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Tesis Doctoral

Estudio de la evasión de la respuestaEstudio de la evasión de la respuestainmune citotóxica por el Virus de lainmune citotóxica por el Virus de la

Inmunodeficiencia Humana Tipo-1 (HIV-1)Inmunodeficiencia Humana Tipo-1 (HIV-1)y su relación con el tratamientoy su relación con el tratamiento

antirretroviralantirretroviral

Dilernia, Darío A.

2010

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Cita tipo APA:

Dilernia, Darío A.. (2010). Estudio de la evasión de la respuesta inmune citotóxica por el Virus dela Inmunodeficiencia Humana Tipo-1 (HIV-1) y su relación con el tratamiento antirretroviral.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

Cita tipo Chicago:

Dilernia, Darío A.. "Estudio de la evasión de la respuesta inmune citotóxica por el Virus de laInmunodeficiencia Humana Tipo-1 (HIV-1) y su relación con el tratamiento antirretroviral".Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2010.

Universidad de Buenos Aires Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 

 

 

 

Estudio de la evasión de la respuesta inmune citotóxica por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana Tipo‐1 (HIV‐1) y su relación con el 

tratamiento antirretroviral  

 Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área 

CIENCIAS BIOLÓGICAS   

 Lic. Darío A. Dilernia 

  

  Director de tesis: Dr. Horacio Salomón  Consejero de estudios: Dr. Eduardo Arzt  Lugar  de  trabajo:  Centro  Nacional  de  Referencia  para  el  SIDA,  Departamento  de Microbiología,  Parasitología  e  Inmunología,  Facultad  de Medicina, Universidad  de  Buenos Aires      

Ciudad Autónoma de Buenos Aires, 2010

Estudio de la evasión de la respuesta inmune citotóxica por el Virus de la Inmunodeficiencia

Humana Tipo 1 (HIV 1) y su relación con el tratamiento antirretroviral

Introducción. El HIV es el agente causal del SIDA. Entender las formas en las que evade la respuesta inmune del

hospedador es crítico para el desarrollo racional de una vacuna efectiva. Aunque la amplia extensión del

tratamiento antirretroviral es capaz de impactar significativamente en los procesos naturales de selección y

escape, pocos trabajos han estudiado esta temática. El objetivo de esta tesis fue identificar aquellas regiones

virales sometidas a presión de selección inmune y evaluar el impacto del tratamiento antirretroviral en su

selección y persistencia.

Metodología y resultados. Mediante análisis estadístico se identificaron 12 mutaciones virales asociadas a

escape inmune, 6 de ellas en regiones no caracterizadas previamente como epítopes. El análisis de secuencias

obtenidas en los últimos 20 años de epidemia sugirió que varias de ellas han incrementado su frecuencia hasta

estar presentes en la mayoría de las cepas virales actuales. La evaluación de la respuesta inmune péptido

específica mostró reconocimiento principalmente de dos péptidos con restricción para el alelo HLA A02

(A02P65 y A02P84), uno para el alelo HLA A03 (A03P28) y uno para el alelo HLA B07 (B07P357). Para los dos

últimos y para A02P65 se demostró que la variante de escape disminuía el reconocimiento por la respuesta

inmune mientras que, para todos los casos, se evidenció la capacidad de inducir una respuesta polifuncional

secretora tanto de IFN como de IL 2 y MIP 1 . Se evaluó también el nivel de agotamiento inmune y, aunque

la técnica de tetrámeros presentó varios inconvenientes, se detectó una mayoría de respuesta no exhausta en

los casos exitosos. La secuenciación del gen viral gag mostró la presencia de escape viral en la mayoría de los

epítopes analizados y sugirió que la positividad de la respuesta inmunológica estaba asociada a una mayor

afinidad del epítope por el alelo HLA que lo presenta. Al mismo tiempo, el análisis de secuencia de dicho gen

viral en muestras repetidas de 50 pacientes separadas por un promedio de 3 años, demostró la presencia de

recambio activo de variantes virales hacia el estado de escape durante el período de muestreo. Se encontró

también que la selección activa resulta menos frecuente en los pacientes bajo tratamiento y el análisis del virus

en dichos pacientes sugirió que esto sería debido a una reducción significativa de la capacidad evolutiva del

virus en el contexto del tratamiento altamente efectivo. Finalmente, un análisis filogenético más profundo de

las secuencias estudiadas permitió datar el inicio de la epidemia del HIV 1 en Argentina en la primera mitad de

la década de 1970.

Conclusiones. El presente trabajo de tesis permitió caracterizar regiones de la proteína viral Gag de frecuente

reconocimiento inmune sobre las cepas del HIV 1 circulantes en nuestra región y caracterizar su dinámica a

nivel poblacional a lo largo de veinte años de epidemia. El conjunto de datos obtenido de los ensayos

inmunológicos confirma la aproximación estadística para identificar sitios de reconocimiento inmune

demostrando respuestas citotóxicas polifuncionales mientras que el estudio de muestras seriadas en pacientes,

la mayoría de ellos en estados clínicos avanzados, sugiere que la selección del escape viral se extiende más allá

de los primeros momentos de la infección. En este sentido, el inicio del tratamiento puede tener un beneficio

adicional al prevenir dicho escape por reducción significativa de la evolución viral.

Palabras clave: HIV, escape inmune, gag, tratamiento, respuesta citotóxica.

Study of the evasion from the cytotoxic immune response by the Human Immunodeficiency Virus

Type 1 (HIV 1) and its relationship with the antiretroviral therapy

Introduction. HIV is the etiological agent of AIDS. To understand the way the virus evade the immune response

of the host is critical for the rational development of an effective vaccine. Although the expansion of treatment

access is able to shape the natural process of selection and escape, few studies have analyzed this

phenomenon. The objective of the present thesis was to identify viral genomic regions where the virus

undergoes selective immune pressure and to evaluate the impact that the antiretroviral therapy may have in

their selection and persistence.

Methodology and results. A total of 12 viral mutations associated to immune escape were identified, six of

them in regions not previously characterized as epítopes. The analysis of a set of viral sequences obtained from

samples collected in the last twenty years suggested that many of them have increased their prevalence in time

until become the most prevalent state of circulating viral strains. The evaluation of peptide specific immune

response showed that the main targets of immune recognition were located in two HLA A02 restricted

epítopes (A02P65 and A02P84), in a HLA A03 restricted one (A03P28) and in a HLA B07 restricted one

(B07P357). For the last two and also for A02P65 we found that the escape mutations significantly impair

recognition by the immune response. For all of them, the capacity of stimulating a polyfunctional response able

to release IFN , IL 2 and MIP 1 was shown. Also, the evaluation of immune exhaustion through tetramer

technique showed, in spite of many technical inconveniences, a low level of exhaustion in the majority of

successfully analyzed samples. The sequencing of viral gene gag showed the presence of escape in the majority

of the epítopes analyzed and suggested that detection of immune response was associated to a greater affinity

of the epítope for the HLA allele. At the same time, the analysis of the same region in repeated samples

collected from 50 patients within a time period of 3 years showed the presence of active replacement of viral

sequences toward the escape state. That active replacement seems to be associated to the lack of

antiretroviral therapy and the analysis of the virus quasispecies in under therapy patients suggested that the

significant reduction of evolutive capacity of the virus in the context of the effective therapy is likely the reason

for that observation. Finally, a deeper phylogenetic analysis of the sequences under study allowed us to locate

the initiation of the HIV epidemic in Argentina at the first half of the 1970s decade.

Conclusions. The present thesis allowed us to characterize the regions of the viral protein Gag under frequent

immune recognition at the population level and to characterize their dynamics in the last twenty years of

epidemic. The set of data obtained from the immunologic assays confirms the statistical approach of the

identification of sites under immune recognition showing polyfunctional cytotoxic responses while the study of

repeated samples from patients that were in their majority in advanced stages of infection show that selection

of escape not only occurs in the first stages of infection. In this sense, the initiation of treatment could have an

additional benefit in preventing the immune escape by significantly reducing the evolutive capacity of the virus.

Key words: HIV, immune escape, gag, treatment, cytotoxic response

A mi amor Dani,

a mis viejos, mi hermana

y mis abuelos,

y a todos mis amigos

AGRADECIMIENTOS

Quisiera agradecer a las siguientes personas que hicieron posible la realización de la presente tesis

de doctorado:

Al Dr. Horacio Salomón por confiar en mí al darme la posibilidad de desarrollar mi tesis de doctorado

bajo su dirección y por estar siempre dispuesto a apoyarme en todas las iniciativas que surgieron

tanto como parte del presente trabajo como en paralelo.

Al Dr. Leandro Jones por su invaluable aporte al análisis filogenético, y por estar siempre dispuesto a

compartir conmigo sus amplios conocimientos y ayudarme con la mejor predisposición.

A la Dra. Sabrina Rodríguez por el tiempo dedicado a los análisis de corrección filogenética.

Al Dr. Christian Bautista quien siempre aportó significativamente al análisis estadístico, tanto a la

presente tesis como a mi conocimiento general respondiendo mis dudas.

A los Dres. Marcelo Losso, Leonardo Lourtau, Guillermo Vila y a sus colaboradores en el Hospital

Ramos Mejía que fueron parte del presente trabajo, colectando las muestras y los datos

epidemiológicos que permitieron un análisis más completo de los resultados.

A los Dres. John Altman y Eric Hunter, y a sus colaboradores en el Emory Vaccine Center que me

recibieron en su instituto y de los cuales aprendí mucho en solamente un mes gracias a su gran

predisposición y amplio conocimiento.

También al Dr. Pablo Romagnoli, integrante del equipo del Dr. Altman, a quien debo el haber podido

terminar la parte preliminar de los estudios de tetrámeros para lo cual dedicó varios días de trabajo

con el objetivo único de poder ayudarme a finalizar aquello que los tiempos no habían permitido.

A los Dres. Pedro Cahn, Alejandro Krolewiecki, Carina Cesar, Omar Sued y a sus colaboradores en

Fundación Huésped con quienes discutimos todos los aspectos del desarrollo del modelo de Markov

presentado brevemente en esta tesis de doctorado pero que significó varias reuniones en las cuales

siempre mostraron la mejor predisposición a discutir resultados y compartir sus conocimientos.

Finalmente agradezco también a mi familia por estar siempre, a Dani por toda su ayuda en todos los

aspectos posibles, por elegirme y por ser mi apoyo, a mis amigos, Nacho, Marie, Mari, Ceci, Nico,

León (!) que siempre son parte de los mejores momentos de mi vida, y a mis compañeros de trabajo

por la compañía y los mates.

COMUNICACIÓN DE RESULTADOS

Parte de los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis fueron presentados en

congresos nacionales e internacionales y publicados en revistas científicas:

Publicaciones aceptadas

HLA driven Convergence of HIV 1 Viral Subtypes B and F toward the Adaptation to ImmuneResponses in Human Populations. Dario Dilernia, Leandro Jones, S. Rodriguez, G. Turk, A. Rubio, S.Pampuro, M. Gomez Carrillo, C. Bautista, G. Deluchi, J. Benetucci, M. Lasala, L. Lourtau, M. Losso, H.Perez, P. Cahn, H. Salomón. PLoS ONE 2008;3(10):e3429.

Manuscritos en preparación

Founder effect in the origin of HIV 1 epidemics in America. Dario A. Dilernia, Leandro R. Jones, MariaPando, Roberto D. Rabinovich, Gabriel D. Damilano, Gabriela Turk, Andrea E. Rubio, SandraPampurro, Manuel Gomez Carrillo y Horacio Salomon.

Presentaciones en Congresos

Origen de la epidemia del HIV en Argentina. Dilernia, Dario A., Jones, Leandro R., Damilano, GabrielD.; Gomez Carrillo, Manuel, Salomon, Horacio. II Congreso Nacional de SIDA. Salta, Argentina. 26 29agosto de 2009.

Estimation of the year of introduction of subtype F HIV in America that lead to the origin of the BFrecombinant epidemic and the first cases of AIDS. Dario A Dilernia, Leandro Jones, Manuel GomezCarrillo and Horacio Salomón. 5th IAS Conference on HIV Pathogenesis, Treatment and Prevention.Cape Town, South Africa. 19 22 de Julio de 2009.

Evidence of HLA mediated immune response driving the maintenance of CTL escape variants inpatients with undetectable viral load. D. A. Dilernia, L. Lourtau, L. Jones, S. Rodriguez, C. Bautista, M.Gomez Carrillo, M. Losso, H. Salomon. AIDS Vaccine 2008, Cape Town, South Africa. Octubre 2008.

Timely diagnosis of HIV infection reduces mortality in patients on HAART in Argentina. A Markovmodel approach. D. A. Dilernia, C. César, A. Krolewiecki, O. Sued, R. Marone, N. Laufer, M. GomezCarrillo, P. Cahn, H. Salomón. XVII International AIDS Conference, México City, México. 3 8 August2008.

Accumulation of CTL Escape Variants and HLA driven Convergence of Viral Subtypes D. A. Dilernia, LLourtau, L Jones, G Turk, M Gomez Carrillo, C Bautista, J Benetucci, M Losso, P Cahn, and H Salomon.15th Conference in Retroviruses and Opportunistics Infections. Boston, MA, USA. February 2008.

Selección poblacional de variantes de escape del HIV 1 a la respuesta CTL en la Ciudad de BuenosAires Dilernia, D; Lourtau, L; Parlante, Á; Losso, M; Salomón, H. Presentación oral el día jueves 6 deSeptiembre de 2007. CONGRESO NACIONAL DE SIDA. Paraná, 5 al 8 de septiembre de 2007.

Differential HLA dependent HIV evolution among subtypes. Dilernia D.A., Lourtau L., Losso M. andSalmon H. 2006 International Meeting of the Institute of Human Virology. Hyatt Regency, Baltimore,USA. November 2006.

ÍNDICE

Contenido

I. INTRODUCCIÓN.................................................................................................................................. 17

I.1. El Virus de la Inmunodeficiencia Humana tipo 1 (HIV 1) ................................................................ 18

I.2. El inicio de la epidemia en Argentina .............................................................................................. 19

I.3. Características estructurales del HIV 1 ........................................................................................... 20

I.4. El ciclo de replicación ...................................................................................................................... 21

I.5. El curso natural de la infección ....................................................................................................... 23

I.6. El escape a la respuesta inmune ..................................................................................................... 24

I.7. Metodología para la identificación de mutaciones de escape ....................................................... 26

I.8. Dinámica de la selección y transmisión de mutaciones de escape................................................. 27

I.9. Evidencia reciente acerca de la adaptación del HIV a la respuesta inmune poblacional ............... 29

I.10. Breve reseña acerca del tratamiento antirretroviral y el desarrollo de resistencia ..................... 30

I.11. Impacto del fenómeno de resistencia en la terapéutica .............................................................. 31

I.12. Objetivos del proyecto y construcción de la hipótesis de trabajo ................................................ 31

I.12.1. La importancia de estudiar la relación entre el tratamiento antirretroviral y la respuesta

inmune, base de los objetivos de la presente tesis de doctorado. .............................................. 31

I.12.2. El objetivo general ............................................................................................................. 32

I.12.3. La hipótesis de trabajo ...................................................................................................... 32

I.12.4. Los objetivos específicos ................................................................................................... 33

II. MATERIALES Y MÉTODOS.................................................................................................................. 34

II.1. Población bajo estudio ................................................................................................................... 35

II.2. Procesamiento de las muestras ..................................................................................................... 35

II.3. Congelado de células...................................................................................................................... 36

II.4. Descongelado de células ................................................................................................................ 36

II.5. Medición de los valores de Carga Viral .......................................................................................... 36

II.6. Medición de los valores de CD4 ..................................................................................................... 37

II.7. Medición de los niveles de activación del sistema inmune ........................................................... 37

II.8. Generación de líneas autólogas de linfocitos B ............................................................................. 37

II.9. Extracción de ácidos nucleicos....................................................................................................... 38

II.9.1. Extracción de ADN .............................................................................................................. 38

II.9.2. Extracción de ARN a partir de muestras con carga viral detectable .................................. 39

II.9.3. Extracción de ARN a partir de muestras con carga viral indetectable ............................... 39

II.10. Caracterización de los genes HLA................................................................................................. 39

II.11. Amplificación de Ácidos Nucleicos............................................................................................... 40

II.11.1. Primers utilizados ............................................................................................................. 40

II.11.2. Amplificación a partir de ARN viral – Nested RT PCR....................................................... 40

II.11.3. Amplificación utilizando enzima polimerasa de alta fidelidad de copia .......................... 41

II.12. Clonado de secuencias virales...................................................................................................... 41

II.13. Secuenciación............................................................................................................................... 41

II.14. Análisis Filogenético ..................................................................................................................... 42

II.14.1. Secuencias de referencia.................................................................................................. 42

II.14.2. Alineamiento de secuencias ............................................................................................. 42

II.14.3. Análisis de similitud .......................................................................................................... 43

II.14.4. BootScanning.................................................................................................................... 44

II.14.5. Árboles Filogenéticos ....................................................................................................... 44

II.14.6 Estimación del tiempo al ancestro común más cercano (TACMC).................................... 45

II.15. Análisis estadístico ....................................................................................................................... 46

II.15.1. Análisis para la identificación de potenciales mutaciones de escape CTL ....................... 46

II.15.2. Corrección filogenética..................................................................................................... 47

II.15.3. Análisis de tendencias en el tiempo ................................................................................. 47

II.16. Medición de los niveles de respuesta inmune HIV especifica ..................................................... 48

II.16.1. ELISPOT para IFN . .......................................................................................................... 48

II.16.2. Estimulación in vitro / análisis por citometría de flujo..................................................... 49

II.16.3. Marcación de CTLs péptido específicos mediante la técnica de tetrámeros................... 50

II.17. Desarrollo del modelo de Markov de la epidemia del HIV 1 ....................................................... 53

III.RESULTADOS ..................................................................................................................................... 55

III.1. Características de la población bajo estudio................................................................................. 56

III.2. Identificación de mutaciones de escape CTL ................................................................................ 58

III.2.1. Los primeros análisis de asociación estadística................................................................. 58

III.2.2. Comparación de las mutaciones identificadas con los epítopes conocidos del HIV ......... 60

III.2.3. Corrección filogenética de las asociaciones encontradas ................................................. 60

III.2.4. Análisis de la prevalencia de las mutaciones identificadas a lo largo de la epidemia del

HIV en Argentina .......................................................................................................................... 60

III.2.5. Análisis de substituciones sinónimas y no sinónimas ....................................................... 63

III.2.6. Identificación de otras mutaciones cuya prevalencia cambió significativamente en el

tiempo .......................................................................................................................................... 63

III.2.7. Análisis estadístico global de las tendencias en el tiempo de las mutaciones asociadas a

escape........................................................................................................................................... 64

III.3. Estudio de la respuesta inmune HIV específica en la población bajo estudio.............................. 70

III.3.1. Evaluación del estado de activación inmune general ....................................................... 71

III.3.2. Estrategia para el análisis de respuesta inmune epítope específica................................. 73

III.3.3. Evaluación de la frecuencia de reconocimiento de los epítopes bajo estudio ................. 73

III.3.4. Comparación de la respuesta a los péptidos salvajes y mutados ..................................... 78

III.3.5. Confirmación de la respuesta citotóxica específica frente a los epítopes estudiados...... 81

III.3.6. Caracterización del nivel de agotamiento de la respuesta epítope específica ................. 87

III.4. Evaluación del impacto del tratamiento antirretroviral ............................................................... 92

III.5. Análisis filogenético de las secuencias estudiadas y el inicio de la epidemia en Argentina ......... 98

IV. DISCUSIÓN...................................................................................................................................... 105

IV.1. Las mutaciones de escape en las variantes del HIV en Argentina .............................................. 106

IV.2. El HIV 1 Subtipo B de Argentina acumuló mutaciones que favorecen la evasión a la respuesta

inmune luego de su introducción desde Norteamérica...................................................................... 106

IV.3. La acumulación de las mutaciones observadas no estaría relacionada con el desarrollo del

tratamiento antirretroviral de las últimas décadas ni con el estadío clínico de la infección.............. 108

IV.4. Las mutaciones de escape han presentado tres comportamientos distintos en el tiempo....... 109

IV.5. La acumulación de escape ocurre en sitios capaces de evolucionar adaptativamente ............. 110

IV.6. La acumulación de estas mutaciones podría conducir a una convergencia de subtipos virales

mediada por la selección inmune ....................................................................................................... 110

IV.7. La evidencia inmunológica apoya las predicciones del análisis estadístico................................ 111

IV.8. Las mutaciones de escape impactarían en el reconocimiento de maneras dependiente de su

posición relativa al sitio de anclaje del epítope .................................................................................. 112

IV.9. Las mutaciones de escape se seleccionan también en estadíos tardíos de la infección y el inicio

del tratamiento podría prevenir este fenómeno................................................................................ 114

IV.10. Breve discusión acerca del origen de la epidemia del HIV 1 en Argentina .............................. 115

IV.11. Conclusiones finales.................................................................................................................. 117

V. REFERENCIAS................................................................................................................................... 119

VI. ANEXOS .......................................................................................................................................... 129

VI.1. ANEXO I – Detalle de los pacientes incluidos en el análisis de asociación genética y

polimorfismos virales enrolados en la primera etapa. ....................................................................... 130

VI.2. ANEXO II Detalle de las características de las segundas y terceras muestras tomadas en la

segunda etapa. .................................................................................................................................... 133

VI.3. ANEXO III –OUTPUT del análisis de corrección filogenética ....................................................... 135

VI.4. ANEXO IV – INPUT y OUTPUT del análisis de medidas repetidas ............................................... 136

VI.5. ANEXO V – OUTPUT del análisis estadístico de la respuesta basal de linfocitos CD3+/CD8+ frente

a líneas B no sensibilizadas ................................................................................................................. 142

VI.6. ANEXO VI – Detalle de las secuencias peptídicas encontradas en las distintas muestras junto con

el análisis de predicción y afinidad de epítopes.................................................................................. 144

VI.7. Anexo VII – Validación del modelo de Markov de la epidemia del HIV...................................... 148

LISTA DE TABLAS Y FIGURAS

FIGURAS

Figura I.1. Historia evolutiva de los lentivirus de primates.

Figura I.2. Mapa de HXB2, secuencia referencia del HIV 1 subtipo B.

Figura I.3. Esquema del virión maduro del HIV 1 rodeado por las proteínas virales estructuralmentecaracterizadas presentes en dicho virión

Figura I.4. Pasos claves del ciclo de replicación del HIV 1.

Figura I.5. Variación de los valores de CD4 y Carga Viral (CV) (marcadores del curso de la infección porHIV 1) con el progreso de la infección hacia SIDA.

Figura I.6. Los reservorios virales del HIV 1 y su contribución a los niveles de viremia.

Figura I.7. Dinámica de la replicación viral del HIV 1 in vivo.

Figura I.8. Esquematización del principio de asociación entre polimorfismos virales y alelos de losgenes HLA cuando el polimorfismo es una mutación de escape a la respuesta inmune mediada porestos genes.

Figura I.9. Prevalencia de la mutante de escape I135X al alelo B51 en un estudio de 9 cohortes conmás de 2800 individuos.

Figura II.1. Análisis de similitud realizado mediante el programa Simplot 2.5.

Figura II.2. Análisis de BootScanning realizado mediante el programa Simplot 2.5

Figura III.1. Histograma de la frecuencia de muestreo en los 3 años que duró la recolección demuestras de la primera etapa. En rojo se detallan aquellos pacientes donde se realizó lacaracterización de los genes HLA A y HLA B.

Figura III.2. Histograma de edad de los 395 pacientes incluidos en el estudio al momento de toma demuestra

Figura III.3. Resultados de caracterización de los alelos de los genes HLA A y HLA B comparados con laprevalencia en la población general.

Figura III.4. Árbol filogenético construido mediante el método de distancia de Neighbor Joining parael gen viral gag sobre el conjunto de muestras analizadas

Figura III.5. Tendencias en el tiempo de los polimorfismos identificados como potenciales mutacionesde escape CTL por análisis estadístico.

Figura III.6. Resultados del análisis de identificación de sitios bajo presión de selección positiva.

Figura III.7. Tendencias en el tiempo de los polimorfismos identificados como potenciales mutacionesde escape CTL por el análisis de tendencia.

Figura III.8. Frecuencia media de las mutaciones de escape a lo largo del tiempo.

Figura III.9. Tendencia en el tiempo de las mutaciones de escape identificadas mediante asociacionesnegativas en los subtipos virales B y F.

Figura III.10. Frecuencia de recolección de primeras, segundas y terceras muestras a lo largo deltiempo.

Figura III.11. Valores medidos de Carga Viral y conteo de células CD4 en el conjunto de primeras ysegundas muestras recolectadas.

Figura III.12. Estrategia de análisis de los niveles generales de activación de la respuesta inmune.

Figura III.13. Valores medidos de activación general de respuesta inmune CD4 y CD8.

Figura III.14. Distribución de los valores medidos en los ensayos de ELISPOT para todas las muestrasanalizadas.

Figura III.15. Proporción de respuesta frente a los péptidos evaluados en ensayos de ELISPOT.

Figura III.16. Respuesta al epítope A02P65 en las muestras F197 y F048.

Figura III.17. Respuesta al epítope A02P84 en las muestras F037, F174 y F048.

Figura III.18. Respuesta al epítope A03P28 en las muestras F197 y F289.

Figura III.19. Respuesta al epítope B07P357 en las muestras F030 y F060.

Figura III.20. Respuesta al epítope B40P218 en la muestra F026.

Figura III.21. Estrategia de análisis mediante tinción con Ioduro de Propidio.

Figura III.22. Estrategia de análisis de polifuncionalidad de la respuesta péptido específica de CMSPsobre líneas B sensibilizadas.

Figura III.23. Resultados obtenidos en los ensayos de polifuncionalidad para péptidos específicos enpacientes previamente caracterizados en la sección 3.3.

Figura III.24. Resultados obtenidos en los ensayos adicionales de polifuncionalidad.

Figura III.25. Control de síntesis de tetrámeros en Gel SDS PAGE luego del tratamiento conEstreptavidina (SAV).

Figura III.26. Perfil FSC vs SSC para las muestras seleccionadas para el análisis de tetrámeros.

Figura III.27. Estrategia de análisis utilizada para distinguir células individuales de agregadas.

Figura III.28. Resultados obtenidos del análisis de tetrámeros.

Figura III.29. Resultados del análisis in sílico de afinidad frente a la magnitud de respuesta en ensayosde ELISPOT.

Figura III.30. Comparación de las variantes salvajes y mutadas encontradas en las primeras ysegundas muestras.

Figura III.31. Perfil de respuesta medido en los ensayos de ELISPOT según el estado (salvaje omutado) de los distintos epítopes bajo estudio

Figura III.32. Reconstrucción filogenética de las quasiespecies virales en cuatro pacientes.

Figura III.33. Esquema de las regiones genómicas virales bajo análisis.

Figura III.34. Reconstrucción filogenética del subtipo F.

Figura III.35. Reconstrucción filogenética del subtipo B.

Figura III.36. Reconstrucción filogenética de la región de subtipo B en la CRF12_BF.

Figura III.37. Estimación del tiempo al ancestro común más cercano (TACMC).

TABLAS

Tabla II.1. Lista de primers utilizados.

Tabla II.2. Secuencias de referencia de subtipos virales utilizadas para realizar los análisisfilogenéticos de caracterización de subtipo viral.

Tabla III.1. Resumen de las 22 mutaciones potenciales de escape CTL identificadas por análisisestadístico

Tabla III.2. Resumen de los 12 polimorfismos que han cambiado significativamente su prevalencia enel tiempo durante los últimos 20 años de epidemia

Tabla III.3. Resumen del análisis estadístico de medidas repetidas y de efectos simples.

Tabla III.4. Detalle del análisis de contrastes para la comparación de a pares de prevalencia demutaciones de escape entre los distintos tiempos.

Tabla III.5. Detalle de los péptidos sintetizados

Tabla III.6. Resumen de los resultados obtenidos en los ensayos de ELISPOT de respuesta péptidoespecífica.

Tabla III.7. Resumen de los epítopes sugeridos en la tabla III.2. y confirmados en los ensayos deELISPOT

Tabla III.8. Diseño experimental para la detección de citoquinas intracelulares en linfocitosCD3+/CD8+ péptido específicos.

Tabla III.9. Magnitud de respuesta a los controles con líneas B no sensibilizadas.

