ �� %����� ������� �� ��� �5�� �� �� �#���""�� ���������� ��& &�$ � ��.* �&#�� !�� �����&����� �� � ���� �� ���.�" &� !�� �#�"#������� �! � ���L� ��'����� �( /"� ��������� ���� �� �� ���

:77

���#��� "#�� �"� !��# � �� �! ���#��������� �� � ������� �����(

� ���& �! ������ "� �� �� ����"�%" �� ��������"����� ��� ��� ���� � ������ �#����#�� �!� �����( �� �"" #� �"����� �$ �� "#�� �&��� !��# � *� ���,������ ��� (�� &� �� % ����"� !�� � �� ������( �� �� ��� ���� ./�,��� ��$ �� �� =�&& 1���3 �� �� ��������� .+ ��& ��� � �"(1��23 � ���� "#�� �� �� ( �"#��� �&��� !��# � ������� ������ &� �� ��& � ���&"�#� ��#�� .���3 �� � *2��������� ����� ����� ��� �� � �������5�� �� %� �� !�������� �! ��� �� �� �� ��������� .�� #���� �"( 1��>3(

������������

� �##��"� �� �"��� # �� !�� ��#%������� ��������� ������� �� %�� �� ��#�" ���� ���#������( � � ������ ��� #��" ����$ � 5��������&� ����� ) � �� �5��� !�� M��� &�'������� �� "" ��" $ %�� �� �������( � �����%"��%�� ���� #��� % � �� ���������� ������������( A�4��� !�#������� #� � ����$ !�� � #��� ����$ �� � ����"#�� ��%�� ����; &"���"$#� ���"$ &"��� �� �#%�������� � ��! #�� %�"� ( � ����#�" !�#������� #� �� � ��� ���#��� �5�� �� !�� ���"�&��� &� '�������� .( ! �� ������#���; � ������� ��

���� � 9��� ������� �� !�� ���"�&��� &� '�������

9��� ������ 0����� + ����� �!��

������� ���������?8� ���" O��� /�,� � �"( 1��1

��������� ���������F�� ���" O��� 0""���� � �"( 1��1�<11 ���" O��� Q��, � �"( 1��8�<1� ���" ����3� O���F�� � �� <��� $ ����%"�� �<1� ���" ����3� ��4 O���F����'� � �� <��� $ ����%"�� �<17 ���" ��4 O�����'� � �� <��� $ ����%"�� �<1> ����3� ��4 F����'� � �� <��� $ ����%"�� �<1: ���& ���� /( ?����#���$ ���( �##��������$�=��8 ��� � � O���%"�� AF1�F ���� F�� /� � � �"( 1��8�18 ���� F�� 9� &,��� � �"( 1���

��" ��4 ������'� �&�� ���� � �"( 1��>�=P=7�> ����3� F�� <���� � �"( 1���

���� �� ������+��A11 ����3�� � � ���#�� � �"( 1��2+��A1� ����3�� ��5�� � ���&� ���#�� 1���+��A18 ����3�� ���#���%1� � �+�7�+�%1�; .�������3 ���#�� 1���

���� ��� ����0/11> ��# ���E9��� =�&& � �"( 1�2>?�:1 ��4����*�.�#��#��#��5# ����9��� =�&& �� �� � 1�2:�=1��@� ��4����*�.�#��4����+ ��7 ��7��&7 ����9��� =�&& � �"( 1�2�/�A1182 ���#���# ���E9��E; ������� � �� � �"( 1��>

���� � �'������� ����� !�� #� �"����� � �����

+"��#� �'������� ����� /"����#��,�

��"�������5���

���&���& �5�� �!��

������� �����������01� ��!�����#���; �HA1���#������ �.�" �.�" /�,�� � �"( 1��8���� �� �������=Q�1�7 ��������#��� �!0� ���� ���#�� 1������� ��� �����0�+Q �������#���; �HG1���#������ Q�H=��� ���� �# � �"( 1��:�+�=�? ��������#���; �HG1���#������ �-*#;

,���#�������� /��� � �"( 1����

��������� �����������+�1�1 ������#���; �HG���#������ �.�" 9��/ ��� �# ���&������ 0""���� ��

9�""�%�& 1��:�6+��1�1 ( !����#���; �HG���#������ �.�" 9��/ ��� �# ���&������ Q��, � �"( 1��8�=11��+/ ��*�����#��� �.�" 9��/ ��� �# ���&������ =( �#�" .������"

�##��������3

:7>

����3 �� � !���&� &� ��� �� ���"! .0""����� �"( 1��>3(

H���#�" ��� ����� �! � ���"�&��� �#���� ���%���� )�� ��� ������- �#�"' !�#�������� #� � �� �� �4��� ��%�� ����� �� ����"�#���( � ����" !�#������� ��# ����� !��# 2� ��18� (

� �%�"��� �� � �� �& ��" � �! � ��#%�������� �� '���� !��# � #� ���" ��� )�� ���#���)�� ��� � � ����� �! #� ���" �� � ���5� !���� �!� �� ��������� '������� ����#( �� �������$ � #� ���" ���"�*����� ���#���� �� �"�� #� �"������ � ����$ ��#"� ���� ��� ���� �� ���������������� �� �����"� �� #� ���" !�� �� �����(� �!�� �� ������" ������ %�� �� � � ����#��5��� !�#������� #� � � �� "��"� ��#%" � ������ ���% �� � !�""�)��& '�#�" !�� � ���� ����� �! �#�"" ������� < ���!� ����&� .9<��&3.����)�* � �"( 1��13(

