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EVALUATION OF SUB-BASAL NERVE PLEXUS IN DIABETES: A REVIEW

Valutazione del plesso nervoso sub-basale nel diabete: una revisione

Paolo Fogagnolo1, Laura Tranchina1, Angelica Dipinto1, Maurizio Digiuni1, Laura Ottobelli1, Luca Rossetti1 1Eye Clinic, ASST Santi Paolo e Carlo, San Paolo Hospital, University of Milan, Italy

CORRESPONDING AUTHORPaolo Fogagnolo Eye Clinic, San Paolo Hospital, Via di Rudinì 8 20142 Milan, ItalyTel: +390281844301 Fax: +390250323150 [email protected]

KEY WORDSdiabetes, cornea; confocal microscopy, diabetic neuropathy, sub-basal plexus, nerve

PAROLE CHIAVEdiabete, cornea, microscopia confocale, neuropatia diabetica, plesso sub-basale, nervo

RIASSUNTOLe complicanze del diabete sono dovute alle alterazioni microvascolari e neuropatiche indotte dall’iperglicemia cronica. Al fine di ridurne la gravità e l’impatto sociale, è d’obbligo diagnosticare tempestivamente e trattare e monitorare in modo adeguato la neuropatia diabetica (ND) e l’angiopatia diabetica (AD). L’esame del fondo oculare e l’angiografia retinica sono marcatori consolidati dell’AD, mentre manca tuttora un marcatore convalidato e adeguatamente specifico per la ND. La cornea è l’organo con la più alta densità di nervi di tutto il corpo e l’unica struttura in cui i nervi possono essere osservati direttamente e in maniera non invasiva. Questo è possibile grazie alla microscopia confocale, una tecnica introdotta di recente nella pratica clinica, la cui importanza nella diagnosi delle patologie della superficie oculare è ben riconosciuta. Obiettivo di questo articolo è esaminare le attuali conoscenze sull’uso e sui limiti della microscopia confocale per la valutazione delle alterazioni diabetiche del plesso nervoso sub-basale corneale e il monitoraggio della ND.

INTRODUZIONEIl diabete colpisce il 5% circa della

ABSTRACTDiabetic complications are due to microvascular and neuropathic changes induced by chronic hyperglycemia. In order to reduce their severity and social impact, it is mandatory to early diagnose and adequately treat and monitor diabetic neuropathy (DN) and diabetic angiopathy (DA). Fundus oculi examination and retinal angiography are established markers for DA, whereas a validated and adequately specific marker for DN is still missing. The cornea is the organ of the body with the highest nerve density and the only structure in which nerves can be directly and non invasively observed. This is possible thanks to confocal microscopy, a device recently introduced in clinical practice, whose importance is well-recognized in the diagnosing ocular surface pathologies. Aim of this paper is to review the current knowledge on the use and limits of confocal microscopy in evaluating diabetic changes of the corneal sub-basal nerve plexus and monitor DN.

INTRODUCTIONDiabetes affects about 5% of the

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popolazione mondiale ed è un’importante causa di morbilità, disabilità e mortalità1-3. Le complicanze del diabete sono indotte dalle alterazioni microvascolari e neuropatiche causate dall’iperglicemia cronica. Al fine di ridurne la gravità e l’impatto sociale, è d’obbligo diagnosticare tempestivamente, trattare e monitorare in modo adeguato la neuropatia diabetica (ND) e l’angiopatia diabetica (AD). L’occhio è un sito unico per valutare le complicanze del diabete, in quanto la retina è il solo tessuto corporeo sul quale arteriole e venule sono direttamente ispezionabili all’esame del fondo oculare e le caratteristiche dei vasi vengono prontamente valutate mediante fluorangiografia; questi due esami sono i capisaldi della valutazione dell’AD. Inoltre, la cornea è il tessuto con l’innervazione più densa del corpo umano. I metodi disponibili per stimare la sensibilità corporea forniscono un equilibrio insoddisfacente tra sensibilità e specificità4-15; in particolare, l’estesiometria corneale può offrire letture nella norma anche quando è andata persa una grande quantità di fibre nervose16,17. Di conseguenza, manca ancora un gold standard per la ND. Considerando che la cornea è l’unico organo del corpo in cui i nervi possono essere osservati direttamente e in maniera non invasiva, la microscopia confocale della cornea (MCC) è un candidato marcatore adeguato per la ND, poiché consente di valutare in vivo le modifiche del plesso sub-basale (PSB), che ha dimostrato di essere alterato nel diabete e di correlarsi alla sensibilità corneale. Obiettivo di questo articolo è rivedere i dati disponibili sulla letteratura (limitatamente agli articoli peer-reviewed in lingua inglese) dedicata all’uso della MCC nella valutazione del PSB corneale nel diabete.