Tabla III.10. Detalle de las muestras seleccionadas para analizar con la técnica de tetrámeros

Tabla III.11. Resumen de los resultados obtenidos del análisis de tetrámeros.

Tabla III.12. Detalle de los estadísticos obtenidos en los análisis filogenético por el método bayesiano

I. INTRODUCCIÓN

I.1. E

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de las

Amér

El Virus de

rus de la In

nodeficienci

[1]. Aunque e

983 [4] exist

es el virus y

bilidad gené

conduce a la

variabilidad

encia y un nú

s últimas su

minación en

similares.

V de distribu

s cepas de d

rica (aquella

la Inmuno

munodeficie

ia Adquirida

el SIDA fue d

te un tiemp

a se encont

tica resultad

a generación

se ve refleja

úmero siemp

urgen de ev

la población

ución cosmop

dicho grupo f

as responsab

odeficienci

encia Human

(SIDA) y la c

descubierto

o de circula

traba circula

do de la eleva

de genoma

ada en la exi

pre creciente

ventos de r

n. En la figura

polita se enc

fue estimado

bles de las in

18

ia Humana

na Tipo 1 (H

causa de mue

en 1981 [2,3

ación críptica

ando en la p

ada tasa de e

s progenie c

istencia de 9

e de Formas

recombinació

a I.1 se mues

cuentra en el

o alrededor d

nfecciones q

a tipo 1 (HI

HIV 1) es el

erte de alred

3] y el HIV re

a (no detect

población hu

error de su e

con secuenci

9 subtipos di

Recombinan

ón entre su

stra la divers

Figura I.1. H

primates. S

filogenéticos

los grupos N

virales de est

l llamado gru

de 1930 [6] y

que conduje

IV 1)

agente etio

dedor de 2 m

econocido co

tada) de var

umana. El H

enzima Trans

ia distinta a

istintos ident

ntes Circulan

ubtipos disti

sidad del HIV

Historia evolu

Se detallan

s relacionados

N, O y M de

te último grup

upoMain, o

y la llegada d

ron al descu

ológico del S

millones de p

omo el agent

ias décadas

IV 1 presen

scirptasa Rev

la del genom

tificables po

ntes (CRFs) id

intos y la s

V y su relació

utiva de los

en rojo

s con el HIV: E

el HIV 1 con

po.

grupo M. El

de cepas del

ubrimiento d

Síndrome de

personas por

te etiológico

durante las

ta una gran

versa (RT)[5]

ma parental.

or análisis de

dentificadas.

subsiguiente

ón con otros

lentivirus de

los grupos

El HIV 1 y 2, y

los subtipos

surgimiento

l subtipo B a

del virus) se

e

r

o

s

n

]

.

e

.

e

s

e

s

y

s

o

a

e

estim

casos

que h

y en p

I.2. E

En A

ident

detec

ocurr

nunc

aque

epide

han d

varia

casos

que

desco

La ci

Suda

Mien

recom

preva

regio

mayo

genó

Con r

de m

de la

fuera

1980

come

ma que ha oc

s de SIDA fu

haber ocurrid

particular ba

El inicio de

rgentina los

tificado por p

ctados en n

rido en los E

a fue analiz

llos primero

emiológicos.

demostrado

ntes de subt

s importados

la introducc

onocido.

rculación de

mérica aunq

tras que en

mbinantes B

alencia de va

nes genómi

oría de las

micas de sub

respecto al i

etodologías

década de 1

a el caso tam

no podria

enzaron a se

currido hacia

eran detect

do ya que ce

ajo la forma d

e la epidem

s primeros c

primera vez

uestro país

Estados Unid

ado profund

os casos ocu

En este pun

que la epide

tipo B y un 5

s de los Esta

ción del sub

e recombina

que la prev

n Argentina

F como se m

ariantes del s

cas de subt

recombinan

btipo F.

nicio de las

filogenética

1960, el prim

mbién para A

ser explica

er detectado

a finales de la

ados. Una s

epas del subt

de recombin

mia en Arge

casos de SID

en los Estad

eran “impo

dos. Sin emb

damente y e

urrieron en l

nto, resulta i

emia del HIV

0% de recom

dos Unidos

btipo F así c

antes BF es

valencia de

circulan e

mencionó an

subtipo B y l

tipo B [14 1

tes BF de A

epidemias, d

s el origen d

mero, y en e

Argentina, la

ada. Estas o

os al mismo

19

a década de

egunda intro

tipo F tambi

nantes con el

entina

DA fueron d

dos Unidos. S

ortados”, es

bargo, el or

el único con

los comienzo

importante

V en Argenti

mbinantes en

solamente e

como el sur

s una caract

los distintos

n igual prev

nteriormente

as recombin

17]. Esta últi

Argentina es

dos estudios

de las epidem

l comienzo d

a elevada pr

observacion

tiempo en

1960 [7], va

oducción de

én circulan e

l subtipo B [8

detectados b

Siempre se s

decir, el re

igen de la e

nocimiento h

os de la déc

recordar que

na está cons

ntre los subt

explicarían el

gimiento de

terística com

s subtipos p

valencia tan

e, en Brasil e

antes BF est

ima observa

stán constit

s previos rea

mias de subt

de la década

revalencia de

es sugieren

ambos país

arios años an

l HIV al con

en alta preva

8 10].

brevemente

supuso que

esultado de

epidemia de

hasta el mo

cada de 198

e varios estu

stituida por a

ipos B y F [9

l 50% de nue

e las recomb

mún de las

parece difer

nto variante

en cambio, p

tán conforma

ación resulta

tuidas princi

alizados en B

ipo B y F en

de 1980 el

e recombina

que, aunq

es, deben e

ntes de que l

tinente Ame

alencia en el

después de

aquellos prim

infecciones

l HIV en nu

omento cons

80 basados

udios de dive

alrededor de

,11 13]. Por

estra epidem

binantes BF

epidemias

rir entre reg

es del subti

parece haber

adas princip

a interesant

ipalmente p

Brasil estima

ese país en

segundo [18

antes BF a m

que los cas

existir difere

los primeros

ericano tuvo

continente,

e que fuera

meros casos

que habían

estra región

siste en que

en registros

ersidad viral

e un 50% de

lo tanto, los

mia mientras

permanece

del HIV en

giones [12].

po B como

r una mayor

almente por

e porque la

por regiones

ron a través

el comienzo

8,19]. Si este

mediados de

os de SIDA

ncias en los

s

o

,

a

s

n

n

e

s

l

e

s

s

e

n

.

o

r

r

a

s

s

o

e

e

A

s

prime

difere

I.3. C

Como

El de

y el d

acces

geno

Fig

Las c

bicap

trans

env).

de la

eros evento

entes.

Característ

o todos los r

las proteína

de las prote

sorias compl

ma viral con

gura I.2. Map

fin del ma

aracterística

pa lipídica d

smembrana (

En su interi

cápside (CA,

os de la co

ticas estruc

etrovirus, el

as estructura

eínas de env

letan el conj

los marcos a

pa de HXB2, se

arco abierto de

posiciones en

as generales

erivada de

(TM (gp41),

or contiene

, gen gag).

lonización q

cturales de

HIV 1 posee

les interiore

voltura (Env

junto de 9 g

abiertos de l

ecuencia refe

e lectura de c

n el genoma d

del virión d

la membran

gen env) y u

una cápside

20

que conduje

el HIV 1

e un genoma

es (Gag), el c

). Otros 6 g

genes que lo

lectura de lo

rencia del HIV

ada gen. El HX

el HIV 1, por e

el HIV pued

na de la cél

unida a ella

e cónica prot

Figura I.3.

las proteín

presentes

eron luego

a de ARN cod

odificante pa

genes codific

constituyen

os genes viral

V 1 subtipo B

XB2 es utilizad

ejemplo, punt

en observas

lula hospeda

la glicoprote

teica constit

Esquema del

nas virales est

en dicho virió

a epidemio

dificante par

ara las prote

cantes para

n. En la figur

les.

. Se detalla la

do como refer

tos de recomb

se en la figu

adora, pose

eína de supe

uida por 200

l virión madu

tructuralmen

ón.

ologías mole

ra tres genes

eínas de repl

proteínas d

ra I.2. se esq

posición de c

rencia para in

binación.

ra I.3. Envue

e en ella a

erficie (SU (g

00 copias de

ro del HIV 1 r

te caracteriza

eculares tan

s principales:

icación (Pol)

enominadas

quematiza el

comienzo y

dicar

elto por una

la proteína

gp 120), gen

e la proteína

rodeado por

adas

n

:

)

s

l

a

a

n

a

Entre

por 2

posit

nucle

rever

empa

infect

I.4. E

El cic

Inicia

de s

inmu

tropis

blanc

e la bicapa li

2000 unidade

iva estabiliza

eocápside (N

rsa (RT, gen

aquetan en e

tada.

El ciclo de r

lo de replica

almente se p

u proteína

noglobulina

smo por los

co principale

pídica y la cá

es. Dentro d

adas como c

NC, gen gag)

pol) y la inte

el virión mie

replicación

ción del HIV

Figur

produce la ad

de superfic

N terminal

linfocitos “T

es, entre otro

ápside se en

e la cápside

complejo rib

) y tres enzi

egrasa (IN, g

entras que la

n

V sigue los pa

ra I.4. Pasos c

dsorción de

cie (gp120)

de la molécu

T helper” (CD

os grupos ce

21

ncuentra la p

se encuentr

bonucleoprot

imas esencia

gen pol). Las

as proteínas

asos clásicos

laves del ciclo

la partícula v

con el rec

ula de CD4. C

D4+), por los

elulares. Per

proteína de l

ran dos copi

teico con un

ales: la prot

proteínas a

Vpu, Tat y

de un retrov

o de replicació

viral a la célu

ceptor celul

Como conse

s macrófagos

ro a diferenc

la matriz (M

as del genom

nas 2000 cop

teasa (PR, ge

ccesorias, N

Rev solo se

virus, detalla

ón del HIV 1.

ula blanco a

lar, en este

cuencia de e

s y por las cé

cia de otros

A, gen gag),

ma de ARN d

pias de la pr

en pol), la t

ef, Vif y Vpr

encuentran

do en la figu

través de la

e caso, el

este hecho, e

élulas dendr

retrovirus, l

, constituida

de polaridad

oteína de la

transcriptasa

r también se

en la célula

ura I.4.

a interacción

dominio de

el HIV posee

ríticas, como

os lentivirus

a

d

a

a

e

a

n

e

e

o

s

de p

prom

Luego

que c

conte

geno

las pr

Una v

comp

asoci

activi

La fas

proce

Rev.

proce

por la

RT e

Las p

mens

prote

tamb

la de

virale

funci

Para

intera

Aprox

encap

las pr

rimates req

mover la fusió

o de la fusió

consiste en

eniendo el g

ma de ARN

roteínas NC.

vez retrotran

plejo de pre

ación con p

idad catalític

se tardía del

esados por s

Tat actúa

esados llegu

a enzima vir

IN.

proteínas de

sajero viral

easas celular

bién son sinte

gradación d

es de envoltu

onal gp41 gp

producir la

actúa direct

ximadament

psida dos co

roteínas MA,

uieren prote

ón. Para el H

n de membr

el desensam

genoma al in

a ADN lleva

nscripto el ge

eintegración

proteínas cel

ca de la enzim

ciclo de rep

splicing. Los

como facto

en al citopla

al PR para d

e envoltura

procesado q

res para gen

etizadas en e

e las misma

ura inhibiend

p120[23].

partícula v

tamente con

te 1200 a 2

opias de geno

, CA y NC res

eínas de su

IV estas prot

ranas y la pe

mblado de l

nterior celu

do a cabo p

enoma a ADN

compuesto

lulares. Lueg

ma viral IN.

plicación com

primeros so

r de transc

asma para po

ar, por un la

son sintetiz

que codifica

nerar las pro

el RE es impo

s, que de ot

do su translo

viral, el extr

n la membr

2000 copias

oma viral. Su

sultando así

22

perficie adic

teínas son lo

netración de

la cápside y

lar. Al mism

principalment

N, es llevado

por el geno

go, el genom

mienza con la

on los codific

cripción pot

oder sintetiz

ado, la polipr

zadas en el

a para una p

oteínas viral

ortante el ro

tra forma int

ocación a la

emo miristo

rana celular

de Gag bro

ubsecuentem

una partícula

cionales de

os quimiorrec

e la nucleocá

y la liberació

mo tiempo se

te por la en

o al núcleo ce

oma viral (a

ma viral es

a síntesis de

cantes para

enciándola.

zar el precur

roteína viral

Retículo En

poliproteína

les gp41 y g

ol de las prot

teractuarían

membrana

olado del do

r y con la c

otan para fo

mente la pro

a viral madu

e la membra

ceptores CXC

ápside se pro

ón del comp

e produce l

zima viral RT

elular por tra

ahora ADN),

integrado al

transcriptos

las proteínas

Rev permit

rsor proteico

Gag y por o

ndoplasmáti

(gp160) qu

gp120. Como

eínas virales

prematuram

celular o la

ominio MA

cola citoplas

ormar una p

teína viral P

ra e infectiva

ana viral y

CR4 y CCR5 [

oduce el des

plejo ribonuc

a retrotrans

T pero acom

ansporte act

, la RT, MA

l genoma ce

s mARN proc

s regulatoria

te que tran

o Gag pol qu

otro lado las

co (RE) a p

ue luego es

o las molécu

s Nef y Vpu e

mente con la

formación d

de la polip

smática de

partícula inm

R cliva a Gag

a.

celular para

20 22].

nudamiento

cleoproteico

scripción del

mpañado por

ivo como un

y la IN, en

elular por la

cesados y no

as Nef, Tat y

nscriptos no

ue es clivado

enzimas PR,

partir de un

clivada por

ulas de CD4

en promover

as proteínas

del complejo

roteína Gag

gp41 (TM).

madura que

g generando

a

o

o

l

r

n

n

a

o

y

o

o

,

n

r

4

r

s

o

g

.

e

o

I.5. E

Al mo

aume

aume

un pe

mom

dismi

lo lar

Los m

concl

deple

efect

que e

de un

Como

prote

linfoc

dend

del v

tipo d

La re

célula

El curso na

omento de l

enta bruscam

ento de CV y

eríodo de va

mento el valo

inuirán abru

go del curso

mecanismos

luyente. Exis

eción de linf

o más impo

es el deterio

na respuesta

o se mencion

eínas celular

citos T help

ríticas. Todo

irus en el o

de régimen a

plicación vir

as susceptib

atural de la

a infección p

mente y es a

y la reduce a

rios años du

or de CV aum

ptamente. E

de la infecc

por los cu

sten dos teo

focitos CD4

ortante causa

oro de las fun

inmune abe

nó anteriorm

res que le pe

per (CD4+)

os los tipos c

rganismo en

antirretrovira

ral en las cél

les, pero dic

a infección

por el HIV la

compañado

un nivel rela

rante el curs

mentará rápi

En la figura I.

ión por el HI

uales el HIV

orías acerca d

resultante d

al de la enfe

nciones celu

errante.

mente, el tro

ermiten ingr

si no tamb

celulares afe

nfrentando t

al.

ulas T CD4 e

chas células i

23

cantidad de

por una fue

ativamente e

so natural de

damente al

.5. se esquem

V 1.

V causa la e

de los mism

de la infecci

ermedad no

ulares inducid

opismo del H

resar a la cé

bién macrófa

ectados jueg

toda respues

es más eficie

infectadas n

e virus en pla

erte respuest

estable alred

e la infección

mismo tiem

matiza la evo

enfermedad

os. Una afir

ón por el v

es la misma

das indirecta

HIV 1 está de

élula. Así, el

agos, célula

gan un papel

sta inmune

ente y rápida

o sobreviven

asma (medid

ta inmune cit

dedor del cu

n hasta la pr

po que los n

olución de lo

no se han

ma que la c

irus. La otra

a muerte de

amente por

eterminado p

HIV 1 no só

as dendrítica

l muy impor

montada po

Figura

valores

(marcad

infecció

progres

SIDA.

a que en cua

n más de un

do como car

totóxica que

al permanec

ogresión a S

niveles de lin

os valores de

identificado

ausa es dire

a teoría sost

e los linfocito

el virus, tal

por la distrib

ólo es capaz

as y células

rtante en la

or el hosped

I.5. Variaci

de CD4 y Car

dores del c

ón por HIV

o de la inf

alquiera del

o o dos días

rga viral, CV)

e contiene el

cerá durante

SIDA. En este

nfocitos CD4

e CD4 y CV a

o de forma

ectamente la

tiene que el

os CD4 si no

vez a través

bución de las

z de infectar

s foliculares

persistencia

ador y todo

ión de los

rga Viral (CV)

curso de la

V 1) con el

ección hacia

resto de las

s funcionales

)

l

e

e

4

a

a

a

l

o

s

s

r

s

a

o

s

)

a

l

a

s

s

para

podrí

que

infect

mues

nivele

Estud

mant

fase G

activo

pero

cualq

respu

de va

grand

I.6. E

Los e

virem

mantener u

ía erradicar

se hubiera

tadas. Es en

stran los dist

es de carga v

dios realizado

teniendo una

G1 son foco

os. Por otro

no permisiv

quier evento

uesta inmun

arios años a

des responsa

El escape a

estudios de d

mia observad

una replicac

el virus del

producido

este aspecto

tintos tipos c

viral.

os indicarían

a producción

s de una baj

lado, los lin

vos a la rep

que los activ

e) se convie

l igual que l

ables de la im

a la respue

dinámica de

dos frente a

ción viral. Es

organismo s

el recambio

o que el rest

celulares que

n que los ma

n viral perma

ja producció

nfocitos T C

licación vira

ve (por ejem

rten en foco

la de las cél

mposibilidad

esta inmun

replicación

la reducida

24

sto implicar

si se adminis

o completo

to de los tipo

e son suscept

crófagos son

anente cuan

ón viral pero

D4 quiescen

l y por lo ta

mplo vacunac

os de produc

ulas folicula

de erradicar

ne

del HIV 1 in

vida media

ía que un t

strara durant

de células

os celulares

tibles a la inf

n menos susc

do la poblac

su vida med

ntes (no acti

anto constit

ción o infecci

cción viral. L

res dendrític

r el virus del

n vivo indica

de las célula

tratamiento

te, por ejem

infectadas

resulta relev

fección por e

ceptibles a la

ción T decae

dia es much

vos) son sus

uyen reserv

ión de cualq

La vida media

cas y por es

organismo q

Figura I.6

virales d

contribució

viremia. B

realizados

aplicación

antirretrov

(HAART).

n que para m

as blanco de

antirretrovi

mplo, una se

por nuevas

vante. En la f

el HIV 1 y su

a citopatoge

. Los linfocit

o mayor que

sceptibles a

vorios latente

uier tipo que

a de este tip

so estos dos

que lo porta.

6. Los res

del HIV 1

ón a los niv

Basado en

mediant

de trata

virales de alta

mantener lo

el virus, debe

ral eficiente

mana, hasta

s células no

figura I.6. se

aporte a los

enicidad viral

tos T CD4 en

e la de los T

la infección

es que ante

e estimule la

po celular es

s grupos son

.

servorios

y su

veles de

estudios

te la

amientos

a eficacia

os niveles de

e existir una

e

a

o

e

s

l

n

T

n

e

a

s

n

e

a

alta t

Esta c

asegu

quasi

resum

venta

En lo

pued

humo

analiz

que r

adela

recon

curso

tiemp

HIV c

varia

“polim

[34].

tasa de infec

característic

ura que los

iespecies vir

men los resu

aja selectiva

os últimos añ

e modelar l

oral[30] y ce

zado la selec

reconoce ep

ante “alelos

nocen motiv

o de la infec

po es espera

con las mism

ción de un

morfismo”) y

En ese trab

cción de célu

a, combinad

individuos

ales[26], cad

ltados de es

al virus que

Figura

ños se ha de

a evolución

elular[31 45

cción de esca

pítopes virale

HLA”). Debid

vos aminoac

cción son di

able que ind

mas mutacio

aminoácido

y el alelo HL

bajo se dem

ulas nuevas y

da con la alta

infectados

da una difirie

stos estudios

la porta, la m

I.7. Dinámica

emostrado q

del virus al

] a través d

ape a la resp

es a través

do a que las

cídicos partic

stintas entre

dividuos port

nes de esca

o en un siti

LA del pacien

mostró que e

25

y por lo tant

a tasa de mu

con el viru

endo de la ot

s. Por eso es

misma emerg

a de la replica

que la respu

l seleccionar

del proceso

puesta celula

de las molé

s diferentes

culares, las

e individuos

tadores de lo

pe en su sec

o particular

nte infectad

existe una a

to una eleva

utación que o

us posean u

tra en una o

entendible q

gerá por sob

ación viral del

esta inmune

r variantes q

de mutació

r de linfocito

éculas de los

proteínas ex

variantes d

s portadores

os mismos a

cuencia ami

r del proteo

o ha sido de

sociación es

ada tasa de p

ocurre duran

una complej

o más mutaci

que si alguna

bre el resto [2

l HIV 1 in vivo

e de un pac

que escapan

ón. La mayo

os citotóxico

s genes HLA

xpresadas po

e escape se

s de distinto

alelos HLA se

noacídica. D

oma del HIV

emostrada e

stadística en

producción v

nte la retrot

a y diversa

iones. En la f

a mutación q

27 29].

o.

iente infecta

n a la respue

ría de los t

os (CTL), es d

A de clase I

or diferente

eleccionadas

os alelos HLA

eleccionen v

Dicha asociac

V (de aquí e

en 2002 por

ntre los alelo

viral [24,25].

ranscripción

a mezcla de

figura I.7. se

que confiere

ado con HIV

esta inmune

rabajos han

ecir, aquella

(de aquí en

s alelos HLA

s durante el

A. Al mismo

variantes del

ción entre la

en adelante

Moore et al

os de HLA y

.

n

e

e

e

V

e

n

a

n

A

l

o

l

a

e

l

y

distin

esque

Fig

e

po

I.7. M

El an

herra

princ

mane

la pro

requi

filoge

comp

en ca

deriv

mism

ntos polimor

ematiza en la

gura I.8. Esqu

HLA cuando

genes. En la

escape, de ma

con un dete

surgimiento d

alelo lo m

oblacional la p

infectad

Metodolog

nálisis de as

amienta útil

ipal de este

ejar grandes

obabilidad d

isito, una crít

enéticas entr

partían el m

ada una de l

ado de un m

mo ancestro c

rfismos de la

a figura I.8.

uematización

el polimorfis

figura, las par

anera que una

erminado alelo

de una varian

más probable e

presencia de l

do. Esta asoci

significa

gía para la

ociación ent

para la ident

e tipo de es

conjuntos d

de falsos pos

tica que se r

re las secuen

ismo polimo

as secuencia

mismo ancest

común y ade

a secuencia v

del principio

mo es una m

rtículas virales

a variante salv

o (en este cas

te de escape

es que esa mu

a mutación de

iación se pued

ativamente ma

a identifica

tre alelos H

tificación de

studios cons

de datos e in

sitivos. Si bie

ealizó a su tr

ncias virales

orfismo asum

as analizadas

tro común. D

emás los ind

26

viral a nivel

de asociación

utación de es

s en rojo repr

vaje (hacia la i

o A02) sufre u

a dicho alelo,

utación no apa

e escape resu

de identificar

ayor a 1, sugie

ación de mu

LA y polimo

epítopes de

siste en pod

cluya correc

en el trabajo

rabajo poste

que analizab

mía que dich

s y no consid

De esta man

dividuos infe

poblacional

n entre polimo

scape a la resp

esentan varia

zquierda de la

una presión d

mientras que

arezca. De est

lta asociada a

mediante el c

ere la asociac

utaciones

orfismos vira

e reconocimi

der realizar u

cciones de co

o de Moore

eriormente fu

ba; es decir, s

ha variación

deraba la po

nera, si un co

ctados con e

. El principio

orfismos vira

puesta inmun

ntes portador

a figura) cuan

e selección qu

e en los individ

ta manera, en

a la presencia

cálculo del OR

ión menciona

de escape

ales puede

iento CTL en

un análisis e

omparacione

[34] cumplía

ue que no co

si un conjunt

había surgid

osibilidad de

onjunto de s

ellas compar

o de dicha a

les y alelos de

ne mediada po

ras de la muta

do infecta un

ue puede cond

duos que no p

n un análisis a

del alelo en e

R que, cuando

ada.

ser utilizado

n el HIV. La c

estadístico q

es múltiples

a ampliamen

onsideraba la

to de secuen

do independ

que fueran

ecuencias co

rtían uno o v

sociación se

e los genes

or estos

ación de

individuo

ducir al

portan el

nivel

el individuo

es

o como una

aracterística

que permita

para reducir

nte con este

as relaciones

ncias del HIV

dientemente

un carácter

ompartían el

varios alelos

e

a

a

a

r

e

s

V

e

r

l

s

HLA

comp

de lo

impro

simila

para

demo

por d

una r

para

I.8. D

Mien

estud

longit

demo

molé

la cél

replic

[36,5

de p

selec

la cap

impli

indivi

capac

el HI

circul

indivi

mayo

HLA

selec

de la

recie

entonces po

partidos por

os individuos

obable ya q

ares. Sin em

los resultad

ostraron que

dicho fenóme

reconstrucció

evitar falsos

Dinámica d

tras que la

dios poblacio

tudinales la

ostrado la rá

cula del HLA

lula citotóxic

cativa del vir

1 53], y la ca

ersistir en a

ciona) siend

pacidad repl

cancia en el

iduo para qu

cidad replica

V podría es

la adquirien

iduos de dic

oría de las m

que posee

cionadas en

a secuencia

ntes de Brum

odía surgir u

dichas secu

s portadores

que implica

mbargo, Bhat

dos de asoci

e la mayoría

eno. Es por e

ón de la histo

positivos en

de la selecc

corrección f

onales, a nive

dinámica

ápida selecc

A en la célula

ca[41], el im

rus[50], la id

apacidad de

ausencia de

o esto últim

licativa del v

diseño de u

ue reconocie

ativa significa

star adaptán

do mutacio

cha població

utaciones qu

y a la muta

el individuo

del virus qu

mme et al [3

una asociaci

encias relaci

del mismo

que cepas

ttacharya et

iación estad

de las asoci

ello que actu

oria evolutiv

n los estudio

ción y tran

filogenética

el de individu

de selección

ión de muta

a presentado

pacto negati

dentificación

variantes de

e la presión

o muy frecu

virus[36,51 5

na vacuna y

era regiones

ativamente d

ndose progre

nes que red

ón. De hech

ue serian con

ación particu

o infectado [

ue porta el

31] que suge

27

ón estadísti

ionadas hab

alelo de HLA

del HIV re

al en 2007[

dística para

iaciones iden

ualmente se

va mediante

s de asociaci

nsmisión d

desarrollada

uo trabajos p

n de las va

aciones que

ora[47 49] o

ivo que algu

de mutacio

e escape de s

selectiva (e

ente para m

53,55]. Todo

a que sería i

s del virus fr

disminuida[5

esivamente

ducen la cap

ho, reciente

nsideradas “

ular del viru

57]. Estas co

individuo tr

erían que la

ca ficticia a

ían emergid

A. En un prin

elacionadas

[46] desarro

la identificac

ntificadas po

considera qu

análisis filog

ión estadístic

e mutacion

a por Battac

posteriores a

ariantes de

disminuyen

por el Recep

nas de estas

nes que com

ser transmiti

en individuo

mutaciones q

o este conjun

nteresante e

rente a las c

56]. Otra imp

a la respue

pacidad de r

mente se h

“escape” en u

us) habrían

onclusiones s

ransmisor y

mayoría de

l considerar

o independi

ncipio este “

infecten ind

llaron una “

ción de mut

or Moore en

ue este tipo

genético de la

ca.

