genetica e inmunologia aplicada al banco de sangre

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Medicina & Laboratorio, Volumen 15, Nmeros 1-2, 2009

Banco de sangre

Medicina & Laboratorio: Programa de Educacin Mdica Contnua CertificadaUniversidad de Antioquia, Edimeco

1 Mdico especialista en Medicina de Laboratorio. Coordinador Laboratorio Clnico, Instituto Neurolgico de Antioquia. Clnica Universitaria Bolivariana. Medelln, Colombia. E-mail: [email protected]

Fundamentos de gentica e inmunologa para bancos de sangre y

medicina transfusionalCarlos Alberto Arbelez Garca1

Resumen: Ms de 100 aos han transcurrido desde el descubrimiento de los grupos san-guneos A, B y O y hasta el presente se han reconocido 308 antgenos, de los cuales 270 estn agrupados en 30 sistemas sanguneos. Su importancia radica en la seguridad con la cual se transfunde la sangre de donantes a pacientes con pruebas tan sencillas en su elaboracin, como la clasificacin sangunea ABO y Rh, las pruebas cruzadas y el rastreo de anticuerpos irregulares, con el fin de evitar la aloinmunizacin de los receptores. A partir de estas tcnicas, inicialmente desarrolladas por el premio Nbel en Medicina, Karl Lansteiner, en 1930, podemos contar en el presente con las nuevas pruebas de biologa molecular que nos permiten el conocimiento del genotipo fetal en mujeres en embarazo que han desarrollado anticuerpos contra los grupos sanguneos, hacer anlisis de grupos sanguneos en pacientes multitransfundidos, detectar donantes con baja expresin del antgeno D, hacer diagnstico gentico preimplantacin y realizar pruebas que permiten la tipificacin de donantes para los polimorfismos ms importantes desde el punto de vista clnico, entre otros. Esta serie de mdulos se inicia en el presente nmero con las bases genticas e inmunolgicas de los grupos sanguneos y pretende llevar al lector de forma clara y concisa en un viaje placentero, desde el punto de vista del conocimiento, a disfrutar del estudio de los grupos sanguneos, sus antgenos y anticuerpos, y la importancia que stos tienen en la prctica clnica. En mdulos posteriores se revisarn la enfermedad hemoltica del feto y del recin nacido, las pruebas empleadas para el diagnstico de las anemias hemolticas autoimunes, el diagnstico e interpretacin de las pruebas ne-cesarias para el estudio de las reacciones transfusionales, la realizacin de las pruebas inmunohematolgicas en banco de sangre y su interpretacin adecuada a fin de aportar elementos suficientes para el manejo clnico y quirrgico de los pacientes. Finalmente, se revisar la serologa de los leucocitos y las plaquetas, y las pruebas de laboratorio emplea-das y su importancia clnica.

Palabras clave: grupos sanguneos, leucocitos, plaquetas, inmunologa, gentica, banco de sangre, medicina transfusional.

Garca-Arbelez CA. Fundamentos de banco de sangre y medicina transfusional. Medici-na & Laboratorio 2009; 15: 37-68.

Mdulo 22 (Banco de sangre), nmero 2. Editora Mdica Colombiana S.A., 2009

Recibido el 19 de enero, 2009; aceptado el 23 de enero, 2009.

Fundamentos de gentica e inmunologa para bancos de sangre y medicina transfusional

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El descubrimiento de los grupos sanguneos en el ao 1900 por Karl Landsteiner abri una nueva era para la transfusin sangunea, demostrando la presencia en el suero de las isoaglu-tininas A, B y C, esta ltima denominada posteriormente O [1, 2]. Al ao siguiente, Lands-teiner clasific la sangre humana en tres grupos sanguneos, de acuerdo a las reacciones serolgicas de los eritrocitos con estas isoaglutininas [3]. La publicacin inicial de Landsteiner fue en la forma de pie de pgina en un artculo sobre fermentacin bacteriana. Infortunadamente, varios aos tuvieron que pasar para que las pruebas fueran introducidas en la prctica diaria. Aparentemente ninguna de las personas del laboratorio de Landsteiner tena el grupo sanguneo AB, menos comn, pero en 1901 este grupo sanguneo fue descubierto por los investigadores austriacos von Decastello y Sturli [4]. Hektoen en Chicago fue el primero en proponer el uso de las pruebas de grupo sanguneo para la seleccin de donantes y receptores [5], pero fue Ottenberg el primero en hacer la tipificacin ABO en pacientes y donantes antes de las transfusiones y tambin fue el primero en realizar las pruebas de compatibilidad antes de las transfusiones [6].

En el ao 1927 Landsteiner y Levine reportaron los grupos sanguneos M, N y P [7]. Posterior-mente en 1939, Levine y Stetson publicaron en menos de dos pginas en la revista Journal of the American Medical Association su artculo clsico, un reporte de caso, describiendo la enfermedad hemoltica del recin nacido y el descubrimiento de un grupo sanguneo que posteriormente se llam sistema Rh [8].

Karl Landsteiner naci en Viena el 14 de junio de 1868. Estudi medicina en la Universidad de Viena, gradundose en 1891. Posteriormente realiz estudios de bioqumica y anatoma pato-lgica, obteniendo el ttulo de Profesor de Anatoma Patolgica en la Universidad de Viena.

A pesar de que Landsteiner hizo numerosas contribuciones en anatoma patolgica, histologa e inmunologa, su nombre siempre ser honrado por su descubrimiento de los grupos sangu-neos, motivo por el cual recibi el Premio Nbel en Medicina en 1930. Landsteiner continu investigando en grupos sanguneos, en la qumica de los antgenos, anticuerpos y otros eventos inmunolgicos que ocurren en la sangre.

En 1939 recibi el ttulo de Profesor Emrito del Instituto Rockefeller, trabajando con la misma energa que lo caracteriz. El 24 de junio de 1943, padeci un infarto de miocardio en su laboratorio y muri dos das despus en el hospital del instituto en el cual haba realizado su distinguido trabajo [9].

En 1908, Moreschi [10] describi la reaccin de antiglobulina, pero su aplicacin en la de-teccin de los grupos sanguneos no fue apreciada hasta 1945, cuando Coombs, Mourant y Race publicaron su trabajo en Lancet y en British Journal of Experimental Pathology en 1945 y 1946, sobre el uso de anticuerpos de conejo contra la IgG para detectar eritrocitos cubiertos con IgG [11]. En pocos aos la prueba de antiglobulina o prueba de Coombs se adopt virtualmente en todos los laboratorios de hematologa y en los servicios de transfusin de sangre de todo el mundo, permaneciendo como la prueba de oro hasta la fecha.

La prueba de antiglobulina mejor la seguridad de la transfusin sangunea y tambin llev al descubrimiento de muchos antgenos y grupos sanguneos. Adicionalmente, esta prueba es la base de la prueba inmunoabsorbente ligada a enzima o ELISA (en ingls, enzyme linked immuno-sorbent assay) y de muchas otras usadas en microbiologa y otras especialidades.

Robert Royston Amos (Robin) Coombs naci en 1921 en Londres, se educ en Sudfrica y Escocia, donde se gradu en Veterinaria. Posteriormente obtuvo su PhD en Cambridge, en donde trabaj toda su vida en el Departamento de Patologa. Recibi ttulos honorarios de las universi-dades de Guelph, Netherlands y Edimburgo, y fue nombrado Fellow de la Royal Society en 1965. Muri en Cambridge el 25 de enero de 2006 a la edad de 85 aos [12].

Arbelez-Garca CA.

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Gentica de los grupos sanguneos La herencia de caractersticas transmisibles o rasgo, incluyendo los antgenos de los grupos

sanguneos, forma la base de la gentica. El material gentico que determina cada rasgo se en-cuentra en el ncleo de la clula. Este material nuclear se llama cromatina, la cual est constituida principalmente por cido desoxirribonucleico (DNA). Cuando la clula se divide, la cromatina pierde su apariencia homognea y conforma unas organelas en forma de bastones denominadas cromosomas. Cada cromosoma est formado por cadenas de DNA. Dentro del DNA cromo-smico estn los genes, que poseen la informacin gentica, los cuales estn constituidos por secuencias especficas de nucletidos. Los genes estn ubicados en un orden especfico a lo largo del cromosoma, ubicados en una posicin fija conocida como locus, loci en plural [13], como se observa en la figura 1.

CromosomasEl nmero de cromosomas y la morfologa de los cromosomas son especficos para cada

especie. Las clulas somticas humanas tienen 46 cromosomas que existen como 23 pares (la mitad de cada par se hereda de cada padre). Veintids de los pares son semejantes en hombres y mujeres, denominados autosomas; los cromosomas sexuales, XX en las mujeres y XY en los hombres, son el par restante.

Cada cromosoma consiste en dos brazos unidos en una constriccin primaria, llamada cen-trmero. Los dos brazos poseen diversas longitudes: el brazo corto se llama p, y el brazo largo se llama q. Los brazos de cromosomas individuales son indicados por el nmero del cromoso-ma seguido por una p o una q (por ejemplo, Xp es el brazo corto del cromosoma X; 12q es el brazo largo del cromosoma 12). Cuando son coloreados, cada cromosoma exhibe un patrn nico de bandas, que se enumeran del centrmero hacia afuera. Los cromosomas son identifi-cados por la localizacin del centrmero y de sus patrones de bandas. La identificacin de genes individuales a lo largo del cromosoma se puede trazar fsicamente, de acuerdo a la ubicacin especfica de las bandas [14], como se observa en la figura 1.

Figura 1. Representacin esquemtica de la ubicacin (locus) de los genes en los cromosomas.

Ncleo

Cromatina

Centrmero

Cromosoma

Locus

Brazocorto p

Brazolargo q

Gen


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Gentica y herenciaLos genes de los grupos sanguneos estn localizados en los 22 pares de autosomas. Ningn

antgeno de grupo sanguneo se ha encontrado en el cromosoma Y, y en el cromosoma X slo los genes Xg y Xk.

