Bioq. Mariela B. Monreal

Estudio de

Linfomas No Hodgkin y

Neoplasias de Celulas Plasmaticas

por Citometria de Flujo

Primera Parte

Conceptos Generales

Introducción

Aportes de la Citometria de Flujo

en el estudio de Linfoma

1- Herramienta DIAGNOSTICA

Diferenciar NORMAL – REACTIVO – NEOPLASICO

2- CLASIFICACION

Reconocimiento de ENTIDADES NEOPLASICAS distintas

Relación con el pronóstico

Reconocimiento de grupos de riesgo diferente, nuevos

protocolos de tratamiento

3- Evaluación de EFECTIVIDAD del TRATAMIENTO

Detección de Enfermedad Mínima Residual

Biología Molecular - FISH

Citogenético

Estudio de CMF para en el diagnostico de Linfomas

Enfoque actual

Inmunofenotipo

Biología Molecular - FISH

Citogenético

Sintomas

Presentación Clínica

Morfología / Citoquímica

Resultados de Laboratorio

Cómo / Cuándo solicitar CMF?

La clasificación de la WHO establece la importancia de

la evaluación conjunta de morfología, genética y

fenotipo para la correcta clasificación de diferentes

entidades.

Realizar los estudios en un mismo centro que pueda

CORRELACIONAR datos de las diferentes metodologias

realizadas ES INDISPENSABLE - sobre todo en ciertas

situaciones diagnósticas.

Frecuentemente, NO es necesario /efectivo (costo / beneficio) realizar

varios CMF y/o en diferentes muestras…..

El Consenso Internacional de Citometría (2006, Bethesda) identifica

situaciones clínicas en las que la citometría es UTIL en la identificación de

neoplasia y caracterización de la misma.

Mujer joven, derrame pericárdico

Posteriormente, hematólogo provee MAS DATOS :

gran masa mediastinal , derrame pleural.

Biopsia de tumor derivada a otro centro.

Diferentes centros: Limitación diagnóstica

Citometria de Flujo : una herramienta extremadamente UTIL

…..que necesita de DATOS para realizarse correctamente

Historia clinica (diagnosticos previos!, tratamientos recibidos).Edad, sexo

Indicacion medica actual– datos clinicos, laboratorio…que motivan el

estudio.

Datos de CMF previas !

Las decisiones del TEST de CMF a REALIZARSE son tomadas

en

BASE A ESTOS DATOS

Anemia severa, MDS?

Citometría de Flujo Análisis de células en suspención

Células en suspención

“Marcadas” con

Anticuerpos

Monoclonales

conjugados a

fluorocromos

Células pasan en fila una a una

Rayo Laser

Detectores de luces

Computadora

•Almacenamiento

de datos

•ANALISIS

•Gráficos-Reporte

Identificación de Neoplasia Linfoide de celula B madura

(B- CLPD , B-NHL) . CMF “convencional”

RESTRICCION DE CADENAS LIVIANAS de Ig - K o L

FENOTIPO ABERRANTE – COMPARACION CON FENOTIPO NORMAL

Evaluación de 4 antigenos

Multiples combinanciones con CD19 y CD45

como marcadores comunes

CD19

CD45

Evaluación de fenotipo. Detección de anomalías.

Asociacion a entidades clinico patológicas de la WHO

CD5+ CD10-

PLL

MZL

DLBCL (Richter)

LPL-B

CD5- CD10+

HCL

LPL

MZL

MCL

CD5- CD10- : GRUPO MUY HETEROGENEO

MCL CD5neg ; FCL CD10neg

CD5+ CD10+

Entidades mas infrecuentes

DLBCL

FCL

MCL

CLL

BL

Para cada grupo, CMF ADICIONAL , morfologia y biologia molecular /

citogenetico colaboran en la mejor definicion de las ENTIDADES

CD19

CD20

CD45 Evaluación de 8 antigenos

SIMULTANEAMENTE

MAS INFORMACION

VENTAJAS :

DEFINIR MEJOR LAS PATOLOGIAS (DCO)

MAYOR ESPECIFICIDAD (MRD)

MAYOR SENSIBILIDAD (MRD)

MAS INFORMACION en pocas CELULAS

NUEVA TECNOLOGIA

Evaluación de fenotipo en combinaciones multiples

INFORMACION PANEL 8 COLORES

SITUACION MAS COMPLEJA

SE REQUIERE

UN CAMBIO

PARA ABORDAR ESTA

NUEVA TECNOLOGIA

NUEVA TECNOLOGIA

Evaluación de fenotipo en combinaciones multiples

ESTANDARIZACION TOTAL DE LA METODOLOGIA

RESULTADOS TOTALMENTE COMPARABLES (en el tiempo / entre centros)