population worldwide and is a major cause of morbidity, disability and mortality1-3. Diabetic complications are induced by microvascular and neuropathic changes caused by chronic hyperglycemia. In order to reduce the severity and the social impact of diabetic complications, it is mandatory to early diagnose and adequately treat and monitor diabetic neuropathy (DN) and diabetic angiopathy (DA). The eye is a unique site to evaluate the complications of diabetes, as the retina is the only body tissue on which arterioles and venules are directly inspectable by fundus oculi examination and the characteristics of vessels are readily evaluated by means of fluorescein angiography; these two examinations are the landmarks of DA assessment. Also, the cornea is the tissue with the most dense innervation of the human body. The methods available to estimate body sensitivity provide an unsatisfactory balance between sensitivity and specificity4-15;

in particular, corneal esthesiometry can give normal readings also when a large amount of nerve fibers have been lost16,17. As a consequence, a gold standard for DN is still missing. Considering that the cornea is the only organ in the body in which nerves can be observed directly and noninvasively, corneal confocal microscopy (CCM) is a proper candidate marker for DN as it allows to evaluate in vivo changes of the subbasal plexus (SBP) which have been shown to be impaired in diabetes and to correlate with corneal sensitivity. Aim of this paper is to review the data available on literature (restricted to peer-reviewed English-written papers) on the use of CCM in evaluating corneal SPB in diabetes.

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Different confocal microscopes are not interchangeble in most casesThe principle of confocal microscopy was first described by Minsky in 1957; he proposed that both the illumination (condenser) and observation (objective) systems have common focal points, hence the name “confocal” microscopy18.Currently, there are 3 classes of in vivo confocal microscopes for corneal research: confocal tandem scanning microscopes (CTSMs), confocal slit-scanning microscopes (CSSMs) and confocal laser scanning microscopes (CLSMs). Even though all these microscopes operate under the same basic principles and provide an en face view of the corneal structure at very high magnification, they are not interchangeable. When measuring endothelial density by means of different CCMs (HRT; ConfoScan3 and SP-1000), large differences by more than 30% were found19. On the other hand, keratocytes densities estimated by ConfoScan4 and CTSM were comparable in all regions of the stroma except in the anterior 10%, where the ConfoScan4 indicated a 30% lower density20. Despite large ranges of normality have been found using different CCMs to measure subbasal nerve density (see below)21-23, a recent meta-analysis on 13 studies, suggested that the diagnostic performance of CCM in assessing corneal nerve parameters is not affected by the type of CCM (CLSM vs CSSM) in patients with diabetic peripheral neuropathy24.

Sub-basal nerve plexus (SBP)Preliminary considerationsThe cornea is the most densely innervated tissue of the human

Nella maggior parte dei casi i diversi microscopi confocali non sono intercambiabiliIl principio di funzionamento della microscopia confocale venne descritto per la prima volta nel 1957 da Minsky, il quale propose che entrambi i sistemi di illuminazione (condensatore) e osservazione (obiettivo) fossero dotati di punti focali comuni, da qui il nome di microscopia “confocale”18.Attualmente, esistono 3 classi di microscopi confocali in vivo per le ricerche sulla cornea: i microscopi confocali tandem a scansione (Confocal Tandem Scanning Microscopes, CTSM), i microscopi confocali slit-scanning (Confocal Slit-Scanning Microscopes, CSSM) e i microscopi confocali a scansione laser (Confocal Laser Scanning Microscopes, CLSM). Benché tutti questi microscopi operino secondo gli stessi principi di base e forniscano una visione frontale della struttura corneale con un ingrandimento molto elevato, non sono intercambiabili. Misurando la densità endoteliale con microscopi confocali diversi (HRT, ConfoScan3 e SP-1000), sono state riscontrate grosse differenze di oltre il 30%19. D’altra parte, la densità dei cheratociti stimata con ConfoScan4 e CTSM era confrontabile in tutte le regioni stromali a eccezione del 10% anteriore, dove ConfoScan4 ha riportato una densità inferiore del 30%20. Nonostante siano stati riscontrati ampi intervalli di normalità con l’utilizzo di diversi microscopi per misurare la densità dei nervi sub-basali (si veda oltre)21-23, una recente metanalisi condotta su 13 studi ha suggerito che la performance diagnostica della MCC nel valutare i parametri nervosi della cornea non è influenzata dal tipo di microscopio (CLSM vs CSSM) nei pazienti con neuropatia periferica diabetica24.