AlelosCada gen tiene un locus especfico sobre un cromosoma, y genes alternos que ocupan un solo

locus se denominan alelos, los cuales son responsables de la especificidad de los antgenos. La terminologa de la Sociedad Internacional de Medicina Transfusional, ISBT (por sus siglas en in-gls, International Society of Blood Transfusion) distingue entre los alelos para los antgenos de los grupos sanguneos (polimorfismos genticos) y los antgenos que ellos codifican [22]. Por ejemplo, los antgenos principales del sistema del ABO son A, B y O, y los alelos son A1, B1 y O1. En el sistema Kell, dos alelos, K y k, determinan los antgenos K y k, respectivamente. Los individuos que tienen alelos idnticos en un locus especfico en ambos cromosomas se denominan homoci-gotos para el alelo (por ejemplo A1/A1 o K/K o k/k). En el estado heterocigoto, los alelos presentes en el locus en cada cromosoma no son idnticos (por ejemplo A1/O1 o A1/B1 o K/k). La tabla 1 presenta los genotipos y las localizaciones cromosmicas para los 30 sistemas de antgenos de los grupos sanguneos [15].

Cuando se heredan dos alelos silenciosos o amrficos, el resultado es un fenotipo nulo o menos-menos. Existen fenotipos nulos en la mayora de los sistemas de grupos sanguneos humanos. Los ejemplos ms comunes son las personas de grupos sanguneos O, Fy(a-b-), ms frecuente en poblacin negra, y Le(a-b-) [16].

Efecto de dosisLos individuos que son homocigotos para un alelo en algunos sistemas de grupo sanguneo

pueden tener mayor cantidad de antgeno expresado en sus eritrocitos que las personas que son heterocigotas para ese alelo. Por ejemplo, los eritrocitos de una persona con fenotipo Jk(a+b-) tienen una dosis doble del alelo Jka y, consecuentemente, expresan ms antgeno Jka en la superficie del eritrocito que un individuo cuyo fenotipo es Jk(a+b+) (una sola dosis del alelo de Jka). La diferencia en la cantidad de antgeno expresado en la membrana del eritrocito, entre un fenotipo homocigoto y heterocigoto se puede detectar por tcnicas serolgicas, como se muestra en el siguiente ejemplo:

Fenotipo Genotipo Reaccin con anti-E

E E/E Fuerte (4+)

Ee E/e Dbil (2+)

E e/e Negativa (O)

El efecto de dosis no se presenta en todos los antgenos de grupo sanguneo o aun en todos los anticuerpos de una especificidad dada. Los anticuerpos que demuestran tpicamente efecto de dosis, son los que pertenecen a los sistemas de grupos sanguneo Rh, MNS, Kidd y Duffy. Los alelos se originan por cambios genticos en el DNA y pueden dar lugar a diferentes expresiones de fenotipos [13].

Frecuencia de los alelosLa frecuencia de un alelo (o la frecuencia del gen) es la proporcin que contribuye al grupo

total de alelos en un locus, en una poblacin y en un momento dados. Esta frecuencia se puede

Arbelez-Garca CA.

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Tabla 1. Genotipos y localizaciones cromosmicas de los sistemas sanguneos

Nmero Sistema Smbolo No. de antgenos Gen Cromosoma

.001 ABO ABO 4 ABO 9

.002 MNS MNS 46 GYPA, GYPB, GYPE 4

.003 P P1 1 P1 22

.004 Rh RH 57 RHD, RHCE 1

.005 Lutheran LU 21 LU 19

.006 Kell KEL 34 KEL 7

.007 Lewis LE 6 FUT3 19

.008 Duffy FY 6 DARC 1

.009 Kidd JK 3 SLC14A1 18

.010 Diego DI 21 SLC4A1 17

.011 Yt YT 2 ACHE 7

.012 Xg XG 2 XG, MIC2 X/Y

.013 Scianna SC 7 ERMAP 1

.014 Dombrock DO 6 ART4 12

.015 Colton CO 3 AQP1 7

.016 Landsteiner-Wiener LW 3 ICAM4 19

.017 Chido/Rodgers CH/RG 9 C4A, C4B 6

.018 Hh H 1 FUT1 19

.019 Kx XK 1 XK X

.020 Gerbich GE 8 GYPC 2

.021 Cromer CROM 15 CD55 1

.022 Knops KN 9 CR1 1

.023 Indian IN 4 CD44 11

.024 Ok OK 1 BSG 19

.025 Raph RAPH 5 CD151 11

.026 John Milton Hagen JMH 1 SEMA7A 15

.027 I I 1 GCNT2 6

.028 Globoside GLOB 1 B3GALNT1 3

.029 Gill GIL 1 AQP3 9

.030 Glicoprotena asociada a Rh

RHAG 3 RHAG 6

calcular de las frecuencias del fenotipo observadas dentro de una poblacin. La suma de frecuen-cias de los alelos en un locus debe ser igual a 1.

La ley de Hardy-Weinberg se utiliza para calcular las frecuencias de alelos y genotipos en una poblacin, cuando la frecuencia de un rasgo gentico (por ejemplo fenotipo del antgeno) se conoce. Sin embargo, tiene en cuenta ciertas premisas: que no existan mutaciones ni migracio-nes (hacia adentro o hacia fuera) de la poblacin, que no haya presencia selectiva de ventajas o desventajas de un rasgo en particular y que se analice una poblacin suficientemente grande, de modo que un solo hecho no pueda alterar la frecuencia de un alelo. Si todas estas condiciones estn presentes, el grupo de genes est en equilibrio y las frecuencias del alelo no cambiarn de una generacin a la siguiente. Si estas premisas no se aplican, pueden ocurrir cambios en la fre-cuencia de los alelos en algunas generaciones, lo cual puede explicar muchas de las diferencias en frecuencias de los alelos entre poblaciones [13].


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SegregacinEl trmino segregacin se refiere al concepto que dos alelos de un gen nunca se encuentran

en el mismo gameto, pero siempre se segregan y pasan a diferentes gametos. En gentica de gru-pos sanguneos, esto puede ser ilustrado por la herencia de los alelos ABO. En el ejemplo de la figura 2, la generacin parental (P) son homocigotos para el alelo A y el alelo O. Todos los miem-bros de la primera generacin filial (F1) sern heterocigotos (A/O) pero expresarn el antgeno del grupo sanguneo A (O es un alelo silencioso). Si una persona F1 se aparea con una persona de genotipo A/O, la progenie resultante, llamada la segunda generacin filial F2, ser de grupo sanguneo A (heterocigoto u homocigoto) o grupo sanguneo O. Si una persona F1 se aparea con una persona heterocigoto del grupo B (B/O), la descendencia podra tener el grupo sanguneo A, B, AB u O, como se observa en la tabla de Punnett de la figura 2.

Figura 2. Segregacin. Ejemplo de segregacin de los grupos sanguneos donde se observa la presencia de un solo alelo por gameto.

MadreA (Fenotipo)

AA (Genotipo)

PadresP

AOX

BO

HijosF1

(Fenotipo)

(Genotipo)

Gametos A A

A

B

O

O

AO AOAO

AB BO

AO OO

AO

A AA A

HijosF2

(Fenotipo)

(Genotipo)(Homocigoto) (Homocigoto)

Tabla de Punnett

(Heterocigoto)

AA AOAO OO

A AA A

PadreO (Fenotipo)

OO (Genotipo)

O O

Arbelez-Garca CA.

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Herencia independienteLa ley de Mendel de herencia

independiente establece que los ge-nes que determinan varios rasgos son heredados independientemente uno del otro. Por ejemplo, si un padre es del grupo A (homocigoto para A) y K+k+, y el otro padre es del grupo B (homocigoto para B) y K-k+ (homoci-goto para k), todos los nios F1 sern el grupo AB; la mitad sern K+k+ y la otra mitad K-k+. Una segunda ge-neracin filial puede presentar cual-quiera de los siguientes fenotipos: grupo A, K+k+; grupo AB, K+k+; grupo B, K+k+; grupo A, Kk+; grupo AB, Kk+; grupo B, Kk+. Las proporciones sern 1:2:1:1:2:1, como se observa en la figura 3.

La herencia independiente se aplica si los genes estn en diferentes cromosomas o en porciones distantes del mismo cromosoma. Una excep-cin a esta regla es que los genes que

Figura 3. Herencia independiente de los grupos sanguneos ABO y Kell.

Madre

P

F1

A, K+ (Fenotipo)AA, Kk (Genotipo)

Genotiposposibles

F2Genotiposposibles

F2Genotiposposibles

B, K (Fenotipo)BB, kk (Genotipo)

Padre

AA, Kk AA, kk BB, KkBB, kk AB, Kk AB, kk

ABB AB

A A

ABB AB

AAA AB

A B

ABB BB

Kkk kk

K k

Kkk kk

Kkk kk

K k

Kkk kk

estn estrechamente ligados en el mismo cromosoma no se heredan independientemente, per-maneciendo juntos de una generacin a otra, esto se denomina ligamiento.

LigamientoEl ligamiento gentico se define como la tendencia de que alelos que estn muy cerca en el

mismo cromosoma, se transmitan juntos. Durante la mitosis, cada par de cromosomas homlo-gos experimenta una serie de recombinaciones. El resultado del intercambio recproco de seg-mentos entre las cromtides se denomina entrecruzamiento (ver figura 4). Los genes que estn muy cerca en un cromosoma tienden a ser transmitidos juntos durante estas recombinaciones y sus alelos, por lo tanto, no se segregan independientemente. Algunas veces el ligamiento es muy estrecho, as que la recombinacin raramente ocurre.

La fuerza de ligamiento se puede utilizar como unidad de medida para estimar la distancia entre diferentes loci. Este tipo de anlisis puede ayudar en identificar, trazar y diagnosticar los genes responsables de ciertas enfermedades heredables. La demostracin de ligamiento entre el gen que controla la secrecin de ABH (Se) y la expresin de los antgenos del grupo sanguneo Lu-theran (Lua, Lub) fue el primer ejemplo reconocido de ligamiento autosmico en humanos [17].

El anlisis de esta relacin tambin proporcion la primera evidencia en los seres humanos de la recombinacin debido a entrecruzamiento, y ayud a demostrar que ocurre ms frecuen-temente en hembras que en varones.

Desequilibrio de acoplamientoCuando dos loci estn muy cerca, los alelos en estos loci tienden a heredarse juntos y se dice

que constituyen un haplotipo. El ligamiento estrecho entre los loci que controlan la expresin de


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M, de N, de S y de s, es un ejemplo de desequilibrio de ligamiento. Las frecuencias aproximadas de cada uno de los cuatro alelos son:

Alelo Frecuencia (%) Alelo Frecuencia (%)

M 0,53 S 0,33

N 0,47 s 0,47

Si los alelos de los antgenos M, N, S, y s, se segregan independientemente, la frecuencia esperada de cada haplotipo, sera el producto de las frecuencias de los alelos individuales. Sin embargo, las frecuencias observadas no son las que se esperan:

Alelos Frecuencia esperada Frecuencia observada

MS 0,53 x 0,33 = 0,17 0,24

Ms 0,53 x 0,67 = 0,36 0,28

NS 0,47 x 0,33 = 0,16 0,08

Ns 0,47 x 0,67 = 0,31 0,40

Total 1,00 1,00

Este es un ejemplo de desequilibrio del acoplamiento: la tendencia de combinaciones espe-cficas de alelos en dos o ms loci ligados, se heredan juntos ms frecuentemente de lo que se podra esperar por azar.