LST

LST : TUBO SCREENING para B, T o NK SLP

IDENTIFICA LINFOCITOS ANORMALES Combinacion de 12 anticuerpos monoclonales (8 colores)

LST : TUBO SCREENING para B, T o NK SLP

12 muestras de SP NORMAL , DIFERENTES DONANTES SANOS

A LO LARGO DE DOS MESES

Identificación de Neoplasia Linfoide de celula T madura

FENOTIPO ABERRANTE – COMPARACION CON FENOTIPO NORMAL

SCREENING INICIAL TUBO LST

Fenotipo T sin anomalias

Intensidad de CD3 en celulas CD4 y CD8

Identificación de Neoplasia Linfoide de celula T madura

NEOPLASIAS DE CELULAS T MADURAS

(PERIFERICAS) WHO

PREDOMINANTEMENTE LEUCEMICAS /DISEMINADAS

• Leucemia Prolinfocítica T

• Leucemia de Células Grandes Granulares T

• Leucemia NK Agresiva

• Leucemia/Linfoma T Del Adulto (HTLV-1+)

PREDOMINANTEMENTE NODALES

• Linfoma T Angioinmunoblástico

• Linfoma T Periférico sin otra caracterización (NOS)

• Linfoma De Grandes Células Anaplásico, T o Nulo, Primario Sistémico

PREDOMINANTEMENTE EXTRANODALES

• Micosis Fungoides / Síndrome de Sezary

• Linfoma De Grandes Células Anaplásico, T o Nulo, Primario Cutáneo

• Linfoma T Subcutáneo Paniculítico

• Linfoma Extranodal T/NK, Tipo Nasal

• Linfoma T Intestinal Tipo Enteropatía

• Linfoma T Hepatoesplénico

PANEL EUROFLOW para B-CLPD

CLL MCL

B-CLPD panel APS

CLL vs MCL

1 sIgM 14.02

2 CD200 13.76

3 CD79b 11.94

4 CD23 8.57

5 CD38 7.73

UTILIDAD CLINICA PRINCIPAL

NUEVO ENFOQUE DIAGNOSTICO en base a FENOTIPO

1- El total de la información de los 5 tubos del panel es UNIFICADO en

un solo “TUBO” (unico FILE)

2- El fenotipo TOTAL de la población de interés (por ej, CELULAS B) , se

ubica en una zona de los nuevos gráficos llamados “APS” :

Separador Automático de Poblaciones

UTILIDAD CLINICA PRINCIPAL

NUEVO ENFOQUE DIAGNOSTICO en base a FENOTIPO

B- CLPD panel :

Comparacion de un caso problema vs. varios grupos de referencia

ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL

Conceptos generales

Nuevos regimenes de tratamiento en Linfoma No Hodgkin – B prolongan sustancialmente la SLE (sobrevida libre de enfermedad) y sobrevida global.

Inmunoquimioterapia : Combinaciones de anti CD20 con diferentes regimenes de altas dosis de quimioterapia

Transplante autólogo

Sin embargo, ciertos pacientes sufren de recaídas tempranas.

Es de gran interés predecir tempranamente la duración y calidad de la respuesta, que posibiliten tomar decisiones terapéuticas alternativas.

Después del tratamiento, es posible identificar pacientes con depleción de células neoplásicas a muy bajos niveles (EMR), lo cual se asocia a pronostico favorable.

La erradicación de la enfermedad se plantea actualmente como un objetivo necesario para superar riesgo de recaida o progresion.

CONCLUSIONES

En los últimos 15 años, la citometría de flujo ha evolucionado enormemente como metodología diagnóstica .

Lejos de ser considerada una técnica auxiliar de estudios morfológicos, provee información extremadamente útil y completa, en menos de 24 horas.

La misma debe ser considerada CONJUNTAMENTE con los resultados anatomo-patologicos , para la correcta clasificación de muchas de la entidades ya descriptas.

Los ENORMES avances tecnológicos de los ultimos 5 años, han planteado la necesidad imperiosa de ESTANDARIZACION de esta COMPLEJA metodologia con la que hoy contamos, para lograr aprovechamiento total de los datos, y obtener resultados COMPARABLES entre laboratorios, y a lo largo del tiempo.

ESTE trabajo ha sido lanzado por el grupo EUROFLOW.

El análisis de fenotipo cambia radicalmente a partir de esta propuesta.

Esta NUEVA citometría permite identificar y subclasificar las mayoría de las entidades definidas (WHO actual) , y permitirán el reconocimiento de nuevos grupos de patológías.

Seguimos con fenotipo normal

y algunos ejemplos!