gensel induksi poliploid cholis

48
LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA SEL INDUKSI POLIPLOIDISASI KROMOSOM PADA BAWANG MERAH (Allium ascalonicum L.) DENGAN INDUKSI KOLKHISIN DAN PENGARUHNYA TERHADAP PERILAKU KROMOSOM SELAMA MITOSIS OLEH : Nama : Adhi Nurcholis Nim : 13/357330/PBI/1215 Kelompok : II LABORATORIUM GENETIKA PROGRAM STUDI PASCASARJANA BIOLOGI FAKULTAS BIOLOGI 1

Upload: adhi-nurcholis

Post on 26-Dec-2015

90 views

Category:

Documents


6 download

DESCRIPTION

this is my report of genetic cell lesson.

TRANSCRIPT

Page 1: Gensel Induksi Poliploid Cholis

LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA SEL

INDUKSI POLIPLOIDISASI KROMOSOM PADA BAWANG MERAH (Allium ascalonicum L.) DENGAN INDUKSI KOLKHISIN DAN

PENGARUHNYA TERHADAP PERILAKU KROMOSOM SELAMA MITOSIS

OLEH :

Nama : Adhi Nurcholis

Nim : 13/357330/PBI/1215

Kelompok : II

LABORATORIUM GENETIKA

PROGRAM STUDI PASCASARJANA BIOLOGI

FAKULTAS BIOLOGI

UNIVERSITAS GADJAH MADA

2014

1

Page 2: Gensel Induksi Poliploid Cholis

LEMBAR PENGESAHAN

Telah mengikuti praktikum Genetika Sel yang telah dilaksanakan pada tanggal 7 Juni

2014 di Laboratorium Genetika, Fakultas Biologi, Universitas Gajah Mada dan pada

tanggal 14 Juni 2014 di Kebun Stroberi Inggit, Banyuroto, Magelang, Jawa Tengah.

Sebagai pra syarat menyelesaikan praktikum Genetika Sel Tahun Ajaran 2013 – 2014

di Laboratorium Genetika Sel Fakultas Biologi Universitas Gajah Mada Yogyakarta.

Yogyakarta, 9 Juli 2014

Mengesahkan,

2

Page 3: Gensel Induksi Poliploid Cholis

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR ..................................................................................... i

DAFTAR ISI ................................................................................................... ii

BAB I. Latar Belakang .................................................................................... 1

BAB II.Tinjauan Pustaka ................................................................................. 3

BAB III. Metode Penelitian.............................................................................. 27

BAB IV. Hasil dan Pembahasan....................................................................... 35

DAFTAR PUSTAKA

LAMPIRAN

3

Page 4: Gensel Induksi Poliploid Cholis

BAB I

PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

B. PERMASALAHAN

Permasalahan pada praktikum tehnik molekuler ini adalah:

1. Bagaimana cara melakukan induksi poliploid terhadap tanaman dengan

mutagen kolkisin?

2. Bagaimana cara mengamati pengaruh induksi poliploid terhadap

kromosom tanaman ?

3. Bagaimana cara mengamati fase – fase mitosis berdasarkan letak

kromosom?

C. TUJUAN

Praktikum ini bertujuan untuk :

1. Melakukan dan memahami induksi poliploid terhadap tanaman dengan

mutagen kolkisin.

2. Melakukan dan memahami pengaruh induksi poliploid terhadap

kromosom tanaman.

3. Melakukan dan memahami fase – fase mitosis dengan mengamati letak

kromosom.

D. MANFAAT

Manfaat dari praktikum ini mahasiswa :

1. Mampu melakukan induksi poliploid terhadap tanaman dengan mutagen

kolkisin.

2. Mampu melakukan dan memahami pengaruh induksi poliploid terhadap

kromosom tanaman.

4

Page 5: Gensel Induksi Poliploid Cholis

3. Mampu melakukan dan memahami fase – fase mitosis dengan mengamati

letak kromosom.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. DASAR TEORI

B. HIPOTESIS

5

Page 6: Gensel Induksi Poliploid Cholis

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. ALAT

Alat – alat yang digunakan dalam praktikum ini antara lain:

a. Induksi Poliploidisasi

1. Petridish 2. Pisau

b. PCR

1. Kotak es 4. Sentrifuge

2. Micro pipet dan tip 5. Mesin Thermo Cycle

3. Tube 6. Freezer

c. Electrophoresis

1. Labu ukur 2. Micro pipet dan tip

3. Microwave 4. Mupid Electrophorator

5. Cetakan gel dan sisir 6. Pemancar UV

B. BAHAN

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah :

a. Isolasi DNA tanaman menggunakan KIT

1. Aluminium foil 2. XTE buffer

3. Reagen Phytopure I 4. Chloroform

5. Reagen Phytopure II 6. Resin Phytopure

7. Es batu 8. Isopropanol

9. Ethanol 70%

6

Page 7: Gensel Induksi Poliploid Cholis

b. PCR

1. Premix PCR : 2. DNA template

Aquabides

Master mix

Primer RAPD

c. Electrophoresis

1. TBE buffer 2. Cyber safe

3. Aquades 4. DNA

5. Agarose 6. Loading dye

7. Aluminium foil

C. CARA KERJA

a. Isolasi DNA tanaman menggunakan KIT

1. Menimbang tanaman yang akan di ambil DNA nya (anggrek Spatoglotis

plicata, melon var tacapa, dan bamboo) sebanyak 0,5 gr.

2. Menggerus tanaman yang akan digunakan menggunakan mortar dan

grinder sampai halus.

3. Memasukkan hasil gerusan tanaman pada tube ukuran 15 ml.

4. Menambahkan 500µl Reagen Phytopure I pada hasil gerusan dan

menginversinya.

5. Menambahkan 100µl Reagen Phytopure II pada hasil gerusan dan

menginversinya.