nes de esc

charya [46] r

al de Moore

escape [34

la afinidad

ptor de Célu

s mutaciones

mpensan dic

idas a otros

os que no p

ue no tienen

nto de descu

estimular la

cuales, en ca

plicancia de

sta inmune

reconocimie

ha encontrad

un individuo

sido en rea

se apoyan e

contradice

las mutacio

r que los po

entemente e

“error” pare

dividuos gen

“corrección f

tantes de es

n 2002 podía

de estudios

as secuencia

cape

resulta impo

demostraro

4]. Dichos tr

del péptido

las T (TCR) e

s tienen en l

ha capacidad

individuos [5

poseen el H

n efecto dele

ubrimientos

respuesta in

aso de escap

estos result

de la pobla

ento por los

do evidencia

(de acuerdo

lidad transm

n la ventaja

observacion

ones asociad

olimorfismos

en cada uno

cía bastante

néticamente

filogenética”

scape CTL y

an explicarse

debe incluir

as analizadas

ortante para

n en análisis

rabajos han

o viral por la

especifico en

la capacidad

d replicativa

54] e incluso

HLA que las

etéreo sobre

tienen gran

mune de un

par, viera su

tados es que

ación donde

HLA de los

a de que la

o a los alelos

mitidas y no

de disponer

nes también

as al escape

s

o

e

e

”

y

e

r

s

a

s

n

a

n

d

a

o

s

e

n

n

u

e

e

s

a

s

o

r

n

e

viral

a la

muta

prese

partic

previ

impro

escap

virus

parej

recep

Estos

persis

gene

podrí

recon

profu

partic

del H

varia

poten

El pr

trans

secue

conju

indivi

porta

secue

obten

(codif

prese

vitro

trans

emergían se

que llegaron

aciones de es

entes en el

culares del p

a de la varia

obable que

pa” solamen

tanto del in

as de trans

ptor o fue tra

s resultados

sten con mu

ral de que la

ía estar ada

nocido en lo

undamente e

cularmente

HIV en el mo

bilidad y se

nciales vacun

imer trabajo

smisión fue

encias del g

unto de 8 pa

iduo recepto

aba el indiv

encias de ge

nidos por D

ficante para

entes en el e

los diferent

smitidas del g

eleccionadas

n Brumme y

scape en estu

virus que

paciente hab

antes “salvaj

un individuo

te por azar.

ndividuo que

smisión) per

ansmitida; y

sustentan la

ucha más fac

a respuesta

ptándose pr

os nuevos in

el evento de

importante

omento de la

e constituye

nas y drogas

o en demos

el desarrolla

gen env del

arejas de tra

or podría at

iduo transm

noma comp

Derdeyn et

la proteína

estadío cróni

tes grados d

gen env[62,6

por la respu

y colaborado

udios longitu

disminuyera

bían emergid

je” del epíto

o tuviera al m

Sin embargo

e lo transmi

rmitieron co

de hecho, o

a inquietante

ilidad y con

inmune pob

rogresivame

ndividuos in

e transmisió

porque se h

a transmisió

e además c

(como micro

strar la dram

ado por Der

virus HIV q

ansmisión es

ribuirse sola

misor. Estos

pleto del viru

al sugerían

de envoltur

co de la infe

de sensibilid

63]. Aún mas

28

uesta citotóx

ores resultó

udinales pero

an la afinid

do en ese pa

ope. Esta sup

mismo tiem

o, los nuevos

itió como de

onocer si la

bservan que

e teoría de q

mayor frecu

blacional pue

ente a dicha

fectados. Se

n para ente

ha demostrad

ón, lo que se

como un es

obicidas) qu

mática dismi

rdreyn et al

ue portaban

stimaron qu

amente a un

resultados

us también e

n también q

ra) poseían c

ección. De he

dad a la neu

s, un estudio

xica del indiv

de ver el s

o además, de

dad del epít

aciente aun

posición se s

po “la muta

s estudios do

el individuo

a supuesta m

la mayoría f

que las muta

encia de lo q

ede moldear

respuesta h

e muestra t

ender el futu

do que exist

e traduce en

scenario ide

e prevengan

inución de l

l [59] donde

n tanto el t

e en la may

na variante v

fueron con

en parejas de

que las sec

característica

echo, posteri

utralización

o reciente de

viduo. Concr

surgimiento

e suponer qu

tope viral p

sin tener ev

sustentaba e

ación de esca

onde se disp

que fue infe

mutación em

fueron trans

ciones de es

que se creía,

r la evolució

hasta ser sig

ambién la i

uro de la ep

te una fuerte

n una signific

eal para est

n la transmisi

la diversidad

e, analizand

ransmisor c

yoría de los

viral del con

firmados m

e transmisió

cuencias tra

as particular

iormente se

por anticue

emostró que

retamente, la

en el tiemp

ue aquellos a

por alguno

videncia de l

en considera

ape” y “el al

ponía de la se

ectado (en l

mergió en

mitidas.

scape son tra

, apoyando la

ón del HIV y

gnificativam

mportancia

pidemia del

e selección d

cativa dismin

tudiar el de

ión[58].

d viral en e

o filogenétic

omo el rece

casos la infe

njunto de va

ás adelante

n[60,61]. Lo

nsmitidas d

es, distintas

demostró e

rpos de est

e pacientes c

a conclusión

po de varias

aminoácidos

de los HLA

la existencia

ar altamente

lelo del cual

ecuencia del

las llamadas

el individuo

ansmitidas y

a teoría más

que el virus

ente menos

de estudiar

HIV. Esto es

de variantes

nución de la

esarrollo de

l evento de

camente las

eptor en un

ección en el

ariantes que

e analizando

s resultados

del gen env

de aquellas

n ensayos in

as variantes

con mayores

n

s

s

A

a

e

l

l

s

o

y

s

s

s

r

s

s

a

e

e

s

n

l

e

o

s

v

s

n

s

s

nivele

tiend

célula

El es

anális

publi

un e

trans

relev

ser tr

natur

luego

persis

comp

El est

trans

bien

nivele

anális

gene

asoci

porta

indep

pronó

los al

muta

comp

en pa

confi

I.9.

pobl

Un t

pobla

es de activa

en a infecta

as blanco de

tudio de es

sis de la din

cado en 200

pítope part

smisión a un

ancia limitad

ransmitida a

raleza altam

o del evento

stencia es

pensatorias[3

tudio de la s

smisión ha po

trabajos pre

es de virus

sis[32,67 69]

rada por el

adas a las

adores de es

pendienteme

óstico es aso

elos de HLA

aciones de es

pensatorias[3

arejas serod

rmado por e

Evidencia

lacional

rabajo recie

acional, rean

ación inmu

arse con un

l HIV en muc

ste tipo de

námica de s

05 por Leslie

icular de la

individuo q

da a nivel de

un individuo

ente polimó

o de transm

posible gra

36,53,66].

selección y t

osibilitado ta

evios analiza

en sangre, l

]. Al estudia

mismo viru

mutaciones

ste tipo de m

ente de los a

ociado a la in

que posee e

scape apare

33]. Incluso d

discordantes

estudios post

reciente

ente ha est

nalizando gra

ne (debido

mayor núme

cosas facilita

pacientes re

selección y t

et al [54,65

a proteína G

ue no poseí

el individuo p

o con diferen

órfica del gen

misión, otras

cias a la a

transmisión

ambién evalu

ron la posib

a variabilida

ar el virus e

us en dos p

de escape.

mutaciones t

alelos del gen

nfección con

el individuo i

ntemente pu

dos trabajo h

que compa

teriores[71,7

acerca de

udiado la h

andes conjun

29

por ejemplo

ero de varia

aría la infecci

elacionados

transmisión

5] que demo

Gag (con re

ía el alelo HL

para las muta

ntes alelos H

n HLA). Sin e

s mutacione

parición de

de mutacion

uar su impac

ilidad de un

ad de este p

n parejas de

pacientes dif

. Estos estu

ienden a ge

n HLA que p

variantes de

nfectado. Di

ueden ser in

han llegado a

rten alelos d

72].

e la adapt

hipótesis de

ntos de dato

o a infeccio

ntes. Es dec

ón[64].

amplió sign

de variante

stró la rever

estricción pa

LA B57. Esto

aciones de e

HLA (evento a

embargo, tra

s de escape

e las anterio

nes de escap

cto en parám

a relación e

parámetro e

e transmisió

ferentes y f

udios recient

nerar una in

osea el indiv

el HIV portad

chas cargas

ncrementada

a sugerir un

del gen HLA

tación del

adaptación

os provenient

nes agudas

cir, que una

nificativamen

s de escape

rsión de una

ara HLA B57

os primeros

scape ya que

altamente p

bajos poster

e son capac

ormente me

pe en el con

metros clínico

ntre las mut

n la infecció

ón puede co

facilitar la d

tes han dem

nfección con

viduo infecta

doras de mu

virales reduc

as por el surg

incrementad

A aunque est

l HIV a la

n del virus

tes de 9 cen

de transmi

mayor activ

nte las posib

e. El primer

mutación d

7) luego del

resultados s

e se suponía

robable con

riores demos

ces de persi

encionadas

ntexto de un

os como la c

taciones de

ón natural d

ompararse la

etección de

mostrado qu

cargas viral

ado [70] aun

taciones de

cidas por la p

gimiento de

do riesgo de

te resultado

a respuest

a la respue

tros en un m

sión sexual)

vación de las

bilidades de

trabajo fue

de escape en

l evento de

sugerían una

a revertían al

siderando la

straron que,

istir y dicha

mutaciones

na pareja de

arga viral. Si

escape y los

dificultaba el

a carga viral

e diferencias

ue los virus

es menores,

que un peor

escape para

presencia de

mutaciones

transmisión

o deberá ser

ta inmune

esta inmune

meta análisis

)

s

e

e

n

e

a

l

a

,

a

s

e

i

s

l

l

s

s

,

r

a

e

s

n

r

e

e

s

con a

y enc

muta

Por o

prime

que p

que s

válida

alelos

impo

encue

nuev

a nive

y ent

interv

I.10.

resis

Medi

indet

los in

infecc

terap

alrededor de

cuentran un

ación de esca

otro lado, ta

eros momen

poseen alelo

si la hipótesis

a, es probab

s “raros” au

rtantes para

entran limita

a. Actualmen

el poblacion

re poblacion

venciones ef

. Breve r

stencia

iante el trat

tectables y co

ndividuos no

ción y la efic

péutica.

2800 pacien

na asociació

ape I135X en

ambién se s

ntos de la div

os HLA de b

s de que el H

ble que lo ha

un se vería f

a entender

ados por la in

nte se consid

al. Por eso, e

nes es esenc

ficientes com

reseña ace

amiento ant

onsecuentem

o infectados

ciencia del tr

ntes. En el m

n positiva e

n las distintas

sugirió la inf

versificación

aja prevalen

HIV se ha ada

aya hecho p

forzado a es

la interacci

ncapacidad d

dera casi un

estudios má

ial para ente

mo una vacun

erca del

tirretroviral

mente increm

[76]. Así, los

ratamiento a

30

mismo confirm

entre la pre

s poblacione

Figu

alel

indi

fluencia de

n del HIV[73]

ncia[74]. Este

aptado en ci

para los alelo

scapar y por

ión del HIV

de seguir al v

hecho que l

s profundos

ender la pato

na [75].

tratamien

los niveles d

mentar los n

s parámetro

antirretrovir

man las asoc

evalencia de

s estudiadas

ura I.9. Preval

o B51 en un e

ividuos[38].

la respuesta

] y una mayo

e último dat

erto grado a

os mas preva

r lo tanto a

V con la po

virus a medi

as respuesta

acerca del o

ogénesis del

nto antirre

de CV pued

iveles de CD

os de CV y C

al, guiando e

ciaciones pre

el alelo B51

s (Figura I.9.)

lencia de la m

estudio de 9 c

a inmune m

or diversifica

to debe inte

a la respuest

alentes y en

diversificars

blación en

da que se pr

as CTL mode

origen del H

virus e impe

etroviral y

en reducirse

4, incluso a n

D4 sirven pa

en la toma d

eviamente de

y la preval

).

mutante de es

cohortes con

mediada por

ación viral e

erpretarse co

a inmune po

n aquellos pa

se. Estos res

la que circu

ropaga en un

lan la divers

IV y su evolu

erativo para

y el desa

e, idealment

niveles simila

ara seguir el

de decisione

escriptas[38]

lencia de la

cape I135X al

más de 2800

HLA en los

n individuos

onsiderando

oblacional es

acientes con

sultados son

ula pero se

na población

idad del HIV

ución dentro

el diseño de

arrollo de

te, a niveles

ares a los de

curso de la

es durante la

]

a

l

0

s

s

o

s

n

n

e

n

V

o

e

e

s

e

a

a

Los a

prime

blanc

Trans

Inhib

produ

nuev

Fusió

I.11.

La d

proba

emer

frecu

resist

resist

replic

Sin em

de m

medi

varia

lado

trata

Y por

trans

infect

I.12.

I.12.1

inmu

Tanto

contr

pode

antivirales ut

eros utilizad

co es el sitio

scriptasa (NN

idores de la

uctos virales

os blancos v

ón.

. Impacto d

disminución

ablemente s

rge y preva

entemente

tencia cruzad

tentes result

cación viral.

mbargo, si b

utaciones as

o libre de e

ntes salvaje

implica que

miento, las v

r otro lado, q

smisión de re

tado.

. Objetivos

1. La importa

une, base de

o la respue

rarrestar la r

mos llamar

tilizados en e

os fueron lo

activo de la

NRTI) cuyo b

Proteasa (P

s. En los últ

virales entre

del fenóme

de la efe

e deba a la s

alece por s

presentan r

da entre dro

ta ser un pro

bien en un m

sociadas a re

esta presión

s (wild type

cuando a u

variantes res

que cuando

esistencia), l

s del proye

ancia de estu

los objetivo

esta inmune

replicación v

artificial. La

el tratamien

os llamados

enzima RT.

blanco es tam

PI), enzima v

timos años

los que se c

eno de resi

ctividad de

selección de

sobre el res

resistencia a

gas de una m

oblema grav

edio donde

esistencia tie

de selecció

e, no resiste

n individuo

sistentes (pr

un individuo

as mismas n

ecto y cons

udiar la rela

os de la prese

HIV especí

viral, siendo

respuesta i

31

to se puede

Inhibidores

El segundo g

mbién la RT

viral involucr

se han des

uentan los In

istencia en

el tratamien

una variante

sto. Y debi

a varias clas

misma clase

ve que siemp

existe presió

enen una cap

ón dicho fitn

ntes)[81 83]

que se encu

edominante

o se infecte c

no deberían

trucción de

ción entre e

ente tesis de

ífica como

la primera u

nmune, al ig

en clasificar d

Nucleosídic

grupo son lo

pero no su

rada en proc

arrollados n

nhibidores d

n la terapé

nto para co

e resistente a

ido a que

ses de drog

es frecuente

pre complica

ón de selecci

pacidad repl

ness viral es

. Esto tiene

uentra bajo f

s) deben ser

con variante

persistir muc

e la hipóte

l tratamient

e doctorado.

el tratamien

una forma n

gual que el

de acuerdo

cos de la Tra

os Inhibidore

sitio activo.

cesamientos

nuevos antir

e la Integras

éutica

ontener la

al/los antivir

las variante

gas antirretr

e [78 80], la e

a nuevos esf

ión antiviral

icativa (fitne

s, en genera

e consecuenc

falla terapéu

r reemplazad

s resistentes

cho tiempo

esis de trab

to antirretro

.

nto antirret

natural y la s

tratamiento

al blanco de

anscriptasa (

es no Nucleo

. El tercer gr

s post traduc

rretrovirales

sa y los Inhib

replicación

ral/es admin

es del HIV

ovirales[77]

emergencia

fuerzos para

las variantes

ess viral) sup

al, menor qu

cias inmedia

utica se le in

das por la fo

s (es decir, u

en este nuev

bajo

oviral y la res

troviral son

segunda una

o antirretrov

e acción. Los

(NRTI), cuyo

sídicos de la

rupo son los

ccionales de

que atacan

bidores de la

viral muy

istrados que

resistentes

y a que la

de variantes

controlar la

s portadoras

perior; en un

ue el de las

atas: por un

terrumpe el

orma salvaje.

n evento de

vo individuo

spuesta

formas de

a forma que

iral, poseen

s

o

a

s

e

n

a

y

e

s

a

s

a

s

n

s

n

l

.

e

o

espec

indivi

indivi

indivi

Inclus

acces

la ev

antirr

capaz

teste

más t

cerca

que r

nivel

infect

muta

Sólo

antirr

perm

Prote

[85,8

trata

I.12.2

Carac

de ev

antirr

I.12.3

Nues

es co

antirr

varia

cificidad po

iduos. La dif

iduos infect

iduos diagno

so, del conju

so al tratami

volución de

retrovirales

z de modela

o y el acceso

temprano d

ano la mayor

resulta de gr

poblacional

tados que se

aciones de es

unos poco

retroviral [84

mitir extrapo

easa que no

86]. Por lo

miento en la

2. El objetivo

cterizar los e

vadir la resp

retroviral en

3. La hipótes

tra hipótesis

onsecuencia

retroviral fa

ntes salvajes

r el virus y

ferencia ent

tados mient

osticados y

unto que cu

ento. Esto su

el virus a

ha sido am

ar la evolució

o al tratamie

ebido a la re

ría de la pob

ran importan

puede afect

e encuentran

scape CTL.

os estudios

4 86] aunque

lación a niv

o son consid

tanto, exist

a persistencia

o general

epítopes vira

puesta selecc

la persisten

sis de trabajo

s de trabajo

de la signific

avorece la r

s, mejor adap

y seleccionan

tre ambas re

tras que la

en particula

umple con e

ugiere que la

nivel pobla

pliamente d

ón de las va

nto antirretr

educción de

blación infect

ncia estudiar

tar y/o inter

n bajo tratam

han analiza

e fallan en a

el poblacion

deradas ent

e un gran

a de las muta

les que está

cionando mu

cia dichas m

o

fue que “la

cativa reduc

eversión de

ptadas a la r

32

n variantes

espuestas es

respuesta

ar aquellos q

l criterio, de

a respuesta

acional. Sin

descripta y e

ariantes del

roviral, suma

la toxicidad

tada se enco

r cómo esta

actuar con la

miento; y en

ado la rela

lcanzar un n

nal [84] y la

re los blanc

vacío de in

aciones de e

n sometidos

utaciones de

mutantes.

desestimula

cción de la c

e las variant

eplicación vi

de escape

s que la res

por antirre

que cumplen

ebe aclararse

inmune sería

embargo,

estudios rec

HIV a nivel

ado a la tend

d de los med

ontrara bajo

fuerte pres

a respuesta

particular c

ción entre

úmero impo

mayoría de

cos más imp

nformación

escape CTL.

s a presión in

e escape, y

ación de la re

arga viral de

tes de esca

iral.”

que puede

puesta inmu

etrovirales s

n criterio de

e que nunca

a mucho má

la transmi

ientes sugie

poblacional

dencia a inici

dicamentos

tratamiento

ión de selec

inmune mon

on la selecci

el escape

ortante de m

e ellos estud

portantes de

necesaria a

nmune citotó

evaluar el im

espuesta inm

ebido a la ef

pe a la res

en transmitir

une actúa e

solamente e

e inicio de t

a el total de

s potente pa

sión de re

eren que ser

. Con la am

ar tratamien

utilizados, e

o. Por eso co

cción artificia

ntada por lo

ión y persist

CTL y el t

muestras ana

dian las pro

e la respue

cerca del im

óxica y que s

mpacto del t

mune HIV es

ficiencia del

spuesta citot

rse a otros

n todos los

en aquellos

ratamiento.

e ellos tiene

ara modelar

esistencia a

ría también

pliación del

nto cada vez

n un futuro

onsideramos

al ejercida a

s individuos

encia de las

tratamiento

lizadas para

teínas RT y

sta inmune

mpacto del

son capaces

tratamiento

specifica que

tratamiento

tóxica hacia

e

o

a

I.12.4

1. C

2. Id

3. C

4. C

5. E

6. D

e

in

4. Los objetiv

Caracterizar l

dentificar me

Confirmar las

Caracterizar l

Evaluar la din

Determinar e

estas mutaci

niciar el trata

vos específic

a población

ediante anál

s mutaciones

a respuesta

námica de es

el posible im

ones analiza

amiento

cos

bajo estudio

isis estadísti

s identificada

inmune espe

tas mutacion

mpacto del

ando los gen

33

o

co las poten

as mediante

ecífica frente

nes en el cur

tratamiento

nomas virale

ciales mutac

ensayos inm

e a estas var

rso de la epid

antirretrov

es presentes

ciones de esc

munológicos

riantes

demia del HI

iral en la se

s en pacient

cape CTL

in vitro

V en Argent

elección/per

tes antes y

ina

rsistencia de

después de

e

e

II. MATERIALES Y MÉTODOS

II.1.

El cr

diagn

de In

Centr

térm

prese

terce

hecho

preva

heter

25%.

mayo

proye

Unive

II.2.

Las m

estud

homo

mues

fracc

y el r

célula

el di

corre

con P

suspe

se re

y de

de 2

millo

Población

riterio de i

nosticado po

munocompr

ro de Testeo

inos de prev

entes en los

er mundo, se

o, en unos

alencia de in

rosexual aun

Los estudio

oritariamente

ecto ha sido

ersidad de B

Procesam

muestras de s

dio se recib

ogeneizar, se

stra se cent

iones de 1 m

resto se alma

as mononuc

luido sobre

espondiente

PBS. Se tom

ensión de CM

suspendió e

2 millones d

millones se

nes se conge

bajo estud

nclusión pa

rtador del H

rometidos de

o Voluntario

valencia de re

pacientes [9

e encuentra

de los trab

fecciones re

nque la pob

os de caracte

e recombina

presentado

uenos Aires

iento de la

sangre perifé

bieron en tu

e separó un

rifugó a 250

ml en criotub

acenó a 70º

leares de sa

3 ml de s

a las CMSPs

mó una alícu

MSPs se lavó

n el volumen

de CMSPs. Se

secaron par

elaron de acu

dio

ara el pres

HIV. El muest

el Hospital R

o. Esta pobla

esistencia pr

9]. En genera

en estados

bajos antes

ecientes era a

blación HSH

erización mo

ante BF mien

y aprobado

(OHRP ref nu

as muestra

érica obtenid

ubos conten

a alícuota d

00 rpm dura

os. Una de la

ºC. El centrif

angre perifér

solución de

s se separó a

ota de 0,5

ó por centrif

n adecuado

e centrifugó

a obtener la

uerdo a la m

35

ente trabaj

treo se realiz

Ramos Mejía

ación fue pr

rimaria a ant

al es una pob

avanzados d

citados se e

alrededor de

(hombres q

olecular del

ntras que var

o por el Com

um: IORG000

as

das por pun

niendo EDTA

de 1 ml para

ante 10 min

as fracciones

fugado se di

rica (CMSPs)

Ficoll a 25

a un tubo fa

ml y se con

fugación a 17

para alicuot

nuevamente

s CMSPs com

metodología d

jo consistió

zó sobre los p

de Capital F

reviamente c

tirretrovirale

blación que,

de la infecci

estimó med

el 10%. La po

que tienen se

virus han d

riantes del s

ité de Bioéti

04063).

ción venosa

A como ant

a realizar las

nutos. El sob

s fue utilizad

luyó al medi

por gradien

00 rpm por

lcon de 15 m

ntaron las C

700 rpm dur

ar en criotub

e a 1700 rpm

mo pellet se

descripta a c

en ser in

pacientes qu

Federal, la cu

caracterizada

es [87] y subt

como suele

ón al mome

iante la téc

oblación sue

exo con hom

demostrado

ubtipo B ron

ica de la Fac

de los indiv

ticoagulante

s mediciones

brenadante

da para realiz

io con buffe

nte de Ficoll

r 15 minuto

ml y se llevó

MSPs en cá

rante 5 minu

bos de 2 ml

m durante 5

co, mientras

ontinuación

ndividuo rec

ue asistieron

ual opera tam

a por nuest

tipos virales

ser el caso e

ento del diag

cnica de De

le ser mayor

mbres) pued

que el mism

ndan el 30%.

cultad de Me

iduos involu

. Previa agi

s de CD4. El

(plasma) se

zar las medic

r PBS y se se

Hypaque: S

os sin freno

a un volum

ámara de Ne

utos y el pell

fracciones d

minutos y la

s que las frac

.

cientemente

a la sección

mbién como

ro grupo en

de las cepas

en países del

gnóstico. De

tune que la

ritariamente

de rondar el

mo suele ser

. El presente

edicina de la

crados en el

itación para

resto de la

alicuotó en

ciones de CV

epararon las

e centrifugó

o. La banda

en de 15 ml

eubawer. La

let obtenido

e 6 millones

as fracciones

cciones de 6

e

n

o

n

s

l

e

a

e

l

r

e

a

l

a

a

n

V

s

ó

a

l

a

o

s

s

6

II.3.

Las c

millo

de 50

soluc

inten

rápid

"Mr.

las tr

mese

II.4.

Los c

acele

goteo

goteo

progr

veces

II.5.

Las m

DNA

340 b

hibrid

prime

genó

captu

viral y

indivi

distin

forma

alcali

con u

Congelado

células que s

nes por mili

00 a 700 µl

ción de Sue

samente la s

amente tod

Frosty") que

ransfiere a u

es es también

Descongel

criotubos de

erar el desco

o sobre 1 ml

o, se agrega

resivamente

s con medio

Medición

mediciones d

(bDNA) con

bDNA Analyz

dación de ác

er lugar, el

mico se liber

ura de oligon

y a las sonda

iduales, y la

ntas partes d

ando un co

na se hibrid

un sustrato q

o de célula

se desean co

litro. Luego

(5 a 7 millo

ro Fetal Bo

suspensión c

o el conteni

e permite ret

un sistema d

n posible.

lado de cé

e las células

ongelamiento

l de medio R

n otros 10 m

y agitando

RPMI 10%SF

de los valo

e carga viral

el kit VERSA

zer. El ensay

cido nucleico

HIV 1 se co

ró de los viri

nucleótidos s

as del amplif

as sondas d

del gen pol d

omplejo de A

daron a este

quimiolumini

as

ongelar se l

se distribuye

ones de célu

ovino (SFB)

celular. Una

do y se colo

tardar el tiem

de nitrógeno

lulas

a desconge

o. Una vez d

RPMI al mism

ml de medio

al mismo ti

FB.

ores de Car

l se realizaro

ANT® HIV 1

yo VERSANT

o para la cua

oncentró a p

ones, se cap

sintéticos es

ficador. Las s

iana, que co

del ARN vira

ADN ramific

complejo in

iscente. La e

36

as resuspen

en en criotu

ulas por tubo

20% DMSO

vez finalizad

ca en sistem

mpo de cong

o líquido en

elar son llev

descongelada

mo tiempo q

o RPMI 10%

iempo. Una

rga Viral

on a partir de

RNA 3.0 Ass

T® HIV 1 RNA

antificación d

partir del pl

pturó en un m

pecíficos. Un

sondas de ca

onstan de 8

al y la sonda

cado. Varias

nmovilizado.

emisión de lu

de en medi

bos de 2ml

o). Finalmen

en forma

do el goteo d

ma Mr Frosty

gelación y se

los días sigu

vados rápida

as, se dispen

que se agita

% SFB tambié

vez finalizad

e 1 ml de pla

say (bDNA) d

A 3.0 (bDNA

directa de AR

asma por ce

micropocillo

n conjunto d

aptura, que c

81 extensore

a del amplifi

s copias de

La detecció

uz es directam

o RPMI a un

(Greiner bio

nte se agrega

de goteo su

de la solución

y (5100 Cryo

e lo almacena

uientes aunq

amente a un

nsa el conte

intensament

én en forma

do el goteo

asma media

de Bayer y e

) es un proc

RN del HIV 1

entrifugació

mediante un

e sondas dia

constan de 1

es diana ind

icador se hib

una sonda

ón se realizó

mente propo

na concentr

o one 126) e

a igual volum

uave mientr

n mencionad

1°C Freezin

a a 70ºC. Id

que una dem

n baño a 37

enido en form

te. Una vez

a de goteo a

se centrifug

nte la técnic

el equipo BA

cedimiento s

1 en plasma

n. Una vez

n conjunto d

ana se hibrid

17 extensore

dividuales, se

brida al prea

marcada co

ó incubando

orcional a la

ación de 10

n fracciones

men de una

ras se agita

da se mezcla

g Container,

ealmente se

mora de 4 5

7ºC a fin de

ma de lento

finalizado el

acelerándolo

ga y lavan 2

ca de Branch

AYER®System

sandwich de

humano. En

que el ARN

de sondas de

daron al ARN

s de captura

e acoplan a

amplificador

on fosfatasa

el complejo

cantidad de

0

s

a

a

a

,

e

5

e

o

l

o

2

h

m

e

n

N

e

N

a

a

r

a

o

e

ARN

relati

conce

ARN

II.6.

