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Evaluation of Hemolysis

Matthew Elkins, MD PhD Upstate University Hospital

Hemolysis Definition:

Disruption of the cell membrane of RBCs  resulting in the release of free hemoglobin Intravascular hemolysis – disruption within  the blood stream with release of RBC contents  into the circulation Extravascular hemolysis – disruption outside  of blood stream (in reticuloendothelial  system)

Hemolysis Sequelae Anemia – decrease in hemoglobin below the  patient’s usual baseline Acute anemia – loss of RBC, usually without loss of   intravascular volume Chronic anemia – long term decrease in RBC mass,  compensation

Pallor, lethargy, diaphoresis, nausea/vomiting,  tachycardia, headache, dizziness, depression,  shortness of breath, high‐output cardiac  failure, death

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Hemolysis Sequelae

Schaer et al. 2013 Blood

Hemolysis Sequelae Free hemoglobin binds to nitric oxide to  form methemoglobin Methemoglobin induces release of  proinflammatory cytokines fromproinflammatory cytokines from  endothelial cells (e.g. IL‐6, IL‐8)  Fever, chills, SIRS

Decrease in NO results in increased  vascular tone and hypercoagulability  resulting in hypertension and stroke

Hemolysis Sequelae

Schaer et al. 2013 Blood

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Hemolysis Sequelae

Acute tubular necrosis

Damage to renal tubule epithelium

Acute, severe back/flank pain Can result in permanent  kidney damage

Hemolysis Sequelae

Schaer et al. 2013 Blood

Causes of Hemolysis Non‐immune hemolysis  Mechanical shearing (artificial heart valve, fibrosis)  Trauma, toxins, infections Abnormal RBC or hemoglobin Microangiopathic hemolytic anemia (MAHA)

 Immune hemolysis Immune hemolysis  Immune destruction of transfused RBCs due to alloantibodies  produced by recipient

 Immune destruction of patient RBCs due to antibodies in  transfused plasma/antibody concentrate (e.g. RhoGam)

 Immune destruction of patient RBCs due to autoantibody

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Hemolysis workup History, physical exam

—Symptoms and duration, PMHx

Hematology Lab tests  ―CBC, Reticulocyte counts, Peripheral smears, Hemoglobin  electrophoresis, Osmotic fragility testing, Bone marrow  evaluationevaluation

 Chemistry Lab tests  ―Haptoglobin, Bilirubin, LDH, Serum‐free hemoglobin,  Urinalysis (hemoglobinuria) 

 Blood Bank Evaluation ―Type and screen, DAT, Eluate, RBC antibody identification 

Hemolysis Work‐up

Is the patient undergoing hemolysis? Haptoglobin Lactate dehydrogenase Bilirubin Serum‐free hemoglobin Urinalysis 

Chemistry Evaluation Haptoglobin Measured by immuno‐turbidometric measurement

Mix patient’s serum with anti‐human  h t l bi Abhaptoglobin Abs

 Resultant aggregate blocks light  transmittance on a spectrophotometer

Hpt is also an acute phase reactant, so may  see increase with inflammation

Hpt is produced from the liver, so low levels  can be seen due to liver failure

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Hemolysis  Anemic? Hemolysis may occur without anemia due to  the capacity of bone marrow to replenish

Patient Evaluation

the capacity of bone marrow to replenish  destroyed RBCs Anemia occurs if hemolysis exceeds  erythropoiesis capacity of the bone marrow High rate of hemolysis Decreased erythropoiesis capacity 

Hematology Lab Tests  Complete Blood Count (CBC) Automated counting of 

–RBCs Platelets–Platelets

–WBCs Determined by size of cellular component Measured using either impedance or light  scatter

Hematology Lab Tests  Complete Blood Count (CBC) Measured by impedance method:  Set up two chambers with maintained electrical current at  set voltage

+‐

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Hematology Lab Tests  Complete Blood Count (CBC) As cells pass through aperture between chambers,  resistance to electrical flow increases in relation to cell  size

 RBC and platelets tested in one reaction  Second sample tested after hydrolysis of RBCs

+‐

Hematology Lab Tests  Complete Blood Count (CBC) Light scatter measured using a flow cytometer Cellular constituents pass through a laser beam  one at a time The light is refracted as it passes through the cell The amount of refraction (spread) correlates to  the size of the cell