6. Menginkubasi campuran reagen dan hasil gerusan pada suhu 65◦C selama

10 menit.

7. Memindahkan campuran kedalam kotak es dan di tunggu selama 20

menit.

7

Page 8: Gensel Induksi Poliploid Cholis

8. Menambahkan 500µl Chloroform dingin kedalam campuran.

9. Menambahkan 50µl Resin Phytopure pada campuran.

10. Mensentrifuge capuran dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit.

11. Mengambil dan memindahkan Supernatan kedalam tube baru ukuran

1,5ml.

12. Menambahkan isopropanol sebanyak ukuran yang sama dengan

supernatant.

13. Mensentrifuge campuran supernatant dengan kecepatan 10.000rpm selama

10 menit.

14. Mengambil pellet menggunakan micropipette lalu mencucinya dengan

100µl ETOH 70%.

15. Mensentrifuge campuran supernatant dengan kecepatan 10.000 rpm

selama 5 menit.

16. Membuang sisa ETOH dan mengambil pellet lalu di keringkan.

17. Menyimpan DNA didalam 1x TE buffer sebanyak 50µl.

b. PCR

1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

2. Menyiapkan kotak es dan DNA template yang telah diperoleh dari isolasi.

3. Membuat premix PCR sebanyak sample dengan komposisi premix pada

masing - masing sampel berupa Aquabides sebanyak 3,8 µl, Master mix

11µl, dan Primer RAPD 30µmol sebanyak 2,2µl.

4. Mencampurkan semua komposisi premix dalam satu tube.

5. Membagi premix PCR dalam beberapa bagian sesuai dengan jumlah

sampel DNA template.

6. Mencampurkan primer PCR dengan DNA template dalam tube kecil.

7. Menghomogenkan campuran primer PCR dengan men-spindown-nya.

8

Page 9: Gensel Induksi Poliploid Cholis

8. Memasukkan hasil campuran primer DNA dan DNA template ke dalam

mesin thermo cycle dengan program PCR sebagai berikut:

No Reaksi Suhu (◦C) Waktu (menit)

1 Predenaturasi 95 3

2 Denaturasi 95 1

3 Annealing 36 1

4 Elongation 72 2

5 Post elongation 72 10

6 Endless 4 -

9. Menyimpan hasil PCR dalam freezer (-20◦C).

c. Electrophoresis

Tahap electrophoresis secara umum dibagi menjadi 4 bagian besar yaitu

1. Pembuatan buffer TBE 1x sebanyak 500 ml.

a. Mengencerkan 50 ml Buffer TBE 10x menggunakan labu ukur.

b. Menambahkan 500ml aquades pada buffer TBE.

c. Menggojok larutan buffer TBE sampai homogen.

2. Pembuatan minigel agarose konsentrase 2%.

a. Menimbang Agarose sebanyak 0,4 gr.

b. Menambahkan 20ml TBE 1x kedalam agarose.

c. Menggojok dan memanaskan campuran TBE dan agarose sampai

tercampur menggunakan microwave.

d. Mendinginkan capuran sampai suhu 50◦C.

e. Menambahkan cyber safe sebanyak 1µl kedalam campuran agarose.

f. Mempersiapkan cetakan gel (termasuk memasang sisirnya).

g. Memasukkan campuran agarose kedalam cetakan gel.

h. Menunggu hingga agarose mengeras lalu mengangkat sisir dari gel.

9

Page 10: Gensel Induksi Poliploid Cholis

3. Preparasi sampel dan loading.

a. Mencampurkan TBE 1x dalam DNA hasil PCR.

b. Mempersiapkan gel yang telah dibuat dan dimasukkan ke alat MUPID

ELECTROPORATOR.

c. Mencampurkan campuran DNA sebanyak 4µl DNA dengan loading

dye 2µl.

d. Memasukkan campuran DNA kedalam sumuran gel.

e. Meruning DNA hasil PCR dalam alat MUPID ELECTROPORATOR

dengan voltase 100 volt selama 45 menit.

f. Menunggu fragmentasi DNA pada gel sampai lebih kurang 75% dari

panjang gel keseluruhan.

4. Visualisasi menggunakan UV transiluminator.

a. Meletakkan gel hasil elektrophoresis kedalam UV transiluminator.

b. Menyalakan alat UV illuminator.

c. Mengamati fragmentasi DNA hasil elektrophoresis.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. HASIL

1. Hasil isolasi DNA tanaman menggunakan kit.

10

Page 11: Gensel Induksi Poliploid Cholis

2. Hasil PCR dan Electrphoresis.

Keterangan Gambar :