Las m

flujo

T890

CD8 P

ambi

rojos

desti

desti

lavad

flujo

CD3/

II.7.

Este

mues

realiz

técni

linfoc

nivel

cantid

antic

Biosc

cada

II.8.

Estas

de la

se de

del HIV 1 p

ivas de luz.

entraciones

del HIV 1 en

Medición

mediciones d

con el TriTE

EPICS XL. Se

PE/CD3 PerC

ente por un

mediante a

lada), la solu

lada) y la sol

dos (fundam

BD FACSCa

/CD4/D8.

Medición

ensayo se r

stras evaluad

zarse la marc

ca de citom

citos citotóx

de activació

dad apropia

uerpo no p

ciences). Co

muestra dos

Generació

s líneas se ge

línea celula

ejan crecer h

presente en

Se definió u

conocidas d

las muestra

de los valo

de CD4 se rea

EST CD4 FITC

e mezclaron

CP con 100

período de

agregado se

ución B (Bic

lución C (For

ental para r

anto Flow

de los nive

realizó siem

das será men

cación, la mi

metría de flu

icos de linfo

ón celular. M

da de cada

pegado y an

omo controle

s marcacione

ón de línea

eneran por in

r B95.8 crec

hasta que el

cada muest

una curva p

de virus HIV

as se determ

ores de CD

alizaron a pa

C/CD8 PE/CD

5 µl. del ant

l de muestr

1 hora (rang

ecuencial de

arbonato de

rmaldehido a

recuento ab

Cytometer

eles de act

pre sobre la

nor al total d

sma no sería

ujo. Los ma

ocitos “helpe

Metodológica

anticuerpo a

nalizan en e

es para pod

es adicionale

as autóloga

nfección con

ida en medi

medio este

37

tra y el ana

patrón por la

1 tratado c

inaron a part

D4

artir de 1 ml

D3 PerCP (Be

icuerpo mon

ra. Se incubó

go de 45 min

tres solucio

e potasio, ca

al 0,2% en Is

soluto). Las

(BD Bioscie

tivación de

a muestra r

e muestras b

a realizada m

rcadores ut

er” y los ma

amente se i

a 4ºC duran

el citómetro

er determin

es, cada una

as de linfoc

un stock vir

o RPMI supl

ligeramente

alizador regi

a emisión d

con beta pro

tir de esta cu

de sangre m

ecton Dickin

noclonal (TriT

ó en oscurida

n. a 2 horas)

ones: La so

arbonato de

sotón). La mu

muestras se

ences) con

el sistema i

recién extraí

bajo estudio

más adelante

ilizados fue

arcadores CD

ncuban alre

te 30 minut

de flujo B

nar los límite

en ausencia

citos B

al de Epstein

ementado c

e ácido y ent

istra los res

e luz de est

opiolactona.

urva estánda

mediante la t

son) y el cit

Test de Bect

ad en el flujo

. Luego se re

lución A (Ác

calcio, hidró

uestra una v

e corrieron

el protoco

inmune

ída. Es por

ya que, si po

e. La medició

ron CD3/CD

D38 y HLA D

ededor de 1

tos. Luego se

D FACSCant

es de positiv

de CD38 o H

n Bar. Dicho

on antibiótic

onces se cen

ultados com

tándares qu

Las concent

ar.

técnica de ci

ómetro de f

ton Dickinson

o laminar a t

ealizó la lisis

cido fórmico

óxido de cal

vez lisada no

utilizando c

lo denomin

ello que el

or alguna raz

ón se realiza

D4/CD8 para

DR como ind

millón de P

e lavan para

to Flow Cyt

vidad se rea

HLA DR.

stock se obt

co y 10%SFB

ntrifuga y lu

mo unidades

e contienen

traciones de

itometría de

flujo Coulter

n) CD4 FITC/

temperatura

de glóbulos

o en agua

lcio en agua

requiere de

itómetro de

nado Rutina

número de

zón no pudo

mediante la

a diferenciar

dicadores de

PBMC con la

a remover el

ometer (BD

lizaron para

iene a partir

B. Las células

ego filtra en

s

n

e

e

r

/

a

s

a

a

e

e

a

e

o

a

r

e

a

l

D

a

r

s

n

poros

conce

de 5

stock

de Cy

baño

5%CO

duran

de fo

Una

enriq

de 5

II.9.

La ex

QIAa

plasm

partir

II.9.1

Dos

eppe

Luego

200

Se ce

adhe

nuev

(QIAG

filtrad

de bu

colum

20ºC

s 0,45µM a

entrado en v

millones de

k de Epstein

yclosporina A

a 37ºC dura

O2 37ºC dura

nte ese perío

ocos de prol

muestra de

quecimiento

millones y co

Extracción

xtracción de

mp viral extr

ma y el QIAa

r de CMSPs a

1. Extracción

millones de

ndorff de 1,

o se agregar

l de etanol

entrifugó a 6

rido a la col

amente a 60

GEN) a la col

do y se coloc

uffer de eluc

mna y el ADN

.

fin de rem

virus Epstein

CMSP y se r

Bar (de acue

A a fin de in

ante 1 hora.

ante alreded

odo. Finaliza

iferación (in

e la suspens

en linfocitos

ongeladas sig

n de ácidos

ácidos nucl

raction Kit (Q

amp DNA mi

almacenadas

de ADN

CMSPs se

,5 ml al cua

ron 200 l d

absoluto par

6000 x g por

lumna. Se ag

000 x g por

lumna. Se ce

có la column

ción (Buffer A

N resuspendi

mover la fra

n Bar. Para re

resuspenden

erdo a la infe

hibir la resp

. Luego se ag

dor de 1 me

das las 4 sem

cluso visible

sión positiva

s B y luego es

guiendo el p

s nucleicos

eicos se rea

QIAGEN, Gm

ini Kit (QIAG

s como pelle

resuspendie

al se agregar

e Buffer AL

ra precipitar

r 1 minuto y

gregaron 50

1 minuto. S

entrifugó a m

na sobre un t

AE, QIAGEN)

ido en 200

38

cción celula

ealizar la tra

n en 1 ml de

ectividad / c

uesta citotó

gregan 5 ml

es sin realiza

manas se ob

es sin micros

a es marcad

s contada en

rotocolo des

s

alizó mediant

mgH, Hilden,

GEN, GmgH,

t seco.

eron en 200

ron 20 l de

(QIAGEN) y

el ADN y se

y se descartó

0 l de buff

e descartó e

máxima velo

tubo eppend

y se centrif

l buffer AE e

ar. Este sobr

nsformación

e medio RPM

capacidad tra

xica específi

de medio R

r ningún tip

serva la susp

scopio) es in

da con CD3

n cámara de

scripto anter

te los kits co

Alemania) p

Hilden, Alem

0 l de buffe

e solución d

se incubó a

cargó la solu

ó el filtrado.

fer AW1 (QIA

el filtrado y

cidad (20.00

dorff de 1,5 m

ugó a 6000 x

en el tubo ep

renadante s

n de linfocito

MI solo. Lueg

ansformante

ica para Epst

RPMI 10% SF

po de cambio

pensión al m

ndicativo de

3/CD4/CD8/C

Newbawer,

riormente.

omerciales d

para la extrac

mania) para

fer PBS y se

de Proteasa

56ºC por 10

ución total e

Luego se re

AGEN) a la c

se agregaron

00 x g) por 3

ml. Se agrega

x g durante

ppendorff se

se encuentra

os B se toma

go se agrega

e del stock) e

tein Bar y se

FB y se incub

o de medio

microscopio. L

transformac

CD19 para c

fraccionada

de QIAGEN:

cción de ARN

la extracció

e colocaron

QIAGEN (Pr

0 minutos. S

n una colum

ealizó el lava

columna y s

n 500 l de

minutos. Se

aron a la colu

1 minuto. Se

almacenó e

a altamente

an alrededor

n 1 2 ml del

en presencia

e incuban en

ba en estufa

ni agregado

La presencia

ción celular.

confirmar el

en alícuotas

se utilizó el

N a partir de

ón de ADN a

en un tubo

roteinasa K).

Se agregaron

mna QIAamp.

ado del ADN

e centrifugó

buffer AW2

e descartó el

umna 200 l

e descartó la

n freezer a

e

r

l

a

n

a

o

a

.

l

s

l

e

a

o

.

n

.

N

ó

2

l

l

a

II.9.2

En u

(QIAG

etano

6000

volvie

colum

6000

colum

coloc

elució

el AR

II.9.3

Se tra

trasv

centr

sigma

420µ

bajar

un tu

centr

415µ

ambi

en 55

II.10

La ca

secció

carac

sobre

2. Extracción

n tubo eppe

GEN). Se inc

ol absoluto.

x g por 1 m

eron a centr

mna. Se agre

x g por 1 m

mna. Se cent

có la column

ón (Buffer A

N resuspend

3. Extracción

asvasaron en

asó el plasm

rifugó a 170

a y 10µl de

µl de 5M Gua

r liquido en l

ubo de 1,5m

rifugó a 21.0

µl de etanol 7

ente. Finalm

5µl de solució

0. Caracteri

racterización

ón de Inmun

cterización a

e ADN celula

de ARN a pa

endorff de 1,

ubó a temp

Se cargaron

minuto y se

rifugar a 600

egaron 500

minuto. Se d

trifugó a má

a sobre un t

VE, QIAGEN

dido en 60

de ARN a pa

ntre 8 y 15m

ma clarificad

.000g por 1

proteinasa K

anidinium th

las paredes.

l. Luego se a

00g por 30m

70% y se vo

mente, se elim

ón de elució

rización de

n de los gen

nogenética d

dos dígitos

r extraído se

artir de mue

5 ml se colo

eratura amb

n 630 l de

descartó el

00 x g por 1

l de buffer

escartó el fi

áxima velocid

tubo eppend

) y se centrif

l buffer AVE

artir de mue

l de plasma

o a un tubo

hora a 4ºC.

K. Se incubó

hiocyanate y

Se incubó 1

agregaronn 4

min a temper

rtexeó 10 se

minó todo e

n Qiagen.

los genes

es HLA fue r

del Hospital

y se realizó s

egún el proto

39

estras con ca

caron 140

biente duran

la solución

filtrado. Se

1 minuto. Lu

AW1 (QIAG

iltrado y se

dad (20.000

dorff de 1,5 m

fugó a 6000

en el tubo ep

estras con ca

a un tubo fa

o de ultrace

. Se removió

ó 30min a 55

10µl de Gly

15min a tem

495µl de alc

ratura ambie

egundos. Se

l etanol y se

HLA

realizada po

de Clínicas d

sobre los loc

ocolo descrip

arga viral det

l de plasma

nte 10 minu

total en una

cargaron los

uego se reali

EN) a la colu

agregaron 5

x g) por 3 m

ml. Se agrega

x g durante

ppendorff se

arga viral ind

lcon de 15m

ntrífuga y se

ó el sobrena

5ºC vortexea

ycogen. Se vo

peratura am

cohol isoprop

ente, se desc

centrifugó a

secó al aire

r el laborato

de la Ciudad

ci A y B medi

pto en la ant

tectable

y se agregar

tos y luego

a columna Q

s 630 l rest

izó el lavado

umna y se ce

500 l de buf

minutos. Se

aron a la colu

1 minuto. S

e almacenó e

detectable

ml y centrifug

e llenó con

adante y se a

ando periód

ortexeó suav

mbiente y se

pílico y se vo

artó el sobre

a 21.000g po

e por 10min.

orio del Dr. L

de Buenos A

iante la técn

erior sección

ron 560 l de

se agregaro

QIAamp. Se

tante a la co

o del ARN ad

entrifugó nu

uffer AW2 (Q

descartó el

umna 60 l

Se descartó l

en freezer a

ó 15min a 3.

solución de

agregaron 9

icamente. S

ve y se dio u

trasvasó el

ortexeó 10 s

enadante y s

or 15 min a t

El pellet se

Leonardo Fai

Aires. La mis

nica de sonda

n.

e buffer AVL

on 560 l de

centrifugó a

olumna y se

dherido a la

uevamente a

QIAGEN) a la

filtrado y se

de buffer de

a columna y

20ºC.

.600 rpm. Se

llenado. Se

0µl de agua

e agregaron

un spin para

contenido a

egundos. Se

se agregaron

temperatura

resuspendió

imboin en la

sma fue una

as PCR SSOP

L

e

a

e

a

a

a

e

e

y

e

e

a

n

a

a

e

n

a

ó

a

a

P

II.11

Se ut

neste

termo

II.11.

Los p

forma

Tabla

Nom

1ga

2ga

1ga

2ga

II.11.

El me

dNTP

trans

sustr

mezc

corre

se le

de en

minu

Para

1,5m

25µM

agreg

según

minu

segun

Para

MgCl

1. Amplifica

tilizó la técni

ed PCR, para

ociclador PE

1. Primers u

primers utiliz

a casi compl

II.1. Lista de

mbre

agFw CTAG

agFw TCTC

agRev CAG

agRev TTTC

2. Amplifica

edio de reac

Ps, 10mM D

scripción rev

ato ARN ex

clar (por rea

espondiente

agregaron 6

nzima RT Sup

tos a 72ºC.

el primer ro

M y 0,2mM

M y 0,2µl de

garon a los

n los siguient

to 40 segun

ndos a 72ºC]

el segundo

2 2,5mM y 0

ación de Á

ica de Reacc

a amplificar

RKIN ELMER

utilizados

zados se det

eta (hasta u

primers utiliz

Sec

GCAGTGGCGC

CTCGACGCAG

TCTTTCATTTG

CCACATTTCCA

ación a partir

cción de la re

DTT, 1,6 U/µ

versa. La rea

xtraído segú

acción) 3,45

y 10µl del su

6,16µl una so

perscript II (I

und de amp

M dNTPs. Se

e enzima pol

20µl de pro

tes ciclos: 3

ndos a 72ºC]

], 10 minutos

round de a

0,2mM dNT

cidos Nucl

ción en Cade

la región g

R GeneAmp P

tallan en la

nos 100nt an

zados.

cuencia

CCCGAACAGG

GACTCG

GGTGTCCTTC

AACAGCCC

r de ARN vira

etrotranscrip

µl de la enz

cción se llev

n la técnica

µl de una s

ustrato de AR

olución comp

Invitrogen).

lificación se

tomaron 19

limerasa (Am

ducto de tra

minutos a 95

, 30 ciclos d

s a 72ºC.

mplificación

Ps. Se toma

40

leicos

ena de la Pol

genómica ba

PCR System 9

tabla II.1. E

ntes del extr

P

G

al – Nested R

pción contie

ima RT Sup

vó a cabo en

a descripta

solución 35%

RN extraído.

puesta por 4

La mezcla co

preparó una

9,4µl de esta

mpliTaq DNA

anscripción

5ºC, 5 ciclos

de [15 segun

se preparó

ron 19,7µl d

imerasa (PC

ajo estudio,

9600 (Roche

Estos primer

emo 3´).

osición (gen

629 6

682 7

2044 2

2022 2

RT PCR

ne “Strand"

erscript II (

n un volume

anteriormen

% glicerol 1,

Esta mezcla

µl de 5X Stra

ompleta se in

a mezcla de T

a solución y

A polymeras

reversa y se

de [15 segu

ndos a 90ºC,

una mezcla

de esta soluc

R) en sus va

con los kits

diagnostic S

s permiten

noma HXB2)

650

700

2066

2042

RT Buffer a

Invitrogen) y

en total de 2

nte. El proc

2 mM dNTP

a se incubó 5

and Buffer, 2

ncubó 45 mi

Tris pH 8,3 5

se agregaro

e, Invitrogen

e inició la re

ndos a 95ºC,

15 segundo

a de Tris pH

ción y se agr

riantes nest

s correspond

System).

amplicar el

Aplic

1º round –

2º round –

1º round

2º round

1X, 6% Glice

y 0,5µM de

20µl incluyen

cedimiento c

P, con 0,4µl

5 minutos a 6

2µl de DTT 0,

inutos a 42º

0mM, KCl 25

on 0,4µl de

n). Estos 20

eacción de a

, 15 segundo

os a 56ºC y 1

8,3 50mM,

regaron 0,10

ed RT PCR o

dientes y el

gen gag en

ación

– Forward

– Forward

– Reverse

– Reverse

erol, 0,2mM

el primer de

ndo 10µl de

consistió en

l del primer

65ºC y luego

,1M y 0,16µl

C y luego 15

5mM, MgCl2

cada primer

µl finales se

mplificación

os a 56ºC y 1

1 minuto 40

KCl 25mM,

04µl de cada

o

l

n

M

e

e

n

r

o

l

5

2

r

e

n

1

0

,

a

prime

se ut

prime

II.11.

En lo

enzim

siguió

de elo

0,2m

Polym

de pr

segun

II.12

Para

realiz

se pr

de pr

volum

4ºC O

Luego

de es

4ºC,

incub

mayo

conce

dejó

según

II.13

La re

Warr

Biosy

er 25µM y 0,

ilizó 1µl de p

er round.

3. Amplifica

s casos en q

ma Platinum

ó el mismo p

ongación a 6

M dNTP, 2m

merase. La re

roducto del p

ndo round d

2. Clonado

realizar el c

za la reacción

eparó la me

roducto de P

men final de

O.N.

o se realizó l

stas bacteria

luego 45 seg

bó en agitad

or parte del

entrada de b

O.N. a 37ºC

n protocolo d

3. Secuenci

eacción de s

rington, UK)

ystems).

,104µl de en

producto de

ación utilizan

ue fuera nec

High Fidelity

protocolo de

68ºC. Con res

mMMgSO4, 0

eacción se ll

primer round

e amplificaci

de secuen

clonado de

n de ligación

ezcla de ligac

PCR y al final

10µl. Todo e

la transform

s y se le agr

gundos a 42º

or 1 hora a

sobrenadan

bacterias se

C y se toma

descripto en

iación

secuenciació

y el equip

zima polime

reacción de

ndo enzima p

cesario realiz

y Taq Polym

etallado en e

specto al seg

0,25µM de c

evó a cabo

d. El ciclado t

ión excepto

cias virale

secuencias

n. Para ello se

ción con 5µl

1µl de enzim

el procedimi

ación de bac

egaron 3µl d

ºC y 2 minut

37ºC. Luego

nte y el pelle

plaqueó en

ron las colo

las seccione

ón se llevo a

o de secue

41

erasa (AmpliT

l 1º round. E

polimerasa d

zar una neste

erase. En est

l inciso ante

gundo round

ada primer y

en un volum

térmico fue

la temperatu

es

se utilizo el

e cuantificó

de “2X Rapi

ma “T4 DNA

iento se real

cterias comp

de producto

os a 4ºC nue

o se centrifu

et se resusp

LB agar con

nias blancas

es anteriores

a cabo con

nciación aut

Taq DNA poly

El ciclado tér

de alta fideli

ed RT PCR co

te caso para

rior pero cam

d se preparó

y 0,16 U/µl d

men final de

idéntico al d

ura de elong

vector pGE

en gel del pr

id Ligation B

Ligase” y ag

lizó en hielo

petentes. Pa

de reacción

evamente. Se

ugaron breve

pendió en el

n ampicilina,

s para realiz

s.

el kit Big D

tomática AB

ymerase, Inv

mico es idén

idad de copi

on alta fidelid

el primer ro

mbiando la e

una mezcla

de enzima Pla

25µl utilizan

detallado en

gación que se

EM T [Prome

roducto de P

Buffer”, 1µl d

gua para biol

y la reacción

ra ello se tom

de ligación.

e agregaron

emente las b

l volumen m

y en presen

ar una colon

Dye teminato

BI Prism 310

vitrogen). Co

ntico al deta

a

dad de copia

ound de amp

enzima y la t

con buffer d

atinum High

ndo como su

el inciso ant

e realizó a 68

ega A1360].

PCR a ser clo

del vector pG

logía molecu

n de ligación

mó una alícu

Se incubó 3

80µl de med

bacterias, se

muerto. Esta

ncia de IPTG

ny PCR de 1

or (Applied

00/3100 Ava

omo sustrato

llado para el

a se utilizó la

plificación se

temperatura

de la enzima,

Fidelity Taq

ustrato 2,5µl

erior para el

8ºC.

Primero se

nado. Luego

GEM T, 65ng

ular hasta un

n se incuba a

uota de 20µl

30 minutos a

dio SOC y se

e descartó la

suspensión

G y X Gal. Se

1 solo round

Biosystems,

ant (Applied

o

l

a

e

a

,

q

l

l

e

o

g

n

a

l

a

e

a

n

e

d

,

d

Se m

Big D

3,5

secue

de: 1

fenól

minu

Se ce

se ce

se co

se en

Arbo

II.14

Se ut

del a

Joinin

Máxi

confi

II.14.

Las se

págin

secue

la cer

tabla

II.14.

El ali

BioEd

Clust

el pro

ezclaron 9

Dye Terminat

l Agua esté

enciación se

10 segundos

ica agregand

tos a 2500 x

entrifugó 10

ntrifugó bre

onservó a 4°C

nsamblaron y

r, MI).

4. Análisis F

tilizó una var

análisis parti

ng. Para la

ma Parsimo

rmación de l

1. Secuencia

ecuencias de

na web de

encias corres

rteza de que

II.2

2. Alineamie

neamiento d

dit Sequence

alW. Posteri

ograma Gene

l de la “Mez

tor® v3.1 5x S

ril apirógena

realizó en e

a 96°C, 5 s

do 40 l de e

xg. Se descar

minutos a 2

vemente pa

C para luego

y analizaron

Filogenétic

riada gama d

cular. Para

reconstrucc

onia y de A

los resultado

as de referen

e referencia

Los Álamos

sponden a ge

e son subtipo

ento de secu

de las secue

e Alignment

ormente se

eCutter dispo

cla de Reacc

Sequencing

a) con 1 l d

el termocicla

segundos a 5

etanol 75%, s

rtó el sobren

2000 xg y al p

ra asegurars

o analizar me

mediante e

co

de técnicas d

la caracteriz

ión de relac

Análisis Baye

os mediante

ncia

de cada sub

s National L

enomas vira

os puros y no

uencias

encias con la

t Editor ver

realizó un pa

onible on lin

42

ción de Secue

Buffer, 1 l P

de producto

ador DNA th

55°C y 4 mi

se incubó 15

nadante y se

pellet se le a

se que las m

ediante el AB

el software S

de análisis fil

zación del s

ciones de a

esiano; en g

técnicas ind

tipo viral uti

Laboratory

les completa

o recombina

as referencia

rsión 5.0.9

aso de optim

e en la págin

enciación” (2

Primer corre

o de amplific

hermal cycler

nutos a 60°

minutos al r

e resuspendi

agregaron 10

uestras esté

BI Prism® 31

Sequencher v

ogenético cu

subtipo viral

ncestralidad

general, am

ependientes

ilizadas son a

de la Unive

amente secu

ntes intersu

as de subtipo

(North Caro

mización por

na web de Lo

2 l Big Dye

espondiente

cación a secu

r Perkin Elm

C. Luego se

resguardo de

ó el pellet e

0 l de Hi Di

n en la parte

100 Genetic A

versión 4.0.5

uya aplicació

l se utilizó e

se utilizaro

bas en par

s.

aquellas pub

ersidad de

uenciados y q

btipo. Sus no

o se realizó

olina State

codones del

os Alamos Na

Terminator®

de secuencia

uenciar y la

mer TC 9600

realizó la p

e la luz, se c

n 150 l de

Formamide.

e inferior de

Analyzer. Las

5 (Gene Cod

ón dependía

el método d

on las meto

alelo a fin

blicadas com

California, U

que por lo ta

ombres se d

mediante e

University)

l alineamien

ational Labo

® v3.1, 2.5 l

ación 4µM y

reacción de

en 25 ciclos

precipitación

entrifugó 30

etanol 70%.

. Finalmente

cada tubo y

s secuencias

des Co., Ann

del objetivo

de Neighbor

odologías de

de obtener

o tales en la

USA. Dichas

anto se tiene

etallan en la

el programa

Algoritmo

to mediante

ratory.

l

y

e

s

n

0

.

e

y

s

n

o

r

e

r

a

s

e

a

a

o

e

Ta

II.14.

Se re

comp

que

conse

tama

herra

obten

abla II.2. Secu

SubtipoViral

A1

A2

B

C

D

3. Análisis d

ealizó el an

parar el porc

se encuentr

enso por su

ño ajustable

amienta es ú

nido para un

uencias de ref

Secue

A1.KE.94.Q23

A1.SE.94.SE72

A1.UG.85.U45

A1.UG.92.92U

A2.CD.97.97CD

A2.CD.97.97CD

A2.CY.94.94CY

B.FR.83.HXB2_

B.US.83.RF_AC

B.US.86.JRFL_A

B.US.90.WEAU

C.BR.92.92BR0

C.BW.96.96BW

C.ET.86.ETH22

C.IN.95.95IN21

D.CD.83.ELI_A

D.CD.83.NDK_

D.CD.84.84ZR0

D.UG.94.94UG

de similitud

álisis media

centaje de si

ra alineada.

btipo y ana

e) que se m

útil para iden

na secuencia

ferencia de su

de cara

encia Referencia

17_ACC_AF0048

53_ACC_AF0696

55_ACC_M62320

G037_ACC_U511

DKS10_ACC_AF28

DKTB48_ACC_AF

Y017 41_ACC_AF

_ACC_K03455

CC_M17451

ACC_U63632

U160_ACC_U2113

025_ACC_U52953

W0502_ACC_AF1

220_ACC_U46016

1068_ACC_AF067

ACC_K03454

_ACC_M27323

085_ACC_U8882

G114_ACC_U8882

ante el prog

imilitud de u

Si existen

liza la simili

ueve por pa

ntificar posib

no recombin

43

ubtipos virale

acterización d

885

670

190

86241

286238

286237

35

3

10967

6

7155

2

24

grama Simpl

una secuenc

más de una

itud a lo lar

asos (tambié

bles recombi

nante y el ob

es utilizadas p

de subtipo vira

SubtipoViral

F

G

H

J

K

lot 2.5 (199

ia incógnita

a secuencia

rgo de la se

én ajustable

nantes. En l

btenido para

ara realizar lo

al.

Secuen

F1.BE.93.VI850_

F1.BR.93.93BR0

F1.FI.93.FIN9363

F1.FR.96.MP411

F2.CM.95.MP25

F2.CM.95.MP25

G.BE.96.DRCBL_

G.FI.93.HH8793

G.NG.92.92NG0

G.SE.93.SE6165_

H.BE.93.VI991_A

H.BE.93.VI997_A

H.CF.90.90CF056

J.SE.93.SE7887_

J.SE.94.SE7022_

K.CD.97.EQTB11

K.CM.96.MP535

97 1999 Stu

con las disti

referencia

cuencia med

s) a lo largo

a figura II.1.

una recomb

Figura II.

realizado

Simplot

observa e

de subtip

análisis

recombina

os análisis filo

cia Referencia

_ACC_AF077336

20.1_ACC_AF005

3_ACC_AF075703

1_ACC_AJ249238

5_ACC_AJ249236

7_ACC_AJ249237

_ACC_AF084936

12.1_ACC_AF06

83_ACC_U88826

_ACC_AF061642

ACC_AF190127

ACC_AF190128

6_ACC_AF005496

_ACC_AF082394

_ACC_AF082395

1C_ACC_AJ24923

5_ACC_AJ249239

art C. Ray,

intas referen

por subtipo

diante una v

o del alineam

se observa

binante.

1. Análisis

mediante e

2.5. A la

l análisis de u

po B y a la

de una

ante BF

ogenéticos

5494

3

6

7

1641

6

6

5

M.D.) para

ncias con las

o, realiza un

ventana (de

miento. Esta

el resultado

de similitud

el programa

izquierda se

una secuencia

a derecha el

secuencia

a

s

n

e

a

o

d

a

e

a

l

a

En am

claram

inters

II.14.

La téc

los re

que s

un á

incóg

y una

secue

un ej

Para

con la

de Bo

una v

Fi

se

II.14.

II.14.