��� ������ �� �� ������ ����� ��� �� �����������

� &��)��& "��� �! ������� �� %��& ��� � �� #� ��"����� � �����( � � ��"� �"���$ %�����" �� �#�� �������$ �*�#�$ ����%� ��$ ���,���$ �"��#�������� �� ��#���( � �"���� �! � � '�#�"� ��"��� �� ��%" �( � !�""�)��& ����� )�"" !��� �� �!) '�#�"� �! �� ������""� �#������� ������� ���� � �� �� ��������� �� �� ��� ����(

+�� �� �"��#��� �� �� ��������� ��"� ����" � ��#�����"�$ !�� '�#�"$ � ������ ��#�%��� ��� ��$ ) � �� �����"� �� �&���& "����"����"� .�� #��� � �"( 1��>3$ �� ����" �##����""� ����"�%" ������� < �����( � �"��#�� �!� � ����� �� ���% �� #�� ���" %"�)(�� ����������%�� ��� ����� ����#� �� %�

�"�� !�� � ��� �� ��2 ��%���� �! 9<��&$��������& ������ �! � #��� �#������� ������� �!� ������� < ����� .����)�* � �"( 1��1; 0""���� �� �"%� 1��83( � ��� ����� ������ )�� &���� %������ ���& � �"��#� )�� � &� !�� � ����" ����&�!�� �� � �� ���#��� "#��� � �����!��# ������ #�� � � % !�#�� #�"����& &"���" �� #� ���" �� ��%�� ����� .� ������� �����3( ��� �� ������"�� !�#������� ��� ��$ � #� ���" ! �� ������ !�� � �� ����� �! ##%��� ���"�!�������� � ����� �� ���"�&��� ������ ��� �����( <���� ������ �� ����� �����""�"��"�$ �� #��� % ����� �� ����- !��# ""�"�� '�����( � ���& ����� �! ���� � ""� �� �#�&��* $ �� ����#�������& "" %��� �� � �� '���� �� �������� �� ������ ��� ����!�&�����( � 9<��& ������ ��� "�� ���������� �� !��� � ����- %� � �5���! &" � ��������$ ��� ' ��& ��#���&��� �$ �����!�&����� �� &" -"�������( ������""�$ �& "� ����- "��������� �����"� �� �%���� ) � ������ �! � ���"�&��� ����&� ���#%" ���� ����� ���

##%����( � �� �����" ������� �� ������" !�� ���#��"����& �� �##���"�&��" ������( 6�� ���� !���#�"�����$ � �����" �� � ���% �� �� �"�#���# � ��'� � J����� .0""���� �� �"%� 1��83( =������"�$ �)� �� ���������� ��� ������� < ������� �##���""� ����"�%"� 9����'�0�$ ��� � %� ?0== .?���3$ �� �&<$ ��� � %� F+=.��&�����3(

+�� ����� ������ !�� �� ������" �*�#� �� ��"�� )�� �� #� ���� �� M��� �� ��� ����� �������( ���"�$ � ��� ����� ����� !�� � ���� �� %� ���%"�� %�� �� �� ��������� �������.���� � �"( 1���3( + ����� .�����������" '�,���� ��� �� � ��� � � ��"���3 �� �*�#� � �� �"��� ��� �� &����� !��# � ��� �� $ � #��� �����&!��# �! � ��� �� �� �"����( � ��'����� � ����� �!�� �*�#� �� ���#�" ! !������� �� &�� � ����� �� ����� � ������#������ �� �� ��&� �� �,�� )�� � �#�"� ���� �! � ��� �� � ��� �)�� )��" % ���%" �� �� .�� *���,� �� O""� 1��83( � � ���� ��� ����� ����� #��� #������� � �& ��" ����& ��'����� ��%�� �����( � ���%�"�� �� ��������� !�#������� !�� � ���� ��� ������ �� ������� %� &��)� �� &"���" �� !�""�) %���������� "�#�� � ����� �! &"��� .&"��� �����������3( � �� �����$ ) � �� %�� �� �� ��'�������%�� ����$ �� ��" 1�(> &�" �! � ��� ��*�#$ � �� #���& � ���#� �5���#��� !�� ! � ���� ��� ����� .���� � �"( 1���3(

� ��� ����� �! 9/� ��� &��� �&�����& #������ ��"� % � �& "� M��� �� ����4��� �����$%�� #��� � ������""� ����� � �#���� �! �& 5��"��� �� ������( +����� �� ����""� �#������� ����"%�#�� �� ����""� � #������ �� �#��� �� ��� �!&��#� 5��������( �� M��� ��� ����� ����� ��%� �"�� %�� �� ��#%����� �� ��� ���� �������.<��� � �"( 1���3( � ����� ��" � �����'�#��"�1� &�" %� ����#�*��& � ! �! #� ���"$ �� �� ������� �� %� �-� �� #���#�* �����"��� &��� ����� .?�%���� � � �"( ����3( � !�#������� �� �)�����# ����� )�� �"�� �� �� �� ������">� #� ��" #�"����& /�����F��� � ��"�&� ��� ����" ����-����� ��� ./�#� � �"( 1���3(