No Sumuran Explant Fragmentasi DNA

1 PCR Melon H15 Tidak Ada

2 PCR KP Ada

3 PCR Darah 1 Ada

4 PCR Darah 2 Ada

5 PCR Ang 2 Tidak Ada

6 PCR A3 Ada

7 PCR B3 Ada

11

1 2 3 4 5 6

x x

7 8

x

9

x

Lad 1211 1314 15 16 17

x x x x

Page 12: Gensel Induksi Poliploid Cholis

8 PCR M3 Tidak Ada

9 PCR M2 Tidak Ada

10 Ladder Ada

11 Genom Darah 1 Tidak Ada

12 Genom KP Tidak Ada

13 Genom M3 Ada

14 Genom A3 Ada

15 Genom B3 Tidak Ada

16 Genom Darah 2 Tidak Ada

17 Genom Ang 2 Ada

3. Hasil Uji Kualitas DNA

No ID Absorbance Ratio Concentration Protein

1 A3 0,194 1,510 287,8 1,5

2 D1 0,149 1,283 103,6 0,9

3 D2 0,150 1,274 107,4 1,0

4 M3 1,635 1,809 344,1 6,6

5 2 Ang 0,013 1,379 213,8 1,6

6 2 Mel 1,815 1,735 3500,0 9,3

7 Kp 0,168 1,405 137,5 0,9

8 D3 0,179 1,421 170,8 1,1

12

Page 13: Gensel Induksi Poliploid Cholis

A3 D1 D2 M3 2 Ang

2 Mel

Kp D3 0

2

4

6

8

10

Protein

A3 D1 D2 M3 2 Ang

2 Mel

Kp D3 0

500100015002000250030003500

Concentration

A3 D1 D2 M3 2 Ang

2 Mel

Kp D3 0

0.5

1

1.5

2

Absorbance

A3 D1 D2 M3 2 Ang

2 Mel

Kp D3 0

500

1,000

1,500

2,000

Ratio

B. PEMBAHASAN

1. Proses isolasi DNA, PCR ,dan Elektrophorasis

Isolasi DNA menggunakan kit

Berdasarkan dari catatan praktikum terkait dengan langkah kerja

isolasi DNA, setiap langkah memiliki tujuan dan fungsi masing-masing untuk

keberhasilan isolasi DNA. Dimulai dengan proses penggerusan sampel

menggunakan grinder dan mortar. Tujuan dilakukannya penggerusan adalah

untuk menghancurkan struktur organ dari sampel tanaman. Pada tanaman

terdapat dinding sel yang memperkokoh sturktur tubuh tanaman. Praktikum

yang dilakukan tidak melakukan perlakuan penempatan sampel pada suhu

dingin karena sampel yang digunakan dalam keadaan segar, sehingga tidak

memputuhkan penyimpanan di suhu dingin (-20◦C).

Setelah proses penghalusan sampel dilakukan tahap selanjutnya adalah

penambahan reagen phytopure I. Tujuan dari pemberian reagen phytopure I

13

Page 14: Gensel Induksi Poliploid Cholis

adalah melisiskan dinding sel dari tanaman sampel, sehingga mempermudah

proses isolasi DNA. Reagen phytopure I dapat digunakan sebagai pelisis

dinding sel karena mengandung beberapa bahan diantaranya buffer, deterjen,

dan beberapa enzim degradatif lain seperti selulose.

Pada reagen I terdapat buffer, hal tersebut mutlak diperlukan untuk

menjaga kondisi PH lingkungan sehingga DNA yang akan di isolasi tidak

rusak. Selain buffer, terdapat juga detergen. Detergen berfungsi sebagai

senyawa pelisis lemak. Dengan adanya reagen maka lapisan lemak yang

berada pada membrane sel akan rusak sehingga sel akan terbuka. Selain

sebagai pembuka membrane sel, detergen juga berfungsi sebagai bahan kimia

penghampabt DNAse. Ketika DNAse dihambat, maka kemungkinan DNA

rusak menjadi semakin kecil serta protein yang ada di dalam sel tersebut dapat

di denaturasi. Tumbuhan memiliki selulosa yang berfungsi untuk

pembentukan dinding sel dan lain lain, sehingga dalm reagen I terdapat enzim

selulase untuk membersihkan selulosa dari sampel.

Langkah selanjutnya adalah penambahan reagen phytopure II. Tujuan

dari pemberian reagen II adalah untuk membuka lapisan membrane inti sel.

Komposisi dari reagen phytopure II adalah buffer dan enzim endonuklease.

Keberadaan enzim tersebut berfungsi sebagai pembuka membrane inti sel,

sehingga DNA di dalam intisel dapat dikeluarkan dari dalam inti sel. Setelah

DNA tersebut keluar DNA tidak akan cepat rusak karena adanya buffer dalam

reagen II. Buffer pada reagen I dan II memiliki fungsi yang sama yaitu

mempertahankan PH lingkungan sehingga DNA tidak terdegradasi ataupun

rusak oleh lingkungan. Selain untuk mempertahankan PH lingkungan

keberadaan buffer juga perperan dalam penstabilan tekanan osmotic pada

campuran tersebut.

Setelah pemberian reagen II dilakukan proses selanjutnya adalah

optimalisasi penguraian DNA yaitu dengan cara mengocok tube secara

14

Page 15: Gensel Induksi Poliploid Cholis

perlahan. Setelah di kocok maka proses selanjutnya adalah inkubasi campuran

pada suhu 65◦C selama 10 menit. Hal tersebut bertujuan untuk optimalisasi

kerja enzim pendegradatif serta melepaskan DNA ke dalam campuran dengan

lebih efektif.

Proses selanjutnya adalah inkubasi campuran didalam kotak es selama

20 menit. Proses ini bertujuan untuk optimalisasi pengeluaran DNA dari

dalam inti sel, mitokondria, dan kloroplas. Selain itu, efek kejutan suhu

tersebut juga dapat menghentikan laju kerja enzim dengan cepat.

Langkah isolasi DNA setelah inkubasi di suhu dingin adalah

pencampuran kloroform dan resin. Fungsi dari penambahan kloroform pada

campuran tersebut adalah sebagai senyawa penghilang debris. Koroform

memiliki kemampuan untuk mendenaturasi protein dan polisakarida. Proses

deproteinasi disebabkan karena kemampuan kloroform untuk mendenaturasi

rantai polipeptida masuk ke dalam fase antara air dan kloroform. Protein akan

mengendap karena jumlah protein yang besar diantara fase air dan kloroform.

Pemberian resin phytopure pada campuran DNA akan membersihkan

isolate DNA dari polisakarida karena resing memiliki sifat mengikat

polisakarida. Polisakarida harus di ikat atau dipisahkan dengan DNA karena

polisakarida akan mengotori hasil isolate DNA. Oleh karena itu dapat

dikatakan juga bahwa isolate DNA yang baik adalah isolate yang terbebas

dari polisakarida sebagai debris. Selain mengikat polisakarida, resin juga

berperan sebagai senyawa pembentuk lapisan semi padat pemisah antara

debris dan bagian yang mengandung DNA.