El an

Evolu

mbos casos

mente mayo

subtipo) que

4. BootScan

cnica de Boo

esultados ob

se desplazan

rbol filogen

gnita, las dos

a cuarta qu

encia incógn

e x que repr

asegurar qu

a muestra in

ootScanning

ventana de 1

gura II.2. Aná

ecuencias ana

5. Árboles F

5.1. Método

nálisis filoge

utionary Gen

se observa

or (similitud

e aparecen ag

nning

otScanning fu

tenidos por

escaneando

ético por N

s involucrada

ue actúa co

ita y cualqui

esenta las po

ue una mues

ncógnita, con

de una mue

140pb y paso

álisis de BootS

alizadas en la f

a la

ilogenéticos

o de Neighbo

nético basa

netics Analy

que la simi

intrasubtipo

grupadas a n

ue realizada

el análisis de

o el alineami

Neighbor Join

as en la reco

mo outgrou

iera de las se

osiciones de

stra es recom

n un valor ig

estra de sub

os de 20pb.

Scanning real

figura 2.2. A la

derecha el an

s

or Joining.

do en este

ysis versión

44

ilitud con la

o) que la sim

niveles inferi

con el progr

e similitud co

ento pero en

ning bajo e

ombinación (

up. El valor

ecuencias re

la secuencia

mbinante de

gual o superi

btipo B y de

izado median

a izquierda se

nálisis de la se

método se

2.1, de Kum

a referencia

militud con e

ores.

rama Simplo

on el mismo

n vez de hac

el modelo d

determinada

de bootstra

eferencia es

a.

ebe haber un

or a 75. En l

una recomb

nte el program

observa el an

cuencia recom

e realizó co

mar, Tamura

del subtipo

el resto de l

t 2.5 y confie

programa. U

er un análisi

e K2P entre

as por el aná

ap de los c

registrado y

n cambio de

la figura II.2.

binante BF. P

ma Simplot 2.

nálisis de la se

mbinante BF

n el progra

a, Jakobser

a la que p

as referenci

ere soporte e

Utiliza tambi

s de similitu

e cuatro se

álisis de simi

lados conte

graficados a

e la referenc

. se muestra

Para el análi

5 sobre las m

ecuencia de su

ama MEGA3

y Nei) bajo

pertenece es

as (similitud

estadístico a

én ventanas

d, construye

cuencias: la

litud previo)

niendo a la

a lo largo de

cia agrupada

un ejemplo

sis se utilizó

ismas dos

ubtipo B y

3 (Molecular

o el modelo

s

d

a

s

e

a

)

a

e

a

o

ó

r

o

evolu

réplic

II.14.

El an

http:/

analiz

“Tree

de 10

Los c

fuero

fusio

15 ho

largo

II.14.

El an

cabo

por c

se res

descr

II.14.

La es

(Univ

http:/

simul

mode

Swoff

árbol

reloj

gene

con 1

caden

in” de

utivo K2P, T/

cas de remue

5.2. Método

nálisis filoge

//www.zmuc

zar grandes

e Drift” y “Se

00 secuencia

iclos de T R

on almacena

nados con lo

oras y los a

era posible,

5.3. Método

álisis filogen

2 corridas in

corrida con u

sumieron en

ripto en la sig

6 Estimación

stimación de

versity of A

//beast.bio.e

laciones de

elo de subst

ford (Smiths

l inicial cons

molecular re

raciones par

10 millones

nas indepen

e 2 o 3 millo

/t: 2.0. Com

estreo.

o de Máxima

nético basa

c.dk/public/

conjuntos d

ectorial Searc

as de adició

Df SS fueron

ados para

os árboles ob

rboles resul

, al menos ba

o de Análisis

nético basad

ndependient

un periodo “b

n un árbol co

guiente secc

n del tiempo

e este parám

Auckland, A

ed.ac.uk]. E

Monte Carlo

titución nuc

sonian Instit

truido a par

elajado no c

ra optimizar

de generac

dientes de M

ones de gene

mo prueba e

a Parsimonia

do en este

phylogeny/T

de datos [21

ch” (T R Df S

n aleatoria (

n aplicados t

alimentar la

btenidos en

tantes fuero

ajo nuestras

s Bayesiano.

o en este m

tes con 4 u 8

burn in” de

onsenso de m

ción.

o al ancestro

metro se real

Auckland, N

El programa

o. Para este

cleotídica fue

tution, Wash

rtir del méto

correlacionad

los diferent

iones para

Markov, cada

eraciones se

45

estadística s

a.

método se

TNT). Este p

]. Utilizamos

SS) aplicado

(RAS) seguid

res veces a c

as rondas

cada RAS+TB

on fusionado

condiciones

método se re

8 cadenas de

2 millones. E

mayoría. Tam

o común más

izó con el p

ew Zealand

a utiliza un

análisis se a

e obtenido

hington DC,

odo bayesian

do Log Norm

tes operado

mejorar las

a una de 10

gún el caso.

e utilizó el

e realizo con

programa im

s una combi

sucesivame

do por “Tree

cada RAS+TB

subsiguiente

BR. Este esqu

os para veri

s experiment

ealizó con el

e acuerdo al

El conjunto d

mbién se utili

s cercano (TA

rograma BEA

d) y A. Ra

n análisis d

asignó el año

mediante e

USA); http

no de coales

mal. Se realiz

res. Entonce

optimizacio

millones de

La muestra

método de

n el progra

mplementa n

nación de “T

nte a los me

e Bisection R

BR. Los mejor

es de T R D

uema fue re

ficar que ni

tales.

programa M

caso, y 10 m

de árboles d

zó el program

ACMC).

AUti/BEAST

mbaut (Un

de cadenas

o de muestr

l ModelTest

://paup.csit.

cencia “Skyl

zó una corrid

es nuevos an

nes. La corr

generacione

posterior fu

Bootstrappi

ma TNT (di

nuevas tecno

Tree Fusing”

ejores árbole

Reconection”

res árboles d

Df SS, es de

petido 10 ve

ngún mejor

Mr. Bayes. S

millones de g

e la muestra

ma BEAUti/B

v1.4.8 [A. J.

iversity of

de Markov

reo a cada s

t[88] y PAUP

.fsu.edu/]. S

line” bajo un

da inicial de

nálisis fuero

rida final co

es con un pe

ue analizada

ing con 500

sponible en

ologías para

”, “Ratchet”,

es obtenidos

” (RAS+TBR).

de cada ciclo

ecir, fueron

eces durante

amiento del

Se llevaron a

generaciones

a “posterior”

BEAST v1.4.8

Drummond

Edinburgh);

v mediante

secuencia. El

P4.0b1 [D.L.

Se utilizó un

n modelo de

1 millón de

n realizados

nsistió de 8

riodo “burn

mediante el

0

n

a

,

s

.

o

n

e

l

a

s

”

8

d

;

e

l

.

n

e

e

s

8

l

progr

Auck

con e

trans

los la

"):0;"

por "

una d

corrid

De e

arbol

mayo

II.15

II.15.

Este

cabo

prese

consi

conse

dond

esper

utiliza

Al mi

con u

con “

asoci

inflad

posit

proba

falsam

sea m

de ti

consi

rama Tracer

land, Auckla

el programa

sforman las s

rgos de ram

" por ");"; es

" nombrema

de las 8 sal

das con el co

sta manera

les (que cor

oría 50.

5. Análisis e

1. Análisis p

análisis fue

un análisis u

encia o ause

derando “po

enso del con

e al menos

rado menor

amos el valo

smo tiempo

una potencia

“backward e

aciones que

da con análi

ivos desarro

abilidad aju

mente la hip

mayor del 20

ipo Bonferro

deramos po

r v1.4.1 [A. R

and, New Ze

a Mr.Bayes s

salidas del B

a) y después

decir, sacar

triz.nex.runx

idas del BEA

omando MrB

MrBayes le

responden a

estadístico

para la identi

desarrollado

univariado de

encia de po

olimorfismo”

njunto de da

una de las

r a 4,5. Ento

or p obtenido

estimamos

a menor al 30

elimination”

e tuvieran u

isis de signif

ollado por

ustados. La

pótesis nula (

0%) y tiene a

oni que con

otenciales m

Rambaut (U

ealand); http

siguiendo e

BEAST a form

s se edito co

rle el “:0”. En

x.t " donde “

AST. Entonce

Bayes> mcmc

ee las 8 salid

a las primer

o

ificación de

o basándono

e asociación

limorfismos

” a aquellos

atos. Previam

cuatro celd

onces llevam

o como filtro

la potencia d

0%. Luego d

considerand

n valor p m

ficancia múl

Benjamini

aproximació

(esto es, la t

algunas vent

ntrolan el ll

utaciones de

46

niversity of

p://beast.bio

l procedimie

mato Nexus (

nWord de m

ntonces se c

“runx” pued

es se ejecut

cp nruns=8,

das transfor

as 2 millone

potenciales

os en el desc

entre la pre

en cada un

residuos am

mente al aná

as de una t

mos a cabo

, eliminando

del análisis p

esarrollamo

do los alelo

menor a 0,05

tiple, el pro

y Hochberg

ón lineal c

asa de ident

tajas (incluye

amado “fam

e escape CTL

Edinburgh)

o.ed.ac.uk]; y

ento descrip

(esto se hace

manera de re

ambia el nom

de ser run1 o

ta la matriz

luego se eje

madas del B

es de genera

mutaciones

cripto por M

esencia o aus

na de las po

inoacídicos d

álisis, se elim

abla de dos

un análisis

o aquellas as

para cada pa

s un análisis

os HLA como

5. Luego, pa

ocedimiento

g fue aplica

ontrola la

tificación de

endo mayor

mily wise er

L a aquellos

and A. J. Dr

y el consens

pto a contin

e con el pro

eemplazar al

mbre a cada

o run2 o run

en el MrBa

cuta el coma

BEAST, remu

aciones) y d

de escape C

Moore et al[1

sencia de los

osiciones ana

distintos al p

minaron aque

por dos tu

por la pru

ociaciones c

r bajo anális

multivariad

o regresores

ra controlar

de tasa de

ado para c

proporción

falsos positi

potencia) so

rror rate”. E

polimorfism

rummond (U

so de mayor

nuación: Inic

grama PAUP

final de cad

a una de las

n3 hasta run

ayes, y se de

ando sumt b

ueve los pri

evuelve el c

CTL

17]. Primero

s distintos ale

alizadas en

presente en

ellos pares H

viera un nú

eba exacta

on un valor

is y eliminam

o por regres

s mantenien

r la tasa de

identificació

calcular los

esperada d

vos es esper

obre los pro

En el presen

mos que tuvi

University of

ría obtenido

cialmente se

P guardando

a árbol cada

ocho salidas

n8 para cada

eterminan 8

burnin=2000.

meros 2000

consenso de

, llevamos a

elos HLA y la

el gen gag,

la secuencia

HLA posición

mero real o

de Fisher y

mayor a 0,1.

mos aquellos

sión logística

ndo aquellas

error tipo I

ón de falsos

valores de

de rechazar

rable que no

cedimientos

nte estudio,

eran al final

f

o

e

o

a

s

a

8

.

0

e

a

a

,

a

n

o

y

.

s

a

s

I

s

e

r

o

s

,

l

vez c

estad

la DM

II.16

Estas

evalu

fuero

estim

IFN

II.16.

Para

anális

según

a una

ml re

Millip

lavan

ello s

segun

PBS.

tanto

Newb

pépti

PMA/

luego

RPMI

dispe

react

de PM

se lav

diluci

previ

calculado el

dístico para l

MS (es decir,

6.Medición

s mediciones

uó en ensayo

on marcadas

mulación in vi

.

1. ELISPOT p

esta metod

sis. Todo el

n procedimie

a concentrac

ecostado 5 g

pore IP agre

ndo 3 veces

se diluye el a

ndo día se co

Luego se ag

o se prepara

bawer y se

idos se prep

/Ionomicina

o se la diluye

I completo 1

ensan 50µl d

tivos corresp

MA/Ionomic

van las placa

ión 1/250 d

amente filtr

estadístico

os mismos g

ahora la incó

n de los niv

s se realizar

os in vitro de

s con tetrám

itro con el p

para IFN .

dología se u

ensayo tien

ento detallad

ción final de 4

rados sobre

egando 50µl

con buffer P

anticuerpo 1

omienza con

regan 150µl

an las célula

las resuspe

paran en un

que se prep

e 1/100 hac

1% DMSO. Fi

e las corresp

pondientes, t

ina y control

as 3 veces co

de anticuerp

ado en poro

de Fisher,

grados de lib

ógnita es el “

veles de re

on mediante

e ELISPOT p

meros sintét

éptido espec

utilizaron pé

ne una dura

do anteriorm

4 millones p

la horizonta

l de etanol

PBS. Luego s

1/200 en PBS

n el “bloqueo

de medio R

s, lo péptid

nde en una

na concentra

para partiend

cia una soluc

nalizada la i

pondientes s

tanto péptid

l negativo. La

on una soluc

po de detec

o 0,22µM a f

48

se determi

bertad con lo

“1 ” del est

espuesta in

e tres meto

ara la libera

ticos para l

cífico seguid

éptidos sinté

ción de tres

mente. Se lav

ormililitro. S

al. En paralel

puro a cad

se realiza el

S y se dispe

o de la placa

RPMI comple

os y los con

concentrac

ación de 200

do de una so

ción final 2X

ncubación d

suspensione

os a evaluar

a placa así co

ción PBS 0,0

cción biotin

fin de remov

na el valor

os que fue o

tadístico).

nmune HIV

dologías dis

ción de IFN

os epítopes

a de una ma

éticos para

s días. El pri

van dos vece

Se incuban O

lo se realiza

a pocillo a

recubrimien

nsan 60µl po

a” removiend

eto 10%SFB y

ntroles: las c

ción de 4 m

0mM. Como

lución 200X

X. El control

e la placa, se

s celulares a

r (al menos e

onstituida se

05%Tween20

ilado (BD, c

ver impureza

p como la

btenido el v

V especifica

stintas: inicia

. Por otro

s reconocido

arcación por

los distinto

imer día se

s y resuspen

O.N. a 37ºC e

la activación

utilizar, vol

nto con antic

or pocillo y

do el anticue

y se incuba

células se la

illones de c

o controles

(PMA 1/100

negativo es

e descarta e

a las cuales s

en duplicado

e incuba O.N

0 y luego se

cat 51 1690

as presentes

probabilida

alor crítico p

a

almente la r

lado muestr

os y tambié

citometría d

os epítopes

descongelan

nden en med

en tubo tipo f

n de la placa

cándolo ráp

cuerpo de ca

se incuba O

erpo y lavand

1 hora a 37º

as cuenta en

células por m

se usa una

00, Ionomicin

una solució

l medio bloq

se les agrega

o) como con

. a 37ºC. En

dispensan 1

0KZ) en me

en el SFB. L

ad de dicho

para calcular

respuesta se

ras positivas

én mediante

de flujo para

virales bajo

n las células

dio completo

falcon de 15

a de ELISPOT

pidamente y

aptura. Para

.N. a 4ºC. El

do 1 vez con

ºC. Mientras

n cámara de

mililitro. Los

solución de

na 1/10) que

ón de medio

queante y se

a 50µl de los

trol positivo

el tercer día

00µl de una

dio 10%SFB

Las placas se

o

r

e

s

e

a

o

s

o

5

T

y

a

l

n

s

e

s

e

e

o

e

s

o

a

a

B

e

incub

0,05%

hora

veces

indica

revel

posit

lecto

aque

CMSP

II.16.

Para

estuv

expre

célula

comp

falcon

1,5m

pépti

medi

de an

15 m

a una

siguie

rema

antic

en os

muer

suave

vorte

prepa

aprop

volum

ban 2 horas

%Tween20. L

a temperatu

s con una s

aciones del

ado se deti

ivos. Las me

r de placas d

llas muestra

P luego de s

2. Estimulac

esta metod

vieran dispon

esan el HLA p

as según pro

pleto a una c

n de 15 ml r

ml se incuban

ido durante

o de cultivo

nticuerpo an

l recostado 5

a concentrac

ente se lava

anente del ú

uerpos apro

scuridad y lu

rto remanen

emente. Se

exeando entr

ara una sol

piada de an

men de soluc

s a temper

Luego se disp

ura ambiente

olución de

proveedor y

ene con ag

embranas se

de ELISpot Im

con un valo

er sustraído

ción in vitro /

dología se u

nibles. Cuan

para el cual

ocedimiento

concentració

recostado 5 g

n 100.000 cé

1 hora a 37º

conteniend

ti CD49d. Est

5 grados sob

ción final de

an las célula

último lavado

piados y det

uego se lava

nte del últim

incuba 20 m

re cada lava

ución de m

nticuerpo es

ción posible.

ratura ambi

pensan 100µ

e. Luego se

PBS solo. Se

y utiliza com

ua corriente

e dejan seca

mmunospot S

or promedio

el promedio

/ análisis po

utilizaron lín

do no estuv

el péptido a

detallado a

ón final de 4

grados sobre

lulas B autól

ºC. Luego se

o 10% de su

ta suspensió

bre la horizo

10ug/ml y se

s 2 veces co

o. En un tot

tallados en la

an 2 veces co

mo lavado, se

minutos a 4

ado el volum

marcado con

specífico pa

. Se agrega l

49

iente y lue

µl de una dilu

lava 3 veces

e prepara el

mo revelado

e cuando se

ar a tempera

Series 3A An

de sus réplic

o de los nega

or citometría

neas de linf

vieran dispon

estudiar po

anteriorment

4 millones po

e la horizont

ogas en un m

lavan las lín

uero fetal bo

ón se incuba

ntal. Pasado

e incuba ent

on medio R

tal de 50µl

a sección “R

on medio RP

e agregan 10

ºC en oscur

men muerto

el buffer P

ara las citoq

a solución d

go se lavan

ución 1/800

s con una so

l sustrato A

r dispensand

e observa p

atura ambie

alyzer (CTL A

cas que resul

ativos.

a de flujo.

ocitos B au

nibles, se uti

osee restricci

te. Se lavan

or mililitro. S

tal. En el seg

medio conte

eas B y se le

ovino, 1ug/m

a 37ºC dura

o el tiempo d

re 5 y 6 hora

PMI, y se re

se marcan

Resultados”. S

PMI. Las cél

00µl del rea

ridad y se la

remante pa

Perm/Wash

quinas intra

e marcado a

n 3 veces

en PBS de Av

lución PBS 0

EC (BD cat

do 75µl por

ositividad in

nte O.N. y l

Analyzers). S

ltara mayor a

tólogos en

ilizaron linfo

ión. El prime

dos veces y

Se incuban O

gundo día, en

niendo una c

e agregan 50

ml de anticue

nte 1 hora e

de incubación

as. Luego se

esuspenden

las molécula

Se incuba du

ulas se resu

ctivo Cytofix

ava 2 veces

ra asegurar

como solve

acelulares n

a cada tubo y

con una so

vidina HRP y

0,05%Tween2

t 551951) de

pocillo. La

ntensa de lo

uego se ana

e considerar

a 5 puntos c

aquellos ca

ocitos B hete

er día se desc

y resuspende

O.N. a 37ºC e

n un tubo ep

concentració

0.000 CMSP

erpo anti CD

en un tubo ti

n se agrega

incuba O.N.

en el volum

as de superf

urante 30 m

uspenden en

x/Cytoperm

son buffer

la homogen

ente y con

ecesarias en

y se incuban

olución PBS

y se incuba 1

20 y luego 2

e acuerdo a

reacción de

os controles

alizan en un

ron positivas

ada 100.000

asos en que

erólogos que

congelan las

en en medio

en tubo tipo

ppendorff de

ón 20µM del

s en 1 ml de

28 y 1ug/ml

po falcon de

Brefeldina A

a 4ºC. Al día

men muerto

ficie con los

inutos a 4ºC

el volumen

y se mezcla

Perm/Wash

neización. Se

la cantidad

n el menor

n 30 minutos

S

1

2

a

e

s

n

s

0

e

e

s

o

o

e

l

e

l

e

A

a

o

s

C

n

a

h

e

d

r

s

a 4ºC

medi

en 20

de flu

tubos

linfoc

estim

II.16.

II.16.

Día 1

antib

Día 2

agita

incub

400m

Día 3

medi

la mu

900µ

fuert

final

homo

como

almac

La su

pellet

homo

alred

La su

caso

react

C en oscurid

ante una su

00µl finales p

ujo BD FACS

s de 1,5 ml y

citos B y es

mulando las C

3. Marcació

3.1. Prepara

1: Se plaquea

biótico aprop

2: Se transfie

dor durante

bación se tra

ml de medio

3: Se enfría la

o ZYP 5052

uestra para u

µl de la sus

emente. Lue

de 500µl a

ogéneament

o último recu

cena a 20C

spensión ba

t bacteriano

ogeneización

edor de 60m

spensión se

de que el

tivos por sep

dad. Durante

ave agitació

para ser ana

SCanto Flow

y los lavado

stimulando c

CMSP con lín

n de CTLs pé

ación de los c

an bacterias

piado y se inc

ere 1 coloni

e 6 a 8 hora

ansfieren 150

ZYP 5052 y s

a suspensión

de la suspen

un subsecue

pensión bac

ego se agreg

la cual se le

te disuelto; e

urso sonicarl

para posteri

cteriana se c

se resuspen

n, proceso q

ml.

transfiere a

volumen fu

parado: 1,2m

e los 30 min

ón. Finalmen

alizadas en e

w Cytometer

s se realizar

con una sol

neas B no sen

éptido espec

cuerpos de i

BL21 transf

cuban O.N. a

ia de la plac

s o hasta ve

0µl de la sus

se incuba O.

n bacteriana

nsión utilizan

ente análisis

cteriana y e

an 200µl de

e agrega 1µl

en caso de ve

lo 2 a 3 minu

or análisis.

centrifuga 30

nde en 10 m

que puede d

un agitador

era menor.

ml de lysozim

50

nutos de inc

te se lavan

l equipo de

(BD Bioscie

ron con volú

lución de P

nsibilizadas.

cíficosmedia

inclusión

formadas y a

37ºC.

ca de agar a

er el medio

spensión bac

N. en agitad

a y se mide l

ndo como bl

de proteínas

el pellet se

agua y 250µ

de DTT. Fin

er ADN no h

utos con las

0 minutos a

l de Buffer d

emorar hast

magnético c

Mientras se

ma 50mg/ml,

cubación se

2 veces con

citometría. E

ences). Toda

menes de 1

MA/Ionomic

ante la técni

almacenadas

a 1ml de m

turbio pero

cteriana a un

or a 37ºC.

a absorvanc

lanco una m

s totales por

resuspende

µl de solució

nalmente se

omogeneiza

muestras en

4000xg y a 4

de resuspens

ta 30 minut

con barra de

e lo agita s

600µl de M

mezclan en

buffer Perm

El análisis se

as las marca

ml. El contro

cina. El cont

ica de tetrám

s en glicerol

edio P 0,5G

o no saturad

n erlenmeye

cia a 600nm

muestra del m

r SDS PAGE.

e en 50µl d

n 2x SDS SB

confirma qu

do se debe v

nfriadas en h

4ºC. Se deca

sión (con DT

os. El volum

e plástico y s

se agregan e

gCl2 1M, 3m

períodos de

m/Wash resu

e realiza en u

aciones se re

ol positivo s

trol negativo

meros

en placa LB

y se incuba

o. Pasado e

r de 1 litro c

de una diluc

medio. Luego

Para ello se

de agua y

para tener u

ue el ADN s

vortexear fu

hielo. El ADN

nta el sobre

TT fresco). Se

men final deb

e lleva a 60m

en goteo lo

ml de Dnasa

e 5 minutos

uspendiendo

un citómetro

ealizaron en

e realizó sin

o se realizó

B agar con el

a a 37ºC en

el tiempo de

conteniendo

ción 1:10 en

o se prepara

centrifugan

se vortexea

una solución

e encuentre

ertemente y

N disuelto se

nadante y el

e agita hasta

bería ser de

ml finales en

s siguientes

I 2mg/ml en

s

o

o

n

n

ó

l

n

e

o

n

a

n

a

n

e

y

e

l

a

e

n

s

n

glicer

mant

Esta

minu

a 2 m

buffe

visibl

resus

sobre

una s

mas

2720

se tra

calcu

Finalm

en ni

se co

1:150

II.16.

Día 1

agreg

pépti

(En g

utiliza

inclus

alícuo

se re

los co

remo

agita

y bajo

rol 50% con

tiene por uno

suspensión

tos a 27200x

ml de buffer

er de lavado.

emente lim

spende en b

enadante y e

solución de

volumen. De

0xg por 15 m

ansfiere a un

la la concent

mente se ali

trógeno líqu

orre un gel 1

0 o 1:200 en

3.2. Prepara

1: Se colocan

gan 400µl de

ido para el c

general se ut

arse tambié

sión cargand

otas de 250n

pite el mism

ontenidos d

olino formad

ción. La solu

o agitación c

teniendo 75

os 15 a 20m

se sonica po

xg por 10 mi

de lavado y

Se repiten l

pio, realizan

buffer de la

el pellet se re

Urea 8M pr

e esta mane

minutos a 4º

n tubo de 50

tración de pr

cuotan 250n

uido. Para co

10% o 12% S

SDS SB con

ación de los

n 200ml de

e PMSF 100

cual el tetrám

tilizan unos

n) y se agre

do una jerin

nmoles de cu

mo procedimi

e ambas jer

do en el buf

ción así prep

continua a 80

5mM NaCl, 1

minutos.

or 1,5 minut

inutos. Luego

se disocia c

os pasos de

ndo todo el

avado sin T

esuspende e

eparada en

era los cuerp

ºC y el sobre

0ml. A parti

roteínas mid

nMol (500nM

onfirmar la ef

SDS PAGE de

DTT de la so

monómeros

buffer de p

mM, 307,3m

mero se dese

12mg de pé

ega al buffe

ga con 2 a

uerpos de in

iento para 5

ringas (el de

ffer de pleg

parada se de

0 rpm.

51

1,2ml de Tri

tos con inter

o se descart

con una barr

sonicado, ce

procedimie

Triton X y s

en 500µl de a

el momento

pos de inclu

enadante con

r de una dil

diendo absor

Mol para B2m

ficiencia del

e la muestra

lución final d

s biotinilados

plegado en u

mg de glutat

ea sintetizar

éptido aunqu

er de plegad

3 ml de buf

nclusión prep

00nmoles de

e la cadena

gado que co

eja agitando

ton X 100 y

rvalos de 0,5

a el sobrena

ra de plástic

entrifugado y

ento a 4ºC.

se centrifug

agua bidesti

o, típicamen

usión se solu

nteniendo lo

ución 1:100

rvancia entre

m) en tubos d

proceso de

a inicial y de

de cuerpos d

s

una botella

ión reducido

r se disuelve

ue cantidade

do bajo agit

ffer de inyec

parados segú

e la cadena

pesada y el

ontiene el p

unos minuto

y 600µl de D

5 segundos.

dante y el p

o para luego

y lavado has

Cuando el

a igual que

lada. A esta

te 3 a 5 ml

ubilizan. La s

os cuerpos d

(2µl en 200

e 240nm y 32

de 1,5ml y se

purificación

e una dilució

de inclusión.

bajo agitació

o y 61,3mg

en la cantid

es tan bajas

tación. Se p

cción y luego

ún el protoco

liviana 2m.

de la caden

péptido acel

os mas y lueg

DTT 1M. La

Luego se ce

ellet se resu

o agregar ot

ta que se log

pellet se ve

e antes. Se

suspensión

aunque pue

solución se

e inclusión s

0µl final de U

20nm.

e congelan r

de cuerpos

ón de aproxi

ón magnétic

de glutatión

dad apropiad

como 1 a 2

reparan los

o agregando

olo anterior.

Finalmente,

na liviana) a

erando la v

go se incuba

agitación se

entrifuga 10

spende en 1

ros 30ml de

gre un pellet

e blanco, se

decanta el

se le agrega

ede requerir

centrifuga a

solubilizados

Urea 8M) se

rápidamente

de inclusión

madamente

ca. Luego se

n oxidado. El

da de DMSO

2mg pueden

cuerpos de

o una de las

. En paralelo

, se inyectan

al centro del

velocidad de

O.N. a 10ºC

e

0

1

e

t

e

l

a

r

a

s

e

e

n

e

e

l

O

n

e

s

o

n

l

e

C

Día 2

250n

anter

Pasad

y se i

Día 3

preci

hasta

Seph

luego

recup

100m

enzim

Día 4

tama

utiliza

Día 5

tubo

de H

1ml n

hace

320n

se co

Día 6

Se di

solam

se co

el tra

indica

corre

II.16.