� �%�"��� �! �� ��������� �� ��'���� �4���&�� �� -' $ ���%" ������ #�,� �� �� �������� %������"��� !�� � %���������� �! ���- ��%���������� ��"��%" �� ������" �#���� �( � %�����"��������� )�� ���"� &���� !�� � �������� �!&"��"�� �� &"��'�"�� �� � �������� �! "�������� ������� .0""���� � �"( 1��83( �M��� ��������� �� � �� � ���� �! � &"��"�� �'� �� �� � �����%" ���"�� �� ����#�" ���� ��#��� �#�����(�� � �� � ��$ �� ������" ��#%����� ������ )�� ��&��� ��%����& �� ���&��� ���� �! � ����� � ��� &"��"�� �'� �� .��3 &�( /�%�5���"�$ ��� ������" 1> ���� �! � *� ���,������ ��� ���"��� .����3 &� )� ����� � ���� � �� ������( � ���"���& ������ ����� � %�� �*�#� �� �& �#����� �� �� �� ����#�" ���� ��#��� �����( 6��

:78

��������$ � ��%����� )�� � �� ��&������� ��#%����� ""� � �� � �����""�"��"� ���#�"�� � �)� �*�#� �!�� !�#������� �� ����������� �� ������( =""� �� % ��" !�� ��

"��� �>@�� ��%�5��� %�����"��� ������� .0""����� �"( 1��83( � �"���� �! ��� ����� ������ %�� �� &����""� �&��� �� ��������� ������� ������� �� ��%" 7(

���� � �'�#�"� �! !���&�������� ��� � ��#� �"����� � �����(- �����""�"��$ * ������(.�� �- �� �� �� �!��=�&& 1��� �� 0""���� �� 9�""�%�& 1��:3

�� �!��

���� �� ������9�#�� &"���#�� ��%�'�"�� � ���#�� � �"( 1��29�#�� "���� / ���#�� 1���

���� ��� ����<�����+������� ������� ������ .6���� ����3 � ��#���� � �"( 1��1������ ��'�� = !��&#�� .���� ������3 � ="�� � �"( 1��1/�%��"���� �� �%���� .* ��� �����3 / ���,����� � �"( 1��8

6��&��"� � 1 �""�&� .�� �������3 / A ���& � �"( 1��8A����� �"����� �� � .�����5�����3 / <������ � �"( 1��:�1$���������"�����!��� .*��������3 / ��#�� � �"( 1��:

+"����0"��"�� �'� �� .����� 3 � +��� � �"( 1��>=�� 1 �""�&� .<�#� � &����3 / /#�� � �"( 1��8+ ��� ��#� � �� < .������3 � �� �� � �"( 1��:

�����%����0�� N������ ������ .J""�-� 3 � ������� � �"( 1��8<#28 ����&� .��,3 � �� ��&�* � �"( 1��79��� �� / ����!" � �"( 1��8

9�#���9������� < ���!� ����&� � =�&& � �"( 1�2:��� �#�" &��)� !���� / /�&" � �"( 1�����H���� ����� / ��"#��� � �"( 1��89�#�� ���# �"%�#�� / <��� � �"( 1���9�#�� F)�� !����"�����!��� .6������3 / 0�""� � �"( 1��2�1������������ / ?��& � �"( 1��29�#�� �' ����� �%�� ��& ������ ./<+3 / /�� � �"( 1���9�#�� � ������� / <� # � �"( 1���

������� ��������� ��"�� ,���� .*��������3 � /�,�� � �"( 1��>0"���#�"�� ..�7����3 / /�,�� � �"( 1��8

��������� ���������<�������F���#�� .0� ���3 � ����)�* � �"( 1�22��0�"����� �� .0� ���3 � <���� � �"( 1���

6��&�0"���#�"�� .*2���������3 / 0""���� � �"( 1��1������� .*��������3 / ������ � � �"( 1��>=���"�� � .*��������3 � 0""���� � �"( 1��80"��� �'� �� .�����5�����3 / 9� &,��� � �"( 1���+ ���� .�����5�����3 / ���� � �"( 1���

+"����0"��"�� �'� �� .����� 3 � 0""���� � �"( 1��8/ �����& ������ � <�, �"* �� 0"��� 1��1��"�� � ��&��� .)��� #"��3 � 6�%� � �"( 1��7+ ��� ��# .���3 � ��*"� � �"( 1��:

���#�"�9��� �� .9��� �3 / �� #��� � �"( 1��>��������� .%����3 / Q��, � �"( 1��80�� N������ ������ .J""�-� 3 � =( �#�" .������" �##��������3

9�#���9<��& .�3 / / � � �"( 1�2�9<��& ./$ /�F3 � ����)�* � �"( 1��19#�&"�%�� � 0�"%�� � �"( 1��7 �F���� / <�, �"* �� 0"��� 1��1 �� ���� ���'� �� / � "�, � �"( 1��� �O��,���� / �&�� ���� � �"( 1��>�1 ����������� / ?��& � �"( 1��29/� / ?��& � �"( 1���; =�' � �"( ����

:7:

���������

�� �"����� � �� %�# ��!�� ���� !�� ����"�&��� &� '�������( � ��! �� �����������#� �� �%" �� ����� �#������ ������ !�� � ��� ����� �! �� ������" �#���� � ���&��& !��#� ���" �*�#� �� � ��#�����"� ���� !�� ��#�� ��( � � ��"�&� !�� ���"���& � � ����� ��������""� #���� ��) �� � '������� ����#� �������"� %��& �#�"#�� )�� �) �#�������� �) ���"�������(

� ������������� � )��" "�, �� � ��, 6( ���"� �� �( +���� �, !�� � �� "� �� �������& � #��������(

���������

�&�� ���� �H$ +�*���,���,� ��$ <�& ����� ��$ ������������ �A .1��73 ���"����� �� ������*����� �! � )0��&� �! ��������� ���������( P��� 1�� >��@>1�

�&�� ���� �H$ <%���� �P$ ����������� �A$ /#����� ��.1��>3 � ���������� ���"�#�� ������ !�� � ���&� ���&������ �! !���&� &�� �� ��������� ���������� P��� 11�1�71@1�7:

�&�� ���� �H$ ���� ,��� +�$ /� � ��9$ = �� ��/$ � /�?$����������� �A .1���3 ����� !�� ���� �"���� �! ����&����� )�� �4��� �"��#� ��� ��#%� �� � ���� ���������� ��������� AF�1( P��� 1>� >71@>>1

<����� ��$ +��� ��$ P����) A .1���3 P����� ������������ � ���-�����$ �� �( =�#%�� & O�������� +���$=�#%�� &

<��� ?�$ 9��,��� /�$ /�,��� �� ? .1���3 +�����" !�� M��������� �! 9/� �"�� !��# ���� ��� ����� + ��# ��&1�� 72@>1

<������ �$ ���� �$ A%������ �+$ A��5��� �$ ?�%���� � 9$F��&R �+ .1��:3 <�� #��" �� ����&�� ������*����� �! ��) ����� �"����� �� ���"�� !��# �����5����� 8���5� ���� <��" = # �:�� 8��2@8�77

<� # �$ +����/ � � /$ ���� F<$ / �"�� �$ 6�",#�� �.1���3 A��������� �! � 90�� &� �� ���� ��� ���� �""�)�'������� �! !�""�"�&� #���� �� �#�� � �������( P���1>� >8�@>:�

<�& ����� ��$ �&�� ���� �H$ ����������� �A .1��>3 +"���#� ���&���*����� ����& ���&����� �����!��#����� �� ���������� ���������� P��� 11�17� 1@�

<�& ����� ��$ ?����,��� H/$ �&�� ���� �H$ ������������A .1��23 /5��� �! *�������� ���,����� � #����A�� �#������& �"��#� �����������& ����������� ����������P��� 17� 1@�

<��� ��� �?$ =���""��� 6� .1���3 0"����"����� �! ������� ����� ��� �������( <��� ��" ���" <�� # ���1��@���

<���"� �� .1��23 /����� �! ��#%����� �#�� ����"���"�,&��)� !���� �( ��� 9�&&��� A�$ =�&& �� . �3 ���� ����

���"�� #� � � �� #�"�"�� %��"�&�$ ���� 11( 9�#���$����)�$ ��$ �� 17�@1::

<���� �$ +R �* �A$ +� �#� 0$ 0��*�R "* =$ 0��SR ��F�&� +$/����� �� .1���3 � �� �! ��������� ��������� ���&���������� �� ������� ��: !������( ���" ����%��" <��� ��">�� ��@��

<�, �"* �0$ 0"��� ��0 .1��13 P��� ����#� !�� � �#�#���" ��� ����� �! ���"�&��� �������( <��� ��"�&� ��1�8:@1�:�

="�� ��$ ���#�� 6<$ <�""����� /+$ /�,��� �� ?$ ��#������ .1��13 9�& �"�" '������� �! ������ ��'�� !��&#�� = ������ ��� ���� ������� ��������& #�"���" ��� # ���&��������! � &�( <��� ��"�&� �� 7>>@78�

=�' 9$ �� A$ /� %�� +$ �"�� �$ ����� F .����3 =����������'������� �! ��#%����� ������� �� � #� �"����� � ������������� ��������� ����& � � �� ���#���( P��� .������3

=�&& �� .1���3 �'������� �� � #� �"����� � ���� ������� ����� ��� 6���� * ��$ 9�T� �+ . �3 0� '�����������#�� ����& ����� !�� � ��� �! '�������( �� #�$ /��A�&�$ �� 1>:@1�1

=�&& ��$�� �?� .1�2:3A�"��#�� �! ���� �����!��#���������#� �� ���������� �! #� ���"����"�*��&� !��� #������� �! ���� ��� ���� %� &� ���������( ��� /�)��� 00$����"" �$ ?"�� �A$ 9�%� �� . �3 <��"�&��" ���� ���� ������" �����$ ��" �( =�=$ <�� �����$ 6"�($ �� 1@12

=�&& ��$ <�����&� ?�$ 9��"� �P$ �� � ?� .1�2>3 ������� ���� �� � ��� ����# !�� �����!��#������( ��" ="" <��" >���:8@��2>

=�&& ��$ �� ��� �6$ /��""#�� =$ /�&" �$ �,��& �$ =���& �/$<�, �"* �0$ �� � ?�$ ?""���� +�$ A���� 0�$ /#�"�<F$ =��* �$ ����&����� �$ �"�"%� 0$ � �"" 0+ .1�2:39�& �"�" '������� �� M��� ���#%"� �! ������� <���!� ����&� �� � #� �"����� � ����$ ���� ��� �����<��� ��"�&� >� 7:�@72>

=�&& ��$ �� � ?�$ <�����&� ?�$ � �"" 0+$ /��""#�� =�.1�2�3 6�������" ������*����� �! � �)� �"� �" �'� ��&�� !��# � ���� ���� ��� ����( ��" ="" <��" �� 1�18@1���

A ���& ��$ � �,� ��$ =����� �9$ Q ��& F$ ���� �� 0$�� 9$ ��J�� 9� .1��83 ���"����� �� '������� �! � A��"�� �� ��& �� �� ������� �� ���� � �"� � 1 ��%����( ��� �� �""�&� �##���" 111� �2>@��>

A� #� ��$ /������ ���$ 9�B �� =<$ 9�""�%�& =+ .1��13 ��M��� �����!��#����� ��� �� ��%"��& "��&���# �����&�! �#���� ""� �! ������� ���� &���( P��� :� 8�1@8��

A����& 6$ ?"���� �$ � �� /$ A���" 9 .1��23 O� �! � &"����" � ���� ��� �� � ��&��� ���#��� !�� ��� ������ �! !�������" #�##�"��� ##%��� ��������� ������� ��� ���� ���� ��� ����� <�� # <��� �� �� =�##�� �>��>�1@>�>

�&"� �$ ��� A�J,� �+$ �� ��� �$ 9�� � �$ 6� �� � .1�2�3�� ���" #��%�"��# �� ������ �&�"����� �! � ���� ��� �!���%�"� �*�#�( �� ����%��" 1�7� 11>@1�7

6�%� ?�$ 9��#� +$ 9�� � �$ �� ��� �$ �% 0 .1��73 9�& "��M��� "��������!��#����� �! � ���� ��������� ����������� =��� 0�� �>� ��>@�1�

6�%� ?�$ 9�� � �$ �% 0$ �� ��� � .1��>3 �� �"����� ������ �� !������ !�� � ��� ����� �! !���&� �������( P���11� 1��1@1�77

���� � �� ������" ��� ����������� %�� ��#� �"����� �

+����� .��&����#3 �'������� ��� /����� �!��

+ ��#�����"�9<��& . �#��3 �� ��������� +�� ��� "��� 0""���� �� �"%� 1��89��� �� .������3 �� ��������� ="����" ����"� 0""���� �� �"%� 1��89/� . �#��3 �� ��� ���� ="����" ����"� /�#� � �"( 1����06�� . �#��3 �� ��� ���� ="����" ����"� <���"� 1��2

� ���" �*�#�+ ���� .�����5�����3 �� ��������� +�"�� ���� ���� � �"( 1���

:72

6""��&� ��$ ��%�," ���$ ��" ��$ /� %�� +�$ <�# ��$H��%, �$ ������ =� .1��13 �'������� �! � ��&�"������ �� !��# ��������� � ��5������� .0���3 %� ��������� ����������� P��� :� 78�@7:7

0�""� +6$ ���J��� 9$ +��� ��$ ��!�� �$ H�"#�� � �$ H���"�$ F ������ =$ 0��""���� �$ ��"�� � .1��23 9���"�&���'������� �! �� �&��� ������ !��# �! �#�� F)��!����"�����!��� .6O�����3 %� � #� �"����� � ���� ����� ��� ����� 0"��%��"�&� 2� �1�@��>

0��*, �$ �� #��� O$ ����)�* Q�$ 9�""�%�& =+ .1��>3/��%" #�"����� ���&������ �! ���� �5��� �� ������������������( ���" ����%��" <��� ��" 7�� 277@27�

0""���� 0$ �"%� ? .1��83 �� �"����� � ���� ������������������ �� ��� ����� ��&����# !�� ��#%����� � ��#������"�( A��& �� 78� �7�@�72

0""���� 0$ 9�""�%�& =+ .1��:3 ���"������ �! ����� �� &�'������� ��� ��� � �#������� �! *�������� ���,�����$��������� ��������� �� 9���,������� �� �� @ � ���)(0� 1��� 2:@�:

0""���� 0$ 9�""�%�& =+ .1���3 ���������� ��� ��%����� �?$<��� =�$ +��" +A . �3 ���"�� �� �! !�� #���%��"�&�$��" �( �� #�$ /�� A�&�$ �� �:8@�2�

0""���� 0$ ����)�* Q�$ ��,"%� �$ +����, �$ ?�� +$�� #��� O$ 9�""�%�& =+$ /������ ��� .1��13 9����"�&��� &� '������� �� ��������� ���������; M��������� �! &"���#�"��( <��� ��"�&� �� ��1@��>

0""���� 0$ 9�""�%�& =+$ ����)�* Q� .1��>3 0� '��������� #� �"����� � �����( <����� � ��" ��� 1�>@���

0""���� 0$ +����, �$ A� "#� O$ ��*")�,� �$ 0���&�� ��$A�=���#� �$ ����� AF$ ����)�* Q� .1��83 ���#%����� ��������� ��������� �� � %�����"���� �'�������� �! � ����� &"��"�� �'� �� .��3 �� � *� ���,����� ���"�� � .����3 &�( ���" ����%��" <��� ���" 78� 78@>7

0##�"" ��$ ���#%" �< .1���3 H����) �! ���� H�"��, �"��&��� ��� �������� !��� �� ������� ���� ����( <�� �#<��� �� ��� 17�8� ��:@��:

0�"%�� /=$ ��� O�, 9$ 0��-" A�$ ����� ��$ A����?�$ =�& "�� A$ ���� 0A$ �� A� .1��73 ����� �� �����#%� �! �� ���&��� ���� ����& ��������� �"��� �!��������� ��������� '������& !�������" �#�� �#��&"�%��( P��� 1�� 1>8�@1>2�

0"��� ��0$ /� %�� +� .1�223 � #� �"����� � �����(P��� 7� 1@1>

0� =6$ 0��#� ��$ �� ��� A=$ <� � �<$ ���#���� ��.1��13 � �"�&��� ��� � �! &"���������� %������� !������4���& �"�&��� ��� ������� �� � �� 4� �� &"��������� ��������( <��� ��"�&� �� 1�7:@1�>>

0����� F/$ �� ��� �6 .1�2�3 /�* �����%����� �� &���"��������" !����� �! ��"��, �"�&��� ��� � !��# � #� �"����� � ����$ ���� ��� ����( P��� >� 1�:@11>

9�*� �$ <���� �=$ <�� + .1�:�3 �� ���" ����#�"����� %������( �� ����%��" 2:� 12>@122