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Plesso nervoso sub-basale (PSB)Considerazioni preliminariLa cornea è il tessuto più densamente innervato del corpo umano25; i nervi corneali originano dalla divisione oftalmica del nervo trigemino e contengono fibre mieliniche Aδ (nervi dritti di grosso calibro che rispondono principalmente agli stimoli meccanici) e fibre C amieliniche (nervi “a rosario” di piccolo calibro che rispondono agli stimoli termici e chimici). I nervi corneali offrono protezione inducendo un’adeguata risposta a traumi, tossine, infezioni e altri insulti nocivi; l’innervazione della cornea è essenziale per preservare l’integrità epiteliale e promuovere la guarigione delle ferite dopo una malattia, un trauma o un intervento chirurgico25 27.La complessa architettura nervosa della cornea è stata studiata con l’aiuto della microscopia ottica28 ed elettronica26,29; più di recente, è stata utilizzata una tecnica di MCC in vivo30-34 per visualizzare direttamente e in maniera non invasiva la struttura nervosa della cornea, in particolare il PSB. Il primo resoconto dettagliato sul PSB venne pubblicato nel 200135; veniva descritto come un “ricco plesso formato da fibre nervose ben definite, spesso “a rosario” e con estese anastomosi, apparentemente situato nello strato di Bowman, appena posteriormente alla lamina basale epiteliale”. Patel e McGhee36 hanno mappato il PSB con la MCC nei 3-4 mm centrali della cornea e hanno dimostrato che il plesso si irradia dal limbo in direzione di un complesso spiraliforme situato 1-2 mm al di sotto dell’apice corneale; in questa regione è stata osservata una convergenza di nervi oraria e antioraria. Si ritiene che le fibre nervose di piccolo calibro del PSB rappresentino da vicino quelle coinvolte nel processo della polineuropatia sensitivo-motoria diabetica lunghezza-dipendente; pertanto, lo sviluppo di una tecnica di analisi di queste

body25; corneal nerves are derived from the ophthalmic division of the trigeminal nerve and contains myelinated Aδ fibers, which are large-diameter, straight nerves that respond primarily to mechanical stimuli, and unmyelinated C fibers, which are small-diameter, beaded nerves that respond to thermal and chemical stimuli. Corneal nerves provide protection by inducing adequate response to traumatic, toxic, infectious, and other noxious insult; corneal innervation is essential to preserve epithelial integrity and to promote wound healing after diseases, trauma or surgery25,27.The complex corneal nerve architecture has been studied by means of light28 and electron26,29 microscopy; more recently, a technique of in vivo CCM30-34 was used to visualize directly and non-invasively corneal nerve structure, and in particular SBP. The first detailed account of the corneal SBP was published in 200135; it was defined as “a rich plexus of well defined, often beaded and extensively anastomosing nerve fibers, apparently located in Bowman layer, immediately posterior to the epithelial basal lamina”. Patel and McGhee36 mapped SBP with CCM across the central 3 to 4 mm of the cornea and showed that SBP radiates from the limbus toward a whorl-like complex located 1 to 2 mm below the corneal apex; clockwise and counterclockwise convergence of nerves has been noted in this region. The small nerve fibers of SBP are thought to closely represent those that are involved in the length-dependent process of diabetic sensorimotor polyneuropathy; so, developing a technique for analysis of these structures is potentially of paramount importance for monitoring DN.

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strutture è di importanza fondamentale per il monitoraggio della ND.

