etude des relations structure/fonction d’une bactériocine anti- listeria ,

Etude des relations structure/fonction d’une bactériocine anti-Listeria,

la mésentéricine Y105

Equipe de Microbiologie fondamentale et appliquée

CNRS-FRE 2224,

Université de Poitiers

Directeur: Pr Jacques Frère

Les bactériocines

• Synthèse ribosomique• Produites par des bactéries• Spectre antagoniste généralement étroit• Immunité• Deux groupes suivant le producteur:

- Gram négatif- Gram positif (bactéries lactiques)

Les bactériocines des bactéries lactiques

• Applications potentielles: clinique, alimentaire, vétérinaire, cosmétique• Classification sur critères physico-chimiques

Classification des bactériocines de bactéries lactiques

(d’après Klaenhammer, 1993)

• Classe I: LantibiotiquesPetits peptides modifiés (nisine)

• Classe II: Peptides thermostables non modifiésIIa: anti-ListeriaIIb: deux composantsIIc: autres peptides (Eijsink et coll., 2002)

• Classe III: Protéines thermosensibles• Classe IV: Complexes

Existence controversée (Nes et coll., 1996)

Bactériocines de la sous-classe IIa:caractères physico-chimiques

• Peptides cationiques

• Thermorésistants

• Taille réduite (37 à 48 résidus)

Bactériocines de la sous-classe IIa:structure

• Non structurés dans l’eau

• Structurés dans environnement mimant la membrane

COOHNH2

Fregeau-Gallagher et coll., 1997

feuillet

hélice

épingle à cheveux

pont disulfure

Bactériocines de la sous-classe IIa:spectre d’activité

• Bactéries proches phylogénétiquement

• Genre Listeria et espèce Enterococcus faecalis

• Autres bactéries à Gram positif

KYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAASAGIHRLANGGNGFW KYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAFSAGVHRLANGGNGFW KNYGNGVHCTKKGCSVDWGYAWTNIANNSVMNGLTGGNAGWHN KYYGNGVSCNKKGCSVDWGKAIGIIGNNSAANLATGGAAGWSK KYYGNGVSCNKKGCSVDWGKAIGIIGNNSAANLATGGAAGWKS KYYGNGVHCGKHSCTVDWGTAIGNIGNNAAANWATGWNAGG ARSYGNGVYCNNKKCWVNRGEATQSIIGGMISGWASGLAGM KYYGNGVSCNKNGCTVDWSKAIGIIGNNAAANLTTGGAAGWNKG AISYGNGVYCNKEKCWVNKAENKQAITGIVIGGWASSLAGMGH VNYGNGVSCSKTKCSVNWGQAFQERYTAGINSFVSGVASGAGSIGRRP TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQAAGGIGQTVVxGWLGGAIPGK ATYYGNGLYCNKQKCWVDWNKASREIGKIIVNGWVQHGPWAPR ATRSYGNGVYCNNSKCWVNWGEAKENIAGIVISGWASGLAGMGH KYYGNGVTCGLHDCRVDRGKATCGIINNGGMWGDIG KYYGNGVSCNSHGCSVNWGQAWTCGVNHLANGGHGGVC KYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGGHQGNHKC KYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGGHQGTHKCTTHSGKYYGNGVYCTKNKCTVDWAKATTCIAGMSIGGFLGGAIPGKC TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC KYYGNGVTCGKHSCSVNWGQAFSCSVSHLANFGHGKC KYYGNGLSCSKKGCTVNWGQAFSCGVNRVATAGHGKx KSYGNGVHCNKKKCWVDWGSAISTIGNNSAANWATGGAAGWKS KYYGNGLSCNKSGCSVDWSKAISIIGNNAVANLTTGGAAGWKS TSYGNGVHCNKSKCWIDVSELETYKAGTVSNPKDILW

YGNGV C C V W A

X > 80%, X < 80%

Mésentéricine Y105Leucocine ALeucocine CMundticine

Mundticine KSSakacine P

Curvacine APiscicoline 126

Carnobactériocine BM1Carnobactériocine B2

Bavaricine MNBactériocine 31

Entérocine PBifidocine B

Sakacine GPédiocine PA-1

CoagulineEntérocine ADivercine V41

Plantaricine 423Plantaricine C19

Listériocine 743ASakacine 5X

Lactococcine MMFII

Consensus

1 10 20 30 40

Bactériocines de la sous-classe IIa:organisation génétique

• En général, déterminants génétiques sur un plasmide

inducteurprotéine kinase

régulateur de réponse

ABC-transporteur

protéine accessoire

prébactériocine

immunité

Transport et maturation

• Système de transport dédié (DTS)• ABC-transporteur et sa protéine accessoire• Hélices transmembranaires• Deux domaines cytoplasmiques:

- hydrolyse ATP- maturation

• Leader à doublet de glycines

prébactériocine

Bactériocine mature

Peptide leader

NC

Extérieur

Intérieur

Membrane

Protéineaccessoire

ATP

ADP + Pi

D’après Simon, 2001

Bactériocines de sous-classe IIa: mode d’action (1)

• Modèles proposés• Intervention d’un récepteur? PTS mannose (Dalet et coll., 2001; Gravesen et coll., 2002)

A. Modèle “en douve de tonneau” ou “barrel-stave”.B. Modèle ”en tapis” ou ”carpet”. (Bechinger, 1999)

B

A


• Partie N-terminale- consensus YGNGV- charges positives- feuillet - premier pont disulfure


• Partie C-terminale- hélice centrale- épingle à cheveux - second pont disulfure- rôle des tryptophanes

Notre modèle: la mésentéricine Y105 (1)

Héchard et coll., 1992

• Peptide de 37 résidus, PM= 3868• Leuconostoc mesenteroides Y105• Séquence proche de celle de la leucocine A• Active contre bactéries des genres Listeria, Leuconostoc, Lactobacillus, Carnobacterium, Pediococcus et Enterococcus

A22F*

I26V*

Christian Lacombe, communication personnelle

* Résidus dans la leucocine A

Notre modèle: la mésentéricine Y105 (2)

• Deux opérons sur le plasmide pHY30

Héchard et coll., 1999

pré-MesB105ABC-transporteur

protéine accessoire

pré-MesY105immunité

?

immunité?

Préambule

• Objectif: étude des relations structure/fonction• Condition: obtenir une collection de MesY105 modifiées

• Moyens à mettre en œuvre:- système efficace de production de peptides- protocole mutagenèse adapté- caractérisation des dérivés obtenus

Production des bactériocines:protéines de fusion

Fusion Maltose Binding Protein (MBP)::MesY105

• Avantages:- E. coli: bactérie facile à manipuler- rendements de production importants- système inductible- purification rapide

Mauvais rendement lié à un clivage inefficace

mesY

pGEM-T3 kpb

mat-mesY

DraI PstI

pDMYC01 3,1 kpb

XmnI

LacZ

PstI

malE

pMal-C2

6,6 kpb

(New England Biolabs)

Site de clivage du polypeptide par le facteur Xa

malE mat-mesY

XmnI/DraI PstI

Ptaq

pDMYC02

Utilisation du système de transport dédié à MesY105

• Expression chez Leuconostoc (Ln.) mesenteroides

• Avantages:- bactérie relativement facile à manipuler- bactériocine mature- sécrétion- purification facilitée

Système de production adéquat

Expression par Ln. mesenteroides:système à deux plasmides

• pDMJF01: transport et maturation

• pDMJF:YI: MesY105 et immunité Immunité mais pas MesY105

• Les deux plasmides simultanément Sécrétion de MesY105

PmesCDEpFBYC04

mesC mesD mesE mesF mesH

mesB-part

mesYmesI

PmesYI

pDMJF01 PmesCDE


mesB-part

mesI

PmesYI

mesY mesI

LeaderTerminateur

RBS PmesYI

pMK4

EcoRI

ori

LacZ

apR

EcoRI EcoRI

pDMJF:YI6,4 kpb

LacZ

apR

ori

mesI

mesY

pFBYC04

EcoRI

Expression par Ln. mesenteroides:Bilan

• Production similaire à la souche sauvage• Production inférieure à DSM20484 (pFBYC04)• Elimination de mesI, mesH et mesF

Production similaire à DSM20484 (pFBYC04) Système satisfaisant pour expression de bactériocines

PmesCDEpFBYC04


mesB-part

mesYmesI

PmesYI

pDMJF01 PmesCDE


mesB-part

mesI

PmesYI

pDMJF03PmesCDE

mesC mesD mesE

PmesYI

Expression hétérologue de peptides

Utilisation du système à deux plasmides

• Production de MesB105• Production de la pédiocine PA-1 • Production d’autres peptides

Peptide Vaso Intestinal

- leader de MesB105 reconnu

- protéine d’immunité codée par mesH

- co-production de MesY105 et MesB105

- promoteur de MesY105 nécessaire

- leader de la pédiocine PA-1 reconnu

Mutagenèse aléatoire par PCR:Mise au point d’un protocole

Un codon muté par séquence codant MesY105 mature

• Conditions particulières de PCR- MnCl2/ MgCl2 = 1/5- déséquilibre en nucléotides (dGTP limitant)

12 séquences mutées sur 40 analysées

Mutagenèse aléatoire par PCR:obtention des peptides dérivés

Sur 12 peptides potentiels, 5 non obtenus- séquences ADN vérifiées- problème de maturation ou sécrétion?

KYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAASAGIHRLANGGNGFW--C-----------------------------------------------S------------------------------------Y--------------------------------------------------C---------------------------------------------C

MesY105Y3CC14SC14YR28CW37C

1 10 20 30

MesY105 et ses dérivés :activité anti-Listeria

• Mes Y105 et dix dérivés testés• Activité antagoniste réduite pour tous les dérivés• Trois groupes en fonction de l’activité

mesY s15f w 18f h8y w 37f a21v h8l g13e a24p r28h mes36

1,0E-10

1,0E-09

1,0E-08

1,0E-07

1,0E-06

1,0E-05

1,0E-04

CM

I (M

)


G13EH8LH8Y

A21VW18F

S15F

W37F37

R28HA24P

KYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAASAGIHRLANGGNGFW-------L------------------------------------Y-----------------------------------------E--------------------------------------F---------------------------------------F---------------------------------------V---------------------------------------P----------------------------------------H---------------------------------------------FKYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAASAGIHRLANGGNGF

MesY105H8LH8YG13ES15F*W18FA21VA24PR28H*W37F

*mes36

1 10 20 30

Dérivés de MesY105 :types de modification

• Encombrement stérique (S15F, A21V, R28H)• Charge (H8Y, H8L,G13E)• Polarité (H8L, S15F)• Point de flexibilité de l’hélice (A21V, R28H)• Résidu casseur d’hélice (A24P)• Résidus à l’interface eau/lipides (W18F, W37F, mes36)

MesY105 et ses dérivés :structure secondaire

• Dichroïsme circulaire en milieu mimant la membrane• Comparaison du degré d’hélicité / MesY105

• Trifluoroéthanol (TFE) Favorise structure en hélice

• Lysophosphatidylcholine (LPC) Lipide zwittérionique formant des micelles

MesY105 et ses dérivés :structure secondaire (2)

• Peptides non structurés dans l’eau • Structuration progressive avec quantités croissantes de TFE• Hélicité différente dans TFE et LPC • Hélicité variable selon le peptide

Hélicité n’est pas seule à déterminer l’activité

%H/MesY105en LPC

%H/MesY105en TFE

MIC/MesY105

MesY105 100 100 1

s15f 97 100 3

w18f 100 76 13

h8y 74 91 20

w37f 90 88 29

a21v 99 78 46

h8l 94 89 52

g13e 78 98 78

a24p 63 50 6000

r28h 36 69 12000

mes36 59 72 16600

G13E H8LH8Y

A21VW18F

S15F

W37F37

R28HA24P

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

180 220 260 300

(nm)

e/ n

(cm

-1.L

.mol

-1

)

0%

90%

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

180 220 260 300

(nm)

e/ n

(cm

-1.L

.mol

-1)

0%

30%

40%

53%

60%

68%

77%

80%

90%

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

180 220 260 300

(nm)

e/ n

(cm

-1.L

.mol

-1

)

0%

MesY105

MesY105 et ses dérivés :interaction avec les micelles (1)

• Fluorescence intrinsèque des tryptophanes• Longueur d’onde d’émission dépend du solvant

• Tryptophanes de MesY105:- exposés au solvant dans tampon aqueux- peu enfouis dans les micelles

Fluorescence intrinsèque de MesY105

0,E+00

5,E+05

1,E+06

2,E+06

2,E+06

300 320 340 360 380 400 420 440

(nm)

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

(U.A

.)

Ri=0 Ri=12,5 Ri=22 Ri=31 Ri=40,5

MesY105 et ses dérivés :interactions avec les micelles (2)

• Trois dérivés avec substitution de tryptophane:- W18 plus enfoui que W37- aromaticité importante en position 37

• Autres dérivés:- trois interagissent très peu: activité faible- interaction similaire à MesY105

Lien entre activité et interaction avec la membrane

G13E H8LH8Y

A21VW18F

S15F

W37F37

R28HA24P

MesY105 et ses dérivés :structure tridimensionnelle

• Modélisation sur la base de la leucocine A- structure similaire à la leucocine A- seul a24p est modifié

• Résonance magnétique nucléaire- résultats préliminaires- partie N-terminale en feuillet

- partie C-terminale à déterminer


MesY105 et ses dérivés :Bilan (partie N-terminale)

• H8L

• H8Y

• G13E

• S15F

Baisse d’activité liée au changement de charge

Pas ou peu d’impact sur l’hélicité

Interactions électrostatiques

Reconnaissance par récepteur?

