examens complémentaires en hématologie hématologie cellulaire en pratique hémostase

Examens complémentaires en hématologie

hématologie cellulaire

En pratique

hémostase


hémogramme numération des réticulocytes

immunophénotypage des cell. Sanguines myélogramme/biopsie médullaire

caryotype/réarrangement des gènes des Ig et du TCR /recherche de translocations en biologie moléculaire

adénogramme/biopsie ganglionnnaire

fer sérique, transferrine et ferritine électrophorèse de l’Hb, test de Coombs,

dosages vitaminiques méthodes isotopiques in vivo


Quand?

bilan systématique -pré-opératoire

-1ère hospitalisation

hémogramme

Comment? prélèvement: veineux, jeun non obligatoire

ne pas prélever dans tubulure de perfusion (dilution), à distance des intra-lipides

(interférence avec leucocytes)à adresser à t°ambiante en – de 6H

Bilan orienté - pâleur, dyspnée, amaigrissement, fièvre inexpliquée,

adénopathies, VS…

Conditions de réponse: fonction de l’urgence clinique, distance du laboratoire, horaire des ramassages… 20 mn à 6H


hémogramme

Technique : automates utilisant 2 paramètres principaux comptage électronique des particules,

diffraction d’un rayon laser à petit et grand angles (volume, densité du contenu de la cellule GR hypo/hyperchromes),

+/- techniques cytochimiques (évaluation du contenu en peroxydases des granuleux et monocytes)

+/- techniques de fluorescence (densité du noyau, contenu en ARN du cytoplasme ex lymphocytes activés) Systèmes d’alarmes de + en + précises quanti/qualitatives

détectant les incertitudes de l‘automate

les microcytes peuvent être comptés comme des plaquettes

les grosses plaquettes comme des leucocytesGR décomptés comme leucocytes ds certaines

conditionsgouttelettes lipidiques décomptées comme des GB


valeurs automatisées -mesurées (réponse dans 1/2 journée):

numération des GR, des GB et des plaquettes

taux d’hémoglobine

volume globulaire moyen et indice de distribution (CVGR<15%)

- calculées: TGMH* (Hb/nbre GR) *TCMH ou HCM mesurée particule/particule % GR hypochromes

hématocrite ( GRxVGM)- CCMH (Hb/Ht) pas d ’intérêt clinique

formule leucocytaire en valeur absolue - 5 catégories leucocytaires Gr N, Eo, B; Ly; Monocytes- détection de cellules anormales +/- fiable ss forme

d’alarmes

hémogramme

toute anomalie quantitative/qualitative détectée par l’automate génère des alarmes étude morphologique des éléments figurés sur lame réponse dans journée

Examens complémentaires en hématologiehémogramme

étude morphologique des éléments figurés sur lame

étalement automatisé ou manuel d ’une goutte de sang et coloration de MGG

décompte de 100 leucocytes

sur certains automates, détection automatisée des érythroblastes et de la myélémie

morphologie des GR, détection d’érythroblastes à décompter du nombre de GB si nombreux (comptés par plupart des automates comme GB)

morphologie des leucocytes et détection des cellules anormales (myélémie, blastes, cellules lymphomateuses..) morphologie plaquettaire et détection d’éventuels agrégats plaquettaires (fausses thrombopénies)


hémogramme

Numération globulaire normale en fonction de l ’âge et du sexeHomme Femme Enfant Nourrisson Nouveau-

né3-12ans 3 mois-1an

Nombre de GR 1012/l 4.5-5.8 4-5.4 3.6-5.5 3.2-4.2 3.9-5.5

Hb (g/dl) 13-18 12.16 11-15 10-12.5 13.5-19.5

VGM (fl) 83-98 83-98 76-93 72-85 98-118

TGMH (pg) 27-32 27-32 24-32 25-34 30-36

Hématocrite (l/l) 40-54 35-47 36-44 30-4142-62

CCMH (g/dl) 32-36 32-36 32-36 32-36 32-36

Nombre de GB 109/l 4-10 4-10 4.5-12 6-17 10-25

neutrophiles 1.8-7 1.8-7 1.5-8 1-8.7 6-25

éosinophiles 0.05-0.5 0.05-0.5 0.05-0.7 0.05-0.7 0.05-0.6

basophiles 0-0.05 0-0.05 0-0.05 0-0.05 0-0.05

lymphocytes 1.5-4 1.5-4 1.5-6.5 3.5-16 2-15

monocytes 0.1-0.9 0.1-0.9 0.1-0.6 0.1-0.8 0.1-1.5

Plaquettes 109/l 150-500 150-500 150-450 150-600 150-600


valeurs automatisées :-numération des GR

-taux d’hémoglobine

fausses anémies par hémodilution (grossesse, splénomégalie, composant monoclonal IgM très élevé)

fausses polyglobulies par hémoconcentration (grands brûlés)

anémies masquées par hémoconcentration (déshydratation)