Patrones de herencia

Rasgo dominante y recesivo

Los rasgos son la expresin observada de los genes. Un rasgo que se observa cuando el alelo determinante est presente se llama dominante. Cuando diferentes alelos en cromosomas ho-mlogos producen un rasgo observable, se utiliza el trmino codominante. Los antgenos de los grupos sanguneos se expresan como rasgos codominantes. Por ejemplo, si una persona hereda el gen E de un padre y el gen e (antgenos E y e del sistema Rh) del otro padre, entonces ambos

Figura 4. Los loci que se encuentran muy cerca unos de otros, raramente se afectan por el entrecruzamiento, por lo tanto los alelos de estos loci se heredan juntos (N y S, M y s). Los loci que estn en el mismo cromosoma, pero no muy cerca (loci Ss y Zz), pueden presentar entrecruzamiento. El entrecruzamiento ocurre entre cromtides homlogas durante la meiosis, dando como resultado segregacin de los alelos en el mismo cromosoma.

N

S

N

S

N M M

S s s

Z Z

N

S

N

S

M

s

M

s

Z z Z zz Z zZ z z

N

S s

MM

s

Arbelez-Garca CA.

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antgenos E y e se expresaran sobre la superficie de los eritrocitos, como se observa en la figura 5.

Un rasgo recesivo se observa nicamente cuando el alelo no se aparea con un alelo dominante, o sea cuando dos alelos recesivos estn presentes. Los rasgos obser-vables se llaman fenotipos. La ti-pificacin de los antgenos de los grupos sanguneos con antisueros identifica el fenotipo. En algunos casos, los genotipos se pueden de-ducir del fenotipo, especialmente cuando se realizan estudios familia-res, pero los genotipos usualmente no se determinan tipificando los eritrocitos.

Asignacin cromosmica

La expresin antignica se puede alterar por la interaccin de los genes. Genes reguladores o modificadores, no necesariamen-te localizados en el mismo locus, pueden modificar un grupo sangu-neo. Adems, los genes supresores

Figura 5. Ejemplo de combinaciones de los genes E y e, sobre el cromo-soma 1, brazo corto q.

Locus paraE o e

E E E e e e

Cromosomas homocigotospara el gen E

Eritrocitosexpresan

antgeno E

Eritrocitosexpresan

antgenos E y e

Eritrocitosexpresan

antgeno e

Cromosomas heterocigotos para

los genes E y e, codominantes

Cromosomas homocigotospara el gen e

Figura 6. Localizacin de los alelos en cis (en el mismo cromosoma) y en trans (en el cromosoma par).

C

D

c

d

cis cis

trans

o modificadores pueden afectar la expresin de otros genes a travs de mecanismos poco conocidos. La interaccin de tres loci separa-dos (H, Le y Se), determina el fenotipo Lewis. In(lu) es un gen modificador que inhibe la ex-presin del antgeno Lutheran junto con P1, i, Aua y otros [18, 19]. Algunas observaciones en serologa de los grupos sanguneos han sido explicadas por la interaccin gentica: de-bilitamiento de la expresin del antgeno de D cuando el alelo C est presente en cis (en el mismo cromosoma) o en trans (en el cro-mosoma par), como se observa en la figura 6 [20].

Gentica poblacional

En situaciones clnicas para predecir la pro-babilidad de encontrar sangre compatible con un suero que contiene mltiples anticuerpos, es importante el conocimiento de la gentica poblacional. Para los clculos se utilizan las pu-blicaciones de las frecuencias de los fenotipos.


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Frecuencia de los fenotipos

Las frecuencias de los fenotipos de los grupos sanguneos se obtienen analizando muchas per-sonas seleccionadas de forma aleatoria, de la misma raza o grupo tnico y observando la propor-cin de reacciones positivas y negativas con un anticuerpo especfico para un grupo sanguneo. En un sistema de grupo sanguneo, la suma de las frecuencias del fenotipo debe ser igual al 100%. Por ejemplo, en una poblacin caucsica, 77% de los individuos seleccionados aleatoriamente son Jk(a+). La frecuencia de los individuos de Jk(a-) debe ser el 23%. Si se necesita sangre para un paciente con anti-Jka, el 23% o aproximadamente una en cuatro unidades de sangre ABO-compatibles, deben ser compatibles.

Clculos para fenotipos combinados

Si un paciente tiene mltiples anticuerpos de grupos sanguneos, puede ser til estimar el nmero de unidades que deben ser analizadas para encontrar unidades de sangre negativa para todos los antgenos. Por ejemplo, si un paciente tiene anti-c, anti-K, y anti-Jka, cuntas unidades de sangre ABO-compatibles tendran que ser analizadas para encontrar 4 unidades con el feno-tipo apropiado?

Anticuerpo Frecuencia del fenotipo (%)

c- 20

K- 91

Jk(a-) 23

Para calcular la frecuencia del fenotipo combinado, las frecuencias individuales se multipli-can porque los fenotipos son independientes unos de los otros. Entonces, la proporcin de las personas que son c- es 20%. Del 20% de individuos c-, el 91% son K-; por lo tanto 18% (0,20 x 0,91 = 0,18) son c- y K-. De este 18% de individuos c-K-, el 23% deben ser Jk(a-); por lo tanto, solamente el 4% de individuos tendrn sangre c-K-Jk(a-) (0,2 x 0,91 x 0,23 = 0,04). Es as como de 100 unidades analizadas, 4 unidades son compatibles. Para la toma de decisiones se debe solicitar ayuda a los bancos de sangre, con el fin de encontrar sangre compatible en pacientes aloinmunizados [13].

Pruebas de paternidad

Los antgenos de los grupos sanguneos, muchos de los cuales se expresan como rasgos co-dominantes, con modelos simples de herencia mendeliana, son tiles en los anlisis de paterni-dad. Si uno asume que los resultados de las pruebas son exactos, la paternidad se puede excluir de dos maneras:

1. La exclusin directa de la paternidad se establece cuando un marcador gentico est presente en el nio pero est ausente en la madre y en el supuesto padre. Ejemplo:

Fenotipo de grupo sanguneo

Nio Madre Supuesto padre

B O O

El nio ha heredado un gen B, el cual no se puede heredar ni de la madre ni del padre su-puesto. De acuerdo con los fenotipos de la madre y del nio, el gen B se debe haber hereda-do del padre biolgico y se llama un gen obligatorio paterno.

Arbelez-Garca CA.

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2. La exclusin es indirecta cuando el nio carece de un marcador gentico que el padre alega-do (dado su fenotipo observado) debe transmitir a su descendencia. Ejemplo:

Fenotipo de grupo sanguneo

Nio Madre Supuesto padre

Jk(a+b-) Jk(a+b-) Jk(a-b+)

En este caso, el supuesto padre es probablemente homocigoto para Jkb y debe haber trans-mitido Jkb al nio. La exclusin directa es ms convincente que la exclusin indirecta cuando se trata de establecer paternidad. La exclusin indirecta puede resultar algunas veces por la presencia de un alelo silencioso. En el ejemplo anterior, el padre supuesto podra tener un alelo silencioso (Jk), el cual fue transmitido al nio.

El genotipo del nio podra ser JkaJk en vez de JkaJka, mucho ms comn. La interpretacin de datos fenotpicos debe considerar todos los factores biolgicos y analticos conocidos para influenciar resultados. Cuando el supuesto padre no puede ser excluido de la paternidad, es posible calcular la probabilidad de la paternidad. La probabilidad que el padre supuesto transmi-ta los genes obligatorios paternales se compara con la probabilidad que cualquier otro hombre aleatoriamente seleccionado de la misma poblacin racial/tnica pueda transmitir los genes.

El resultado se expresa como un cociente de probabilidad (ndice de paternidad) o como por-centaje (probabilidad posterior de paternidad dada una probabilidad anterior). Los mtodos para el anlisis de paternidad incluyen a menudo el estudio de muchos sistemas genticos diferentes a los grupos sanguneos (por ejemplo HLA y repeticiones cortas al azar (STR, en ingls short tandem repeat systems). Muchos laboratorios de pruebas de paternidad emplean el mtodo STR para el anlisis de DNA como una medida para evaluar los casos de disputa de paternidad. La Asociacin Americana de Bancos de sangre (AABB, en ingls American Association of Blood Banks) ha desa-rrollado estndares para los laboratorios que realizan estudios de paternidad [21].

Nomenclatura de los grupos sanguneosEl grupo de trabajo de la Sociedad Internacional de Transfusin de Sangre (ISBT, en ingls

International Society of Blood Transfusion) ha establecido un sistema estandarizado para clasificar los antgenos de los grupos sanguneos. Sin embargo, se deben conservar las terminologas an-teriores, para evitar confusin con las nuevas, por lo tanto ahora existen convenciones comunes para su uso correcto. La Sociedad Internacional de Transfusin de Sangre ha descrito 30 sistemas de grupos sanguneos [22].

La terminologa de la Sociedad Internacional de Transfusin de Sangre para los antgenos de los eritrocitos, fue ideada como una nomenclatura numrica para facilitar su automatizacin. Una designacin de seis dgitos indica la especificidad de cada grupo sanguneo. Los primeros tres nmeros identifican el sistema del grupo sanguneo y los ltimos tres nmeros identifican la especificidad individual. Esta terminologa numrica est diseada principalmente para las bases de datos de computadores.

Para la clasificacin de la Sociedad Internacional de Transfusin de Sangre, cada sistema de grupo sanguneo debe ser genticamente distinto. La asignacin de antgenos a un sistema espe-cfico de grupo sanguneo depende de las relaciones genticas, serolgicas, y bioqumicas. La clo-nacin de genes ha hecho posible la asignacin definitiva y ha permitido algunas designaciones no aprobadas previamente por los estudios tradicionales de familias (por ejemplo, la expansin del sistema de Diego para incluir un nmero de antgenos de baja incidencia). Sin embargo, an no se ha demostrado que algunos antgenos son parte de un sistema reconocido.