9� &,��� �$ �� A$ <�""�� A�$ 0�� � �$ /� %�� + .1���3�'������� �! � &"��� �'� �� &� !��# �����5����� ��5�� ����������� ��������� �� ��� �� �� � ������ &� �� ���"���&�"����� #��������( P��� �� 8�>@8�>

9�""�%�& =+$ 0""���� 0 .1��:3 +�� ����� �! ��#%������������ %� #� �"����� � �����( =��� H��� <��� ��" 2�>>7@>8�

����)�* Q�$ ��,"%� �$ �,��� �$ �� #��� O$��&&�,�#� �$ 9�""�%�& =+ .1�223 �'������� ����#%�� �� � #� �"����� � ���� ��������� ����������P��� 7/� 1>>

����)�* Q�$ �"%� ?$ ��,"%� �$ ���%� �$ 9��!�� �$=�#%�%� �$ 9�""�%�& =+ .1��13 /�#�"������ '�������� �! � / �� F ���!� ����&�� �! ������� <$ �� !���#����� �! #�' �����"� �� � #� �"����� � ����$��������� ���������� P��� :� 7�1@77�

��,��� �$ +��, �<$ ��#� A= .1��83 0����& � &"����"�������& �� �#�"������ !�� � %��� ��"�&� �� �����( ��� <���� ��" 17� �:>@�21

?��& 9�$ /� � ��9$ = �� ��/$ = ��& <9$ P� ��9$ � /�?.1��23 0"����"����� �! �#�� �1������������ �� *��������� ���,����� �� #� �"����� � �����( P��� 17� �:1@�21

?��& 9�$ 9��& �?$ = �� ��/$ /� � ��9$ �&�� ���� �H$ � /�? .1���3 H���#�*����� �! � ������ '������� �! ��#�%����� �#�� ���# �"%�#�� !��# � �� ���#��� ����������� ���������� =��� 0�� �>� ��2

?�%���� � ?$ ��,�#��� �$ /�#� �$ H #��� �$ P�,���#� ?.1��23 � �"��#�� �! ��#%����� �#�� ���# �"%�#��(� � �� � �� �>:@�8�

?�%���� � ?$ ?�)� /$ H �� �$ H � �$ H ��#� �$ H � 9$��#�#���� ?$ H #��� � .����3 9�& �"�" '������� �! ���#%����� �#�� ���# �"%�#�� !��# � #� �"����� ����� ���� ��� ���� )�� #���#�" ������ ��� ����� �� ����������( � <���� <���& 2�� >>@81

F %�� ��$ � �� F$ ���� �$ ����� =$ <�� ��$ ������ =�$����)�* Q�$ �,��� �$ ��&&�,�#� �$ 9�""�%�& =+.1�2>3 ��"�"�� "����& �� ������*����� �! � &� � ��&!�� #� ���" �'� �� �� ��������� ���������� ��"� �� ��� 1�� ��8�@��2�

���,����� �$ <�"" =�$ ?�"����,� � +� .1��83 �� �%����� �! ������5����� ���� �������� %� * ��� ����� ��%��"���� �� �%������ �& �"�" '������� �! � �� �� �%���� �� ���� ��� �����<�� # <��� �� �� =�##�� ���� �:�@�:8

���� �6$ 9""#�� ?$ / "�,� 9$ F��*�O"�%���� �$ H��" /$A� "#� O$ /������ ���$ ��� F��� �+0� .1���3 �� '�������� ����# #������ � �& "� M��� �� ����4�������� !�� � ���� ��� ����� %� ��#%����� ������� �!��������� ���������( <��� ��" <���& 8�� �:�@�21

������� �Q$ ��*" ��$ F��� 09$ 9�#�� ��$ /�%��#��� /.1��83 F�%""��& �! ���'���#� )�� &�� N������ �������� "����& �� ��� ���� ""�( � 9���� # =��� # 77� >21@>2�

�������� �$ 0���� �$ U������ H$ =�#��� �� .1��23 ����������� ��"��, �"�&��� ��� �������� �� ���"�&��� ���������� %� � #� �"����� � ���� ���� ��� ����( +������'�� +���! 17� 1�:@��:

��*"� A$ �#%�& �$ 0�B ���� � .1��:3 F��&���" &��������! �M���������- ��#%����� � ��� ��# ��#����� (+ ��� # + ���%��" 88� :1�@:1>

������ � ��$ �� ��&�* F$ �� ��&�* �$ A��* �$ A"&� � �$9���� F .1��>3 9�& "�" ��� ����� �! ��#%����� �������� �� ��������� ���������� <��� ��" F�� 1:� �7�@�>�

+��� �/$ +���""� ?F$ 0���&�� ��$ ��&�� F�$ A�=���#� �$����� AF .1��>3 9�& �"�" ��� ����� �! ����� &"��"���'� �� �� � #� �"����� � ���� ���� ��� ����; �&�����&� %�����"���( 0� 18:� �1>@�1�

+ ��& ��� �$ ��,"%� �$ ?�� +$ 0""���� 0$ 9�""�%�&=+ .1��23 ="����& �� ������*����� �! � &� �� ��& �������%" �� � ��� ���� .����3 !��# � #� �"����� ����� ��������� ���������� ���" ����%��" <��� ��">�� ::@27

���#�� =? .1���3 ��#%����� ������ '������� �� ������ ������( ��� 6���� * ��$ 9�T� �+ . �3 0� '�������� ����#�� ����& ����� !�� � ��� �! '�������( ��� #�$ /�� A�&�$ �� 1��@���

���#�� =?$ <�,�)�,� �$ 9�" �#�� /A$ = ��& �6�$ ����J��$ /��## �� .1��23 A�"��#�� �! � #� �"����� �����$ ���� �� ������$ !�� � '������� �! �! � 8>�,�"� �"��� ���!��# �! �#�� &"���#�� ��%�'�"��( P���17� 11@��

��� �� �$ ��#��� �$ ��#,� �$ A ���&�"�� = .1���3 � � �#�� �"� ���� ��������� ��������� �� ��� �5����� �"�� ���� ��� !�� &��)� �� �& �#������� %�� �� !�����#�" �5�������� �! � �#���"���( � <�����" 121� 788>@7882

�� ��&�* �$ ��%��� �$ +�� � �$ ��������� �$ =�#��� �$ "� 6��� � .1��73 9�& �"�" '������� �! � 6� ��������<#28 ����&� �� � ���� ���� ��� ���� !��#��& �& "� �#�#���&�� �����"� !�� ���"( � <��� ��" ��� 1�>@178

��#���� ��$ ="�� ��$ <�"� ?�$ ���#�� 6<$ <�""����� /+$��,�4 ��$ A��&�� 0$ 6���)�� � �6$ = ��"� �0 .1��13��#%����� 6���� ���� ��� ����� ������� .+8�3 !��# � ����

:7�

���� ��� ����; 9�& �"�" ��� ����� �� �##���"�&��"��������( ���� �� ��1@��8

��#�� +�$ F����� �$ / �� ��$ <���� 9$ 9������ � .1��:3?��1� �� �� ��1$��#������"�����!��� �! *�������� ����,�����( =�#������� �! � �*�#� �������� �! ��"�%" ���#%����� ?��1� �� ?�������1� ��� � �� ������� ����� <�� # � ��1� �2�@��>

����!" /�$ �� �� A$ ���� � �$ 9�""�� 06$ ?��%% ��$ ��� /.1��83 +�� ����� �� ����-����� �! ��#%����� ��� �� '����� �� � #� �"����� � ���� ���� ��� ����( +������'���� +���! 2� 7:8@72�

�� �� �$ / #� � +$ 0��* =$ <���"���,� /�$ 0�B ���� �$/ �4�� ? .1��:3 ��#%����� ��� � �� < � ��� ��#�!��# ������( �������� �%�������� ���������( <�� #������8� 1��@111

/�,�� P$ ���� P .1���3 ="����& �� �5����& �! � �"� �"�'� ����� ��& &� .��!�3 !��# � !��#�" � ���� ���& ������&���� #� �"����� � ����$ ��������������� /�( 0� 117� 8:@:�

/�,�� P$ ?�*���#��� �$ ���� P .1��13 �����!��#����� ����# !���� ������&���� #� �"����� � ����$ ������� ��������; "�����& �! � ����� ���>��� ��� �� ��%�'�"�� &� .�.�"3$���"����� �! ����" ��'����� � #������$ �� �� �! � #������!�� ���&����� �����!��#�����( � <�����" 1:�� :7>2@:78�

/�,�� P$ ��&� �$ ��,� � �$ ?��� �$ ���� P .1��>3 �'������� �!*�������� � ��"�� ,���� &� �� ������� �������� �� �� �&�"����� �! ��� �"� �" �'� �� ���#���( ���" ����%��"<��� ��" 7�� 28�@287

/�,�� P$ �,���#��$ ?�� � 9$ / �%��� P$ ?��� � .1��83 9�& �"�" ������ �! !��&�" &"���#�"�� ����& � ������� ��������&� '������� ����#( <�� �# <��� �� ��� 1��2� 21@2:

/��� =�$ <�, �"* �0$ ="�� ��$ ��#���� �� .1����3 � ������""�"�� ��� ����� �� ������ �!9���1 ��"�� ������ ��� #� �"����� � ���� ���� ��� ����� 0� 1�8� 111@11�

/��� =�$ ="�� ��$ �=�#%� ��$ ��#���� ��$ /�,��� ��? .1���%3 ���� �"���� ����& 0712 �! �& ��� ��#%������!��#���� �! ���� ��� ���� !�� �& �"�" !���&� &�'�������( <��� ��"�&� 1�� 121@127

/ � /�9$ <����� F$ �&��� �$ 6��& �$ /"�"��� /� .1�2�3 /���� ��� �� ������ �! ������� < #� " ���!� ����&� %� � #� �"����� � ���� ��������� ���������� 0� 27� ���@���

/ � /$ /�"�� 0$ �4��� ��$ =�&& �� .1��23 � �����& �����&�������&�"�� ���#��� !�� �����"" '������� �! !���&�&�� �� � ���� ���� ��� ����� 0� �18� ��@1��

/�&" �/$ <�, �"* �0$ � �"" 0+$ ��� ��, F� .1���3 +��� ����� �! �� �#�" &��)� !���� �� #� �"����� � ����""�( ��� +�� ���" �H���1�8�:

/#�� +�$ /�� ��&"� =$ 0��M� ��$ � ����"� ?$ ?��' �<$ /��& �< .1��83 ="����& �� '������� �� ���� ���� ��� ���� �! �%��"�&��""� ���� !��# �! =�� 1$ � #�J�� �""�&� �! <��#� � &���� ��""�( � �""�&� ="�� �##���" �2� ��1@�7�

/� � �9$ = �� �/$ ?�# =9$ �&�� ���� �H$ ������������A$ � �/$ � /? .1��83 � ���" ������#���"� ��"������& �5�� .��/3 !�� #�"���" ���&������ �� � ������������� ��������� AF�1( � <�����" 1:2� 77��@77�2