Sentrifuse dilakukan setelah pencampuran koloform dan resing pada

campuran DNA. Sentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit.

Sentrifuge bertujuan untuk memisahkan antra bagian yang berisi DNA dengan

bagian yang berisi reagen dan debris yang berupa polisakarida dan protein.

15

Page 16: Gensel Induksi Poliploid Cholis

Setelah tahap pemisahan larutan yang berisi DNA dengan lapisan

debris langkah selanjutnya adalah isolasi larutan yang berisi DNA. DNA di

pindahkan dengan micro pipet lalu ditempatkan pada tube yang baru. Didalam

tube yang baru larutan DNA di tambahkan dengan iso propanol. Isopropanol

berfungsi untuk memfiksasi DNA. Fiksasi DNA yaitu proses dehidrasi

sehingga akan terjadi gumpalan DNA di dasar tube setelah sentrifuse. Setelah

larutan DNA di tambah isopropanol maka larutan di sentrifuse dengan

kecepatan tinggi yaitu 10000 rpm selama 10 menit. Hal ini bertujuan untuk

mengendapkan pellet DNA membantu kerja isopropanol sebagai senyawa

fiksatif.

Hasil dari penambahan isopropanol serta sentrifuse larutan adalah

pellet DNA di dasar tube. Dengan menggunakan micropipette, pellet DNA di

ambil dan di cuci menggunakan ETOH 70%. Pencucian ini bertujuan untuk

membersihkan DNA. Langkah selanjutnya setelah pencucian dengan ETOH

70% adalah resuspensi DNA kedalam TEB. Resuspensi harus dilakukan untuk

menghiangkan efek ETOH pada DNA. Karena DNA dapat rusak jika terlalu

lama terkena ETOH. Dengan penyimpanan DNA di dalam TBE akan

melindungi sementara DNA dari kerusakan.

Polymeration Chain Reaction

Setelah diperoleh pure DNA maka langkah selanjutnya adalah

penggandakan untai DNA menggunakan metode PCR. Metode PCR dinilai

sangat efektif untuk mendapatkan banyak untai DNA dalam waktu yang

singkat secara invitro. Dalam praktikum ini proses yang dilakukan setelah

mendapatkan DNA murni dari sampel adalah menggandakan untai DNA

tersebut.

Proses penggandaan untai DNA dimulai dengan persiapan premix

yang akan digunakan dalam proses PCR. Premix yang digunakan untuk PCR

mempunyai komposisi aquabides, master mix, primer. Premix dibuat dengan

16

Page 17: Gensel Induksi Poliploid Cholis

mencampurkan beberapa komposisi tersebut menjadi satu tube. Aquabides

digunakan dalam proses ini sebagai pelarut untuk master mix dan primer.

Master mix yang digunakan dalam praktikum ini adalah mastermix faststart

PCR master dari Roche. Master mix tersebut mengandung FastStart Taq DNA

Polymerase, magnesium chloride, double concentrate reaction buffer dan

nucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 0.4 mM)(Panduan pemakaian produk,

2011). Dengan adanya Taq DNA Polymerase maka mastermix tersebut dapat

digunakan untuk meningkatkan kespesifikan dan sensitivitas dari PCR. Taq

polymerase tersebut meminimalisir terjadinya produk amplifikasi yang kurang

spesifik. Taq DNA polymerase merupakan enzim yang akan membantu dalam

proses penggandaan sequence DNA. Dikatakan Master mix karena

didalamnya mengandung banyak sekali campuran seperti enxim dan

nukleotida. Muladno (2010) mengatakan bahwa didalam tehnik PCR

dibutuhkan dNTPs untuk membentuk rangkaian molekul DNA baru. Didalam

mastermix tersebut terdapat pula dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP. Buffer yang

terdapat di dalam master mix tersebut berfungsi untuk menjaga kondisi

lingkungan agar PH dan tekanan osmotic lingkungan tetap terjaga sehingga

DNA tidak rusak selama proses amplifikasi.

Didalam mastermix tersebut juga mengandung MgCl. MgCl adalah

salah satu koenzim. Ketika proses polimerisasi DNA maka terlebih dahulu

primer akan menempek pada bagain tertentu di untaian DNA, dengan adanya

MgCl di lingkungan mengakibatkan enzim polymerase akan memperpanjang

untai DNA yang telah ditempeli oleh primer. DNA polymerase akan

membentuk pasangan pelengkap dari untai DNA di belakang primer yang

berlawanan dengan untai DNA awal.

Premix tersebut juga mengandung primer. Primer didalam prose PCR

berfungsi untuk mengawali pembentukan untai DNA yang di inginkan. Primer

berfungsi sebagai penanda wilayah DNA yang akan diperpanjang oleh enzim.

17

Page 18: Gensel Induksi Poliploid Cholis

Perlu diketahui bahwa primer ini adalah untaian pendek basa nitrogen atau

yang biasa kita sebut dengan oligonukleotida.

Pada praktikum, premix dibuat dengan skala besar sesuai jumlah

sampel yang akan di PCR. Hal tersebut bertujuan untuk menghomogenkan

campuran premix untuk sampel satu dengan sampel yang lain. Sehingga

ketidak valid-an amplifikasi karena tidak homogen bisa diminimalisir.

Setelah proses pembuatan premix selesai maka langkah selanjutnya

adalah membagi premix tersebut pada tube - tube menjadi beberapa bagian

sesuai dengan jumlah sampel yang akan diPCR. Langkah selanjutnya adalah

mencampurkan DNA template (sampel) dengan premix yang telah jadi

tersebut. Men-spindown campuran premix dan DNA template bertujuan untuk

mencampur dua larutan tersebut menjadi larutan yang homogen.