MCC per il PSB: limiti attualiLa MCC sta guadagnando un forte consenso sia tra i medici che tra gli scienziati. Tuttavia, questa metodica è al momento influenzata da una serie di limiti che devono essere attentamente ponderati, in particolare quando si valuta il PSB. Una possibile strategia per ridurre la variabilità della MCC è quella di promuovere l’uso di procedure operative standard per la raccolta e l’analisi dei dati da parte dei centri che effettuano le misurazioni; un aspetto particolarmente rilevante nell’ambito degli studi multicentrici37. Mancanza di parametri standardizzatiI ricercatori hanno sviluppato una varietà di metodi per quantificare i parametri del PSB, tra cui:1) Densità delle fibre nervose corneali

(Corneal Nerve Fiber Density, CNFD): definita come il numero di fibre per unità.

2) Densità dei rami nervosi corneali (Corneal Nerve Branch Density, CNBD): definita come il numero di rami originanti dai tronchi nervosi principali.

3) Lunghezza delle fibre nervose corneali (Corneal Nerve Fiber Length, CNFL): definita come la lunghezza totale di tutte le fibre e i rami nervosi (mm/mm2) presenti nel campo dell’immagine.

4) Tortuosità delle fibre nervose corneali (Corneal Nerve Fiber Tortuosity, CNFT).

La CNFD e la CNFL sembrano riflettere la degenerazione globale delle fibre nervose, mentre la CNBD riflette la rigenerazione delle fibre nervose, che verrebbe misurata anche dalla CNFL. Per quel che riguarda le fibre nervose, i risultati possono essere espressi come numero di fibre/mm2 o numero di fibre/campo; lunghezza totale delle fibre/mm2 o lunghezza totale delle fibre/campo. Ovviamente, queste differenze possono

CCM for SBP: current limitationsCCM is gaining high popularity between both clinicians and scientists. Still, this method is actually affected by a number of limitations which need to be carefully considered, particularly when evaluating SBP. A possible strategy for reducing CCM variability is to promote the use of standard operating procedures for data collection and the analysis by reading centers; this is particularly relevant in the context of multicenter studies37. Lack of standardized parametersA variety of methods for quantifying SBP parameters was developed by researchers, including:1) Corneal nerve fiber density (CNFD):

it is defined as the number of fibers per unit.

2) Corneal nerve branch density (CNBD): it is defined as the number of branches emanating from the major nerve trunks.

3) Corneal nerve fiber length (CNFL): it is defined as the total length of all nerve fibers and branches (mm/mm2) on the image field.

4) Corneal nerve fiber tortuosity (CNFT). CNFD and CNFL seemed to reflect overall nerve fiber degeneration, whereas CNBD reflects nerve fiber regeneration, which would be also measured by CNFL. As regard nerve fibers, results can be expressed as number of fibers/mm2 or number of fibers/field; total length of fibers/mm2 or total length of fibers/field. These differences can obviously cause remarkable difficulties when comparing the results from different studies.SBP densities in normal human corneas vary considerably depending on the CCM used. Normal SBP density were 5.5 µm/mm2 +/- 1.8 SD using the CTSM; 10.6 µm/mm2 +/- 5.5 SD using CSSM38 and 21.7 µm/mm2 +/- 14,1 SD

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causare grosse difficoltà quando si confrontano i risultati di studi diversi.Le densità del PSB nelle cornee dei soggetti normali variano considerevolmente in base al microscopio confocale utilizzato. La densità normale del PSB era pari a 5,5 µm/mm2 +/- 1,8 DS con il CTSM; a 10,6 µm/mm2 +/- 5,5 DS con il CSSM38 e a 21,7 µm/mm2 +/- 14,1 DS nella porzione centrale della cornea con il CLSM37. Un’ampia variazione nei valori della densità nervosa può essere causata da differenze nella luminosità di campo e nel contrasto delle immagini tra i diversi strumenti. La luminosità e il contrasto delle immagini sono superiori con il CLSM e il CSSM rispetto al CTSM. Il CLSM è in grado di rilevare i nervi di calibro più piccolo e le stime della densità sono doppie rispetto a quelle formulate con il CSSM37; analogamente, la densità misurata con ConfoScan4 era doppia rispetto a quella rilevata con il CTSM38.Soggettività e riproducibilitàLa valutazione e la conta delle fibre del PSB con il modulo HRT-Rostock dipendono dall’operatore e, pertanto, sono soggettive32,39-44. Uno studio recente ha valutato la ripetibilità dei metodi CNFD, CNFL, CNFT con il test-retest nei soggetti normali e ha scoperto che la variabilità intra-osservatore aveva una sostanziale ripetibilità (ICC=0,66-0.74) ottenuta nei pazienti diabetici (ICC=0,92-0,97)41,43. La valutazione di tutti i parametri MCC (CNFD, CNBD, CNFL e CNFT) è fortemente riproducibile quando una singola immagine viene interpretata da esperti, ma per l’analisi degli esami seriati di un paziente – più rilevante dal punto di vista clinico – la CNFL ha mostrato una ripetibilità più elevata (ICC intra-osservatore 0,72 e ICC inter-osservatore 0,73) sia nei pazienti diabetici che nei controlli), e la variabilità inter-osservatore aveva una ripetibilità moderata-buona (ICC=0,54-0,93). Ciò valeva per tutti i parametri eccetto la