/� � �9$ = �� �/$ ?��& 9�$ � �/$ � /? .1����3 � !�#�"��! �"�#��������� ������#���"� ��"�����& �5��� �� � �� !������� �� ���&� ��#%������� �� ��������� ���������� AF��( � <�����" 121� 1��>@1�1�

/� � �9$ = �� �/$ ?��& 9�$ � �/$ �&�� ���� �H$ ����������� �A$ � /? .1���%3 � �#����� �"���� ����# ��&� !�� ������#%�������"" &� ���&������ �� ���������� ��������� AF�1( ���" ����%��" <��� ��" >1�2��@2�:

/������ ���$ 0""���� 0 .1��23 P��� '������� ����#� �� � �� �#������ ������#��( + ��# ����! ��� �� 1>1@1>�

/� %�� +� .1��73 � ����*�������� �����( P��� 1�� 1:�:@1:�8

/� %�� +� .1��83 � '������� �! ��#%����� ������� �������( =��� H��� <��� ��" :� >1:@>�7

/�� F�$ F���� �$ �� =$ �=��� �$ ��� �$ +��� +9 .1���39���"�&��� '������� �! )�" ��� �� &"����"�� ��#�� �' ����� �%�� ��& ������ ./<+ �� /9<03 �� � ����$���� ��� ����� = ������*����� �! � ��#%����� �������(� /���� <�� # ��" <��" 82� 11�@1�:

/�#� �$ H,���#� ?$ ?�%���� � ?$ H ���� �$ H #��� �$ P��,���#� ? .1���3 +���-����� �! ��#%����� �#�� ���#�"%�#�� @ M��� ����-����� ����& /�����F���( <������������ 2� 1�>@���

��"#��� 6$ /� �%� /$ A#��& +$ ��"�� �$ �#���� F� .1��83�'������� �� � ��#��"�&��" ������*����� �! �#�� ������� ����� �� � #� �"����� � ���� ���� ��� �����6�</ F�� ��7� �82@�:�

���� P$ ?��� �$ P�#� � 9 .1�:23 O��"�*����� �! #� ���" %������( � � ����% + ����" �7� 18>@128

���#%" �<$ ��,����� +9$ �� ��� �6$ ��)��� ��$ ��"� 6.1��13 /������ �! �"�&��� ��� � �� *�������� *���������� ��� %� � #� �"����� � ���� ���� ��� ������ <��" = # �88� ��2�:@��21:

� ��, �$ <�, �"* �0$ ��&" �$ O��� �$ ?���� �$ +����) /$/�&" �/$ � �"" 0+ .1��13 9�& �"�" ������ �! %��"�&��""����� ��������� !��# � #� �"����� � ���� ���� ��� ������ �� ����%��" :� 1�:@���

��**� F�$ ����)� F$ 9�&&��� A�$ +��"" ��$ <�&�� �$ =�"�"������� F�$ F���""� ��$ 9�T� �+ .1��83 +�� ����� �! ���#%����� %���� ����,���� ���"��� ��%���� �� � #� �"����� � ���� ���� ��� ����� <��� ��"�&� 17� ::@21

���� �# 9�$ A�&�� ��$ ?���* +�$ F��� /F$ =�&& �� .1��:3���"����� �! � ���� ��� ���� &"���" � ���� ��� �� � ��&��� &� �� �&�"����� �� �� �! ��� ���#���(0� 128� �:@77

� "�, �$ 6��#����, �$ 6�)"� / .1���3 �'������� �! �#��� ���� ���'� �� �� *�������� ���,����� �� ������������������� � ��" �� �����" 1�� ��>@��8

�� #��� O$ ?�� +$ +����, �$ /������ ���$ / ) � �$0""���� 0$ ����)�* Q� .1��>3 9�& �"�" ������ �! ��� ��%� ��������� ��������� 3 ��� ��� �������& �! � � �!�!��� ����� ��� ���( ���" ����%��" <��� ��"( 77� �::@�2>

� �� =�$ 9���� ��$ �����&� A+$ � �� F�$ ?�#��� ��.1��>3 F��&���" '�������$ ����-����� �� ������*������! �#�"" !��&#��� �! � ��#%�#� �"��� � ��"� �! � ��'� �#��� �� �! #� ����� �22( +����� ��& 2� 11::@112:

�� *��,� ��$ O""� �9 .1��83 + ����( � � ���" ����%��" 7���8�@���

Q��, =$ ?�%�� �$ ?�� +$ 9�B �"�� A$ <����, �$ � �B ##� �$?�"� ���$ 9�""�%�& =+$ 0""���� 0 .1��83 +�� ����� �!�)� ��������� �������� �� ��������� ���������( +���� <��� # �1� 8:�@82�

��� ����� �� ������ � ��!��#����� �� �� =( �#�"$ ������"�##�������� �� /( ?����#���$ ������" �##�������� #����) % !��� �� � !�""�)��& ��%"��������

�#�" =$ 0""���� 0$ 9�""�%�& =+$ /�,�) � .����3���"���� �! �� � �, ���#���� �� ��������� ����������� ��*� ���#���$ � ���" "#�� !�� ���"�&��� &�'�������( <��� ��" <������� ��& >� 1@8?����#��� /$ +��� �$ 0""���� 0$ 9�""� �$ <���� 0 .����3��.�& �� � ����#�� #���� �! � #� �"����� �������������� ��������� �� �� ����� ���� #� ���"���"�*�����( � <�����" 12�� 7122@71�:

:>