: Como prim

moles de la

rior. Nuevam

das las horas

ncuba O.N. a

3: La reacció

pitado agreg

a tener men

adex PD 10

o 2,5ml de m

peran de la c

mM, 10µl de

ma BirA 2mg/

4: La reacción

ño en colum

ando un tub

: La solución

a menos de

PLC para rea

nuevamente

una dilución

m para calcu

ngelan rápid

6: Se realiza l

ivide en dos

mente buffer

rren en un g

atado con e

ador de qu

espondiente

3.3. Armado

mer paso se c

cadena pesa

mente se inc

s de agitació

a 10C con ag

ón de plegad

gado. Luego

os de 5ml d

G 25M (inic

muestra con

columna y lu

e leupeptina

/ml. Se mezc

n de biotinila

mnas S300. L

o falcon con

n concentrad

1ml, se extr

alizar la crom

en los mism

n 1:50 o 1:10

ular la conce

damente con

la prueba de

s tubos: a u

r a fin de util

gel SDS PAGE

streptavidin

ue el proce

al monómer

o de los tetrá

coloca la solu

ada se agreg

cuba a 10ºC

n se repite p

gitación.

do se centri

se coloca en

de solución.

cialmente se

ncentrada y

ego se llevan

1mg/ml, 10

cla suavemen

ación se filtr

Las fraccione

filtro incluid

da se resuspe

rae del tubo,

matografía d

mos tubos y s

00 de 1 o 2 µ

entración de

n nitrógeno l

e biotinilació

uno de ellos

izar como co

E (sin calenta

a correspon

dimiento fu

ro (31 a 36 kD

ámeros

52

ución de ple

ga a la solució

C y bajo agit

por tercera v

ifuga a 15 m

n un concent

Luego se re

pasan 25 m

finalmente 3

n a 10ml y se

0µl de pepst

nte por inve

a con jeringa

es de interés

do.

ende en Tris

, se lleva a 1

de intercamb

se lava 2 vece

µls de la solu

monómeros

íquido.

n diluyendo

s se le agre

ontrol. Se inc

ar ni agregar

ndientes a m

ue eficiente.

Da).

gado bajo ag

ón siguiendo

tación conti

vez el agrega

minutos a 2

trador por fil

ealiza el inte

ml de buffer

3,5ml de buf

e agregan: 10

tatina 1000x

rsión y se inc

a y se realiza

s se recolecta

20mM pH8,

0ml con Tris

bio aniónico.

es con buffer

ución final y

s. Se alicuota

una fracción

egan 10µl d

cuban por 30

r DTT al prep

monómeros,

. El control

gitador magn

o el mismo p

nua de 70º

ado de 250nm

5000xg a fin

tración y pre

ercambio de

de biotinilac

uffer de bioti

00µl de ATP

x, 20µl de P

cuba O.N. a t

a una croma

an y se conc

, se vuelve a

s 20mM pH 8

. El eluido se

r de almacen

se mide abs

a en fraccion

n de 3 a 5 µ

e estreptav

0 minutos a t

parado). La p

dímeros, tr

debe tene

nético y otra

procedimient

rpm entre 6

moles de cad

n de remov

esión de nitr

buffer en u

ción para eq

inilación). U

100mM, 40µ

PMSF 100mM

temperatura

tografía de e

centran a me

concentrar

8 y se carga e

e concentra

namiento. Fi

sorvancia ent

nes de 200ug

ls y se diluye

idina 1mg/m

temperatura

resencia de

ímeros y tet

er solament

a alícuota de

to que el día

6 y 8 horas.

dena pesada

er cualquier

rógeno a 4ºC

una columna

quilibrarlas y

nos 7 ml se

µl de biotina

M y 10µl de

a ambiente.

exclusión de

enos de 1ml

en el mismo

en el equipo

a menos de

nalmente se

tre 240nm y

g cada una y

e a 0,4ug/µl.

ml y al otro

a ambiente y

4 bandas en

trámeros es

te la banda

e

a

.

a

r

C

a

y

e

a

e

e

l

o

o

e

e

y

y

.

o

y

n

s

a

Finalm

y se

(16,5

otros

II.17

El mo

prese

detec

infecc

Dicho

trans

utiliza

la ep

prese

El mi

softw

micro

En es

negat

indivi

mues

proba

repite

pued

diagn

que r

la sim

los in

de ca

viral

SIDA

indivi

mente para

agrega por

µl cada 10m

s colores Alex

7. Desarroll

odelo de Ma

ente trabajo

cción de los

ción realizad

o modelo de

smisibilidad a

ación a pred

idemia de S

entan en el A

ismo consist

ware TreeAg

osimulacione

ste modelo l

tivos que a l

iduos ingres

streado de d

abilidades d

en en interv

e estar o no

nosticada. La

representan

mulación y en

ndividuos y a

arga viral. El

y determina

y muerte d

iduos puede

armar los te

goteo, lenta

minutos para

xa, Fluoresce

lo delmod

arkov para es

de tesis do

primeros ca

dos mediant

e Markov in

aunque en lo

dicciones en

SIDA. El mism

Anexo VII. A c

te en un mo

ePro Suite

es de Monte

a población

o largo de c

san al mode

distribucione

ependientes

valos que re

o infectado, y

a historia nat

los tres esta

n cada ciclo e

demás el est

conteo de

a las probabi

dependen d

n diagnostic

etrámeros se

amente y co

SAV APC, 31

ein, Pacific o

delo deMa

studiar la ep

ctoral y utili

asos de SIDA

e análisis fil

ncluye predi

o que respec

ausencia de

mo fue prev

continuación

odelo basad

2007 (TreeA

Carlo.

bajo estudio

ada corrida

elo con una

es obtenida

s del sexo, g

epresentan e

y si está infe

tural de la in

adíos clínico

el programa

tadío en el q

CD4 empiez

lidades de t

el conteo d

carse en el m

53

e utiliza estre

on agitación

1µl cada 10m

f Pacific Ora

arkov de la

pidemia del H

izado en est

A a fin de va

ogenético d

icciones que

ta a los obje

tratamiento

iamente vali

n se provee u

do en matric

Age Softwar

o es una coh

del modelo

a edad, sex

s de datos

grupo de rie

el tiempo en

ectado pued

nfección se m

os característ

registra los

que se encue

za a descend

ransición en

de CD4, carg

modelo a trav

eptavidina m

a fin de fav

minutos para

nge).

a epidemia

HIV en Argen

te trabajo pa

alidar las est

e las secuen

e involucran

etivos específ

o antirretrovi

idado con d

una descripc

ces de Mark

re, Inc) y lo

horte de ind

y en algún m

o, grupo de

epidemiológ

sgo y edad.

n meses. En

e estar diag

modeló como

ticos (asinto

valores de to

entran. Cuan

der según un

ntre estados.

ga viral, eda

vés de dos vía

marcada con

vorecer la fo

a SAV PE y 7

a del HIV 1

ntina fue des

ara estimar e

imaciones d

ncias obtenid

el tratamie

ficos de la pr

iral como era

atos reales y

ión breve de

kov tiempo d

os análisis so

ividuos hipo

momento de

e riesgo y c

gicos publica

El modelo o

n cada ciclo

nosticado o

o estadíos m

mático, sinto

odas las vari

ndo se infect

na función d

Las probab

ad actual y

as: mediante

el fluorocro

ormación de

7µl cada 10m

sarrollado en

el año mas

e los primer

das en la pre

ento antirre

resente tesis

a el caso al c

y dichas vali

e dicho mode

dependiente

on realizado

otéticos inicia

e su vida se i

conteo de C

ados y se i

opera con c

(o mes) cad

portar una

mutuamente

omático, SID

ables que ca

an se les asig

dependiente

ilidades de p

edad de in

e testeo volu

mo deseado

e tetrámeros

minutos para

n paralelo al

probable de

ros casos de

esente tesis.

troviral y la

s se limitó su

comienzo de

idaciones se

elo:

es. Utiliza el

os mediante

almente HIV

nfectan. Los

CD4 que es

nfectan con

ciclos que se

da individuo

infección no

excluyentes

DA). Durante

aracterizan a

gna un valor

de la carga

progresión a

fección. Los

untario o por

o

s

a

l

e

e

.

a

u

e

e

l

e

V

s

s

n

e

o

o

s

e

a

r

a

a

s

r

ident

de rie

Aires

Cuan

sentid

pacie

estad

supre

indivi

mode

frecu

mode

Las p

tificación por

esgo para el

) y conteo de

do se diagno

do, algoritm

entes y “dec

dos que rep

esora. Cuatro

iduo posee o

eló de man

encia de me

elo.

rincipales pr

r sintomatol

primero (se

e CD4 para e

ostican, los i

mos clínicos

cida” si inici

presentan e

o formas dist

o no respues

era que pu

edición de la

redicciones q

ogía con pro

egún curvas r

el segundo.

ndividuos pu

fueron inc

ar tratamien

l primer añ

tintas de res

stas discorda

uede ocurrir

carga viral y

que constituy

54

obabilidades

reales obten

ueden iniciar

luidos para

nto o no. La

ño de tratam

spuestas al tr

antes virológ

debido a t

y conteo de

yen en parte

que depend

nidas de cent

r tratamiento

que el mo

a historia d

miento, la t

ratamiento f

gica y/o inm

toxicidad o

CD4 fueron

e su validació

den de su ed

tros de teste

o o permane

odelo “lea”

e tratamien

terapia supr

fueron mode

unológica. L

ineficacia d

incluidas tam

ón se muestr

dad actual, s

eo voluntario

ecer no trata

los paráme

to fue mod

resora y la

eladas de acu

La falla al tra

de los trata

mbién como

ran en el Ane

sexo y grupo

o de Buenos

dos. En este

etros de los

elada como

terapia no

uerdo a si, el

atamiento se

mientos. La

o entradas al

exo VII.

o

s

e

s

o

l

e

a

l

III.RESULTADOS

III.1.

Para

etapa

almac

nitróg

recol

últim

El 63

años;

. Caracterís

el presente

as distintas.

cenar plasm

geno líquido

ectadas. La p

ma en octubre

Figura III.1. H

muestras

,5% de los p

; la distribuc

ísticas de la

estudio se to

En la prime

ma y células

o. En la Figur

primera mue

e de 2005.

Histograma de

s de la primer

c

pacientes er

ión de esta v

a població

omaron mue

era se toma

mononucle

a III.1. se mu

estra para la

e la frecuenci

a etapa. En ro

caracterizació

an hombres

variable se m

56

ón bajo est

estras de san

aron muestr

ares de san

uestra un his

primera eta

a de muestre

ojo se detallan

ón de los gene

y el restant

muestra en la

udio

ngre periféric

ras de 395 p

ngre periféri

stograma con

apa fue toma

o en los 3 año

n aquellos pac

es HLA A y HLA

te 36,5% mu

a figura III.2.

Figura III

pacientes

toma de m

ca de pacien

pacientes y

ca (CMSP) v

n el número

ada en el me

os que duró la

cientes donde

A B.

ujeres. La ed

.2. Histogram

s incluidos en

muestra

ntes HIV posi

se procesar

viables alma

de muestra

es de marzo

a recolección

e se realizó la

dad promedi

ma de edad

el estudio al

itivos en dos

ron a fin de

acenadas en

s mensuales

de 2003 y la

de

io fue de 35

de los 395

momento de

s

e

n

s

a

5

5

e

La se

pacie

Sobre

103 d

sobre

mues

de po

carga

El det

Anex

egunda etapa

entes enrolad

e el conjunto

de ellas. El h

e el histogra

stras adicion

oder extend

as virales, co

talle de las c

o II.

a consistió e

dos en la prim

o de primera

histograma d

ama de mu

ales tomada

er el período

nteos de CD

característica

en tomar un

mer etapa.

as muestras,

de muestras

estras total

as en el año 2

o de tiempo

D4 y alelos id

as de los pac

57

a segunda (y

, se realizó la

seleccionad

es. Dicha ca

2001 para las

o bajo anális

entificados e

cientes en la

y en algunos

a caracteriza

as se muest

aracterizació

s cuales se d

is. El detalle

en los genes

s segundas y

s casos una

ación de los

ra en rojo e

ón fue realiz

disponía de c

e de las edad

HLA A y B se

y terceras m

tercera) mu

loci A y B de

n la figura II

zada tambié

élulas almac

des, fecha d

e muestra e

muestras se r

uestra de los

el gen HLA a

II.1. anterior

én sobre 10

cenadas a fin

e muestreo,

n el Anexo I.

esume en el

s

a

r

0

n

,

.

l

III.2.

Como

meto

objet

de lo

preva

aunq

Figur

En el

mism

III.2.1

A par

ARN,

edició

dicha

figura

las se

obser

recom

. Identifica

o primer pa

odología des

tivo de busca

os genes HL

alencia de c

ue algunos

a III.3.).

Figura III.3. R

conjunto de

mo conjunto d

1. Los prime

rtir de una m

amplificació

ón de secue

as secuencia

a III.4. se mu

ecuencias ba

rva en la figu

mbinante AD

ación dem

aso para el

scripta en la

ar evidencia

LA I A y HLA

ada alelo en

alelos se en

Resultados de

e datos de H

de alelos.

ros análisis d

muestra de 1

ón por RT PC

ncias, un tot

s se realizó

uestran los re

ajo estudio c

ura, 35 de el

D.

utaciones

estudio de

a sección 14

de selección

A I B en las

n ambos gen

ncuentran so

caracterizació

la preval

LA para los g

de asociació

140µl de plas

CR del gen vi

tal de 1210 p

el análisis f

esultados de

con otras se

las fueron su

58

de escape

e la respue

4.1 de “mate

n mediada p

s 103 muest

nes que en

obrerreprese

ón de los alel

encia en la po

genes A y B n

ón estadística

sma de las m

iral gag y se

pares de bas

filogenético

el análisis de

cuencias ref

ubtipo B, 56

CTL

sta inmune

eriales y mé

or HLA sobre

tras seleccio

general es s

entados (A2

os de los gen

oblación gene

no se detecta

a

mismas 103 m

cuenciación.

ses del geno

para caracte

e similitud po

ferencia de d

fueron reco

a nivel po

étodos” de l

e el genoma

onadas arro

similar a la

4, A68, B39

es HLA A y HL

eral.

aron individu

muestras se

. Luego de re

ma viral fue

erizar genét

or el método

distintos sub

ombinantes B

oblacional, s

a presente

viral. La car

jó como re

de la poblac

9, B07, B40,

LA B compara

uos que com

realizó la ex

ealizar el alin

ron secuenc

icamente al

o de Neighbo

btipos del H

BF, una fue s

se utilizó la

tesis con el

racterización

sultado una

ción general

A31 y B62;

ados con

mpartieran el

xtracción del

neamiento y

iadas. Sobre

virus. En la

or Joining de

IV. Como se

subtipo C y 1

a

l

n

a

l

;

l

l

y

e

a

e

e

1

Luego

carac

polim

que p

linfoc

la efi

CD8)

infect

enco

en n

múlti

p cor

Figura III.4.

para el gen vi

de subtipo

muestras an

o, el alinea

cterización d

morfismos vir

previenen el

citos T citotó

ciencia de p

se espera

tados que p

ntramos un

uestra pobl

iples, 22 de l

regido meno

. Arbol filogen

iral gag sobre

B y las ramas

alizadas y los

amiento nuc

de los genes

rales. Brevem

l reconocimi

óxicos especí

procesamien

que estén

portan el ale

total de 75 p

ación (p<0,0

las 75 asocia

or a 0,0140)

nético constru

e el conjunto

verdes el clad

puntos en co

cleotídico fu

s HLA, fuero

mente, este a

iento de pép

íficos (ya sea

to por el inm

presentes

elo para el c

polimorfismo

05, regresió

aciones tenía

de acuerdo a

59

uido mediant

de muestras

do de recomb

lor rojo y verd

respectivam

ue traducido

on realizados

análisis se ba

ptidos virale

a reduciendo

munoproteo

en frecuenc

cual el pépti

os significativ

ón logística).

an un valor q

al método de

te el método d

analizadas. La

binantes BF. Lo

de representa

mente.

o a aminoá

s los análisi

asa en el hec

s en el cont

o la afinidad

osoma o el r

cias significa

do posee re

vamente aso

. Luego de

q menor a 0,2

e Benjamini

de distancia d

as ramas rojas

os puntos neg

an referencias

ácidos y, ju

s de asociac

cho de que l

exto de la m

del péptido

reconocimien

ativamente

estricción. A

ociados con

la correcció

2 (que se cor

y Hochberg

de Neighbor J

s representan

gros represent

s de los subtip

unto con lo

ción entre a

os polimorfi

molécula de

por la moléc

nto por el TC

mayores en

través de e

diferentes a

ón para com

rresponden c

(Tabla III.1.).

oining

n el clado

tan las

os B y F

os datos de

alelos HLA y

smos virales

HLA por los

cula de HLA,

CR en el LT

n individuos

este análisis,

lelos de HLA

mparaciones

con un valor

.

e

y

s

s

,

s

,

A

s

r

III.2.2

La po

HLA f

CTL m

descr

epíto

Predi

Epipr

III.2.3

Como

ser e

podrí

pued

filoge

HLA

polim

remo

confu

Mark

filoge

mues

corre

sopo

previ

enco

fuero

III.2.4

en Ar

Con

analiz

obten

fuero

de aq

2. Comparac

osición de las

fueron comp

mejor definid

riptos para e

opes no car

iction Server

red (Microso

3. Corrección

o se explicó

estadísticame

ían violar est

e ser resue

enéticas ayu

y polimorfi

morfismos [2

ovieron toda

undidores en

kov y análi

enéticas[19].

stra en la ta

ección filoge

rtadas por

amente def

ntradas tam

on considera

4. Análisis d

rgentina

el objetivo

zaron un co

nidas de ind

on clasificada

quellos polim

ción de lasm

s mutacione

paradas con

dos” [22] y s

el alelo bajo

racterizados

r, Center for

oft Research

n filogenétic

anteriormen

ente indepe

te supuesto

elto incorpor

dan a ident

smos virale

6]. Por lo ta

as las secue

n la inferenc

isis de Mo

. Los detalle

abla III.1., se

nética y sei

la correcció

finidos o pre

mbién dentro

das probable

e la prevale

de analizar

onjunto adic

dividuos rec

as de acuerd

morfismos id

mutaciones id

es que se enc

los datos de

e encontró q

o análisis. Po

previament

Biological Se

[24]).

ca de las asoc

nte en la int

ndientes de

básico de la

rando inform

tificar resulta

s debido a

nto, se aplic

encias recom

cia filogenét

onte Carlo a

es del resulta

e encontraro

s moderada

ón filogenéti

edichos. Ent

o de epítop

es falsos pos

encia de las m

la dinámic

cional de se

cientemente

do al subtipo

entificados c

60

dentificadas

contraron si

e epítopes co

que 6 de ello

or otro lado,

te pero pre

equence Ana

ciaciones en

troducción, l

bido a una

a mayoría de

mación filog

ados falsos

relaciones

caron estos p

mbinantes d

ica. Luego, a

a las 22 a

ado de este

on cuatro aso

amente sopo

ca se encon

re las 12 as

pes conocido

sitivos.

mutaciones

a de estas

ecuencias de

diagnostica

viral y al añ

como mutac

con los epít

gnificativam

onocidos de a

os se ubicab

, otras 3 mu

edichos por

alysis, Techn

ncontradas

os datos bio

historia filog

e los procedi

genética en

positivos en

evolutivas

procedimien

del análisis

aplicamos e

asociaciones

análisis se

ociaciones f

ortadas. La

ntraron al m

sociaciones n

os o predich

identificada

mutaciones

el gen viral

ados entre l

o de toma d

ciones de esc

topes conoci

ente asociad

acuerdo al “

ban dentro d

utaciones se

los program

nical Univers

ológicos de c

genética com

mientos esta

el análisis [

n análisis de

entre indivi

tos al prese

con el obje

l método ba

para corr

muestran e

uertemente

mayoría de

mismo tiem

no soportad

hos. Las res

as a lo largo

de escape

gag de 12

os años 198

de muestra y

cape CTL en

idos del HIV

das a los dis

“resumen de

de epítopes p

encontraro

mas NetMH

ity of Denma

comparación

mpartida y p

adísticos. Est

[25]. Estas c

asociación

iduos que p

nte estudio.

etivo de ev

ayesiano de

egir por c

n el Anexo

soportadas

las asociaci

po dentro d

das, dos de

stantes 10 a

de la epide

a nivel po

29 muestras

87 y 2006.

y se analizó l

tres interva

tintos alelos

los epítopes

previamente

n dentro de

HC 3.0 (CBS

ark [23]) y/o

n podrían no

por lo tanto

te problema

correcciones

entre alelos

portan esos

Primero, se

vitar efectos

Cadenas de

orrelaciones

III. Como se

luego de la

iones (7/10)

de epítopes

ellas fueron

asociaciones

emia del HIV

blacional se

s de plasma

Las mismas

a frecuencia

los distintos

s

s

e

e

S

o

o

o

a

s

s

s

e

s

e

s

e

a

)

s

n

s

V

e

a

s

a

s

de tie

B, 55

hecho

Tabla

HL

Corre

A0

B5

A1

A0

Corre

B0

A2

A1

A0

B4A2

Corre

A0

A0

Correfiloge

B4B4A0A0A3A3B0B4A0A2

E

H

p

a

c

e

e

e

N

U

e

empo. El aná

5 (21,8%) er

o de que en

III.1. Resume

Estado

LA Consenso

elaciones fuerte

03 K

57 T

11 A

03 E

elaciones mode

07 G

24 R

11 G

02 Q

40 T24 V

elaciones dentro

02 A

01 GAP/N

elaciones que noenética (probab49 K40 Q02 A01 L31 T31 N08 T49 E01 P24 T

En la tabla se

HLA asociado

polimorfismo

a 0,2 (en nu

clasificadas de

epítopes cono

en negrita el

epítopes con

NetMHC 3.0

University of

es posible calc

álisis filogené

an subtipo F

Sudamérica

en de las 22 m

o en la posición

o Polimorfis

emente soporta

Q R

N

K M T V

D G

radamente sop

S

K

S

H

AL I

o de epítopes c

V

S

o se encuentrables falsos posit

E Q A DK R NP S TI V MS

S T GV AD

T S Q IS

detallan las p

o, el residuo a

correspondie

estro conjun

e acuerdo al n

ocidos o predi

/los residuo/

ocidos según

(”NetMHC”, C

Denmark) y E

cular el valor

ético mostro

F y 103 (40,

las variante

mutaciones po

nPosicióen HXBsmo

adas como esca

P028

P242

P118

P055

portadas como

P357

P030

P357

P065

P081P046

conocidos o pre

P083

P125

an en epítopes ptives)D P012

P090P146P215P342P372P303P312P339P342

posiciones de

aminoacídico

ente. Todas la

to de datos

nivel de sopor

ichos. En rojo

/s de anclaje

n Los Álamos

CBS Predictio

pipred softwa

61

o que 93 (36

,9%) eran re

s del subtipo

otenciales de

ónB2 OR v

ape por la corre

21,0 <

54,7 0

10,5 0

4,8 0

escape por la

7 13,8 0

0 0,21 0

7 13,2 0

5 4,8 0

1 5,8 06 3,4 0

edichos pero no

3 0,13 0

5 NPC 0

predichos ni co

2 0,00 00 0,00 06 0,27 05 0,00 02 0,12 02 NPC 03 4,0 02 15,6 09 4,9 02 5,9 0

las mutacione

mas frecuent

s asociacione

equivalente

rte de la corre

se destacan

a la molecu

Best defined

on Server, Cen

ares (”Epipred

,9%) de las 2

ecombinante

o B co circula

escape CTL id

vacorrvalor p

ección filogené

< 10 7 0,0

0,0002 0,0

0,0018 0,0

0,0123 0,0

corrección filog

0,0050 0,0

0,0076 0,0

0,0070 0,0

0,0031 0,0

0,0084 0,00,0090 0,0

o soportados po

0,0043 0,0

0,0105 0,0

onocidos y tamp

0,0116 0,00,0104 0,00,0099 0,00,0105 0,00,0063 0,00,0099 0,00,0047 0,00,0119 0,00,0042 0,00,0110 0,0

es en la proteí

te encontrado

es mostradas e

a un valor p

ección filogen

las posiciones

ular HLA corre

d CTL/CD8+ E

nter for Biolo

d”,Microsoft

252 muestra

es BF, lo cua

an con varian

dentificadas p

alor pregido Se

ética

0006 RLR0013 TSTL0019 KTQ

0139

genética

0051 GP0070 KY0063 GVG

0025 IL

00760082

or la corrección

0038 SL

0114 NSS

poco soportada

0127010200950108005700890044013300320121

ína Gag refere

o en cada po

en la tabla tie

p de 0,0140).

ética y si se e

s donde el esc

espondiente.