-volume globulaire

-TGMH calculé

Anomalies des Globules rouges

Anémie Hb <11- 13 g/dl Polyglobulie Hb >16-18 g/dl

Microcytaire <80 flnormo/macrocytaire 82-140 flHypochrome<27pgNormochrome 27-33

* TCMH ou HCM mesurée particule/particule % de GR hypochromes

détection précoce d’une carence en fer avant modification de la valeur moyenne globale

CVGR >15% distribution anormale du volume des Gr


Neutropénie en valeur absolue < 1.8 G/L ou 109/l- sévère si < 1- agranulocytose si < 0.5 (urgence

diagnostique)

Polynucléoses > 8 +/- myélémie (+/- importante)

Anomalies leucocytaires et plaquettaires

Hyperéosinophilies > 0.9 G/L ou 109/l

thrombopénie < 150, sévère si < 50, symptomatique si < 20

hyperplaquettose > 600 causes multiples, > 1000 SD myéloprolifératif

Hyperlymphocytoses > 4 G/L ou 109/l

- réactionnelles - tumorales

Cytologie +/- phénotype à confronter à l ’âge, contexte clinique (fièvre, syndrome tumoral)

Examens complémentaires en hématologieNumération des réticulocytes

Quand? devant anémie normo/macrocytaire

Évalue la production médullaire érythroblastique et donc le caractère régénératif ou arégénératif de l’anémie

Comment? Détection de l ’ARN ribosomial des GR immatures (48H à 72H)

classiquement par bleu de crésyl brillant ou bleu de méthylène avec lecture au microscope sur 1000 GR

actuellement détection automatisée par produits fluorescents technique plus rapide et précise % et niveau de fluorescence Valeur si < 25 x 109/l érythropoïèse défaillante (insuff

médullaire primitive ou secondaire: insuff rénale, cause endocrinienne, carences vitaminiques, envahissements)

si > 110 x 109/l érythropoïèse augmentée (anémie régénérative : hémolyse, hémorragie aigüe)

Examens complémentaires en hématologieExploration du fer

Quand?

devant une anémie hypochrome microcytaire, avant traitement. pour le dosage du fer arrêt de Tt par le fer depuis 72H, prélèvement soigneux à jeun évitant l’hémolyse,

A Savoir

causes principales des anémies hypochromes :carence martiale +++thalassémie hétérozygotte +++anémie inflammatoire +/-

suspecter la carence en fer avant l’anémie devantune hypochromie isolée, 1ère anomalie de la

NFdiminution des capacités physiques à l’effort baisse des capacités intellectuellesmoins bonne résistance aux infections

si suspicion de surcharge martiale

Examens complémentaires en hématologieExploration du fer

Comment? Dosages -fer sérique, transferrine et/ou ferritineDosage: fer sérique (13-20µmol/l), transferrine (2-3.8 g/l), et CTF 45-70µmol/L, ferritine (30-400 µg/l chez homme, 20-300 chez femme)Calcul du coefficient de saturation (CS) de la transferrine (N = 30%)

interprétation d’une hyposidérémiesi carence en fer: fer sérique CTF transferrine CS ferritinesi sd inflammatoire: fer sérique CTF transferrineCS N ferritineLimites ferritine: dans lyses cellulaires importantes, difficile à interpréter si association carence et sd inflammatoire - dosage de l’ hepcidine dans l’avenir? Hormone régulant l’absorption intestinale du fer et son relargage par les macrophages, hyperproduction dans l’anémie inflammatoire