Setelah campuran tersebut siap maka langkah selanjutnya adalah

memasukkan campuran premix dan DNA template kedalam mesin thermo

cycle. Sebelum proses amplifikasi dilakukan mesin di seting terlebih dahulu

seperti berikut:

Reaksi Suhu (◦C) Waktu (menit)

Predenaturasi 95 3

Denaturasi 95 1

Annealing 36 1

Elongation 72 2

Post elongation 72 10

Endless 4 -

Proses amplifikasi DNA yang sesungguhnya terjadi didalam mesin

thermocycle tersebut. Tahap – tahap dari reaksi tersebut sangatlah

menentukan keberhasilan dari PCR. Diawali dengan reaksi predenaturasi.

Predenaturasi adalah reaksi yang berfungsi untuk mempersiapkan untai DNA

18

Page 19: Gensel Induksi Poliploid Cholis

agar terbuka. Adanya suhu tinggi dengan waktu yang lumayan lama

menghasilkan pembukaan untai DNA menjadi semakin banyak. Ketika reaksi

denaturasi maka untai DNA diasumsikan telah membuka lebar sehingga

terdapat bagian yang terbuka dari untai DNA tersebut yang memungkinkan

untuk di tempeli primer. Pembukaan untai DNA tersebut akibat dari efek

pemberian suhu tinggi. Pembukaan terjadi karena putusnya ikatan hydrogen

antar dua untai rantai DNA. Semakin banyak nukleotida berjenis C dan G

maka akan semakin membutuhkan waktu yang lama dan suhu yang tinggi

untuk memutus ikatan hydrogen diantara kedua rantai DNA.

Setelah diberi perlakuan dengan suhu tinggi (denaturasi) reaksi

selanjutnya adalah perlakuan suhu jauh dibawah suhu denaturasi dalam

praktikum ini bersuhu 36◦C. Pada suhu normal tersebut maka untai DNA akan

berusaha menutup kembali. Kedua rantai DNA yang terpisah akan kembali,

saat ini lah primer akan menempel pada untai DNA. Reaksi ini biasa disebut

dengan reaksi annealing atau penempelan primer pada rantai DNA. Dengan

bantuan induksi dari MgCl mengaktifkan enzim polymerase maka untai DNA

yang telah ditempeli primer akan dibentuk rantai DNA komplementernya di

belakang primer. Tahap pemanjangan untai DNA dibelakang primer biasa

disebut dengan reaksi elongasi. Reaksi ini terjadi ketika suhu dinaikkan

menjadi 72◦. Reaksi post elongasi adalah reaksi yang digunakan untuk

memperpanjang untai DNA. Dengan adanya reaksi post elongasi diharapkan

pembentukan rantai DNA pada PCR menjadi semakin maksimal. Tahap

endless adalah tahap pengakhiran dari keseluaruhan reaksi. Pada tahap endless

ini suhu thermocycle akan otomtis menjadi 4◦C. Suhu rendah berfungsi untuk

mempertahankan keadaan DNA, sehingga untai DNA tidak rusak karena

pengaruh suhu tinggi.

Untuk satu siklus, satu buah primer dapat menghasilkan satu untai

DNA. Ketika didalam lingkungan tersebut terdapat beberapa primer maka

19

Page 20: Gensel Induksi Poliploid Cholis

akan menghasilkan beberapa untai DNA. Dengan pemberian perlakuan

beberapa siklus diharapkan akan menghasilkan banyak duplikasi DNA hasil

PCR.

Electrophoresis

Ketika telah didapati untai DNA sampel yang banyak hasil PCR maka

langkah selanjutnya adalah analisis fragmentasi untai DNA menggunakan

tehnik elektrophoresis.

Tahap proses elektrophoresis pada praktikum ini dapat dibagi menjadi

empat kegiatan. Yaitu pembuatan buffer TBE 1x, pembuatan mini gel

agarose, preparasi sampel dan loading, serta visualisasi menggunakan UV

transiluminator. Langkah pertama electrophoresis pada praktikum ini adalah

pembuatan buffer TBE 1x sebanyak 500 ml. prinsip dasar dari pembuatan

larutan buffer tersebut adalah dengan pengenceran TBE 10x menjadi 1x

dengan menambahkan aquades pada buffer TBE lalu menghomogenkannya.

Fungsi dari buffer tersebut sebagai larutan menyangga sehingga kondisi PH

dan tekanan osmotic lingkungan tidak merusak DNA hasil PCR.

Langkah selanjutnya adalah pembuatan agarose konsentrasi 2%. Gel

agarose digunakan sebagai medium perambatan fragmentasi DNA pada alat

Mupid elektrophorator. Pembuatan gel agarose pada prinsipnya adalah

melarutkan agarose pada TBE buffer lalu menghomogenkannya. Adapun

pemanasan menggunakan microwave pada percobaan ini bertujuan untuk

menghomogenkan agarose sehingga saat gel jadi kepadatan setiap sisi pada

gel akan merata. Ketika agarose telah tercampur homogeny maka agarose di

dinginkan sampai suhu 50◦C. setelah suhu cukup dingin gel agarose ditambah

dengan pewarna DNA bermerk cyber safe DNA staining dari invitrogen.

Fungsi dari penambahan pewarna pada gel agarose adalah untuk memberikan

efek warna pada fragmentasi DNA ketika dilakukan frgmentasi menggunakan

alat mupid electrophorator.

20

Page 21: Gensel Induksi Poliploid Cholis

Tahap selanjutnya adalah preparasi sampel dan loading. Pada tahap ini

sampel DNA hasil PCR dicampurkan dengan TBE buffer dan loading dye.

Loading dye ditambahkan kedalam DNA sampel karena berfungsi untuk

meningkatkan densitas sampel sehingga fragmen DNA berada didasar

sumuran. Loading day juga dapat membantu pergerakan sampel ke anoda.