in the central cornea using the CLSM37. Wide variation in nerve density values may be caused by differences in field brightness and image contrast between instruments. Image brightness and contrast are higher with the CLSM and CSSM compared to the CTSM. The CLSM can detect smaller-caliber nerves and density estimates are double that by using CSSM37; similarly, density measured by the ConfoScan4 were twice that measured using the CTSM38.Subjectivity and reproducibilitySBP evaluation and count using HRT-Rostock module is operator-dependent and, therefore, subjective32,39-44. A recent study evaluated the repeatability of CNFD, CNFL, CNFT at test-retest on normal subjects, and found that intra-observer variability had substantial repeatability (ICC=0.66-0.74) obtained on diabetic patients (ICC=0.92-0.97)41,43. The evaluation of all CCM parameters (CNFD, CNBD, CNFL and CNFT) is strongly reproducibility when a single image is interpreted by experts, but for the more clinically relevant analysis of serial patient examinations, CNFL had higher repeatability (intra-observer ICC 0.72 and inter-observer ICC 0.73) both in diabetic patients and controls), and inter-observer variability had moderate-good repeatability (ICC=0.54-0.93). This was true for all parameters except branching, whose repeatability was low40. In order to improve CCM analysis, fully automated techniques have been developed37,45-48. The Authors also underline the others limitations of fully automated CNFL analysis such as nerve-tracing errors made by the automatic nerve-tracking algorithm due to failure to detect nerves which are thin, out of focus or faint, and erroneous recognition of other structures such as dendritic cells.



ramificazione, la cui ripetibilità era bassa40. Al fine di migliorare l’analisi MCC, sono state messe a punto delle tecniche completamente automatizzate37,45-48. Gli Autori sottolineano anche gli altri limiti dell’analisi CNFL completamente automatizzata, come errori nel tracciamento dei nervi da parte dell’algoritmo automatico dovuto al mancato rilevamento delle fibre sottili, non a fuoco o indistinte e l’erroneo riconoscimento di altre strutture come le cellule dendritiche. Area di campionamentoUn’ampia variazione dei valori di densità nervosa si riscontra anche nell’intera cornea: la densità dei nervi sub-basali è massima al centro della cornea (14,7±6,1 µm/mm2) e minima alla periferia media nasale (7,9±4,9 µm/mm2)48. Una diminuzione graduale della luminosità di campo in direzione dei margini dell’immagine può limitare il rilevamento dei nervi, cosicché l’utilizzo di diverse aree confinanti potrebbe influenzare la densità riportata49. Questo potenziale errore può essere ridotto al minimo usando un’area campione limitata al centro del campo (59% del campo intero), dove la densità apparente dei nervi era uniforme in una misura compresa entro il 60% del massimo38. Questa differenza sottolinea che l’acquisizione di immagini MCC dalla stessa area è di importanza fondamentale per confrontare gli studi, in particolare gli studi prospettici. In assenza di un dispositivo di tracciamento oculare che consenta di tracciare le stesse fibre nel corso del tempo, l’approccio attualmente adottato dalla maggior parte dei ricercatori è quello di acquisire delle immagini della cornea centrale. Tuttavia, considerando che i frame hanno dimensioni ridotte (400x400 micron), è estremamente improbabile che venga studiata esattamente la stessa area al retest.