Pas d’impact sur hélicité ou interaction avec les micelles

Position moins importante

Interaction au récepteur modulée?

G13E H8LH8Y

A21VW18F

S15F

W37F37

R28HA24P

MesY105 et ses dérivés :Bilan (hélice )

•A21V

• A24P

• R28H

Pas de rapport entre activité, hélicité et interaction avec les micelles Point de flexibilité de l’hélice? Interaction au récepteur modulée?

Lien entre activité, hélicité et interaction avec les micelles Point de flexibilité de l’hélice? Positionnement hélice dans membrane?

Lien entre activité, hélicité et interaction avec les micelles

Hélice nécessaire mais pas suffisante

G13E H8LH8Y

A21VW18F

S15F

W37F37

R28HA24P

MesY105 et ses dérivés :Bilan (tryptophanes)

• W18F

• W37F

• mes36

Interface membrane/solvant

W18 plus enfoui que W37

Aromaticité indispensable en position 37

Insertion dans la membrane

W37 stabilise position dans la membrane (épingle à cheveux)

G13E H8LH8Y

A21VW18F

S15F

W37F37

R28HA24P

Conclusion: interaction au récepteur

• Récepteur EIItMan (Gravesen et coll., 2002, Dalet et

coll., 2001)• Interaction récepteur/ partie N-terminale

- rôle de la région conservée• Partie C-terminale module l’interaction

- rôle de A21- spécificité de cible (Fimland et coll., 1996)

G13E H8LH8Y

A21VW18F

S15F

W37F37

R28HA24P

Conclusion: interaction avec la membrane

• Interactions électrostatiques membrane/ région N-terminale

- rôle des charges• W18 et W37 favorisent l’enfouissement de l’hélice• W18, W37 et R28 stabilisent position de l’hélice• Epingle à cheveux• Hélice:

- non-transmembranaire- angle faible d’insertion (Bennik et coll., 1998)

++

W

R

+FW

phase hydrophobe

phase hydrophile

Bactériocine de classe IIa

Bactériocine de classe IIa

PTS EIItMan

Interaction initialeavec le PTS EIIt

Man

Interaction initialeavec le PTS EIIt

Man

Installation dans la membrane

Association de plusieurs molécules

fuite de matériel cellulaire

dissipation de la force protomotriceOuverture du PTS

EIItMan

Destructuration de la membrane

Perspectives (1)

• Structure tridimensionnelle• Mutagenèse dirigée

- A21, R28- point de flexibilité- plus hydrophobe/ hydrophile- épingle à cheveux- résidus clés N-terminaux

Perspectives (2)

• Dichroïsme sur modèles plus réalistes• Interaction récepteur/ peptide • Comparaison des spectres

• Production de peptides à intérêt thérapeutique

ATP

ADP

RRHPK-P RR-P Activation des gènesHPK

IF

Régulation de l’expression

Simon, 2001

• Charge du peptide• Hélicité• Domaines hydrophile et hydrophobe de l’hélice• Composition en lipides• Récepteur?

Antimicrobiens: éléments structuraux

Hélice MesY105MesY105MesY105MesY105MesY105MesY105MesY105MesY105

= 5,64

= 53,3°

= 53,3°

Face apolaire

Face polaire

MesY105MesY105MesY105MesY105MesY105MesY105MesY105MesY105

= 5,64

= 53,3°

= 53,3°

Face apolaire

Face polaire

Hélice flexible

phase hydrophobe

phase hydrophile ++

FW W

Lysophosphatidylcholine

KYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAASAGIHRLANGGNGFW--------------------L------------------------------------N-------------------------------------------K-----------------------------------G----------------------------------I--------------------------T------------------------------------W---------------------------------K------------------------------------H-------------------------------------K------------------------------------H----------------------------------------D------------------------------------Q--------------------

MesY105A21LA21NR28KH27GG25IS15TS15WS12KS12HG13KG13HN17DN17Q

1 10 20 30

Mutagenèse dirigée

etude des relations structure/fonction d’une bactériocine anti- listeria ,

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