- Récepteur soluble de la transferrine,

en cas de carence en fer et non influencé par Sd inflammatoire

Examens complémentaires en hématologieDosages vitaminiques

Quand ? devant une anémie macrocytaire

avant tout traitement et toute transfusion, après le myélogramme

À savoir: Possibilité d’association carence vitaminique/hémopathie

carence vitaminique probable si VGM > 120fl. pas d‘urgence à traiter (anémies d’installation

chronique)

Comment? Dosages vitamine B12 (200-500pg/ml) et folates sériques (5-15ng/ml), érythrocytaires (>200 pg/ml de GR) par technique de radio-analyse

Test de Coombs Quand? Devant une anémie normo/macrocytaire régénérative (réticulocytes > 120 x 109/l ), pour rechercher origine auto-immuneComment? sur sang veineux;Test direct: mise en évidence d’anticorps fixés sur les GR du patient,en ajoutant des anticorps de lapin anti-immunoglobulines humains : si test +,agglutination des GR

test indirect: recherche d’AC libres dans le sérum du patient en présence d’un panel de GR portant des antigènes connus, si fixation, agglutination en ajoutant du sérum de lapin anti-Ig humaines.


Electrophorèse de l’hémoglobine

Quand ? quand on suspecte une anomalie de l’hémoglobine

de srtucture ou de synthèse

En particulier devant une anémie hypochrome microcytaire ,

avec CVGR normal (si CVGR carence en fer)

et fer sérique et ferritine normal ou augmenté

Comment? Sang veineux, étude de la migration des hémoglobines dans un champ électrique

Normales: Hb A1 prédominante, Hb A2 < 3.5%, Hb F traces


masse sanguine quantification précise du volume globulaire par

technique de dilution d’hématies du sujet marquées au Cr51 ou Te99

du volume plasmatique par albumine marquée

Méthodes isotopiques in vivo

test de Schillingétude de l’absorption de la vitamine B12 marquée au Co58 donnée per os,après saturation des réserves hépatiques avec B12 froide, par élimination urinaire en 48H.

étude du mécanisme du défaut d’absorption par ingestion de B12 marquée par un autre isotope du Co associée à du FI

indications

Trancher entre polyglobulie vraie et fausse polyglobulie ( du volume plasmatique), anémie vraie et par hémo-dilution


immunophénotypageQuand? Caractérisation de cellules anormales dans le sang, moëlle osseuse, ganglion, liquides…., pour préciser la filiation et le niveau de différenciation cellulaire, rechercher une clonalité B et/ou un profil spécifique d’une entité donnéeComment? Mise en évidence d’antigènes membranaires ou cytoplasmiques spécifiques de lignée et/ou de différenciation cellulaire, sur sang total ou suspensions cellulaires, par techniques d’immunofluorescence et lecture en cytométrie de flux ou d’immunocytochimieEn pratique: technique assez longue (1 à 3H), semi-manuelle et

coûteuseindications à discuter avec le biologiste (en dehors des numérations CD4/CD8)Adresser des tubes de sang sur EDTA (tubes à NFP) sur RV

Rapide (1 à qques H)

caractérisation précise des pop. tumorales par doubles, triples et quadruples marquages profils spécifiques (entités B)phénotypes anormaux (T>>B)

Quantification de marqueurs

Clonalité B (restriction isotypique de l’expression des chaînes légères)

Cytométrie de flux

Immuno-cytochimie

Faible consommation cell.Corrélation

marqueur/celluleRéalisation compatible avec urgence (1H avec kits commerciaux)

CD10

Sang total, Moëlle totale, liquides, suspensions cellulaires à partir de tissus

Cytométrie de flux

Immuno-cytochimie

CD10

Indications préférentielles

Etalements directs (adénogrammes, myélogrammes, empreintes de biopsies..)

Étalements cyto-centrifugés de suspensions


immunophénotypage

Antigènes de la lignée T :CD2, CD3, CD5, CD4, CD8

Antigènes de la lignée B: DR, CD19, CD20, CD79, immunoglobulineAntigènes des cellules myéloïdes: CD13, CD33, myéloperoxydase

Antigènes des cellules immatures : CD34, CD117

Profils phénotypiques spécifiques :

Leucémie lymphoïde chronique CD19+ CD5+ CD23+

Lymphome folliculaire CD20+ CD10+ CD5-

Antigènes des cellules monocytaires CD14, CD11Antigènes des cellules érythroïdes: glycophorine A

Antigènes de la lignée plaquettaire : CD41, CD42


pour un diagnostic précis, rapide, économique nécessité d’une synergie clinico-biologique

Explorations tissulaires - Recommandations

générales

- donner des renseignements sur tableau clinique, antécédents familiaux et personnels, traitements éventuels

- s’informer sur modalités de prélèvement

- prélever avant tout traitement

- ne pas hésiter à prendre contact avec le laboratoire

- préciser si possible ce que vous attendez de l ’analyse demandée


Quand?