Selain itu loading dye juga berfungsi untuk penanda adanya pergerakan

fragmentasi DNA. Setelah gel agarose jadi gel di angkat dan diletakkan pada

alat mupid elektroporator. Campuran DNA sampel tadi di masukkan kedalam

sumuran pada gel agarose dan langkah selanjutnya adalah menghidupkan alat

mupid elektroporator. Pergerakan fragmentasi DNA akan bergerak dari arah

positif ke negative karena DNA bermuatan negative.

Waktu yang dibutuhkan untuk perambatan fragmen DNA tersebut

sekitar 45 menit atau pergerakan dari fragmen DNA sudah mencapai jarak

tempuh 75% dari panjang agar. Ketika fragmen DNA telah selesai di uraikan

maka tahap selanjutnya adalah visualisasi fragmen DNA menggunakan alat

UV illuminator. Dengan menggunakan alat tersebut maka fragmentasi DNA

akan dapat dengan jelas terlihat. Dapat terlihatnya

2. Hasil praktikum

Hasil analisis DNA untuk nilai absorbansi, rasio, konsentrasi dan

protein adalah sebagai berkut:

Analisis data hasil spektrofotometer

No ID Absorbance Ratio Concentration Protein

1 A3 0,194 1,510 287,8 1,5

2 D1 0,149 1,283 103,6 0,9

3 D2 0,150 1,274 107,4 1,0

4 M3 1,635 1,809 344,1 6,6

21

Page 22: Gensel Induksi Poliploid Cholis

5 2 Ang 0,013 1,379 213,8 1,6

6 2 Mel 1,815 1,735 3500,0 9,3

7 Kp 0,168 1,405 137,5 0,9

8 D3 0,179 1,421 170,8 1,1

A3 D1 D2 M3 2 Ang

2 Mel

Kp D3 0

2

4

6

8

10

Protein

A3 D1 D2 M3 2 Ang

2 Mel

Kp D3 0

500100015002000250030003500

Concentration

A3 D1 D2 M3 2 Ang

2 Mel

Kp D3 0

0.5

1

1.5

2

Absorbance

A3 D1 D2 M3 2 Ang

2 Mel

Kp D3 0

500

1,000

1,500

2,000

Ratio

Perhitungan kuantitas DNA menggunakan spektrofotometer

merupakan metode paling sederhana untuk memperkirakan konsentrasi dari

DNA. Kemurnian dari banyaknya DNA dapat dilihat dengan membaca

absorbansi pada 260 nm. Rasio absorbansi 260 nm dan 280 nm memberikan

perkiraan kemurnian solusi. Jika rasio260/280 berada ~ 1.8 secara umum

telah dikatakan “murni” untuk DNA; sedangkan rasio ~ 2.0 secara umum

telah dikatakan “murni” untuk RNA. Analisis membandingkan rasio

pembacaan absorbansi pada A260 dan A280 (260 nm dan 280 nm) pertama

22

Page 23: Gensel Induksi Poliploid Cholis

kali dijelaskan oleh Warburg dan Kristen (1942) untuk menilai kemurnian

protein dengan adanya kontaminasi asam nukleat.

Metode ini biasanya digunakan untuk menentukan kemurnian dan

hasil asam nukleat. Asam nukleat menyerap sinar UV dengan nilai maksimal

untuk empat komponen nukleotida terutama pada 260 nm. Menggunakan

jalan cahaya 1 cm, koefisien untuk nukleotida pada panjang gelombang ini

adalah 20 . Berdasarkan koefisien ini, absorbansi pada 260 nm dalam kuvet 1

cm kuarsa solusi 50 ug / ml DNA beruntai ganda atau solusi 40 ug / ml RNA

beruntai tunggal adalah sama dengan 1.

Cara untuk menghitung konsentrasi DNA dalam sampel sebagai

berikut: konsentrasi DNA (pg / ml) = (OD 260) x (faktor pengenceran) x (50

mg DNA / ml) / (1 OD260 Unit) Protein, kontaminan sering kedua DNA dan

sampel RNA, menyerap sinar UV pada kedua 280 nm dan 228 nm. rantai

polipeptida biasanya berisi hingga tiga asam amino dengan gugus aromatik

yang menyerap secara signifikan pada 280 nm.

Beberapa protein, seperti histon atau protamines, mengandung sedikit

atau bahkan tidak ada residu aromatik sehingga akan sedikit sekali atau

bahkan tidak ada absorbansi pada 280 nm. Penyerapan pada ikatan peptida

terdapat pada 228 nm dan merupakan indikator yang lebih konstan terhadap

keberadaan protein dalam sampel. Dengan demikian, pembacaan absorbansi

diukur baik pada 228 nm dan pada 280 nm memberikan perkiraan yang lebih

akurat dari protein atau peptida yang mungkin ada dalam sampel asam

nukleat.

Karbohidrat, sulphydryls, fenolat dan senyawa aromatik lainnya juga

dapat menyerap pada panjang gelombang tersebut. Dengan membandingkan

rasio membaca A260 untuk kedua A280 dan A228 pengukuran, kehadiran

kontaminan dalam sampel asam nukleat dapat dievaluasi lebih baik

dibandingkan dengan hanya menentukan rasio A260/A280 saja. Rasio

23

Page 24: Gensel Induksi Poliploid Cholis

absorbansi pada 260 nm / absorbansi pada 280 nm merupakan ukuran

kemurnian sampel DNA; itu harus diantara 1,65 dan 1,85, sedangkan rasio 1,9

adalah DNA murni. Rasio 260/230 harus 2,0 karena asam nukleat memiliki

minima abosrobance pada 230 nm.