Laser Detector

Side scatter used    to quantitate WBC 

Hemolysis  Anemic What is the RBC morphology? RBC h l id i i ht i t th

Patient Evaluation

RBC morphology can provide insight into the  underlying cause of anemia/hemolysis 

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Peripheral Blood Smear

Sample of whole blood is  spread on a glass slide Thin layer of blood isThin layer of blood is  examined microscopically  to evaluate morphology  of platelets, RBCs, and  WBCs

Case 1: Patient Presentation

52 year old woman Recent upper respiratory infection Left frontal headache Gingival bleeding Gross hematuria New ecchymoses bilateral extremities and  petechiae on trunk 

Case 1: Laboratories 13.2

14.4                 7 37.2

LDH 1698, Bilirubin 3.1 Haptoglobin

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Case 2: Peripheral Case 2: Peripheral Blood Blood SmearSmear

Case 2: TTP Thrombotic thrombocytopenic purpura Anti‐ADAMTS13 antibody or congenital defect Directly inactivates ADAMTS13 and causes  increased clearance ADAMTS13 cleaves vWF extra large multimersADAMTS13 cleaves vWF extra‐large multimers Absence of functional ADAMSTS13 results in  abundance of HMW vWF multimers Larger multimers activate platelets  multiple thromboses Platelets used up  thrombocytopenia 

Case 2: TTP Thrombotic thrombocytopenic purpura ADAMTS13 assay:

1:1 Mix

Normal pooled  plasma

Patient  Sample

Dilution (same final conc

Normal >67% activity or 

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Peripheral Blood Smear Schistocytes Remnants of RBCs from intravascular shearing Small platelet‐fibrin clots transiently lodge in  vessels, narrowing vascular channel andvessels, narrowing vascular channel and  causing activation of complement cascade on  vessel wall

Peripheral Blood Smear

Fibrin strands attach to endothelial walls  RBCs passing through the vessels are  transiently bound by these fibrin strands RBCs torn apart Resultant fragments cleared by the spleen 

Microangiopathic Hemolytic Anemias

Pathophysiology Activation of platelets/coagulation cascade in  small vessels resulting in fibrin stranding and  microthrombimicrothrombi Vascular occlusion, hemolysis, consumptive  coagulopathy (platelets and/or coagulation  factors)

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Microangiopathic Hemolytic Anemias Causes  Thrombotic Thrombocytopenic Purpura  Systemic malignancy Malignant hypertension Autoimmune diseases (SLE, PAN)   Severe infection (sepsis, DIC) Drugs – Quinine best example, but many causes

Schistocytes ≠ TTP   Schistocytes = mechanical shearing of RBCs

Non‐MAHA Schistocytes

Marching hemolysis / drummer hemolysis Stenotic heart valves Artificial heart valves

– Peri‐valvular leak – Valvular stenosis – Mechanical valves

LVADs, ECMO, bypass Fibrosis of liver, bone marrow

Peripheral Smear Spherocytes RBC with smaller diameter and no central clearing Caused by either: Lack of functional cytoskeletal components  A tib di ifi ll i i lf RBC tiAntibodies specifically recognizing self RBC antigens

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Peripheral Smear Spherocytes Abs recognized by macrophages in the splenic  sinusoids which phagocytize RBC membrane Both pathways result in loss of cell membrane RBC cytoplasm and membrane equilibratesRBC cytoplasm and membrane equilibrates Anemia results due to clearing of the spherocytes

Peripheral Smear Other RBC morphologies Stomatocytes – hereditary, Rh null  syndrome Acanthocytes (spur cells) – liver disease,  dyslipidemias McLeod phenotypedyslipidemias, McLeod phenotype Echinocyte (burr cells) ‐ renal failure, burns  phosphate deficiency Degmacyte (bite cells/blister cells) – oxidative hemolysis (ex. G6PD deficiency)  resulting in condensation of hemoglobin  which gets removed by macrophages

Peripheral Smear

Sickle cells, HgbC crystals Condensation of abnormal  hemoglobin resulting in  insoluble crystalsinsoluble crystals Distorts cell membrane Intravascular and extravascular hemolysis Chronic inflammatory state

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Hemolysis  Anemic RBC morphology I h l i ?