Rechercher/éliminer une hémopathie

- cytopénie(s): anémie normo/macrocytaire arégénérative,

neutropénie sévère, thrombopénie

- hyperleucocytose, thrombocytose en dehors sd inflammatoire

/infectieux

- polyglobulie vraie (masse sanguine )

bilan d’extension d’un lymphome

recherche d’une métastase

bilan d’un composant monoclonal sérique/urinairebilan de fièvre prolongée, baisse de l’EG, VS

augmentée sans cause infectieuse

myélogramme


myélogrammeComment? Ponction sternale sauf intervention chir. ou irradiation complications exceptionnelles (effraction crosse aortique),

crête iliaque postérieure (moins dangereux)

trocard à usage unique type Mallarmé avec garde,

anesthésie locale peau +/-périoste (patch d’EMLA si hospitalisation, 30mn de délai, xylocaïne en injection s/c)Technique:

Traverser table externe du sternum (pression douce si sujet âgé), puis aspiration intense et brève (douloureuse) de 1cc de moëlle maximum dans une seringue de 10cc

Recueillir le maximum de grains et les écraser entre 2 lames,

Éventuellement 2ème aspiration pour caryotype, culture de progéniteurs hématopoïétiques, myéloculture


myélogrammeEn pratiqueLaisser sécher les frottis à l’air, les adresser au laboratoire avec fiche de renseignements remplie soigneusementExamen des lames après coloration de May-Grünwald-Giemsa (20-45 mn), délai moyen de réponse écrite 48H, réponse orale si urgence (pour mise en route de traitement) en 2H (après l’arrivée au laboratoire!)Examens complémentaires (décidés par le biologiste)

cytochimiquesPrésence et répartition du fer (coloration de Perls)recherche d’enzymes utiles au diagnostic des hémopathies

Immunocytochimiques

mise en évidence d’antigènes de surface/cytoplasmiques pour caractériser des cellules métastatiques/blastiques/lymphoïdes anormales Limites du myélogramme: moëlle hypoplasique ou avec fibrose

Pas de contre-indication


Biopsie de moëlleQuand?En deuxième ligne après réalisation du myélogramme sauf - bilan d’extension d’un lymphome ou d’un carcinome, - si suspicion de myélofibrose à l’hémogramme (hématies en poire, érythroblasto-myélémie)Comment?- Asepsie +++ - préparation morphine + patch d’EMLA + AL à la xylocaïne-Prélèvement d’un cylindre osseux sous anesthésie locale soigneuse à l’aide d’un trocard de Jamshidi à usage unique, enfoncé sur une longueur de 1.5 à 2 cm en crête iliaque postéro-supérieure (crête iliaque antérieure si obésité ++)- Après extraction de la carotte, réaliser des empreintes sur lames, puis placer l’échantillon dans un liquide de fixation formolé.

Contre-indication absolue: traitement par anti-vitamines donc relais AVK par Héparine de bas poids

moléculaire


Biopsie de moëlle

Résultat minimum de 72H pour avoir le résultat.

Renseigne sur :

richesse et structure du tissu myéloïde (différenciant hypoplasie et fibrose, les 2 pouvant entraîner un échec du myélogramme)

présence et quantité de cellules anormales,par rapport au myélogramme

- meilleure évaluation quantitative, voire détection surtout si foyers fibreux (lymphome, métastase)

- moins bonne définition cellulaire donc moins bonne catégorisation des cellules anormales Myélogramme et BM complémentaires et non substitutifs


Ponction ganglionnaire (adénogramme)Quand? Bilan d’une adénopathie isolée ou

polyadénopathieComment? Geste peu douloureux et facile à réaliserPrélèvement de suc ganglionnaire, par aiguille de taille petite /moyenne, avec /sans aspiration, après immobilisation du ganglion entre 2 doigts, puis projection sur 1 ou plusieurs lames de verre et étalement très doux* et séchage à l’air. Si aspect purulent, renouveler l’aspiration pour étude bactériologique, avec aiguille plus grosse si pus épais. Si échec, renouveler avec aiguille plus grosse.Résultat coloration de MGG (idem myélogramme) délai moyen 48H. Réponse orale si urgence en 2H.