Untuk pembacaan hasil spektrofotometer dapat dilihat untuk masing

masing sampel bisa dilihat kemurniannya. Prinsip dari pembacaan DNA

adalah pembacaan kuantitas molekul DNA didalam medium. Absorbance

adalah angka yang didapat dari penyinaran dengan panjang gelombang 260

nm dan panjang gelombang 280 nm. Sedangkan angka rasio adalah angka

perbandingan antara jumlah molekul yang tersinari pada panjang gelombang

260 nm/280 nm. Kemurnian suatu DNA dapat ditentukan dengan melihat

angka rasio tersebut. Pada praktikum hasil kemurnian DNA terbaik terdapat

pada sample melon karena nilai rasio berada di seitaran 1,8. Kemurnian DNA

yang paling rendah adalah sample darah, hal ini dilihat dari hasil rasio yang

hanya mencapai 1,2.

Angka consentrasi adalah angka yang didapat dari penyinaran molekul

DNA. Angka pada konsentrasi menunjukkan jumlah DNA yang terdapat

didalam campuran tersebut. Konsentrasi DNA tertinggi terdapat pada sample

melon kelompok dua. Dengan melihat data tersebut maka dapat disimpulkan

bahwa sampel melon memiliki jumlah DNA tertinggi.

Angka protein adalah angka yang didapat dari penyinaran molekul

protein pada sampel. Berdasarkan dari hasil spektrofotometer, hasil protein

tertinggi terdapat pada sampel melon. Baik melon kelompok dua ataupun

kelompok tiga memiliki jumlah protein yang banyak. Untuk sampel melon

kelompok tiga di perkirakan kurang bagus karena lebih banyak jumlah protein

daripada jumlah molekul DNA itu sendiri. Pada sampel melon kelompok dua

jumlah antara molekul protein dan DNA sama – sama besar, sehingga kualitas

DNA masih bisa diperhitungkan.

24

Page 25: Gensel Induksi Poliploid Cholis

Analisis data hasil PRC dan Electrophoresis

Pada hasil PCR dan Elektrophoresis didapati ada dua data yang dapat

digunakan untuk dianalisis, yaitu data tentang fragmen DNA Genome dan

DNA hasil PCR. Berikut adalah data hasil elektrophoresis :

Keterangan Gambar :

No Sumuran Explant Fragmentasi DNA

1 PCR Melon H15 Tidak Ada

2 PCR KP Ada

3 PCR Darah 1 Ada

4 PCR Darah 2 Ada

5 PCR Ang 2 Tidak Ada

6 PCR A3 Ada

7 PCR B3 Ada

8 PCR M3 Tidak Ada

9 PCR M2 Tidak Ada

10 Ladder Ada

11 Genom Darah 1 Tidak Ada

12 Genom KP Tidak Ada

25

1 2 3 4 5 6

x x

7 8

x

9

x

Lad 1211 1314 15 16 17

x x x x

Page 26: Gensel Induksi Poliploid Cholis

13 Genom M3 Ada

14 Genom A3 Ada

15 Genom B3 Tidak Ada

16 Genom Darah 2 Tidak Ada

17 Genom Ang 2 Ada

Berdasarkan data diatas maka pembahasan pada kelompok tumbuhan

sebagai berikut :

1. Anggrek 2 PCR tidak terdapat pita DNA sedangkan pada DNA

genom terdapat pita DNA. Analisis untuk hasil tersebut adalah

adanya ketidak sesuaian hasil dengan teori yang seharusnya. Hal

tersebut dikarenakan tidak terlihatnya pita DNA hasil PCR.

Kemungkinan kesalahan terdapat pada proses PCR. DNA genome

terlihat pita hal tersebut menjelaskan bahwa proses isolasi DNA

yang dilakukan sudah sesuai dengan teori sehingga menghasilkan

pita DNA ketika di elektrophoresis. Tetapi kegagaln PCR

mengakibatkan ketidak munculan pita DNA saat elektrophoresis.

Kemungkina kegagalan terjadi saat penempelan primer, jika dilihat

dari data hasil spektro dan elektrophoresis, maka kesimpulan yang

dapat diambil adalah gagal karena DNA hasil isolasi terlalu

sedikit, selain itu adanya smir yang banyak pada hasil elfo

menunjukkan adanya kerusakan DNA saat proses PCR

berlangsung.

2. Anggrek 3, hasil yang didapa pada elektrophoresis menunjukkan

kecocokan antara teori dengan hasil dari praktikum. Hasil tersebut

memperlihatkan bahwa terdapat pite DNA pada DNA genome dan

DNA hasil PCR. Hasil praktikum sudah sesuai dengan teori.

3. Melon 2, pada hasil elfo, untuk melon 2 hanya terdapat hasil PCR

saja. Hasil PCR menunjukkan tidak adanya pita DNA hasil PCR

26

Page 27: Gensel Induksi Poliploid Cholis

pada elfo. Kemungkinan ketidakadaan pita DNA karena kegagalan

baik dalam proses PRC atau proses elektroforesis. Harena

seharusnya pada melon 2 terdapat banyak konsentrasi DNA dan

protein yang terdapat di larutan. Tetapi hasil elfo tidak

menunjukkan adanya pita ataupun semir. Kesimpulan yang dapat

diambil adalah tidak adanya molekul DNA ataupun protein

didalam sampel melon 2 yang di elektrophoresis.

4. Melon 3, pada hasil elfo menunjukkan bahwa hasil PRC tidak

ditemukan adanya pita DNA, sedangkan pada DNA genom

terdapat pita. Hal ini serupa dengan hasil anggrek kelompok dua

dimana proses isolasi DNA berhasil tetapi proses PCR terdapat

kegagalan sehingga tidak terbentuk fragmen DNA yang banyak

pada proses PCR. Hal tersebut di tegaskan pada hasil elektroforesis

yang tidak menunjukan adanya pita pada DNA hasil PCR.