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Las colecciones (llamadas series 200) son al parecer sistemas de antgenos relacionados para los cuales an no existe informacin gentica definitiva. Otros antgenos aislados de alta inciden-cia (serie 901) o baja incidencia (serie 700) se listan juntos hasta que la informacin gentica est disponible. En estos ltimos aos, el nmero de antgenos de estas tres series ha declinado dra-mticamente debido a que la informacin gentica y bioqumica ha permitido su reasignacin.

Terminologa correcta

Las siguientes son las convenciones aceptadas para expresar los fenotipos y genotipos de los eritrocitos [23].

1. Los genes que codifican la expresin de los antgenos de los grupos sanguneos se escriben en itlica (o subrayado si la itlica no est disponible). Si el nombre del antgeno incluye un subndice (A1), el gen que lo codifica se expresa con un superndice (A

1).

2. Los nombres de los antgenos identificados por un superndice o un nmero (por ejemplo Fya, Fy:1) se escriben normal (romana). Las identificaciones numricas se escriben en la misma lnea que las letras. Las letras del superndice son minsculas. (Algunas excepciones ocurren, basados en el uso histrico: hrS, hrB).

3. Cuando se expresan los fenotipos del antgeno usando identificaciones con letras, los resulta-dos se escriben generalmente como + -, en la misma lnea que la(s) letra(s) del antgeno: K+ K-.

4. Para expresar los fenotipos de los antgenos identificados con una letra en superndice, la letra se pone entre parntesis en la misma lnea que el smbolo que define el antgeno: Fy (a+) y Fy (a-).

5. Para los antgenos identificados por nmeros, el smbolo que define el sistema se escribe con letra mayscula seguido por dos puntos, y seguido por el nmero que representa el antgeno analizado. El signo ms (+) no aparece cuando los resultados de la prueba son positivos (K:1), pero el signo menos (-) se pone antes si los resultados son negativos: K:1, K:-1. Si las pruebas para varios antgenos en un grupo sanguneo se han realizado, el fenotipo se identifica por la(s) letra(s) del locus o del sistema del grupo sanguneo seguido por dos puntos, y seguido por los nmeros del antgeno separados por comas: K:-1,2, -3,4. Solamente los antgenos anali-zados se enumeran; si un anticuerpo que define un antgeno especfico no fue analizado, el nmero del antgeno no se enumera: K:-1, -3,4.

Aunque la terminologa numrica se ha ideado para varios sistemas y antgenos, no se debe sustituir la terminologa convencional. El uso de los nombres convencionales de los antgenos tambin es aceptable. En algunos sistemas, principalmente el Rh, existen mltiples terminologas y no todos los antgenos dentro del sistema tienen nombres.

Inmunologa bsica de los grupos sanguneos

AntgenosUn antgeno se define como cualquier sustancia que, cuando ingresa en el organismo y se

reconoce como extraa, provoca una respuesta inmune. sta podra inducir la produccin de an-ticuerpos especficos que determinan una reaccin observable [24]. Los antgenos de los grupos sanguneos pueden ser protenas o glicoprotenas estructurales de membrana del eritrocito. Los anticuerpos reconocen principalmente su cadena polipeptdica o de carbohidratos y los glicol-

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pidos. La mayora de las protenas de superficie son glicosiladas con excepcin de las protenas Rh y Kx [25].

Los antgenos de los eritrocitos se pueden expresar exclusivamente en los eritrocitos (como en el caso de los antgenos Rh) o simultneamente en otras clulas sanguneas (como el antgeno P1) y en los tejidos (antgenos ABO) [26].

AnticuerposUn anticuerpo es el producto de la respuesta inmune que reacciona con el antgeno corres-

pondiente en forma observable. Los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) son protenas plasmti-cas que se ubican en la fraccin de las gammaglobulinas. Existen cinco clases de inmunoglobuli-nas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Los anticuerpos estn formados por cadenas de aminocidos unidos por puentes peptdicos. Los anticuerpos IgG poseen cuatro cadenas, dos pequeas o livianas y dos ms grandes o pesadas. Por su parte, la IgM se compone de 10 cadenas livianas y 10 pesadas. La figura 7 ilustra la diferencia entre las dos molculas [24].

Qu es un grupo sanguneo?Un grupo sanguneo se define como una caracterstica heredada sobre la superficie del eri-

trocito, la cual se puede detectar por medio de un anticuerpo especfico.

Definicin de sistema de grupo sanguneoUn sistema de grupo sanguneo est compuesto por antgenos heredados como grupo. Cada

sistema est constituido por antgenos producidos por alelos en un locus gentico nico o en loci tan estrechamente ligados, que no se presenta entrecruzamiento. Los antgenos de los eritrocitos, que representan un grupo sanguneo nico, estn controlados genticamente por genes allicos heredados independientemente los unos de los otros.

La identificacin de un sistema de grupo sanguneo sigue una secuencia natural. Un anticuer-po que detecta un nuevo antgeno es descubierto, usualmente en pacientes multitransfundidos o en mujeres multparas. Una vez que el correspondiente antgeno es identificado, el patrn de

Figura 7. Representacin esquemtica de las molculas de inmunoglobulinas G y M.

Sitio de unin para el antgeno

Cadena liviana

Cadena pesada

IgG IgM


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herencia es estudiado y se inicia una investigacin para la identificacin del antgeno. Posterior-mente se pueden establecer relaciones genticas ms complejas; por ejemplo, cuando alelos mltiples sobre un cromosoma nico son heredados como grupo, como en el caso del sistema de grupo sanguneo MNSs, o varios loci estn comprometidos, como en el caso del sistema de grupo sanguneo Lewis.

Luego se realizan estudios de poblacin para calcular las frecuencias del gen. Una vez que se confirma la relacin gentica, se puede hacer la asignacin de un sistema de grupo sanguneo. Si es posible, se determina la estructura bioqumica del antgeno y se describe su biosntesis. Por lo tanto, los grupos sanguneos primero se definen inmunolgicamente, luego gentica y bioqu-micamente.

Los grupos sanguneos se pueden clasificar de la siguiente forma: 1) por su importancia cl-nica (es decir que causan reaccin transfusional hemoltica o enfermedad hemoltica del recin nacido), 2) por la fuente de sensibilizacin (exposicin a antgenos similares en el ambiente o por estimulacin inmune de antgenos extraos introducidos por transfusin o embarazo), o 3) por relaciones bioqumicas.

Inmunohematologa

Los anticuerpos que definen los antgenos de los grupos sanguneos se dividen en tres grupos: aloanticuerpos, autoanticuerpos y anticuerpos heterlogos [27]. Los aloanticuerpos pueden ser naturales o inmunes, estimulados por transfusin o por embarazo. Los autoanticuerpos reac-cionan con antgenos de la misma persona que form el anticuerpo y generalmente se dirigen contra antgenos de alta frecuencia. Los anticuerpos heterlogos contra los eritrocitos humanos, se originan de otras especies.

Un antgeno induce la formacin de un anticuerpo especfico, el cual es capaz de combinarse con el antgeno. La porcin que se une fuertemente con el anticuerpo, es el determinante inmu-nodominante. Los determinantes antignicos pueden ser polipptidos y polisacridos lineares o tambin pueden ser protenas.

La especificidad depende de la estructura qumica del antgeno, la cual permite el contacto estereoqumico entre el antgeno y el anticuerpo. El determinante antignico es el rea accesible que se combina con el anticuerpo. El nmero y la localizacin de los determinantes antignicos varan ampliamente de sistema a sistema y se correlaciona con la fuerza con la cual diferentes antgenos reaccionan con sus anticuerpos. [28, 31].

Los anticuerpos inducidos por un antgeno especfico pueden presentar reacciones cruzadas con otros antgenos. Un antgeno generalmente tiene ms de un determinante antignico, que tambin se puede encontrar en antgenos no relacionados. La reactividad cruzada ocurre cuando los determinantes compartidos son similares.

La inmunogenicidad de un antgeno se debe a su capacidad para estimular la formacin de anticuerpos. No todos los antgenos son igualmente inmunognicos. La antigenicidad relativa se puede estimar calculando el nmero de personas negativas para un antgeno especfico, quienes desarrollarn el correspondiente anticuerpo, y se compara con la posibilidad de recibir sangre positiva para un antgeno. De los anticuerpos, los Rh son los ms comunes, seguidos por los que pertenecen a los sistemas de grupo sanguneo Kell, Kidd y Duffy [27].

La formacin de anti-D ocurre casi en 1% de las exposiciones antignicas potenciales, anti-K en aproximadamente 0,1%, y anti-c y anti-E en cerca de 0,04% [32].

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Importancia biolgica de los antgenos de los grupos sanguneos

La importancia biolgica de muchos antgenos de los grupos sanguneos se debe principal-mente a su estructura. Las siguientes funciones se han atribuido a los antgenos de los grupos sanguneos [25]:

Transportadores de molculas biolgicamente importantes a travs de la membrana del eri-trocito

Receptores de estmulos externos y clulas de adhesin

Reguladores del complemento para prevenir la destruccin de los eritrocitos

Enzimas

Anclaje de la membrana del eritrocito al citoesqueleto

Proveedor de matriz extracelular de carbohidratos para proteger a la clula de daos mec-nicos y ataques por agentes infecciosos.

Importancia clnica de los anticuerpos de los grupos sanguneosLa importancia clnica se determina de acuerdo a si el anticuerpo es capaz de destruir los

eritrocitos in vivo, si el anticuerpo puede cruzar la placenta (y el antgeno est bien desarrollado en el feto), y por la frecuencia relativa del antgeno. Usando estos criterios, los anticuerpos ABO, los cuales causan destruccin intravascular inmediata, son los ms importantes en las transfusio-nes, seguidos por los anticuerpos Rh, los cuales ya se han formado por la estimulacin inmune y pueden causar enfermedad hemoltica del recin nacido severa o destruccin inmune de las clulas transfundidas. Otros factores importantes son la clase y subclase de inmunoglobulina y el rango trmico del anticuerpo. En general, los anticuerpos clnicamente importantes son IgG que reaccionan a 37C.

Los anticuerpos clnicamente significativos se presentan entre el 1% y 2% de todos los pa-cientes transfundidos [33]. Los pacientes con enfermedad de clulas falciformes tienen una inci-dencia aproximadamente del 25% [34, 36] y los receptores de transplante heptico desarrollan anticuerpos entre el 6% y el 12%. Las personas con enfermedades autoinmunes tambin presen-tan una frecuencia elevada de aloanticuerpos [37].