Epitope Summ

ogical Sequen

Research) par

s pertenecía

al es consist

ntes recomb

por análisis es

Análisis de e

ecuencia

RPGGKKKKLQEQIGWFQQAAADK

PGHKARVLYKLKHIVWGGPGHKAR

GQLQPSL

n filogenética

LYNTVATL

SQVSQNY

as por la correc

encia de HXB2

sición (conse

enen un valor

. Las mutacio

ncontraban d

cape fue ident

Se utilizó la

mary y los pr

ce Analysis, T

ra predicción.

an al subtipo

tente con el

inantes BF

stadístico

epítopes

Antecedente

Conocido

Conocido

NetMHC

Conocido

Conocido

Conocido

Epipred/NetMHC

Conocido

Epipred/NetMHC

cción

2, el alelo

nso) y el

q menor

ones son

dentro de

tificado y

lista de

rogramas

Technical

NPC: No

o

l

en pr

forma

recom

103 r

un co

efect

analiz

consi

segm

la fig

tenid

Muta

en e

respe

el ca

revalencia si

as recombin

mbinación, lo

recombinant

orto segment

os confundi

zables, elimi

deramos a

mento B 5’ y c

gura III.5., en

o un rango v

Figura II

mutaciones d

subtipo viral (

identificadas

posición P30

el tiempo. E

aciones como

el tiempo (

ectivamente,

aso de la m

milar. Una m

nantes entre

o cual nos pe

tes, 68 (66%)

to de subtip

idores por

inamos aque

las restante

como F para

ncontramos

variable de c

I.5. Tendencia

de escape CTL

(Subtipo F en

s por asociacio

para el subtip

En particular, a

negativos, lín

o aquellas u

p<0,05; Chi

, mientras qu

mayoría o do

muestra corr

los subtipos

ermitió clasi

) de ellas co

o B de 200 p

recombinaci

ellas secuen

s recombina

aquellas mu

que los pol

comportamie

as en el tiemp

L por análisis

el panel izqui

ones negativa

po F, las tende

aquellos que a

neas negras)m

bicadas en l

i cuadrado

ue otras mut

ominando u

62

respondía a

s B y F, la m

ficarlas de a

mpartían el

pares de bas

ión y preve

cias que no

antes BF com

utaciones ub

imorfismos

entos.

po de los poli

estadístico. L

erdo, subtipo

s (negro) o po

encias fueron

actualmente s

muestran los m

las posicione

para tende

taciones se h

no de los d

subtipo C. A

mayoría de e

cuerdo a la

mismo patró

es en el 5’ d

nir al mism

poseían un

mo B para a

icadas en el

identificado

morfismos id

Las mutacione

o B en el pane

ositivas (en az

hacia un incr

son el estado

mayores incre

es 30 y 83 h

ncias) en e

han manteni

dos subtipos

A pesar de la

llas compart

estructura d

ón de recom

e la región. C

mo tiempo l

n estructura

aquellas mut

segmento F

os como mut

dentificados co

es fueron clasi

l derecho), y d

ul). Excepto p

remento o per

más común (

ementos en el

an incremen

el subtipo

ido a una ba

s virales B

a elevada pre

tían el mism

e recombina

mbinación co

Con el objeti

a perdida d

recombinan

taciones ubi

3’. Como se

taciones de

omo potencia

ificadas de ac

de acuerdo a s

para la mutaci

rmanencia est

identificados

tiempo.

ntado signific

B y en el

aja prevalenc

o F. Interes

evalencia de

o patrón de

ación. De las

nsistente en

ivo de evitar

de muestras

nte común y

icadas en el

e muestra en

escape han

ales

uerdo al

si fueron

ón en la

table en

por OR

cativamente

subtipo F,

cia como fue

santemente,

e

e

s

n

r

s

y

l

n

n

e

,

e

,

muta

para

preva

domi

nuest

a trav

para

III.2.5

Luego

utiliza

de lo

presi

(p=0,

mues

alelo

III.2.6

Luego

sufici

virale

aciones en la

el subtipo

alencia en e

nando el su

tro conjunto

vés de asocia

esa posición

5. Análisis de

o, analizamo

ando un mé

s 399 sitios

ón selectiva

027) y 125 (

stra en la Fig

A02 parece

Figura III.6. R

detalla el p

6. Identificac

o nos plant

ientemente f

es, entonces

s posiciones

B y F resp

l subtipo op

btipo F y au

o de datos (p

aciones nega

n.

e substitucio

os las tasas

todo de Max

analizados e

positiva (val

(p=0,007) pr

gura III.6. la

ser una regi

Resultados de

pico correspon

ción de otras

teamos la

fuerte para i

la propagac

s 30 y 83 par

pectivament

puesto. Lo m

mentando e

=0,211). De

ativas (OR<1

ones sinónim

de substitu

ximum Likel

estaban sujet

lor p <0,05).

eviamente id

a región corr

ón “caliente

el análisis de i

ndiente a la po

res

smutacione

hipótesis de

inducir un ca

ción y acumu

63

recen haber

te mientras

mismo se ha

en el subtipo

hecho, estas

) debido a q

mas y no sinó

ución sitio e

ihood [89,90

tos a presión

Dentro del

dentificadas

respondiente

” de selecció

identificación

osición P125 y

tricción para

es cuya preva

e que si la

ambio en el

ulación de m

alcanzado u

que se ha

encontrado

o B, aunque

s tres mutac

ue el escape

ónimas

specíficas si

0]: Mediante

n selectiva si

último grupo

por asociac

e al epítope

ón positiva.

n de sitios bajo

y la región cor

el alelo A02

alencia camb

a selección

estado de di

utaciones qu

na elevada p

an mantenid

o para el esc

no estadístic

iones de esc

e es actualm

inónimas (dS

e este anális

ignificativam

o estaban inc

iones negati

e SLYNTVATL

o presión de s

rrespondiente

bió significat

mediada p

iferentes pos

ue no afecta

prevalencia e

do siempre

cape en la p

camente sig

cape fueron e

ente el estad

S) y no sinó

is encontram

mente negati

cluidas las p

ivas. De hec

L con restric

selección pos

e al epítope SL

tivamente e

or HLA es

siciones de l

n el fitness v

en el tiempo

en elevada

osición 125,

nificativo en

encontradas

do consenso

ónimas (dN)

mos que 194

va y 24 bajo

osiciones 84

ho, como se

ción para el

itiva. Se

L9 con

n el tiempo

una fuerza

as proteínas

viral tienden

o

a

,

n

s

o

)

4

o

4

e

l

a

s

n

a red

preva

a una

basad

acum

regió

tiemp

llevam

de 39

B o F

Nuev

epíto

que

nuest

alelos

posic

0,071

obser

III.2.7

escap

Clasif

para

a tra

realiz

El fac

mues

conti

un su

negat

El tam

P28,

ducir la fue

alencia de m

a pérdida de

das en asoc

mulado en ot

n viral bajo

po. Primero,

mos a cabo u

99 posiciones

(p<0,05; tab

ve de ellas s

opes predich

alteren la a

tros datos p

s HLA: dos d

ciones 30 y 8

16 para aso

rvados para

7. Análisis e

pe

ficando las m

aquellas mu

vés de asoc

zó un análisis

ctor dentro

stras: 1987

nuación: (1)

ubtipo viral

tivas que no

maño muest

P46, P55, P6

rza de la as

utaciones de

potencia est

ciaciones est

ras posicione

estudio bus

clasificamos

un análisis b

s han increm

bla III.2.).

se encontrab

os. De acuer

afinidad por

poseen sufic

e ellas había

83, Tabla III.1

ciaciones co

aquellas mu

estadístico g

mutaciones p

taciones que

ciaciones po

s con el Mod

de sujetos f

1997, 1998

Asociacione

(aquellas co

dominan un

tral para cad

65, P81, P118

sociación; e

e escape en

tadística [29

tadísticas. C

es podrían h

scando otros

s las muestr

asado en Ch

mentado sign

ban dentro

rdo a progra

la molécul

ciente poten

an sido ident

1.) y la muta

on HLA A02.

taciones ide

global de las

por OR es po

e alcanzan as

sitivas. Para

delo Lineal G

fue el año d

2002 y 20

es positivas (

on OR<1 y el

n subtipo vir

a nivel fue 1

8, P242 y P37

64

es decir que

individuos q

]. Por lo tant

Con el objet

aber sido de

s polimorfism

as de acuerd

hi Cuadrado p

nificativamen

de epítopes

amas de pred

a de HLA. P

ncia estadíst

tificadas com

ación en la p

Nuevamen

ntificadas po

s tendencias

osible observ

sociaciones n

a evaluar es

eneral de M

de muestreo

003 2006. El

aquellas con

l subtipo en

al (aquellas

18, 4 y 4, res

75; nivel 2: e

e la transmi

ue no portan

to, no podrá

ivo de dete

eterminados

mos que han

do al año de

para tenden

nte en el tiem

s CTL conoci

dicción de e

Particularme

tica, encontr

mo potenciale

osición 84 te

te, los may

or asociacion

s en el tiem

var los difere

negativas co

tadísticamen

edidas Repe

con 3 nive

factor ent

n OR>1), (2) a

el cual siem

con OR<1 y

spectivamen

escape en las

sión sin rev

n el alelo HL

n ser identif

erminar si lo

por selecció

n cambiado

muestreo y

cia. Encontra

mpo en al me

idos y las re

pítopes, nue

ente, en las

ramos evide

es mutacion

enían un OR

ores cambio

nes negativa

mpo de las m

entes compo

omparadas co

nte las tend

tidas.

les según el

tre sujetos f

asociaciones

mpre domina

en el subtipo

te (nivel 1: e

s posiciones

versión incre

A selectivo c

icadas porm

os cambios

ón inmune, a

significativam

y al subtipo v

amos que 12

enos uno de

estantes tre

eve de ellos

tres posici

encia de aso

es de escape

R de 0,34 y u

os en el tie

s (Figura III.7

mutaciones

rtamientos e

on aquellas i

dencias en e

l año de rec

fue como s

s negativas q

aron) y (3) a

o viral que n

escape en la

P030, P084 y

ementará la

conduciendo

metodologías

que se han

nalizamos la

mente en el

viral, y luego

2 de un total

los subtipos

s dentro de

es probable

ones donde

ociación con

e CTL (en las

n valor p de

mpo fueron

7.)

asociadas a

en el tiempo

dentificadas

el tiempo se

colección de

se detalla a

que dominan

asociaciones

o dominan).

s posiciones

y P125 en

a

o

s

n

a

l

o

l

s

e

e

e

n

s

e

n

a

o

s

e

e

a

n

s

.

s

Tabla

tiemp

Pos

H

Dentro

P

P

P

P

P

P

P

P

P

Dentro

P

P

P

S

r

p

c

III.2. Resum

po durante los

siciónen

HXB2

Valo

Subtip

o de epítopes c

P030 0,03

P076 0,02

P083 0,90

P084 0,01

P095 0,08

P215 0,03

P218 0,04

P223 0,12

P280 0,60

o de epítopes p

P090 0,61

P054 0,55

P138 0,62

Se muestran

resaltado en r

de anclaje a

posiciones. (1)

casos se obse

men de los 12

s últimos 20 a

or p de tendenc

po B Subtip

conocidos

38 0,106

29 0,030

04 0,031

12 0,730

88 0,040

31 0,930

47 0,770

23 0,009

01 0,020

predichos

14 0,028

55 0,009

28 0,040

las secuencias

ojo el residuo

la molécula H

) En estos cas

rvó un increm

conse

2 polimorfism

años de epide

cia Es

o F Cons

6

0

1 A

0

0

0

0

9

0

8

9

0

s aminoacídic

o que cambia.

HLA. También

os no se dispo

mento significa

enso como gru

65

mos que han

emia

stados de la po

senso Polim

R

R

A

V

K

L

V

I

V

Q K

S A P

LA F H

as de los epíto

Aumentado d

se muestran

onía de inform

ativo en el tiem

upo. NPC: no

cambiado si

sición Selocmorfismo

K

K

KYG

GG

K

R

RSL

E

VSLR

RS

SL

TR

RS

T

RIE

VEE

A

A

AEH

HP

VH

HP

TRMV

VRM

R (2)

A

AV

CV

P T (2)ETA

I M P V(2) N

opes conocido

de tamaño se

los resultado

mación acerca

mpo de todos

es posible cal

ignificativame

ecuencia deos epítopesconocidos

KW9 A24:

YKLKHIVWGK9 B08:

GKKKYKLKRY11 A30:

LYNTVAVLYEV9 B08:

LRSLYNTVSL9 A02:

LYNTVATLRY11 A30:

LYNTVATLYSL9 A02:

LYNTVATLRY11 A30:

LYNTVATLYTI9 A11:

LYCVHQRIIL10 B40:

EIKDTKEALEL9 B40:

EAAEWDRLAV9 B40:

EWDRLHPVHA9 B07:

PVHAGPIAHA9 B07:

PVHAGPIARI8 B52:MYSPTSI (1)VI9 Cw18:MYSPVSI (1)

AK9 A11:

VLYCVHQKCK9 A03:

VHKKIEVKEI9 B68:AEGCRQI (1)NL8 A24:

NYPIVQNL

os alrededor d

muestra en c

s del análisis e

de residuos d

s los residuos

lcular el valor

ente su preva

Dentro de

OR Poten

0,23 0,8

NC 0,4

1,70 0,0

1,25 0,0

0,10 0,9

NC <0,0

0,34 0,7

1,79 0,1

2,83 0,3

0,82 0,1

0,42 0,1

2,84 0,2

NPC 0,0

1,55 0,1

2,61 0,1

NPC NP

de estas muta

cada epítope e

estadístico pa

de anclaje. (2)

alternativos a

.

alencia en el

el estudio

ncia Valor p

3 0,0055

2

8

5

4 0,0008

01

7 0,0716

3

0

5

5

9

3

3

1

C

aciones y

el residuo

ara esas

) En estos

al residuo

l

subti

P083

Box y

prueb

evalu

0,117

signif

ANOV

p= 0,

En el

secció

un m

utiliza

obser

tres g

Figura II

mutaciones

puntos en e

subtipo viral (

identific

posic

significativam

el tiempo (Ch

el subtipo

po B y P083

en subtipo B

y demostró c

ba de Mauch

uado con la

7; p= 0,890

ficativa (F4; 42

VA de 1 facto

264 para el n

Anexo IV se

ón “materia

mejor estimad

arlo en la es

rva una asoc

grupos, como

I.7. Tendencia

de escape CT

el tiempo de l

(Subtipo F en

adas por asoc

ciones P30 y P

mente asociad

hi cuadrado pa

o B, las tende

3 en subtipo

B). El supues

cumplirse (F1

hly y tambié

prueba de L

para T2/F2;

2 =13.892; p

or para los n

nivel 1, F2; 9 =

e detalla la s

les y método

dor de la va

stimación de

ciación signi

o se observa

as en el tiemp

TL por el análi

a prevalencia

el panel izqui

ciaciones nega

P83 se repiten

das a un alelo

ara tendencia

ncias fueron h

F y nivel 3:

sto de iguald

12; 285.5 = 1,48

én fue confir

Levene y tam

21 = 0,002;

<0,001), por

niveles entre

= 1,031 p = 0

salida del pr

os” el cuadra

arianza del e

e los estadíst

ficativa entr

a en la tabla I

66

po de los poli

isis de tenden

estimada. Las

erdo, subtipo

ativas (negro)

n como en la F

HLA (q<0,2) y

as, p<0,05). Ex

hacia un incre

escape en la

dad de matric

89; p =0,127)

rmado (p =0

mbién confi

p= 0,998 pa

r lo tanto se

sujetos. Los

0,395 para el

rograma par

ado medio d

error aún pa

ticos F resul

re la prevale

III.3.

morfismos id

ncia. Se muest

s mutaciones

o B en el pane

o positivas (e

Figura III.5. de

y también se e

xcepto para la

emento o perm

as posicione

ces de covar

), el supuest

0,112), el sup

rmado (F2; 2

ara T3). La

realizó un a

s resultados

nivel 2 and

ra el present

del error en

ra el análisis

ta más apro

encia del est

dentificados co

tran las líneas

fueron clasifi

l derecho), y d

en azul). Las m

bido a que se

encontró un ca

mutación en

manencia esta

es P030, P08

rianza fue ev

o de esferici

puesto de ig

1 = 1,024; p

interacción

análisis de ef

para cada gr

F2; 9= 4,193 p

te análisis. C

el Análisis d

s de efectos

opiado. Toma

ado de esca

omo potencia

s de tendencia

cadas de acue

de acuerdo a s

mutaciones en

encontraban

ambio signific

la posición P2

able en el tiem

84 y P125 en

valuado con l

idad fue eva

ualdad de v

= 0,376 par

entre factor

fectos simple

rupo fueron

p = 0,052 pa

Como se men

de Medidas R

s simples y p

ando en cue

ape y el tiem

ales

a para 3

erdo al

si fueron

n las

cativo en

215 para

mpo.

n subtipo F y

la prueba de

luado con la

arianzas fue

a T1/F2; 21 =

res fijos fue

es mediante

F2; 45 = 1,372

ra el nivel 3.

nciona en la

Repetidas es

por lo tanto,

enta esto, se

mpo para los

y

e

a

e

=

e

e

2

.

a

s

,

e

s

A

A

Si bie

contr

tende

Como

signif

signif

entre

ident

de 19

1990

signif

Los r

aume

frecu

los a

posic

preva

Cons

dos s

Tabla II

Fuente deVariación

ANÁLISIS DE M

Entre sujeto

A

B en A

Dentro suje

C

A x C

C x (B en

ANALISIS DE EF

Nivel 1: Aso

Entre

Error

Nivel 2: asosiempre dom

Entre

Error

Nivel 3: Asoque no dom

Entre

Error

en el análisis

rastes demu

encia en el t

o se observ

ficativament

ficativa. Las

e los tiemp

tificadas con

980s y comi

, y luego sos

ficativament

esultados de

entando sign

entes en la

lelos A02 (a

ción 125) y A

alentes en nu

iderando qu

subtipos vira

II.3. Resumen

Scu

EDIDAS REPETI

os

5

1

etos

1

n A) 1

FECTOS SIMPLE

ociaciones posi

1

ociaciones negaminaron)

1

ociaciones negaminan)

1

1

s estadístico

estra que so

tiempo, y ad

va en la tab

e del tiempo

mutaciones

os 1 y 2 y

ORs negativ

ienzos de lo

stuvieron su

e.

escriptos se

nificativamen

población. D

asociado con

A24 (asociado

uestra pobla

e varias mut

les mientras

n del análisis e

uma deuadrados

IDAS

54986,6

13930,5

720,2

1749,6

1301,5

S

tivas (aquellas

743,2

1301,5

ativas que dom

265,5

1301,5

ativas que no d

1758,4

1301,5

demuestra

olamente las

emás es el q

bla III.4., las

o 1 al 2 y lue

s que domin

y luego dis

vos y que se

os 1990s aum

tendencia ha

muestran re

nte en el ti

De acuerdo

n escape en

o con escape

ción.

taciones que

s que domina

67

estadístico de

Grados delibertad

2

21

2

4

42

con OR>1)

2

42

minan un subtip

2

42

dominan un sub

2

42

una asociaci

s mutacione

que posee la

s mutacione

ego aumenta

nan subtipos

sminuyen au

encontraba

mentaron si

acia comienz

esumidos en

empo se en

a datos inde

n las posicio

e en la posic

e han aumen

aban el otro

e medidas rep

CuadradoMedio

27493,3

663,4

360,1

437,4

31,0

371,6

31,0

po viral (aquella

132,8

31,0

btipo viral (aqu

879,2

31,0

ón significat

es pertenecie

as diferencia

es identifica

an entre los

s virales (niv

unque no s

n en baja pr

gnificativam

zos y mediad

n la figura III

ncuentran as

ependientes

nes 83 y 84

ión 30) se en

ntado en el t

subtipo vira

petidas y de e

oEstadíst

41,4

11,6

14,

11,9

as con OR<1 y e

4,3

uellas con OR<1

28,4

tiva en los tr

entes al terc

s con mayor

das por OR

tiempos 2 y

vel 2) aume

significativam

revalencia ha

ente hacia f

dos de la déc

.8. Las muta

sociadas con

(http://www

4), A01 (aso

ncuentran en

tiempo, lo h

al como se m

fectos simple

tico F V

4 <

6 <

1 0

9 <

el subtipo en el

3 0

1 y en el subtipo

4 <

res grupos, e

cer grupo m

r significanci

Rs positivos

y 3, aunque n

entan signific

mente. Las

acia finales d

finales de la

cada de 2000

aciones que

n alelos HLA

w.allelefrequ

ciado con e

ntre los cinco

han hecho en

mencionó ant

es.

Valor p

< 10 7

< 10 4

0,0026

< 10 4

l cual

0,0203

o viral

< 10 7

el análisis de

uestran una

a del grupo.

disminuyen

no en forma

cativamente

mutaciones

de la década

a década de

0 aunque no

se han visto

A altamente

uencies.net),

escape en la

o alelos mas

n uno de los

teriormente,

e

a

.

n

a

e

s

a

e

o

o

e

,

a

s

s

,

es po

hacia

de pr

la Fig

Tabla

escap

F

d

v

osible que lo

a variantes m

revalencia en

gura III.9.

III.4. Detalle

pe entre los di

Tiempcompara

Nivel 1

1

1

2

Nivel 2

1

1

2

Nivel 3

1

1

2

Figura III.8. Fr

secuencias qu

datos previos

de las mutaci

viral (línea ver

s subtipos v

mejor adapta

n ambos sub

del análisis d

istintos tiemp

osados

Difero

2

3

3

2

3

3

2

3

3

recuencia med

ue poseen mu

disponibles p

ones tuvo qué

rde) y las resta

irales B y F e

adas a la res

btipos para la

de contrastes

pos.

rencia mediaobservada

9,4

6,5

2,9

11,4

7,1

4,3

22,5

28,0

5,5

dia de lasmut

utaciones de e

para saber que

é hacerse a po

antes de acue

azu

68

estén conver

puesta inmu

as posicione

para la comp

Errorestándar

1,9681526

1,9681526

1,9681526

3,9363053

3,9363053

3,9363053

3,9363053

3,9363053

3,9363053

taciones de e

escape se rep

e mutaciones

osteriori: aque

erdo a si fuero

l) o positivas

rgiendo, al m

une poblacio

es P030, P08

paración de a

r DMS

69 5,0

69 5,0

69 5,0

37 10,0

37 10,0

37 10,0

37 10,0

37 10,0

37 10,0

escape a lo lar

resentan en e

podrían domi

ellas que se e

on identificada

(línea roja).

menos en su

onal como lo

3, P084 y P1

pares de prev

Estadíde FiS

11,

5,5

1,0

4,1

1,6

0,5

16,

25,

0,9

rgo del tiempo

el eje vertical.

inar el subtipo

ncontraron do

as por asociac

secuencia a

sugieren las

125 como se

valencia de m

ísticosher Va

42 < 0

50 0

07 0

19 0

65 0

58 0

34 <

25 <

97 0

o. El porcenta

Debido a que

o B o F, la clas

ominando un

ciones negativ

aminoacídica

s tendencias

muestra en

mutaciones de

alor p

0,001

,008

,352

,022

,204

,563

10 5

10 7

,388

aje de las

e no hay

sificación

subtipo

vas (línea

a

s

n

e

F

n

c

e

igura III.9. Te

negativas en lo

consenso, inde

en el tiempo m

virales B o F

subtipos v

ndencia en el

os subtipos vi

ependientem

muestra que e

F. Esto significa

irales hacia va

l tiempo de la

irales B y F. La

ente del subt

en años temp

a que se han a

ariantes proba

69

asmutaciones

as cuatro mut

ipo viral. Sin e

ranos de la ep

acumulado en

ablemente má

hospedad

s de escape id

taciones ident

embargo, el an

pidemia domi

n el tiempo y h

ás capaces de

dor.

dentificadasm

tificadas son a

nálisis de su p

naban solo un

han dirigido u

e evadir la resp

mediante asoc

actualmente e

prevalencia ha

no de los dos

una convergen

puesta inmun

ciaciones

el residuo

acia atrás

subtipos

ncia de

e del

III.3.

Los e

toma

mant

razón

nitróg

En to

mues

total

utiliza

secció

fue re

se les

Fig

En el

pacie

sangr

III.11

. Estudio d

estudios de r

adas de los p

tuvieron bue

n de esto fu

geno y todas

otal se reco

stra en la fig

de 49 segun

ada para rea

ón 2 de resu

ecolectada e

s realizó ade

gura III.10. Fr

conjunto de

entes que ini

re. El conteo

.).

de la respue

respuesta in

pacientes ba

enos niveles

ue principalm

s las primera

lectaron 49

gura III.10. el

ndas muestra

alizar el análi

ultados. Los

en el período

más la carac

ecuencia de r

e segundas m

ciaron trata

o de CD4 pe

esta inmun

mune se rea

ajo estudio.

de viabilida

mente que

as muestras s

segundas m

l tiempo pro

as, 29 de ella

sis de asocia

restante 20

o de tiempo

cterización de

recolección de

muestras, las

miento, el 4

ermaneció s

70

ne HIV esp

alizaron sobr

Esto se deb

d luego de u

en un mom

se desconge

muestras y 1

omedio entre

as correspon

ación entre p

muestras c

detallado en

e los alelos d

e primeras, se

s cargas vira

5% de ellos

similar al de

pecífica en

re el conjunt

bió a que el

un promedio

mento el tan

laron.

10 terceras

e primera y s

nden a otros

polimorfismo

orresponden

n la sección 1

de los genes

egundas y ter

les mostraro

no presenta

los medido

la poblaci

to de segun

conjunto de

o de 3 años

nque de alm

muestras (V

segunda mu

pacientes cu

os virales y a

n a paciente

1 de resultad

HLA A y HLA

rcerasmuestr

on una redu

aban niveles

os en las pri

ión bajo es

das y tercer

e primeras m

de almacen

macenamient

Ver Anexo I

estra fue de

uya primera

lelos HLA de

s cuya prim

dos y por lo t

A B.

ras a lo largo d

cción signific

detectables

meras mues

studio

ras muestras

muestras no

namiento. La

to perdió el

I). Como se

e 3 años. Del

muestra fue

scripto en la

era muestra

tanto a ellos

del tiempo

cativa en los

del virus en

stras (Figura

s

o

a

l

e

l

e

a

a

s

s

n

a

III.3.1

Sobre

flujo

CD3+

repet

estos

en la

de ca

de ac

ANOV

nivele

varia

trans

comp

facto

(F2,46=

celula

depe

para

con

Figura III.11.

1. Evaluación

e el conjunt

de los niv

+/CD8+ que

tido para la

s ensayos. El

figura III.13

arga viral me

ctivación y lo

VA consider

es). Los resu

nza (p=0,00

sformación d

probó el sup

res fijos pa

=0,437; p=0,

ar CD8 com

ndiente de

el factor de

cargas vira

. Valoresmed

n del estado

o de segund

veles genera

expresan lo

población CD

detalle de lo

se resumen

edidos en pla

os valores de

ando como

ultados prelim

7; Prueba d

del logaritm

uesto antes

ra la variab

649) y sí det

mparado co

los niveles d

carga viral d

les mayore

didos de Carga

segun

o de activació

das muestra

ales de act

os marcadore

D3+/CD4+. E

os valores m

los resultad

asma. Como

e carga viral.

factores fij

minares indi

de Levene).

o natural no

mencionado

ble transform

tectó una m

on el tipo

de carga vir

demostró qu

s a 1000

71

a Viral y conte

dasmuestras

ón inmune g

s se realizó

tivación cito

es CD38 y H

En la figura I

edidos de ac

os obtenido

o se observa

Esta observ

os el grupo

icaron que n

El análisis

ormalizaría

o (p=0,283; P

mada no ide

magnitud de a

celular CD4

al (F2,46=5,67

e la diferenc

copias ARN

eo de células

s recolectadas

general

también la

otóxica med

HLA DR en s

II.12 se esqu

ctivación se

s para cada t

, existe una

vación se pus

de carga v

no se cumplí

de los resid

los valores.

Prueba de Le

entificó una

activación si

4 (F1,46=14,7

77; p=0,006)

cia significati

N/ml, cuyos

CD4 en el con

s.

evaluación

didos como

su superficie

uematiza la e

muestra en e

tipo celular e

tendencia p

so a prueba

viral (3 nivel

ía el supuest

duos estand

Luego de d

evene). El an

interacción

gnificativam

766; p<0,001

). El análisis

iva emerge e

niveles de

njunto de prim

mediante ci

porcentaje

e. El mismo

estrategia de

el Anexo II m

en función d

positiva entre

mediante u

les) y el tip

to de homog

darizados sug

dicha transfo

nálisis de AN

n entre amb

mente mayor

1) y signific

post hoc de

en el grupo d

e activación

meras y

tometría de

de células

análisis fue

e análisis de

mientras que

e los niveles

e los niveles

n análisis de

o celular (2

geneidad de

girió que la

ormación se

NOVA de dos

bos factores

para el tipo

cativamente

e contrastes

de pacientes

n resultaron

e

s

e

e

e

s

s

e

2

e

a

e

s

s

o

e

s

s

n

signif

(p=0,

Fig

tr

f

ut

ficativament

006)

gura III.12. Es

res paneles su

(CD3+/CD8+

fluorocromo A

tilizado con el

CD3+/CD8+

Figura

e mayores q

strategia de a

uperiores se m

). En el panel

APC utilizado c

l anticuerpo a

+/CD38+/HLA

anteriores.

a III.13. Valore

que aquellos

nálisis de los

muestra la suc

inferior se mu

con el anticue

nti HLA DR y

DR+ según lo

El mismo aná

esmedidos de

72

s medidos en

niveles gener

esiva selecció

uestra de izqu

erpo anti CD38

iii. La muestra

os limites de p

álisis se realizó

e activación g

n los pacien

rales de activa

ón de subpobl

uierda a derec

8, ii. Un contr

a completame

positividad det

ó sobre la pob

general de res

tes con carg

ación de la re

aciones hasta

cha: i. Un cont

ol de isotipo p

ente marcada

terminados co

blación CD3+/

spuesta inmun

gas virales in

espuesta inmu

a la población

trol de isotipo

para el fluoroc

a y la població

on los dos con

/CD4+.

ne CD4 y CD8

ndetectables

une. En los

citotóxica

o para el

cromo PE

n activada

ntroles

8.

s

III.3.2

Una v

inmu

1 S

m

p

2 L

e

d

3 S

fi

4 S

e

5 S

te

La sín

miligr

resus

tabla

III.3.3

Con e

realm

la res

sintet

fue e

pépti

obten

dos c

negat

CMSP

adela

2. Estrategia

vez estimad

ne péptido e

Se sintetizaro

mutaciones d

polimorfismo

Los péptidos

ensayos in vi

del alelo HLA

Se caracteriza

in de detecta

Se confirmó

ensayos de es

Se evaluó el

etrámeros.

ntesis de los

ramo y una

spendieron e

III.5.