Sampling areaWide variation in nerve density values may also be found across the entire cornea: sub-basal nerve density is highest at the corneal center (14.7±6.1 µm/mm2) and lowest at the nasal mid periphery (7.9±4.9 µm/mm2)48. A gradual decrease in field brightness toward the edges of the image may limit the detection of nerves, so the use of different bounding areas could affect density reported49. This potential error can be minimized by using a sample area limited to the center of the field (59% of the full field), where the apparent nerve density was uniform to within 60% of the maximum38. This difference highlights that obtaining CCM images from the same area is of critical importance to compare studies and, in particular, in prospective studies. In the absence of an eye tracker enabling to trace the same fibers over time, currently the approach adopted by most researchers is to obtain images from the central cornea. Still, considering that frames are small in size (400x400 micron), it is extremely unlikely to study exactly the same area at retest.Number of framesIn order to increase the precision of SBP density estimate, many studies have suggested to evaluate more than a single image. Arbitrary numbers of images have been used for analysis of nerve variables: some authors analyzed the average of three to five images per patient33,34,50; in one study, the investigators suggested that at least eight images per participant would give a sufficiently accurate approximation of mean corneal nerve branch density (which, as we previously mentioned, is the variable with higher variability)51.


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Numero di frameAl fine di incrementare la precisione della stima della densità del PSB, molti studi hanno suggerito di valutare più di una singola immagine. Per l’analisi delle variabili nervose sono stati utilizzati numeri di immagini arbitrari: alcuni autori hanno analizzato una media di tre-cinque immagini per paziente33,34,50; in uno studio, gli sperimentatori hanno suggerito che occorrono almeno otto immagini per partecipante per avere un’approssimazione sufficientemente accurata della densità media dei rami nervosi corneali (che, come abbiamo detto in precedenza, è la variabile con la più alta variabilità)51.

PSB e diabetea) Densità e lunghezza dei nerviLa MCC ha dimostrato chiaramente che tutti i parametri nervosi risultano ridotti o alterati nei soggetti con diabete rispetto ai controlli. I principali risultati sono la riduzione di CNFD, CNFL e CNBD nei pazienti diabetici17,30,33,34,50 54-64, anche nel caso di diabete di breve durata55,61. Nei soggetti diabetici, questi risultati mostrano una significativa correlazione con la sensibilità corneale, con la densità delle fibre nervose intraepidermiche (Intra Epidermal Nerve Fiber Density, IENFD) nella biopsia cutanea65 e con la gravità della neuropatia30,33,54,56,58,66. Inoltre, è stato suggerito che la tecnica di MCC può definire accuratamente l’entità del danno delle fibre nervose corneali e della relativa riparazione, agendo da misura surrogata della neuropatia somatica nei pazienti diabetici. In caso di trapianto di pancreas nei pazienti con diabete mellito di tipo 1, la MCC è stata utilizzata per dimostrare la rigenerazione del PSB (aumento della densità e della lunghezza delle fibre) entro 6 mesi dall’intervento chirurgico57. In uno studio recente67, i ricercatori hanno individuato una perdita precoce di fibre

SBP and diabetesa) Nerve density and lenghtCCM clearly showed that all nerve parameters are reduced or altered in diabetes compared with controls. The major findings are reduction in CNFD, CNFL, and CNBD in diabetic patients17,30,33,34,50,54-64 even for short diabetes duration55,61. In diabetic subjects, these findings significantly correlate with corneal sensitivity, with intra epidermal nerve fiber density (IENFD) in skin biopsy65, and with the severity of neuropathy30,33,54,56,58,66. Furthermore, it has been suggested that CCM technique can accurately define the extent of corneal nerve fiber damage and repair, acting as a surrogate measure of somatic neuropathy in diabetic patients. In the case of pancreas transplantation in patients with type 1 diabetes mellitus, CCM has been used to show SBP regeneration (increased fiber density and length) within 6 months from surgery57. In a recent study67, the researchers found an early loss of small nerve fibers detected by both CCM and skin biopsy in recently diagnosed type 2diabetes: interestingly, the vast majority of patients with abnormal CNFD showed concomitantly normal IENFD and vice versa, suggesting that small nerve fibers are not simultaneously affected in all organs (a “patchy manifestation pattern”), as previously shown61. Another study showed that CNFL best discriminated DN39. Another inconsistent report demonstrated a significant reduction in CNFD and CNBD but not CNFL in diabetic patients with mild to severe DN (duration of the disease: 18-25 years), and no reduction in CNFL and CNFD in patients without clinical DN for a mean of 16 years33.