Otro factor importante es la diferencia en la distribucin de los antgenos sobre los eritro-citos, en la poblacin. Como se observa en la tabla 2 [38, 39], la distribucin de antgenos en algunos sistemas de grupo sanguneo, es diferente entre los grupos tnicos, por lo tanto el po-tencial de transfundir glbulos rojos que porten los antgenos a receptores que no los poseen, es mucho mayor.

Anticuerpos IgG

Los anticuerpos IgG constituyen alrededor del 73% de las inmunoglobulinas totales. Tienen un peso molecular de 150.000 daltons. Por su tamao, atraviesan con facilidad la placenta, cau-sando la enfermedad hemoltica del feto y del recin nacido, la cual se presenta cuando los anti-cuerpos maternos cruzan la placenta y destruyen los eritrocitos fetales que poseen los antgenos correspondientes. Los anticuerpos IgG no producen aglutinacin de los glbulos rojos antignicos suspendidos en solucin salina; slo los recubren y sensibilizan [24].


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Tabla 2. Distribucin de grupos sanguneos en poblacin de los Es-tados Unidos

Prevalencia en porcentaje

Sistema sanguneo

Antgeno Blancos Negros

Rh C 68 27

c 80 96

E 29 22

e 98 98

Kell K 9 2

k 99.8 100

Jsa 0 20

Jsb 100 99

Duffy Fya 65 10

Fyb 83 23

Kidd Jka 77 91

Jkb 72 43

MNS S 55 31

s 89 87

Tabla 3. Diferencias entre los anticuerpos IgG e IgM

IgG IgM

Porcentaje del total de inmunoglobulinas 73% 8%

Peso molecular 150.000 900.000

Aglutinacin eritrocitaria No S

Cruce placentario S No

Activacin del complemento S S

Temperatura ptima de reaccin 37oC 4oC

Tipo de anticuerpo Inmune Natural

Anticuerpos IgM

Los anticuerpos IgM constituyen alrededor del 8% de las inmunog-lobulinas totales. Son mucho ms grandes que los IgG y tienen un peso molecular de 900.000 daltons. No pueden atravesar la placenta, de manera que no provocan enferme-dad hemoltica del recin nacido. Aglutinan con facilidad los glbulos rojos suspendidos en solucin salina y su vida media es de apenas 10 das. Durante las reacciones antgeno-an-ticuerpo, a menudo activan el com-plemento, causando hemlisis de los eritrocitos, ms que aglutinacin. La tabla 3 muestra la diferencia entre los anticuerpos IgG e IgM [24].

Grupo sanguneo y enfermedad

La asociacin de grupos sangu-neos y enfermedad se puede dividir en dos categoras: 1) la asociacin del fenotipo de grupo sanguneo con la expresin de enfermedad y 2) el papel de los grupos sanguneos como receptores de patgenos [38]. En la primera categora, la identidad de un fenotipo anormal ha llevado al descubrimiento de una anorma-lidad en la membrana del eritrocito [39]. Usualmente el fenotipo de los

eritrocitos se representa como nulo; esto significa que los antgenos de un grupo sanguneo en particular estn ausentes en los eritrocitos. Un ejemplo es el fenotipo Rh nulo: en personas de este fenotipo, todos los antgenos del sistema de grupo sanguneo Rh estn ausentes en los eritrocitos. Los eritrocitos muestran una forma anormal y las personas presentan anemia leve compensada. Otro ejemplo es el fenotipo McLeod, el cual se manifiesta en los eritrocitos por la ausencia o debilitamiento de los antgenos del sistema de grupo sanguneo Kell. La forma de los eritrocitos es anormal (ovalocitos) y el defecto gentico se asocia con la aparicin tarda de sntomas neurolgicos. Estos ejemplos representan enfermedades asociadas debidas a defectos de membrana heredados.

Los antgenos de los grupos sanguneos son de hecho receptores para ciertos patgenos. La protena del grupo sanguneo Duffy ha mostrado ser el receptor exclusivo para Plasmodium vivax, uno de los parsitos causantes de la malaria. Como consecuencia, una seleccin gentica impor-tante ha ocurrido en reas endmicas del occidente de frica, en donde al 100% de la poblacin le falta la protena Duffy en los eritrocitos. Esta seleccin se refleja en la poblacin americana de origen africano, en quienes la prevalencia del fenotipo Duffy negativo es del 68% [40].

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Figura 8. Respuesta inmune a antgenos extraos. La respuesta inicial se caracteriza por la generacin de anticuerpos tipo IgM, los cuales desa-parecen gradualmente con el tiempo. Posteriormente aparecen los anti-cuerpos tipo IgG, que permanecen detectables de por vida.

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Valo

r re

lativ

o

Meses

6 9 12

IgM

IgG

Los antgenos de grupos sanguneos tambin poseen receptores para bacterias, como en el caso de E. coli que se une al antgeno DR, sobre el CD55. En el caso del parvovirus B19, ste se une por medio de un receptor de membrana al grupo sanguneo P [41, 42].

Respuesta inmune

Cuando el organismo se expone por primera vez a un antgeno extrao, desencadena una respuesta primaria. sta se desarrolla con lentitud y podran pasar varios meses hasta la aparicin de anticuerpos detectables. El segundo contacto con el mismo antgeno determina una respuesta secundaria. sta es mucho ms fuerte, y en general se sintetizan concentraciones ms altas de anticuerpos en poco tiempo. La respuesta primaria a menudo se asocia con niveles altos de IgM, mientras que en la secundaria predomina la IgG [24]. Ver figura 8.

Anticuerpos naturales e inmunes

Si analizamos el suero de una persona normal, encontramos anticuerpos de grupo sanguneo ABO, en tanto que el suero del cordn umbilical o del recin nacido revela concentraciones m-nimas o nulas de anticuerpos de ese tipo. No obstante, si examinamos el suero del lactante 12 a 20 semanas ms tarde, observamos ttulos moderados. Estos anticuerpos aparecen sin inmuniza-cin obvia del beb con antgenos de grupo sanguneo A o B. Por lo tanto, se consideran natura-les; es decir, que surgen en ausencia de un estmulo antignico conocido. Como ya se mencion, los anticuerpos se sintetizan como resultado del ingreso de un antgeno, de modo que el trmino natural podra causar confusin. Ahora se sabe que los virus, bacterias y muchos alimentos poseen antgenos AB muy similares a los de los grupos sanguneos humanos. Entonces, estos anticuerpos naturales se deben a antgenos que entran al organismo y promueven la respuesta adecuada, casi siempre de tipo IgM. Los anticuerpos inmunes de grupo sanguneo suelen ser IgG y se producen en presencia de anticuerpos eritrocitarios extraos. Este evento puede tener lugar como consecuencia de una transfusin de sangre o en caso de embarazo, por el paso de sangre fetal a la circulacin materna [24].

Reacciones antgeno-anticuerpo eritrocitarias

La mayora de las tcnicas empleadas en banco de sangre para detectar las reacciones entre antgenos y anticuerpos se basan en la aglutinacin y en ocasiones, en la lisis de los glbulos rojos (hemlisis).

Aglutinacin

La aglutinacin resulta de la fi-jacin de los anticuerpos a los ant-genos que estn en la membrana de los eritrocitos, formando una red que mantiene unidas las clulas. Este pro-ceso se divide en dos etapas:

Los anticuerpos se fijan a los an-tgenos eritrocitarios en cuanto se ponen en contacto con ellos. Este fenmeno no causa aglutinacin, slo recubrimiento y sensibiliza-cin de los glbulos rojos.


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Figura 9. Reaccin de los eritrocitos con los anticuerpos IgM que conlleva a la aglutinacin.

Figura 10. Eritrocitos sensibilizados por anticuerpos IgG.

Se forma una red que determina la aglutinacin. Esta etapa es una continuacin de la primera etapa, en la cual, si las condiciones son apropiadas, los anticuerpos provocan aglutinacin fsica de las clulas.

Los anticuerpos IgM son grandes y exhiben 10 puntos de combinacin antignica. Pueden sensibilizar y producir aglutinacin de los eritrocitos de manera directa, como se observa en la fi-gura 9. Los anticuerpos IgG son ms pequeos y no aglutinan los glbulos rojos en forma directa, slo recubren y sensibilizan, como se observa en la figura 10.

Para conocer si se produjo sensibilizacin eritrocitaria y reaccin antgeno-anticuerpo, se emplean los siguientes reactivos: albmina, reactivos antiglobulnicos y enzimas proteolticas, los cuales sern descritos ms adelante.

Hemlisis

Hemlisis es la ruptura de los eritrocitos con la correspondiente liberacin de la hemoglobina intracelular. La hemlisis in vitro mediada por anticuerpos depende del ataque del complemento a la membrana de la clula roja. La hemlisis no ocurre si el antgeno y el anticuerpo interactan en el suero, al cual le falta el complemento, o en el plasma, en el cual el anticoagulante ha que-lado los cationes de calcio y magnesio, necesarios para la activacin del complemento.

La hemlisis indica un resultado positivo en las pruebas en las cuales se buscan anticuerpos con-tra antgenos en los eritrocitos, ya que confirma que ha ocurrido la unin del anticuerpo al antgeno y la activacin de la cascada del complemento, lo cual se percibe visualmente como sobrenadante de color rojo o rosado en el suero. Algunos anticuerpos que son lticos (por ejemplo anti-Vel, anti-lea, Jka), pueden causar hemlisis intravascular en pacientes transfundidos con sangre.

Factores que afectan las reacciones antgeno-anticuerpo eritrocitarias

Fuerza inica

En condiciones fisiolgicas normales (in vivo) o en un tubo de ensayo (in vitro), los glbulos rojos nunca hacen contacto, debido a su carga elctrica negativa en la membrana que hace que se rechacen entre s. La distancia que separa los eritrocitos es mnima, pero suficiente para evitar que las molculas pequeas de IgG que se adhieran a las clulas causen aglutinacin, como se aprecia en la figura 9. Sin embargo, las molculas de IgM ms grandes, pueden unirlas, como se muestra en la figura 10. En consecuencia, los anticuerpos IgM pueden provocar aglutinacin

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Figura 11. Potencial Z. Las cargas inicas en la superficie de los eritrocitos los mantienen separados unos de otros. La molcula de IgG es muy pequea y no puede servir de puente entre los eritrocitos, como s lo hace la molcula de IgM.

+ +

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+ +

+ +

+

IgG

IgM

directa de los glbulos rojos, pero los anti-cuerpos IgG slo los recubren y sensibilizan.

