g fp green fluorescent protein

16
GFP Green fluorescent Protein История Структура и свойства Применение Получение рекомбинантного GFP Сергей Крат, МБФ

Upload: addo

Post on 05-Jan-2016

69 views

Category:

Documents


0 download

DESCRIPTION

G FP Green fluorescent Protein. История Структура и свойства Применение Получение рекомбинантного GFP. Сергей Крат, МБФ. История. Выделен вместе с другим светящимся белком экворином из медузы  Aequorea victoria  Осаму Симомурой ( Jap ) 1960. История. - PowerPoint PPT Presentation

TRANSCRIPT

GFPGreen fluorescent Protein

ИсторияСтруктура и свойстваПрименениеПолучение рекомбинантного GFP

Сергей Крат, МБФ

История

Выделен вместе с другим светящимся белком экворином из медузы Aequorea victoria Осаму Симомурой (Jap) 1960

История• Дуглас Прэшер секвенировал и клонировал

ген белка (1992)

• Мартин Чалфи экспрессировал последовательность в Escherichia coli и Caenorhabditis elegans (Science, 1994)

• Исследования Фредерика Тцуи (конформация)

• Нобелевская премия по химии «за открытие и разработку зеленого флуоресцентного белка GFP» (Осаму Симомура, Мартин Чалфи, Роджер Тсьен, 2008)

GFP

GFP

Флуорофор = Ser65+Tyr66+Gly67

Свойства GFP

• 238 ако; • 26,9 кДа; • Пик фл-ии на 498 нм• emission/excitation 395/509• ИЭТ [4,6–5,4]• гидрофобный

Применение GFP

• Маркер в клеточной и молекулярной биологии

• Исследования в области вирусологииAn improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated

plaque counting.van Remmerden Y, Xu F, van Eldik M, others

Green fluorescent protein (GFP) as a vital marker for pathogenic development of the dermatophyte Trichophyton mentagrophytes

Gil Kaufman, Benjamin A. Horwitz, Ruthi Hadar, others

Применение GFP

• Исследования в области генной терапии

• Иммуногистохимия

Green fluorescent protein (GFP) fusion constructs in gene therapy research.

Wahlfors J, Loimas S, Pasanen T, Hakkarainen T.

Детекция экспрессии маркеров (оценка способности дифференцироваться у трансплантированных клеток в спинном мозге крысы)

Использование GFP как метки в молекулярной биологии

FACSПроточная цитометрия

• Иммунология• Онкология• Цитология• Гематология

Получение рекомбинантного GFP

Задачи1. Провести трансформацию E.Coli с pQE30GFP

2. Выделить плазмиду pQE30GFP

3. Экспрессировать GFP в E.coli

4. Выделить и очистить рекомбинантный GFP

5. Идентифицировать GFP методом иммуноблоттинга (Western-blotting)

6. Отработать методику определения концентрации GFP с использованием флуориметра VersaFluor (Bio-Rad)

Провести трансформацию E.Coli

Подобрать методику трансформации e.coli,

например:Кальциевая трансформация, электропорация

методика Т.Маниатис, Э.Фрич, Дж. Сэмбрук «Методы генетической.

Молекулярное клонирование.»(стр.240, гл.8)

Выделить и очистить экспрессированный GFP

На данном этапе работы необходимо разрушить клетки и разделить растворимые элементы, от нерастворимых.Далее необходимо из полученного образца выделить GFP.Можно использовать классические методы биохимии (сорбция, молек.сито, ИЭО и пр) в сочетании с более современными методами.

Выделить рекомбинантный белок можно с помощью метода металл-аффинной хроматографии (IMAC)

Руководство к практикуму по генной инженерии Евроген