nervose di piccolo calibro sia alla MCC sia alla biopsia cutanea nel diabete di tipo 2 di recente diagnosi: è interessante notare che la grande maggioranza dei pazienti con CNFD anomala ha riportato in concomitanza una IENFD nella norma e viceversa, suggerendo che le fibre nervose di piccolo calibro non vengono contemporaneamente influenzate in tutti gli organi (“pattern di manifestazione irregolare”), come dimostrato in precedenza61. Da un altro studio è emerso che la CNFL distingue al meglio la ND39. Un altro rapporto discordante ha dimostrato una significativa riduzione della CNFD e della CNBD, ma non della CNFL, nei pazienti diabetici con ND da lieve a grave (durata della malattia: 18-25 anni) e nessuna riduzione della CNFL e della CNFD nei pazienti senza ND clinica per una media di 16 anni33. b) Tortuosità dei nerviLa tortuosità dei nervi può avere una possibile rilevanza nel diabete. Oliveira Soto ha classificato la tortuosità dei nervi corneali in 5 gradi, da 0 a 4, tenendo in considerazione simultaneamente la frequenza e l’estensione dei cambiamenti nella direzione delle fibre nervose35. De Cillà e colleghi hanno applicato questo metodo allo studio del PSB corneale nei pazienti diabetici. La tortuosità era significativamente più elevata nei pazienti diabetici (2,5±0,9 vs 2,0±0,8; P=0,002), specialmente nel gruppo affetto da retinopatia diabetica proliferativa (2,2±0,8 vs 2,8±0,9; P=0,008)17, come confermato anche in un altro studio61. Il PSB dei soggetti diabetici appariva significativamente più tortuoso e anche più spesso rispetto ai controlli56, come confermato anche da Midena et al55. La CNFL è stata indicata come il parametro morfologico dei nervi corneali più importante per la diagnosi della ND39,43. Le correlazioni tra la lunghezza

b) Nerve tortuosityNerve tortuosity may have a possible relevance in diabetes. According to Oliveira Soto, the tortuosity of corneal nerves was graded into 5 grades, from 0 to 4, considering simultaneously the frequency and amplitude of the changes in the nerve fiber direction35. De Cillà and colleagues applied this method to the studying of corneal SBP in diabetic patients. Tortuosity was significantly higher in diabetic patients (2.5±0.9 vs. 2.0±0.8, P=0.002), especially in the group affected by proliferative diabetic retinopathy (2.2±0.8 vs. 2.8±0.9, P=0.008)17, as also confirmed in another study61. The SBP of diabetic subjects appeared significantly more tortuous and also thicker than controls56, as also confirmed by Midena et al55. CNFL has been advocated as the most important corneal nerve morphology parameter for the diagnosis of diabetic DN39,43. Correlations between corneal nerve fiber length and established measures of neuropathy and risk factors for neuropathy were higher when a correction was made for the nerve tortuosity69.c) Nerve reflectivity De Cillà analyzed fiber reflectivity by comparison with reference images, and found it significantly lower in diabetic patients compared with control subjects (2.3±0.9 vs. 2.6±0.9, P=0.04). This parameter was significantly lower in diabetic patients with proliferative diabetic retinopathy than in patients without it (2.00±.8 vs. 2.6±0.7, P=0.003). Patients affected by proliferative retinopathy that undergone panretinal argon laser photocoagulation showed lower reflectivity than patients who were not treated by argon laser photocoagulation17.d) Nerve beading Midena analyzed number of beadings of SBP, and found it significantly


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decreased in diabetic patients versus control subjects (5.6±0.4 vs. 12.3±0.4, P<0.0001)55.

DISCUSSION AND CONCLUSIONSThe cornea is the only human tissue on which nerve structures can be directly inspected by means of in-vivo CCM. Thanks to this instrument, it is possible to evaluate in detail structural features of the SBP such as fiber length, density, branching and tortuosity; it is also possible to explore the characteristics of other corneal layers which may be involved in the changes occurring in diabetes, as in other systemic pathologies70,71.CCM offers important advantages compared with other techniques to measure DN: it is non invasive (as opposed to skin biopsy) and it is independent from patients’ response (compared to esthesiometry). Similarly to biopsy, CCM provides high-quality images of the nerves, but with the strong advantage of analysing the human tissue with the highest nerve density, ie the cornea.Literature on CCM in diabetes clearly showed that some nerve features (density and length) are sensitive to the changes induced by the disease17,30, 33,34,54-65. An effect proportional to the stage of the disease has been also shown in a number of papers30,33,54,56,58,66. Finally, pilot studies on other eye conditions16,72 and studies on patients receiving pancreas transplantation suggest that SBP could be used as a marker to evaluate the efficacy of neuroprotecting treatments better than other exams such as corneal esthesiometry16. As we have seen so far, CCM seems a promising test for evaluation of DN73,74. Nevertheless, this review also highlighted the numerous limits of CCM. Data may be difficult to