La carga negativa de los eritrocitos deri-va de los grupos de cido neuramnico de la membrana. La fuerza que mantiene la sepa-racin entre las clulas se denomina poten-cial zeta (ver figura 11). Con el fin de reducir la fuerza inica e incrementar la velocidad de la reaccin antgeno-anticuerpo, en los bancos de sangre se utiliza solucin salina de baja fuerza inica (LISS), la cual ser revisa-da ms adelante.

Temperatura

Los anticuerpos de los grupos sanguneos difieren con respecto a su actividad trmica ptima y son reactivos en un rango de tem-peratura restringido. Los anticuerpos fros, ge-neralmente IgM, reaccionan de forma ptima a bajas temperaturas, entre 4C y 25C. Por otro lado, los anticuerpos calientes, generalmente IgG, reaccionan mejor a 37C. Los anticuerpos que reaccionan in vitro slo a temperaturas por debajo de 37C se considera que no tienen signifi-cado clnico y raramente causan destruccin de los glbulos rojos.

pH

El pH ptimo de la mayora de los anticuerpos de los grupos sanguneos es de 6,5 a 7,5. Cuando el pH es demasiado cido o demasiado alcalino, las reacciones se inhiben. Para pruebas de rutina se debe usar un pH de 7,0.

Antigedad del suero y los eritrocitos

Las reacciones ms satisfactorias se obtienen cuando se utilizan suero y eritrocitos frescos. Se aconseja entonces utilizar glbulos rojos recin preparados y conservar el suero a -20C o menos.

Proporcin entre anticuerpos y antgenos

La proporcin entre anticuerpos y antgenos es importante. Cuanto mayor es la concentracin de anticuerpos en relacin con la de los antgenos eritrocitarios, ms intensa es la reaccin. Por lo tanto, la potencia de la suspensin de glbulos rojos es esencial, porque si es excesiva, podra enmascarar la presencia de anticuerpos dbiles. Para las pruebas de aglutinacin, la preparacin de los eritrocitos debe estar entre el 2% y el 5%.

En serologa, una proporcin de glbulos rojos comnmente usada es dos gotas de suero por una gota de una suspensin de glbulos rojos entre el 2% y el 5%. Si el anticuerpo reacciona muy dbil, aumentar la cantidad de anticuerpo puede incrementar la sensibilidad de la prueba.

La reduccin de la concentracin de eritrocitos a partir del 5% hasta el 2% o al 3% dobla la relacin clula-suero, al igual que agregando 4 gotas del suero a la suspensin estndar de los eritrocitos. A veces, es til aumentar el volumen del suero a 10 o aun 20 gotas, particularmente


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durante una investigacin de una reaccin hemoltica transfusional, en la cual las pruebas de ru-tina no revelan ningn anticuerpo. Las alteraciones en el volumen de suero o de plasma afectan de forma importante la fuerza inica de las pruebas en las cuales LISS ha reducido la constante dielctrica, as que los procedimientos deben ser modificados para mantener la relacin apropia-da entre suero y LISS.

Tiempo de incubacin

Las reacciones antgeno-anticuerpo tienen un tiempo ptimo de incubacin que favorece la mxima unin del anticuerpo al antgeno. Periodos de incubacin cortos no permiten que cantidades significativas de anticuerpo se unan, y periodos prolongados de incubacin pueden resultar en disociacin del anticuerpo del antgeno.

Para los sistemas en solucin salina en los cuales se utiliza el suero de antiglobulina humana (AGH) para demostrar la unin del anticuerpo, la incubacin entre 30 a 60 minutos a 37C es adecuada para detectar la mayora de los anticuerpos clnicamente significativos. Para algunos anticuerpos dbilmente reactivos, la asociacin puede no alcanzar el equilibrio en 30 minutos y la prolongacin del tiempo de la incubacin puede aumentar la sensibilidad de la prueba. Prolongar el tiempo de la incubacin ms all de 60 minutos tiene pocas desventajas, con la excepcin de retrasar el tiempo de los resultados.

El tiempo de incubacin a 37C se puede disminuir entre 10 y 15 minutos si se utiliza solu-cin salina de baja fuerza inica, LISS. El uso de polmeros solubles en agua como el glicol de polietileno (PEG, por sus siglas en ingls polyethylene glycol) tambin reduce el tiempo, como se revisar ms adelante [43].

Lectura e interpretacin de las reacciones de aglutinacinLa mayora de los procedimientos de rutina realizados en los bancos de sangre dependen de

aglutinacin y/o hemlisis como punto final. En las pruebas serolgicas, la hemlisis o la aglutina-cin que constituye el punto final de la reaccin, debe ser descrito con precisin. Inmediatamen-te despus de la centrifugacin, se debe observar el sobrenadante para hemlisis y el botn de glbulos rojos se debe desagregar suavemente para observar la aglutinacin. La manera en la cual los eritrocitos son despegados del botn del tubo, afecta la deteccin de la aglutinacin [43].

La fuerza de la aglutinacin observada con cada muestra debe ser registrada una vez se ha ledo. Todo el personal en el laboratorio debe usar el mismo esquema de interpretacin. Un sis-tema comnmente usado es el siguiente:

4+ aglutinados slidos

3+ varios aglutinados grandes

2+ aglutinados de tamao medio, fondo claro

1+ pequeos aglutinados, fondo turbio

+ aglutinados muy pequeos, fondo turbio

O no aglutinacin o hemlisis

HP hemlisis parcial, algunas clulas rojas permanecen

H hemlisis completa, no hay clulas rojas

mf campo mixto, algunos aglutinados de clulas rojas y algunas clulas libres

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Figura 12. Lectura de las reacciones de aglutinacin (Coombs) en tubo.

Negativo Positivo

Para una mxima reproducibilidad, se deben usar una fuente de luz y un lente ptico. Las lecturas al microscopio no se usan de rutina en el banco de sangre, pero pueden ser tiles para diferenciar fenmeno de rouleaux. La formacin de rouleaux es una pseudoaglutinacin en la cual los eritrocitos se adhieren uno a otro sobre su superficie plana, dando la apariencia de una pila de monedas. Esta adherencia no inmunolgica de los eritrocitos, se debe a altas concen-traciones de globulina en el suero, los cuales se observan en pacientes con mieloma mltiple, muestras tomadas del cordn umbilical que se contaminan con la gelatina de Warthon y en pacientes a quienes se les administra dextrn como expansor del plasma. El rouleaux se dispersa con la adicin de solucin salina a la reaccin. Este procedimiento se conoce como la tcnica del reemplazo de solucin salina. La verdadera aglutinacin no se dispersa con esta tcnica. En la figura 12 se observa aglutinacin de los eritrocitos.

Reactivos utilizados para la deteccin de anticuerpos

Albmina

Las molculas como la albmina aproximan los eritrocitos entre s, de manera que los an-ticuerpos IgG pueden fijarse a los antgenos de clulas adyacentes y formar aglutinados. Si los eritrocitos no estn cubiertos, la albmina no acta.

Su efecto se debe a que acta como un estabilizador de baja fuerza inica, facilitando la aglutinacin al reducir la repulsin entre las clulas. La albmina de suero bovino est disponible como soluciones al 22% y al 30% [13].

Enzimas

Las cargas negativas de los glbulos rojos los mantienen separados. Este fenmeno se debe a la presencia de cido neuramnico en la superficie de las clulas. Algunas enzimas como la bromelina, ficcina, papana y tripsina, remueven parte del cido neuramnico, disminuyendo la carga negativa. Los eritrocitos se aproximan y los anticuerpos IgG pueden aglutinarlos. Los anti-cuerpos IgM tambin aglutinan los eritrocitos tratados con enzimas y su reaccin puede ser ms intensa, como en el caso de anti-A y anti-B.

Sin embargo, las enzimas eliminan algunos antgenos eritrocitarios principalmente M, N, S, Fya y Fyb. Por lo tanto, estas pruebas son complementarias y no reemplazan las pruebas bsicas (solucin salina, albmina y antiglo-bulina) [13].

Glicol de polietileno

Glicol de polietileno (PEG) es un polmero lineal soluble en agua usa-do como un aditivo para potenciar las reacciones antgeno-anticuerpo [44]. Se ha sugerido que el PEG promueve la captacin del anticuerpo a travs de la exclusin de molculas de agua en el diluyente, de tal forma que los antgenos y los anticuerpos entran en un contacto muy estrecho, facilitan-do la unin entre los eritrocitos y los anticuerpos. Mltiples estudios han


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demostrado que el PEG incrementa la deteccin de anticuerpos clnicamente significativos y disminuye la deteccin de anticuerpos no significativos [45].

Solucin salina de baja carga inica

La solucin salina de baja carga inica o LISS (aproximadamente 0,03 M), al reducir la fuerza inica del medio, incrementa la velocidad de la sensibilizacin de los anticuerpos contra ant-genos eritrocitarios, comparada con la solucin salina normal (aproximadamente 0,17 M). Para prevenir la lisis de los eritrocitos debido a la fuerza inica tan baja, se adiciona glicina como aditivo al LISS.

Actualmente la mayora de los bancos de sangre utilizan LISS con aditivo, el cual se encuentra disponible comercialmente y puede contener albmina, adems de sales y estabilizadores. Las soluciones LISS aumentan la velocidad de asociacin del anticuerpo (etapa 1) cuando las pro-porciones del volumen estn correctas. Aumentando el volumen del suero, aumentar la fuerza inica de la prueba; por lo tanto, cualquier alteracin en los volmenes del suero usados requiere el ajuste del volumen de LISS o la omisin de LISS. Por esta razn, el uso de LISS para los estudios de rutina de titulacin y otras pruebas, se debe hacer siguiendo las instrucciones del fabricante.

Prueba de antiglobulina o Coombs

Como ya se mencion, algunas molculas pequeas como la IgG pueden sensibilizar los eritrocitos y no producir aglutinacin. En 1945, Coombs y colaboradores [11] describieron una prueba para detectar estos anticuerpos no aglutinantes. Posteriormente, esta misma prueba se utiliz para demostrar la unin del complemento a los eritrocitos. Esta prueba se conoce como la prueba de antiglobulina o prueba de Coombs.

Todas las molculas de anticuerpos son globulinas. Estas globulinas humanas son inyectadas a animales para que fabriquen anticuerpos dirigidos contra esas protenas extraas. El suero del animal es sometido luego a procedimientos de adsorcin para eliminar las aglutininas indesea-das. Este suero tendr la capacidad de reaccionar especficamente contra globulinas humanas, por lo tanto se denomina suero de antiglobulina humana (AGH). Los sueros de AGH se pueden producir con diferentes especificidades, principalmente contra IgG y contra diferentes fracciones del complemento.