rassure si aspect inflammatoire banal, concordant avec clinique et/ou hémogramme, mais la persistance d’une adénopathie sans cause infectieuse prouvée biopsie oriente le Dg : pus (+ bactério), métastase, lymphome à confirmer par une biopsie


Biopsie ganglionnaireQuand? devant une ou plusieurs adénopathies isolées

non inflammatoires, non rapidement régressives, en l’absence de contexte infectieux patent (angine, etc…)

vérifier l’absence de syndrome mononucléosique

si possible après ponction permettant une orientationComment?- Geste chirurgical sous AL ou AG, ou radiologique (micro-biopsies dirigées)- Si possible ne pas faire biopser en siège inguinal- Demander à biopsier l’adénopathie la plus volumineuse, si possible entière et la faire envoyer à l’état frais non fixé dans un délai de 2H maximum- prévenir le laboratoire, lui adresser des informations cliniques


Biopsie ganglionnaireTechniques

Au laboratoire d’hématologieempreintes pour analyse cytologique

d’orientation immédiateimmunophénotypage (CFM,

immunocytochimie)cytogénétique / biologie moléculaire

(clonalité, recherche de translocations)Au laboratoire d’anatomie pathologique

coupes des blocs après inclusion en paraffine

immunohistochimie (antigènes cellulaire, protéines anormales)

recherche de virus ou de marqueurs géniques en hybridation in situ

analyse de clonalité/recherche de translocations


caryotypeQuand? affirmer la clonalité d’une anomalie hématologique

(mais la relation clonalité-malignité n’est pas absolue)

mettre en évidence des anomalies spécifiques d’une affection donnée, à visée diagnostique (LMC, certains types de lymhpomes malins), pronostique (ds leucémies aigües), ou suivi de maladie résiduelle Comment? Mise en évidence d’anomalies chromosomiques de nombre et/ou de structure (translocations, déltions, inversions…) par cytogénétique conventionnelle (dénombrement et classement des chromosomes après culture courte de 18 à 48H, bloquée au stade, métaphasique, analyse de 20 mitoses minimum)

et/ou cytogénétique moléculaire par hybridation in situ fluorescente (FISH) ou peinture chromosomique, sur noyaux en métaphase ou interphase, permettant de préciser une anomalie, ou de la révéler si non trouvée sur le caryotype.

Jean Pierre A….– caryotype sang du 09.04.99

Clone 1: 47,XY, +3, del(7)(q31q35)


caryotypeEn pratique envoi de sang (3 tubes de 5cc), moëlle osseuse (1cc) sur tubes héparinés, AVANT Tt cortico- ou chimiothérapique nécessite 20 millions de cellules, délai de réponse minimum: 3-4 jours

du lundi au vendredi (avant 14H), prévenir si arrivée tardive

fragment de biopsie ganglionnaire frais non fixé pour les lymphomes malinsIndications toutes les hémopathies où la cytogénétique a un intérêt diagnostique ou pronostique pouvant influencer le Tt

Limites cellules tumorales trop peu nombreuses (pousse des cellules normales), ou non en cycle

anomalies minimesanomalies génomiques et non chromosomiques, à

rechercher en biologie moléculaire


Étude du réarrangement des gènes des immunoglobulines ou du récepteur T

Indications Recherche d’une population monoclonale B ou T (pas d’approche de clonalité immunologique)

- bilan initial- recherche de maladie résiduelle

examen très spécialisé à discuter avec le biologisteLimites technique : absence de clone identifiable dans un lymphome malin Interprétation: Présence de clones contrôlés non malins chez sujets

sains

Le réarrangement des gènes des IG ou du TCR est spécifique de la cellule dans laquelle il se produit, donc de toute population tumorale (qui dérive par définition d’une seule cellule-mère)

Extraction de l’ADN cellulaire, utilisation de sonde spécifique de JH pour les Ig, du segment J du TCR , par PCR le + souvent

examens complémentaires en hématologie hématologie cellulaire en pratique hémostase

Documents