delle fibre nervose corneali e le misure consolidate di neuropatia e i fattori di rischio per la malattia erano più elevate quando veniva effettuata una correzione per la tortuosità dei nervi69.c) Riflettività dei nervi De Cillà ha analizzato la riflettività delle fibre confrontandole con le immagini di riferimento e ha scoperto che era significativamente più bassa nei pazienti diabetici rispetto ai controlli (2,3±0,9 vs 2,6±0,9; P=0,04). Questo parametro era significativamente più basso nei pazienti diabetici con retinopatia diabetica proliferativa rispetto ai pazienti senza (2,00±0,8 vs 2,6±0,7; P=0,003). I pazienti affetti da retinopatia proliferativa sottoposti a fotocoagulazione panretinica con laser ad argon hanno dimostrato una minore riflettività rispetto ai pazienti non sottoposti a fotocoagulazione con laser ad argon17.d) Beading (forma “a rosario”) dei nervi Midena ha analizzato il numero di bead (“perline”) del PSB, che è risultato significativamente diminuito nei pazienti diabetici rispetto ai soggetti di controllo (5,6±0,4 vs 12,3±0,4; P<0,0001)55.

DISCUSSIONE E CONCLUSIONILa cornea è l’unico tessuto umano nel quale le strutture nervose possono essere ispezionate direttamente per mezzo della MCC in vivo. Grazie a questa metodica, è possibile valutare nel dettaglio le caratteristiche strutturali del PSB, come la lunghezza delle fibre, la loro densità, la ramificazione e la tortuosità; è anche possibile esplorare le caratteristiche di altri strati corneali che potrebbero essere coinvolti nelle modifiche che intervengono nel diabete e in altre patologie sistemiche70,71.La MCC offre importanti vantaggi rispetto alle altre tecniche utilizzate per misurare la ND: non è invasiva (contrariamente alla biopsia cutanea) ed è indipendente dalla risposta del paziente (in confronto



explore and measure, the exam requires patient cooperation and operator experience. Automated evaluations are developing, but in the current versions they loose useful information and lead to underestimation of parameter such as density and length. Globally, we still need to increase our knowledge on CCM limits and improve its clinical abilities, before considering CCM as a proper marker to diagnose DN, monitor its changes over time and the beneficial effect of treatments.

all’estesiometria). Analogamente alla biopsia, la MCC fornisce immagini dei nervi di elevata qualità, ma con il notevole vantaggio di poter analizzare il tessuto umano con la densità nervosa più alta, ossia la cornea.La letteratura sulla MCC nel diabete ha dimostrato chiaramente che alcune caratteristiche dei nervi (densità e lunghezza) sono sensibili alle modifiche indotte dalla malattia17,30,33,34,54-65. In alcuni articoli di ricerca è stato anche dimostrato un effetto proporzionale allo stadio della malattia30,33,54,56,58,66. Infine, studi pilota su altre condizioni oculari16,72 e studi su pazienti sottoposti a trapianto di pancreas suggeriscono che il PSB potrebbe essere utilizzato come marcatore per valutare l’efficacia dei trattamenti neuroprotettivi, con risultati migliori rispetto ad altri esami come l’estesiometria corneale16. Per quanto visto sinora, la MCC sembra un test promettente per la valutazione della ND73,74. Ciononostante, questa revisione ha anche evidenziato i numerosi limiti della MCC: i dati potrebbero essere difficili da esplorare e misurare e l’esame richiede la cooperazione del paziente e l’esperienza dell’operatore. Sono in via di sviluppo valutazioni automatizzate, ma nelle versioni attuali si perdono utili informazioni che portano a una sottostima di parametri quali la densità e la lunghezza. A livello globale, abbiamo ancora bisogno di incrementare le nostre conoscenze sui limiti della MCC e migliorare le sue abilità cliniche, prima di considerarla come un marcatore adeguato per diagnosticare la ND, monitorarne i cambiamenti nel corso del tempo e gli effetti benefici dei trattamenti.


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