Las molculas de AGH forman un puente entre los eritrocitos adyacentes cubiertos con anticuerpos, para producir aglutinacin visible. Las clulas que no tienen ninguna globulina unida no sern aglutinadas. La fuerza de la aglutinacin observada es generalmente propor-cional a la cantidad de globulina unida. El suero de AGH reaccionar con los anticuerpos y fracciones del complemento de origen humano, que estn unidos a los eritrocitos, por lo tanto los eritrocitos deben ser lavados para eliminar las protenas no unidas, antes de la adicin de AGH.

Prueba de antiglobulina directa

La prueba de antiglobulina directa o Coombs directo se utiliza para demostrar el recubrimien-to in vivo de eritrocitos con anticuerpos o con el complemento, principalmente IgG y C3d. Los eritrocitos lavados de un paciente o de un donante se prueban directamente con los reactivos de antiglobulina humana-AGH. La prueba de antiglobulina directa se utiliza en la investigacin de enfermedad hemoltica del feto y del recin nacido, anemia hemoltica autoinmune, hemlisis inducida por drogas y en el estudio de las reacciones aloinmunes contra eritrocitos transfundidos recientemente.

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Prueba de antiglobulina indirecta

En la prueba de antiglobulina indirecta o Coombs indirecto, el suero (o plasma) se incuba con eritrocitos, luego se hace un lavado para remover las globulinas no unidas. La aglutinacin que ocurre cuando se agrega antiglobulina humana AGH, indica que el anticuerpo se ha unido a un antgeno especfico presente sobre el eritrocito. La especificidad del anticuerpo puede ser cono-cida y la del antgeno no, como en el caso de la fenotipificacin de grupos sanguneos, o pueden ser desconocidas. Tambin se usa para realizar la prueba cruzada de compatibilidad, en donde el suero y los antgenos eritrocitarios son desconocidos. En la figura 13 se esquematiza la prueba de antiglobulina directa e indirecta y en la figura 12 se observa su lectura.

Reactivos de antiglobulina

Se pueden preparar anticuerpos contra las globulinas humana, inyectando animales con IgG, IgA, IgM, C3, o C4 purificado. Estos antisueros obtenidos de animales son policlonales por natu-raleza. Tambin se pueden preparar reactivos monoclonales a partir de hibridomas. Anticuerpos derivados de animales o de hibridomas pueden ser mezclados en las preparaciones de los reacti-vos para obtener cualquier combinacin con las especificidades deseadas, o tambin se pueden juntar en un mismo reactivo diferentes clones de anticuerpos que reconocen un mismo antgeno. Por lo tanto, los reactivos pueden ser policlonales, monoclonales, mezclas de monoclonales o mezclas de anticuerpos monoclonal y policlonal.

Los anticuerpos monoclonales producidos a partir de un clon de una clula nica y espe-cficos para un solo antgeno, se pueden producir en grandes cantidades usando tecnologa de hibridomas. Este proceso involucra la fusin de la clula del bazo de un ratn normal que pro-duce el anticuerpo deseado, con una clula anormal de un ratn que tiene mieloma. En cultivo estas clulas hbridas producen clones que crecen rpidamente y producen grandes cantidades del anticuerpo deseado, como se observa en la figura 14. Las clulas del hibridoma pueden ser inyectadas intraperitonealmente a un ratn, para producir la efusin de grandes cantidades de lquido rico en anticuerpos a la cavidad peritoneal. Posteriormente, el lquido asctico del ratn es obtenido para la produccin de reactivos para los bancos de sangre, entre otros usos.

La Administracin de Alimentos y Drogas de Estados Unidos (FDA) ha establecido las defini-ciones para una variedad de los reactivos de AGH, como se muestra en la tabla 4. Los antisueros especficos para otras inmunoglobulinas (IgA, IgM) o las subclases (IgG1 e IgG3, entre otras) exis-ten, pero raramente se utilizan para las pruebas de rutina [46].

Otros mtodos para detectar las reacciones antgeno-anticuerpo

Los siguientes mtodos representan alternativas a las pruebas tradicionales realizadas en tubo, usando AGH. Algunos mtodos no permiten la deteccin de anticuerpos IgM e IgG, y pueden no aportar informacin sobre la fase y la temperatura de la reactividad de los anticuerpos, que se obtiene cuando se utilizan pruebas en tubo.

Pruebas de adherencia de clulas rojas en fase slida

Las tcnicas en microplato usan antgenos o anticuerpos inmovilizados en fase slida. En una prueba directa, el anticuerpo se fija a los pozos del microplato, luego se adicionan los eritrocitos. Si las clulas expresan el correspondiente antgeno, ellas se adhieren a las paredes del pozo, si no ocurre reaccin antgeno-anticuerpo, las clulas se van al fondo del pozo formando un botn cuando se centrifugan [47].


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Figura 13. Prueba de antiglobulina o Coombs. El Coombs directo se usa para determinar si hay anticuerpos (IgG) o com-plemento (C3) unidos a la membrana de los eritrocitos. Los eritrocitos del paciente son incubados con anticuerpos anti-IgG y anti-C3. Si hay presencia de IgG o C3 en la membrana de los eritrocitos, se presenta aglutinacin y la prueba es positiva. El Coombs indirecto se usa para detectar si hay anticuerpos IgG en el suero del paciente contra los eritrocitos. El suero del paciente se incuba con el reactivo con eritrocitos. Posteriormente se agrega el suero de Coombs (que contiene anticuerpos anti-IgG). Si hay autoanticuerpos o aloanticuerpos contra los eritrocitos, se presenta aglutinacin y la prueba es positiva.

Suero del pacientecon IgG ( )

Incubacin conreactivo con

eritrocitos

Coombs directo

Coombs indirecto

Unin de IgG a loseritrocitos del

reactivo

Incubacin conanticuerpos contra

Ig ( ) humana

Eritrocitos con IgG ( )o C3 ( ) unido a la

membrana

Incubacin con anticuerpos contra

Ig ( ) y C3 ( ) humanos

Aglutinacin (prueba positiva de

Coombs directo)

Aglutinacin (prueba positiva de Coombs indirecto)

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En las pruebas indirectas se utilizan componentes de los eritrocitos, por ejemplo protenas especficas de membrana, que son fijados al microplato. Posteriormente, se adiciona el suero o plasma problema a los pozos cubiertos con eritrocitos, luego los pozos se lavan para eliminar protenas no unidas. El indicador para la unin de los anticuerpos es una suspensin de eritrocitos cubiertos con anti-IgG. La reaccin es positiva si los eritrocitos se adhieren a las paredes del pozo. Si se forma un botn en el fondo cuando se centrifuga el microplato, se demuestra que no ocurri reaccin antgeno-anticuerpo, como se observa en la figura 15 [48].

La unin de antgenos o anticuerpos a la fase slida es una parte integral de otras pruebas tal como la inmovilizacin especfica de anticuerpos monoclonales de antgenos eritrocitarios (MAIEA, del ingls monoclonal antibody-specific immobilization of erytrocyte antigens), que ser discutida ms adelante.

Figura 14. Produccin de anticuerpos a partir de hibridomas: (1) El ratn es inmunizado con un antgeno. El bazo del ratn produce clulas plasmticas que secretan anticuerpos contra el antgeno; (2) se seleccionan las clulas de mieloma que no sintetizan anticuerpos ni la enzima hipoxantin-guanin-fosforribosil transferasa (HGPRT); (3) se aislan las clulas plasmticas a partir del bazo del ratn inmunizado, las cuales son mezcladas con las clulas de mieloma. Se induce la fusin de ambos tipos de clulas para producir hibridomas; (4) las clulas son incubadas en medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidi-na). Las clulas no fusionadas mueren; (5) se seleccionan los hibridomas que producen anticuerpos especficos contra el antgeno inyectado y se producen en forma masiva.

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

Tabla 4. Reactivos de antiglobulina humana

Nombre del reactivo Definicin

Anti-IgG, C3d; poliespecfico Contiene anti-IgG y anti-C3d (puede contener otros anticuerpos como anti-C3c y anti-inmunoglobulinas)

Anti-IgG Contiene anti-IgG sin actividad anticomplemento, no necesariamente especfico de cadenas gamma

Anti-IgG, cadenas pesadas Contiene slo anticuerpos reactivos contra cadenas gamma humanas

Anti-C3b Contiene slo anticuerpos C3b sin actividad anti-inmunoglobulina

anti-C3d Contiene slo anticuerpos C3d sin actividad anti-inmunoglobulina

Anti-C4b Contiene slo anticuerpos C4b sin actividad anti-inmunoglobulina

Anti-C4d Contiene slo anticuerpos C4d sin actividad anti-inmunoglobulina


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Tambin se han diseado sistemas en fase slida para la deteccin de anticuerpos antiplaque-tarios, pruebas microbiolgicas para sfilis, citomegalovirus y antgeno de superficie de la hepatitis B [48-51].

Tecnologa de aglutinacin en columna

Se han diseado varios mtodos en los cuales los eritrocitos son filtrados a travs de una columna que contiene un medio que separa los eritrocitos. Los sistemas comerciales emplean una tarjeta o tira de microtubos, a diferencia de los tubos convencionales. Estos permiten el pro-cesamiento de varias pruebas en forma simultnea. Un espacio o cmara en la parte superior de cada columna se usa para los eritrocitos o para incubar las clulas y el suero o plasma. Cuando los eritrocitos pasan a travs de la columna durante la centrifugacin, el medio de la columna separa los eritrocitos aglutinados de los no aglutinados, de acuerdo al tamao del agregado, como se observa en la figura 16 [48]. En las pruebas de columna, el botn de clulas en las pruebas negativas se va para el fondo. En las pruebas positivas, las clulas son capturadas en la parte su-perior o en el cuerpo de la columna. Una ventaja de estos sistemas es la estabilidad al final de la reaccin, la cual puede ser leda por varias personas, o en algunos casos, documentarla por me-dio de fotocopiado. Las pruebas de columna tienen generalmente una sensibilidad similar a los mtodos de antiglobulina en LISS, pero estas pruebas tiene un menor desempeo en la deteccin de anticuerpos dbiles, especialmente los del sistema ABO [52, 53].

Alternativamente, en algunas pruebas se puede incluir en el medio un antisuero especfico o protenas. Las clulas que portan el antgeno especfico son capturadas selectivamente cuando pasan a travs del gel.