27

Page 28: Gensel Induksi Poliploid Cholis

BAB V

KESIMPULAN

Kesimpulan yang dapat diambil dari proses isolasi DNA, analisis

spektrofotometer, PCR dan Elektrophoresis adalah:

1. Hasil dari proses isolasi DNA pada semua sampel berhasil. Hal ini terlihat

dari hasil elfo untuk semua sampel. Saat terdapat pita DNA pada PCR maka

sudah pasti ada DNA genom yang terisolasi. Jika tidak terlihat DNA genom

tetapi terlihat DNA PCR maka kemungkinan yang terjadi adalah DNA genom

hasil isolasi terlalu kecil sehingga tidak terlihat saat electrophoresis DNA

genom.

2. Hasil analisis kuantitatif menggunakan spektrofotometer menunjukkan bahwa

hanya dua sampel yang memiliki kuantitas DNA besar yaitu sampel melon,

tetapi hasil dari elektrophoresis menunjukkan walaupun kuantitas kecil tetapi

dengan adanya proses PCR, DNA yang kecil dapat diaamplifikasi dan dapat

di analisis menggunakan elektrophoresis.

3. Ketidak bisaan pembacaan pada elektrophoresis pada praktikum ini

mempunyai dua alasan :

a. Ketidak terbacaan DNA genom pada elektrophoresis disebabkan karena

DNA genom terlalu kecil. Sehingga tidak terbada pada alat

elektrophorator.

b. Ketidak terbacaan DNA hasil PCR pada elektrophoresis disebabkan

karena tidak berhasilan amplifikasi DNA saat proses PCR. Ketika hasil

elfo menunjukkan hasil smir banyak maka kemungkinan adalah DNA

hancur ketika PCR sehingga yang tersisa adalah molekul DNA kecil yang

mengakibatkan adanya smir. Tetapi ketika hasil elfo tidak menunjukkan

adanya pita ataupun smir menunjukkan bahwa tidak terdapat DNA

didalam sampel. Kegagalan penempelan primer dapat menjadi salah satu

sebab tidak terjadinya amplifikasi DNA pada PCR.

28

Page 29: Gensel Induksi Poliploid Cholis

DAFTAR PUSTAKA

Ardiana, Dwi Wahyuni. 2009. Teknik Isolasi Dna Genom Tanaman Pepaya Dan

Jeruk Dengan Menggunakan Modifikasi Bufer CTAB. 12 Buletin Teknik

Pertanian Vol. 14 No. 1, 2009: 12-16

Aristya, G.R. 2013. Deteksi Dan Skrining Pewarisan Sifat Ketahanan Penyakit

Powdery Mildew Pada Generasi Backcross Tanaman Melon (Cucumis melo l.)

Var Tacapa. Laboraturium Genetika Fakultas Biologi UGM. Yogyakarta.

Buku panduan penggunaan produk faststart PCR Master. Dari Roche versi 04. Juni

2011

GE Healthcare. 2007. Illustra Nucleon Phytopure Genomic DNA Extraction Kits:

Product Booklet. General Electric Company, Ltd. Buckinghamshire,pp:3,11-

23. Diakses dari https://www.gelifesciences.com. tgl 6 juni 2014

Holme, D.J. & Peck, H. 1998. Analytical Biochemistry. 3rd edition. Prentice Hall,

Addison Wesley Longman, Ltd. Singapore, pp: 449-452.

Langgga, et al. 2012. Optimalisasi Suhu Dan Lama Inkubasi Dalam Ekstraksi Dna Tanaman Bitti (Vitex Cofassus Reinw)Serta Analisis Keragaman Genetik Dengan Teknik RAPD-PCR. J. Sains & Teknologi, Desember 2012, Vol.12 No.3 : 265 – 276

Mikkelsen, S.R. & Corton, E. 2004. Bioanalytical Chemistry. John Wiley & Sons, Inc. New Jersey, pp: 167-170.

Muladno. 2010. Tehnologi rekayasa genetika edisi kedua. IPB press. Bogor

Sharma, A.D., Gill, P.K., Singh, P. 2002. DNA Isolation From Dry and Fresh

Sample of Polysaccharide-Rich Plant. Plant molecular biology. 20 : 415a-

415f.

Tao, Z., Cai, X.F., Yang, S., Gong, Y. 2001. Detection Of Exogenous Gene In

Genetically Modified Plants With Multiplex Polymerase Chain Reaction.

Plant molecular biology reporter. 19:289-298.

Tehnical bulletin. 2012. Interpretation of Nucleid acid 260/280 ratio. Thermo

scientific

29

Page 30: Gensel Induksi Poliploid Cholis

Wilson,keith & John Walker. 2010. Principles and Techniques of Biochemistry and molecular Biology. Cambridge University Press,New York.

30

Page 31: Gensel Induksi Poliploid Cholis

LAMPIRAN

Extraksi organ Hasil extraksi

Penambahan reagen I dan II Sampel + reagen I & II

Inkubasi sampel pada suhu tinggi

31

Page 32: Gensel Induksi Poliploid Cholis

Inkubasi sampel pada suhu rendah Penambahan resin

Penambahan kloroform Sampel + Resin + Kloroform

Sentrifuge sampel Sampel setelah di sentrifuge

32

Page 33: Gensel Induksi Poliploid Cholis

Layer DNA dan debris pada sampel DNA hasil isolasi

Pembuatan premix untuk PCR Pembuatan gel agarose

Penambahan SYBR DNA gel staining Penuangan gel pada cetakan

33

Page 34: Gensel Induksi Poliploid Cholis

Persiapan loading dye penyuntikan DNA pd sumuran

Mupid Electrophorator Proses fragmentasi DNA

Hasil Electrophoresis dilihat pada UV Iluminator

34