Figura 15. Prueba indirecta de antiglobulina en fase slida. En una prueba positiva, el reactivo con eritrocitos se observa en las paredes del micropozo. En una prueba negativa, el reactivo con eritrocitos no se une y el botn de clulas cae al centro del micropozo cuando se centrifuga. Las reacciones dbiles dan resultados intermedios.

Fijacin de protenas de

membrana deeritrocitos a fase slida

Se adicionasuero delpaciente

Se adicionaneritrocitos cubiertos con IgG y anti-IgGLavado

Positiva

Negativa

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En 1986, Lapierre y colaborado-res desarrollaron un proceso que lle-v esta tecnologa al uso de una co-lumna con un gel de partculas [54]. El procedimiento utiliza microtubos que contienen una mezcla del gel, estabilizador y reactivo. Dependien-do de la prueba a realizar, se utiliza un gel neutro que no contiene reac-tivo (los reactivos se adicionan en la parte superior) o un gel especfico que contiene reactivos (por ejemplo suero de antiglobulina o anti-A, B, D, etc.). Una suspensin de eritro-citos (para clasificacin sangunea o para la prueba de antiglobulina directa) o una mezcla de eritrocitos y suero (para la clasificacin ABO reversa o para la identificacin de anticuerpos) es centrifugada bajo condiciones controladas. En las re-acciones negativas, las clulas rojas pasan a travs del gel y se forma un botn rojo en el fondo del tubo, mientras que en las reacciones po-sitivas, los eritrocitos quedan atra-pados en el gel, permitiendo que la reaccin se pueda leer aun horas despus. La prueba es fcil de reali-zar, sensible y reproducible. Se pue-de hacer la prueba de antiglobulina sin necesidad de lavar los eritrocitos, por lo tanto se eliminan reacciones inespecficas y el riesgo por el uso de material contaminado.

Otra tecnologa similar a la aglu-tinacin en gel, es el uso de colum-nas con microperlas de vidrio en un diluyente. Como en las pruebas con gel, las perlas pueden atrapar las c-lulas aglutinadas o antisuero, o tam-bin se puede adicionar anti-IgG al diluyente [55].

Equipos automatizados

Se han desarrollado varios equipos automatizados para la deteccin de reacciones antgeno-anticuerpo. Todos los pasos en el procesamiento de las pruebas, desde la separacin de las muestras hasta el reporte de los resultados, son hechos por el equipo. Estos equipos permiten la realizacin de mltiples pruebas, usando tecnologa en fase slida, gel en columna y platos para microtitulacin. Los equipos son controlados por un programa de computador, utilizando iden-

Figura 16. Prueba indirecta de antiglobulina en gel. El gel contiene anti-cuerpos anti-IgG. Se adiciona el suero o plasma del paciente (que puede o no tener anticuerpos) y el reactivo con los eritrocitos, los cuales son incubados en la cmara antes de centrifugarse la columna. En una prue-ba positiva, el reactivo con eritrocitos se observa adherido al gel en la columna. En una prueba negativa, el reactivo con eritrocitos no se une y el botn de clulas cae al fondo de la columna cuando se centrifuga. Las reacciones dbiles dan resultados intermedios.

Positiva

Suero oplasma delpaciente

AntiIgG

Cmara

Reactivo coneritrocitos

Negativa


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tificacin de las muestras por medio de cdigo de barras. El equipo se puede integrar al sistema de informacin del laboratorio para el reporte de los resultados. Estos equipos son muy tiles en instituciones donde se procesan grandes volmenes de pruebas tanto de donantes de sangre como de pacientes.

Inmunofluorescencia

Las pruebas de inmunofluorescencia permiten la identificacin y localizacin de antgenos por dentro o en la superficie de las clulas. Un fluorocromo, como la fluorescena o ficoeritrina, se puede unir a una molcula de anticuerpo, sin alterar su especificidad o su capacidad para unirse al antgeno. La unin del anticuerpo marcado con fluorescena al antgeno de la clula, hace que la clula cubierta con el anticuerpo aparezca de un color verde amarillo brillante o rojo, dependiendo del fluorocromo.

Los anticuerpos fluorescentes pueden ser usados en procedimientos directos o indirectos, siendo la fluorescencia anloga a la aglutinacin como punto final. En las pruebas directas, el anticuerpo marcado con fluorescena es especfico para el antgeno de inters. En la prueba in-directa, antiglobulina marcada con fluorescena se adiciona a las clulas que han sido incubadas con un anticuerpo no marcado de especificidad conocida. Recientemente los anticuerpos inmu-nofluorescentes se han usado en citometra de flujo, para cuantificar la hemorragia feto-materna, para identificar las clulas transfundidas y medir su vida media en los receptores, para medir ni-veles bajos de IgG unida a las clulas y para distinguir la expresin homocigota de la heterocigota de los antgenos de los grupos sanguneos [56].

ELISA

Las pruebas inmunoabsorbentes ligadas a enzimas o ELISA (en ingls, enzyme-linked immu-nosorbent assays) se usan en banco de sangre para identificar antgenos o anticuerpos. La enzima fosfatasa alcalina se puede unir a molculas de anticuerpo, sin destruir la especificidad del anti-cuerpo o la actividad enzimtica. Esta prueba se ha usado para detectar y medir IgG unida a las clulas y as demostrar hemorragia feto-materna. Cuando se examinan eritrocitos, la prueba se denomina prueba de antiglobulina ligada a enzima o ELAT (en ingls, enzyme-linked antiglobu-lina test).

MAIEA

Significa inmovilizacin especfica de anticuerpos monoclonales de antgenos eritrocitarios (MAIEA en ingls por, monoclonal antibody-specific immobilization of erytrocyte antigens). En la prueba de MAIEA, los eritrocitos se incuban con dos anticuerpos, uno contiene aloanticuerpos humanos dirigidos contra un antgeno de grupo sanguneo y el otro es un anticuerpo no humano (monoclonal de ratn) que reacciona con una porcin diferente de la misma membrana proteica. Este mtodo se ha usado principalmente para aislar estructuras de membrana de forma especfi-ca, para el estudio de antgenos de grupos sanguneos [57, 58].

Mtodos moleculares

Las tcnicas moleculares se han desarrollado como pruebas suplementarias a las tcnicas serolgicas actuales [59]. Las pruebas de aglutinacin, aceptadas como estndar de oro, para la fenotipificacin de los grupos sanguneos, pueden ser poco exactas como en el caso de pacien-tes multitransfundidos o en pacientes con autoanticuerpos [60]. Adems, los antisueros espe-cficos para algunos antgenos de grupos sanguneos como Dombrock (Doa, Dob), Colton (Coa, Cob) y los antgenos de baja frecuencia, son escasos [60]. Las pruebas moleculares superan

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estas limitaciones. El gen MN (GYPA) fue el primer gen de grupo sanguneo clonado, en 1986 [61]. Al presente todos los genes de los 30 sistemas han sido identificados y secuenciados. Se han determinado las bases moleculares para todos los polimorfismos de los grupos sanguneos clnicamente importantes, adems de las variantes raras [62]. La asociacin de la mayora de los antgenos de los eritrocitos con polimorfismos de nucletidos nicos o SNPs (por sus siglas en ingls, single-nucleotide polymorphisms), proveen las bases para la deteccin de la expresin del antgeno por medio de DNA [63]. Aunque estos mtodos han permitido la identificacin de alelos, an no son prcticos para realizar a gran escala debido a su complejidad y a que son procedimientos muy laboriosos y poco rpidos para la obtencin de los resultados. Adems de lo anterior, los resultados de genotipificacin por medio de DNA deben ser analizados cui-dadosamente, debido a que no siempre reflejan el fenotipo [60]. Sin embargo, recientemente se han desarrollado nuevas tcnicas que superan estas dificultades, permitiendo la genotipifi-cacin de los grupos sanguneos a travs de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, ya que permite su automatizacin, flexibilidad en el uso de hardware y rapidez en el tiempo de procesamiento [64].

Las aplicaciones actuales de esta tecnologa incluyen:

Genotipificacin fetal en mujeres en embarazo con anticuerpos contra los grupos sanguneos, para evaluar si el feto est en riesgo de presentar enfermedad hemoltica del feto y del recin nacido.

Clasificacin sangunea en pacientes multitransfundidos (anemia hemoltica autoinmune), pa-cientes dependientes de transfusiones (anemia falciforme, talasemias, anemia aplsica), para proveer sangre con pruebas cruzadas compatibles.

Definicin de variantes del antgeno D.

Deteccin de donantes con baja expresin del antgeno D.

Clasificacin de donantes y pacientes cuando no se dispone del antisuero especifico.

Investigacin de casos difciles, especialmente cuando los eritrocitos estn cubiertos con in-munoglobulinas.

Comprobacin de que los pneles que se usan para la tamizacin e identificacin de anti-cuerpos, tengan la dosis de antgenos de acuerdo al fenotipo determinado serolgicamente.

Diagnstico gentico preimplantacin.

Abstract: Over 100 years have gone by since the discovery of the A, B, and O blood groups and until today there are 308 recognized antigens, 270 of which are clustered in 30 blood group systems. They are important as they allow blood transfusions with safety by means of simple tests such as the blood group analysis for ABO and Rh, compatibili-ty testing and antibody screening in order to avoid alloimmunization of receptors. These tests, initially developed by Nobel price winner, Karl Lansteiner in 1930, paved the way for the development of todays molecular biology assays that allow genotyping analysis of the fetus in pregnant women who have produced antibodies against blood antigens, blood typing of multiple transfused patients, detection of donors with low expression of D antigen, preimplantation genetic diagnosis, and donor typing polymorphisms of clinical importance, among others. These series begin with the present module describing the genetic and immunological bases of blood groups and intends to take the reader across a


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Bibliografa

fascinating journey to knowledge, to enjoy the study of blood typing, its antigens and an-tibodies, and their clinical importance. In the upcoming modules, hemolytic disease of the fetus and the newborn, hemolytic anemia diagnostic tests, transfusion reactions analysis, immunohematologic assays and their correct interpretation in order to provide appropriate elements for the proper clinical and surgical management of patients. Finally, serological studies of leukocytes and platelets will be addressed, as well as the laboratory assays and their clinical importance.

Key words: blood groups, leukocytes, platelets,

genetica e inmunologia aplicada al banco de sangre

Documents

medicina de laboratorio

pruebas de laboratorio

sangre de donantes

bancos de sangre

pruebas cruzadas

pruebas empleadas

anlisis de grupos sanguneos

coordinador laboratorio