3. Evaluación

el objetivo d

mente son re

spuesta med

tizados en su

nsayado en

ido posee re

nidos en ens

controles ne

tivos, en am

P) pero men

ante. En nar

a para el aná

os los nivele

específica. P

on los pépt

de escape) i

os virales.

sintetizado

itro de ELISP

para el cual

aron las curv

ar diferencia

la naturaleza

stimulación

l fenotipo d

péptidos se

a pureza m

en dimetil su

n de la frecu

de determina

econocidos p

dida en ensa

u versión sal

todas las mu

estricción alé

sayos con 10

egativos). Lo

arillo aquello

nores al per

ranja se mue

lisis de respu

es generales

ara ello se ut

idos corresp

dentificados

os se utilizar

OT sobre m

los distintos

vas de respu

as en la magn

a citotóxica

in vitro y aná

de la poblac

solicitó sin m

ayor al 80%

ulfóxido (DM

uencia de rec

ar experime

por la respue

yos in vitro d

vaje. En la ta

uestras prove

élica. Los va

00,000 CMSP

s colores in

os que cump

centil 90 pa

estran aque

73

uesta inmun

s de activaci

tilizó la sigui

pondientes a

s en el anális

ron para det

uestras de C

s péptidos po

esta a péptid

nitud de resp

de la respue

álisis por cito

ción citotóx

modificacion

%. De acue

MSO) a una c

conocimient

ntalmente s

esta inmune

de ELISPOT p

abla III.6. se

enientes de

alores mostr

P (el promed

dican la ma

plen el criter

ara el conjun

llas respuest

ne epítope e

ón inmune,

ente estrate

a epítopes s

sis estadístic

tectar la pre

CMSPs de pa

oseen restric

dos salvajes

puesta frent

esta y se eva

ometría de fl

ica epítope

es adicionale

rdo a la ca

concentració

o de los epít

si los sitios id

específica e

para la liber

resumen los

pacientes qu

rados corres

dio de las do

gnitud de la

io de positiv

nto de valor

tas consider

específica

se prosiguió

egia:

salvajes y m

co de asocia

esencia de

acientes y co

cción.

y mutados e

te a ambas va

aluó su nivel

lujo.

específica m

es, a una can

antidad de

ón de 20mM

topes bajo e

dentificados

n los pacien

ación de IFN

s resultados o

ue posean el

sponden al n

s réplicas me

a respuesta:

vidad (más de

res obtenido

radas de ma

ó a evaluar

mutados (po

ación entre a

respuesta e

onsiderando

en ensayos d

ariantes vira

de polifunci

mediante la

ntidad de alr

péptido sint

M según se d

estudio

por análisis

tes infectado

N frente a

obtenidos. C

alelo HLA pa

número de p

enos el prom

en azul se

e 5 puntos c

os según se

agnitud med

la respuesta

ortadores de

alelos HLA y

specífica en

la presencia

de ELISPOT a

les.

ionalidad en

técnica de

rededor de 1

tetizado, se

detalla en la

s estadístico,

os se evaluó

los péptidos

Cada péptido

ara el cual el

puntos neto

medio de los

resaltan los

ada 100.000

detalla más

dia (medidas

a

e

y

n

a

a

n

e

1

e

a

,

ó

s

o

l

o

s

s

0

s

s

entre

perce

Según

de 5

estos

proba

e los percent

entil 95).

Nombre

A01-P125

A01-P125

A02-P65Q

A02-P65H

A02-P84T

A02-P83V

A02-P84V

A03-P28K

A03-P28Q

A11-P357

A11-P357

A24-P30K

A24-P30R

B07-P223

B07-P223

B07-P357

B07-P357

B08-P76R

B08-P76K

B40-P215

B40-P215

B40-P21

B40-P21

B40-P95R

B40-P95K

B57-P242

B57-P242

A03-P90Q

A11-P11

A11-P90Q

A24-P13

B68-P54S

n se detalla

puntos cada

s ensayos, u

ablemente a

tiles 90 y 95

S

5S N

5N -

Q I

H -

T S

V S

V S

K R

Q -

7G GV

7S --

K K

R -

3I H

3V -

7G G

7S -

R E

K -

5V E

5L -

8V A

8A -

R IE

K --

2T TS

2N --

Q C

8A K

Q A

8L N

S E

en la sección

a 100.000 CM

una magnitu

a considerar

) y en rojo a

Tabla III.5. De

Secuencia

SSQVSQNY

N-------

LGQLQPSL

----H---

LYNTVATL

LYNTVVTL

LYNTVAVL

LRPGGKKK

-------Q

VGGPGHKAR

----S----

YKLKHIVW

-R------

PVHAGPIA

------V-

PGHKARVL

-S------

LRSLYNTV

-K------

EAAEWDRV

-------L

EWDRLHPV

-------A

EIRDTKEAL

--K------

STLQEQIGW

-N-------

VHKKIEVK

TQQAAADK

VLYCVHQK

NYPIVQNL

TAEGCRQI

n 15.1. el pu

MSP. Si bien

ud de 5 pu

positivas mu

74

aquellas resp

etalle de los p

Salvaje/M

Salva

Muta

Salva

Muta

Salvaje/

Salva

Muta

Salva

Muta

Salva

Muta

Salva

Muta

Salva

Muta

Salva

Muta

Salva

Muta

Salva

Muta

Salva

Muta

Salva

Muta

Salva

Muta

Salva

Salva

Salva

Salva

Salva

unto de corte

n este punto

untos cada

uestras realm

puestas de e

péptidos sinte

MutadoP

aje

do

aje

do

Mutado

aje

do

aje

do

aje

do

aje

do

aje

do

aje

do

aje

do

aje

do

aje

do

aje

do

aje

do

aje

aje

aje

aje

aje

e a partir se

de corte es

100.000 CM

mente negati

elevada mag

etizados

Peso molecula(gr/mol)

1171

1198

1113

1121

1124

1152

1122

1182

1183

1096

1126

1357

1385

1041

1027

1077

1107

1236

1208

1244

1258

1264

1236

1346

1318

1324

1337

1225

1105

1204

1086

1148

considera u

el que com

MSP resulta

vas.

gnitud (medi

ar Masasintetiza

1,6

1,4

1,8

1,6

1,4

1,1

1,3

1,9

1,3

1,4

1,3

1,3

1,1

1,2

1,1

1,4

1,3

1,7

1,6

1,5

1,1

1,5

1,8

1,2

1,8

1,2

1

1,3

1,9

1,4

1,2

1

na respuesta

múnmente se

muy baja

das sobre el

aada

a positiva es

e utiliza para

y conduce,

l

s

a

,

Tabla

IDMuestra

F001

F018

F021

F023

F024

F026

F027

F028

F030

F037

F040

F044

F046

F047

F048

F050

F060

F063

F070

F072

F080

F081

F085

F087

F090

F095

F100

F119

F133

F155

F174

F182

F189

F197

F235

F244

F284

F285

F288

F289

Esta

corte

sobre

estad

Debid

medi

III.6. Resume

A01

P125N

A02

P65Q

2

1

0,5

0

3

3,5

1,5

17,5

2,5

0,5 1,5

4,5

12

1

0,5

0

1

2,5

0

1,5

19

4,5

7,5

1,5

0,5

4 21

proporción d

e. Es por ello

e el conjunto

dístico los pe

do a que los

ana fue pr

en de los resu

A02

P84T

A03

P28K

A03

2,5

1

1

3,5

3

85

5,5

3

22,5 20

0

1,5

4 2,5

9,5 15,5

0,5

66,5

2

1

1

1,5

49,5

1,5

2,5

501 47,5

10

14

21 8

de falsos po

o, que a fin d

o de todos lo

ercentiles 90

s datos sugie

ácticamente

ultados obten

A03

P90Q

A11

P357G

A11

0

10

6

18,5

2

23

21

1

11,5

0,5

8 2

ositivos natur

de utilizar un

os valores m

y 95. En la f

eren que la m

e 0 (0,5 pu

75

idos en los en

P118A

A11

P90Q

A24

1

0,5 0,5

0

3 8 3,

4,

0

0

5

0

5

2

0,

0

2 2 1

ralmente de

n criterio obj

edidos en to

igura III.14. s

mayoría de

ntos cada

nsayos de ELIS

P30K

A24

P138L

B07

P223I

1

1

2

0,5

1

0

,5 7,5

2

,5 0

1,5

0 0

0

8,5

5

0,5 1,5

5,5

2,5

,5

0,5 0,5

1

15 4 6

ecrece a med

etivo para c

odos los ensa

se muestra l

los ensayos

100,000 CM

SPOT de resp

P223I

B07

P357G

B08

P76R

2

0,5

5 8

2

33,5

5 2

5 24,5

2,5

2,5

1,5

6 4

dida que se

lasificar la m

ayos se dete

a distribució

resultaron n

MSP), se pu

uesta péptido

B40

P215V

B40

P218V

0,5 2,5

2,5 12

0,5 2

2,5 1

0,5 1

0 7

1 1

7 7

incrementa

magnitud de

erminó media

ón de la varia

negativos, y

uede conside

o específica.

B40

P95R

B57

P242T

0

0,5

2,5

9

3,5

1,5

15,5

11

1,5

4

0,5

7 4

el punto de

la respuesta

ante análisis

able medida.

de hecho la

erar que la

e

a

s

.

a

a

distri

La pr

medi

demo

A02P

A11P

respu

pobla

cabe

evalu

bución de lo

roporción de

das se resum

ostraron ser

P65 y A03P9

P118, A24P30

uesta podría

ación bajo e

destacar qu

uado en 14 p

os valores m

e respuesta

me en la fig

r reconocido

90 alcanzaro

0, B07P223,

estar relaci

estudio que

ue resulta l

acientes.

medidos es u

ensayo

signifi

certer

con al

por so

aquell

29,45

positiv

del pe

5 pun

del 25

Figura

ELISPO

respue

azul las

positiva a lo

gura III.15. C

os con resp

on reconocim

B08P76 y B

onada con l

no permitió

lamativa la

76

una buena a

os realmen

cativamente

ramente pos

lta magnitud

obre el perc

las contenid

puntos). Aq

vidad antes m

ercentil 90 fu

tos correspo

5% de los ens

III.14. Distri

OT para toda

estas de eleva

s de magnitud

os distintos

Como se obs

puestas de e

mientos de

B40P215 no

a limitada p

analizar un

falta de res

aproximación

te negativo

e alejados d

sitivos. De es

d aquellos en

centil 95 (2

as entre los

quellas resp

mencionado

ueron consid

ondió al per

sayos puede

bución de lo

s las muestr

da magnitud,

d baja.

péptidos en

serva, los ep

elevada mag

media mag

se detectaro

prevalencia d

número gra

spuesta fren

n a la variab

os; y que

de la medi

sta manera c

nsayos dond

9,45 puntos

s percentiles

puestas que

(mayor a 5

deradas resp

rcentil 76,6;

considerars

os valores me

ras analizada

, en naranja la

nsayados, ju

pítopes A02P

gnitud, mie

gnitud. Para

on respuesta

de los alelos

ande de mu

nte al epíto

bilidad de los

por lo tan

iana son e

consideramo

de se obtuvie

s), y respue

90 y 95 (en

cumplen el

puntos) pero

uestas bajas

es decir, qu

e en principi

edidos en los

s. En rojo se

as de magnitu

nto con las

P84, A03P28

ntras que l

los epítope

as, aunque e

s correspond

uestras. En e

pe A24P30,

s valores en

to aquellos

nsayos casi

os respuesta

eron valores

stas medias

ntre 18,55 y

l criterio de

o por debajo

s. El valor de

ue alrededor

io, positivos.

s ensayos de

e resaltan las

ud media y en

magnitudes

8 y B07P357

os epítopes

es A01P125,

esta falta de

dientes en la

este sentido,

el cual fue

n

s

i

a

s

s

y

e

o

e

r

e

s

n

s

7

s

,

e

a

,

e

Del to

A02P

B40P

A24P

los in

B07P

frent

Basad

posic

tende

tabla

la evi

el ale

como

que f

confi

asoci

aque

Figura III.15

detall

otal de 13 p

P65Q, A02P8

218V, B40P9

P30K, B07P22

ndividuos ev

357G, B40P2

e a ambas va

dos en los re

ciones conte

encia para d

III.7. se deta

idencia dispo

elo HLA por

o para asegu

fueron analiz

rmados con

ación al ale

llos epítopes

5. Proporción

la la magnitud

péptidos para

84T, A03P28

95R, B57P24

23I, B08P76R

valuados. Lo

218V, B40P9

ariantes salv

esultados ob

enidas en u

eterminar si

allan nuevam

onible que lo

el cual pose

rar un buen

zados donde

evidencia in

lo correspon

s con eviden

de respuesta

d de la respue

a los cuales

8K, A11P357

42T], para 5

R, B40P215V

os restantes

95R, B57P24

vaje ymutada

btenidos, se

n total de

alguno de e

mente los ep

os confirma.

ían restricció

número de

e se observa

nmunológica

ndiente. De

cia estadístic

77

frente a los p

esta y el núme

se sintetizar

7G, A24P30

5 de ellos [c

V] no se enc

s 8 péptido

2T] pudieron

a. Los resulta

reanalizó la

20 epítope

ellos resultab

ítopes de la

Obsérvese q

ón no se enc

casos analiz

ron tendenc

y uno (el A2

aquí en ad

ca y/o inmun

péptidos eval

ero de muestr

ron potencia

K, B07P223

como se obs

contró ningú

s [A02 P65

n ser reevalu

ados se mue

a tabla III.2.

s potenciale

ba confirmad

tabla III.2. ju

que 8 de ello

contraba en

ados. Como

cias significat

24P030) disp

elante, sólo

nológica.

uados en ens

ras analizadas

les variantes

I, B07P357G

serva en la f

n nivel de re

Q, A02P84T

uados para d

estran en la s

donde se m

es identifica

do por los en

unto con la in

os no fueron

prevalencia

muestra la t

tivas en el ti

pone sólo de

serán cons

sayos de ELISP

en cada caso

s de escape

G, B08P76R,

figura III.15.

espuesta en

T, A03P28K,

diferencias e

siguiente sec

mostraba una

ados en los

nsayos de EL

nformación y

analizados d

a lo suficient

tabla, de los

empo, 5 de

evidencia es

iderados en

POT. Se

.

[A01P125N,

B40P215V,

A01P125N,

ninguno de

A11P357G,

en respuesta

cción.

a lista de 12

análisis de

LISPOT. En la

y se muestra

debido a que

emente alta

12 epítopes

ellos fueron

stadística de

n los análisis

,

,

,

e

,

a

2

e

a

a

e

a

s

n

e

s

Ta

Pos

P03

P07

P08

P08

P09

P21

P21

P22

P28

P09

P05

P13

III.3.4

A fin

realiz

ensay

200.0

llegó

utilizó

1 log

dispo

analiz

III.3.4

Este e

célula

la mu

bla III.7. Resu

siciónAleloHLA

30 A24

B08

76 A30

B08

83 A02

A30

84 A02

A30

A11

95 B40

15 B40

18 B40

B07

23 B07

80 B52

CW18

90 A11

A03

54 B68

38 A24

4. Comparac

de identifica

zaron nuevo

yos difieren

000 células p

a 300.000 s

ó una conce

garitmo e i

onibilidad de

zado.

4.1. A02P65

epítope se e

as por pocill

uestra F197 m

umen de los e

oA Secuenc

4 KYKLKHIVW

GGKKKYK

0 RSLYNTVAV

ELRSLYNT

SLYNTVAT

0 RSLYNTVAT

SLYNTVAT

0 RSLYNTVAT

TLYCVHQR

IEIKDTKEA

EEAAEWD

AEWDRLHP

HPVHAGP

HPVHAGP

RMYSPTS

8 VRMYSPV

AVLYCVHQ

CVHKKIEV

ETAEGCRQ

4 NYPIVQN

ción de la res

ar diferencia

s ensayos d

del anterio

por pocillo; e

según dispon

ntración de

intentando

e células. A

ensayó en do

o respectiva

mostró nivel

pítopes suger

ia E

W E

KLK N

VLY N

TV

TL Estadísti

TLY N

TL Estadísti

TLY N

RI N

AL In

RL

PV In

PIA N

PIA

SI N

VSI N

QK

VK In

QI

NL

spuesta a los

as en la resp

e ELISPOT, e

or en que e

esto es, el d

nibilidad de c

péptido de 1

comenzar c

continuació

os muestras

mente. Los

es de respue

78

ridos en la tab

Evidencia

Estadística

o analizado

o analizado

Ausente

ica e inmunoló

o analizado

ica e inmunoló

o analizado

o analizado

munológica

Ausente

munológica

o analizado

Ausente

o analizado

o analizado

Ausente

munológica

Ausente

Ausente

s péptidos sa

uesta espec

esta vez fren

l número d

doble que en

células. Ade

10 5 M, en es

con una co

ón se detalla

positivas, la

resultados s

esta mucho m

bla III.2. y con

Obser

p=0,00

Baja p

Baja p

Falta d

ógica p=0,00

Baja p

ógica p=0,07

Baja p

Baja p

ELISPO

no con

ELISPO

Baja p

no con

Baja p

HLA C

ELISPO

ELISPO

falta d

1 solo

alvajes ymu

ífica frente a

nte a ambas

e células fu

n el caso ant

más, a difere

ste caso se u

oncentración

an los result

F048 y la F1

e muestran

mayores fren

nfirmados en

rvaciones

055

revalencia de

revalencia de

de pacientes

008

revalencia de

716

revalencia de

revalencia de

OT

nfirmada

OT

revalencia de

nfirmada

revalencia de

no caracteriz

OT positivo ba

OT

e pacientes

paciente muy

utados

a los péptido

s variantes p

ue en gener

terior, aunq

encia del cas

utilizaron con

n de 10 4 M

tados obten

197. Se utiliz

en la figura

nte a la varia

los ensayos d

l alelo

l alelo

l alelo

l alelo

l alelo

l alelo

l alelo

zado en este e

ajo y en solo 1

y bajo

os salvajes y

peptídicas. E

al mayor: e

ue en algun

so anterior e

ncentracione

M, nuevame

idos para ca

zaron 163.00

III.16. Como

antes salvaje

de ELISPOT

estudio

paciente

mutados se

Estos nuevos

n promedio

as muestras

en el cual se

es seriadas a

ente, según

ada epítope

00 y 162.000

o se observa,

e comparado

e

s

o

s

e

a

n

e

0

,

o

con l

muy

III.3.4

Este

93.00

La mu

mues

detec

III.3.4

Este e

célula

o observado

similar a am

4.2. A02P84

epítope se e

00 y 162.000

uestra F037

stras fue prá

ctó ningún ti

Fig

4.3. A03P28

epítope se e

as por pocill

o frente a la

bas variante

Figura III.16.

ensayó en t

0 células por

no pudo ser

cticamente i

po de respu

gura III.17. Re

ensayó en do

o respectiva

variante m

es.

. Respuesta al

res muestra

r pocillo resp

ensayada co

idéntica fren

esta en ning

espuesta al ep

os muestras

mente. Los

79

utante. La m

l epítope A02

s positivas,

pectivamente

on el péptido

nte a los pép

una de las d

pítope A02P84

positivas, la

resultados s

muestra F048

2P65 en lasmu

la F037, F17

e. Los result

o P83V. Com

tidos P84T y

iluciones.

4 en lasmues

F197 y la F2

e muestran

8, en cambio

uestras F197

74 y la F048

ados se mue

mo se observa

y P84V. Frent

stras F037, F1

289. Se utiliz

en la figura

o, respondió

y F048.

8. Se utilizar

estran en la

a la respuest

te al péptido

74 y F048.

zaron 162.00

III.18. Como

ó de manera

on 130.000,

figura III.17.

ta en las tres

o P83V no se

00 y 230.000

o se observa,

a

,

.

s

e

0

,

en am

todas

III.3.4

Este e

fue n

III.3.4

Este

célula

la res

respu

Figura

mbas muest

s las dilucion

4.4. A11P357

epítope se e

egativo sugi

4.5. B07P357

epítope se e

as por pocill

spuesta en

uesta práctic

a III.19. Respu

tras se dete

nes ensayada

Figura III.18.

7

ensayó en un

riendo un re

7

ensayó en d

o respectiva

las dos mue

camente nula

uesta al epíto

ctó una resp

as.

. Respuesta al

na muestra,

esultado falso

os muestras

amente. Los

estras mostr

a frente a la

pe B07P357 e

80

puesta de m

l epítope A03

la F046. Se u

o positivo en

s positivas, l

resultados s

ró una respu

variante mu

en lasmuestr

mayor magn

3P28 en lasmu

utilizaron 86

n el primer a

a F030 y F0

se muestran

uesta mayor

tada.

as F030 y F06

itud frente

uestras F197

.000 células

nálisis de ELI

60. Se utiliza

en la figura

r frente a la

60.

a la variante

y F289.

por pocillo.

ISPOT.

aron 204.00

III.19. Como

a variante sa

e salvaje en

El resultado

00 y 206.000

o se observa

alvaje y una

n

o

0

a

a

III.3.4

Este e

célula

result

mues

III.3.4

Este e

fue n

III.3.5

Cons

carac

otras

marc

iodur

que s

muer

sobre

pépti

autól

dicho

4.6. B40P218

epítope se e

as por pocill

tó ser negat

stra F026, co

4.7. B57P242

epítope se e

egativo sugi

5. Confirmac

iderando qu

cterizar la res

s citoquinas,

ación intrac

ro de propidi

se esquemat

rtas sobre la

e las CD3+,

ido A03P28K

ogas, y en c

o porcentaje

8

ensayó en do

lo respectiva

tiva y es po

omo se obser

2

nsayó en un

riendo un re

ción de la res

ue la prueba

spuesta espe

se realizó l

celular de la

io para difer

tiza en la fig

selección d

para la mu

K (siguiendo e

cambio se re

fue 0,42% p

os muestras

amente. Los

or lo tanto o

rva en la figu

a muestra, l

esultado falso

spuesta cito

a de ELISPOT

ecífica previa

a prueba de

s citoquinas

enciar célula

gura III.21. C

e la població

estra F197

el procedimi

ealizó la esti

para la muest

81

positivas, la

resultados

otro caso fal

ura III.20. fue

Figura

B40P218

a F080. Se ut

o positivo en

tóxica espec

T detecta la

amente dete

e estimulació

s MIP 1 e

as vivas de cé

Como se ob

ón linfocitar

estimulada

iento detalla

imulación di

tra F197 y 0,

F026 y la F0

se muestran

lso positivo

e mayor frent

III.20. Respu

8 en la muest

tilizaron 256

n el primer a

cífica frente

liberación s

ectada por E

ón in vitro c

IL 2 aparte

élulas muert

bserva en dic

ia en el cuad

con una lín

ado en la sec

recta de las

33% para la

095. Se utiliz

n en la figur

del primer

te a la varian

uesta al ep

ra F026.

6.000 células

nálisis de ELI

a los epítop

solamente d

LISPOT en té

con péptidos

de IFN . In

tas siguiendo

cha figura, e

drante de FS

nea B autólo

cción ). Cuan

CMSP con

muestra F28

zaron 292.00

ra 4.8. La m

conjunto de

nte salvaje.

pítope

por pocillo.

ISPOT.

es estudiado

de IFN y c

érminos de s

s específicos

nicialmente

o la estrategi

el porcentaje

SC vs SSC res

oga sensibili

do no se usa

el péptido m

89.

00 y 198.000

uestra F095

e análisis. La

El resultado

os

on el fin de

secreción de

s y posterior

se utilizó el

a de análisis

e de células

sultó ser 1%

zada con el

aron líneas B

mencionado,

0

5

a

o

e

e

r

l

s

s

%

l

B

,

es

po

Un in

longit

PerCP

mort

remo

estra

Cons

líneas

B sen

casos

Figura III.21

estimulada

stimulada dire

F289 estimu

corresponde

oblación muer

nconveniente

tud de onda

P, y por lo t

andad medi

oviendo el Io

tegia de aná

iderando tam

s B sensibiliz

nsibilizadas e

s en que no s

A

B

C

1. Estrategia d

a con una líne

ectamente po

ulada también

e al FSC vs SSC

rta (IP positiva

e que surge

a correspon

tanto su uso

idos en el e

oduro de Pro

álisis se esqu

mbién que l

zadas compa

en todos los

se disponía d

de análisisme

a B autóloga s

r incubación c

n directament

C, en el segund

a), en el terce

(CD3+

de la utiliza

diente al flu

o limita el a

experimento

opidio e inclu

ematiza en l

os niveles d

arado con la

s experimen

de linfocitos

82

ediante tinció

sensibilizada c

con una conce

e con el pépti

do se seleccio

er cuadrante s

+/CD8+) secret

ción del Iod

uorocromo P

nálisis a 4 fl

mencionad

uyendo dos m

a figura III.22

de secreción

estimulación

ntos siguient

B autólogos

ón con Ioduro

con el péptido

entración 10 4

ido A02P28K.

ona la subpobl

e determina l

tores de IFN

uro de Prop

PE pero tam

luorocromos

o, se decidi

marcas adici

2.

de IFN fu

n directa con

tes, sean au

transformad

o de Propidio.

o A03P28K. B.4 M del mismo

En cada caso

lación CD3+ y

a proporción

.

pidio es que

mbién interfi

s. Confirman

ió cambiar l

onales: el M

ueron mayor

n el péptido,

utólogas o h

dos).

A. La muestra

. La misma mu

o péptido. C. L

el primer cua

se la diferenc

de linfocitos c

el mismo ab

ere con el f

ndo los bajo

la estrategia

MIP 1 y la IL

res cuando s

se decidió u

eterólogas (

a F197

uestra

La muestra

adrante

cia de la

citotóxicos

bsorbe en la

fluorocromo

s niveles de

a de análisis

2. La nueva

se utilizaron

utilizar líneas

(en aquellos

a

o

e

s

a

n

s

s

En la

ensay

tuvie

Tabla

péptid

CMSP

F030

F037

F048

F060

F080

F087

F197

F289

En

En

po

so

Como

obtuv

y los

consi

contr

result

Po

IFN

M

IL

IFN

IFN

IL

IFN

tabla III.8. se

yadas, se dis

ran el/los ale

III.8. Diseño

do específico

HLA CM

P A

0 1 2 37

7 2 2 48

8 2 3 39

0 1 24 7

0 2 3 57

7 3 31 7

7 2 3 27

9 1 3 57

n la tabla se re

n amarillo se

or ELISPOT en

obre otras mu

o se detallab

vo el porcen

resultados

derar una r

roles, es dec

tados se mu

Tab

orcentajes

N

IP 1

2

N + MIP 1

N + IL 2

2 + MIP 1

N + IL 2 + MI

En la tabla se

e detalla el d

sponía de líne

elos para los

o experiment

s.

MSP

B Línea

7 7 F030

8 35 F197

9 35 F048

44 F030

7 39 F289

45 F289

7 18 F197

7 7 F289

esalta en rojo

resaltan las e

n las curvas d

estras no utili

ba en la figur

taje de linfo

obtenidos s

espuesta po

cir, aquellos

estran en la

bla III.9. Magn

Lí

F030

0,189

0,784

0,252

0,036

0

0,023

P 1 0,014

resaltan en r

diseño exper

eas B autólo

s cuales los p

tal para la d

HLA Lín

B A

0 Autólo

7 2 3 27

8 Autólo

0 1 2 37

9 1 3 57

9 1 3 57

7 Autólo

9 Autólo

o los alelos pre

estimulacione

de respuesta,

izadas para re

ra III.22., a p

ocitos CD3+/C

e muestran

ositiva se co

s donde las

tabla III.9.

nitud de respu

Porcent

íneas B Heteról

F048 F19

0,06 0,11

1,11 1,64

0,237 0,62

0,315 0,08

0,042 0,01

0,057 0,02

0,163 0,01

ojo aquellos v

83

rimental. Com

ogas; en los o

péptidos a en

detección de

ea B

B A02P

oga

7 18

oga 1

7 7

7 7

7 7

oga 1

oga

esentes en las

es programada

mientras que

ealizar las curv

artir de los d

CD8+ respon

a continuac

menzó anali

CMSP se e

uesta a los con

aje de células C

logas

7 F289 F

11 0,071 0

45 0,63 0

2 0,436 0

88 0,035 0

1 0

27 0,047 0

1 0,024 0

valores identif

mo se observ

otros casos s

nsayar tuvier

citoquinas in

P65 A02P84

1

1

s líneas B per

as para confi

e en verde se

vas de respues

distintos cua

ndedores seg

ción. Para de

izando las re

enfrentaban

ntroles con lín

CD3+/CD8+ res

Líneas B

F037 F060

0,094 0,031

0,782 1,02

0,516 0,528

0,016 0

0 0

0,01 0,041

0,005 0

ficados como

va, para cuat

e utilizaron l

ran restricció

ntracelulares

A03P28 A

1

1

1

1

o ausentes en

rmar las resp

e resaltan est

sta.

drantes del

gún la o las c

eterminar el

espuestas ob

a líneas B

neas B no sen

spondedoras

Autólogas

F080 F08

0,109 0,3

0,893 0,2

0,345 0,1

0,082 0,04

0,014 0

0,018 0

0,009 0

extremos en

tro de las oc

líneas B hete

ón.

en linfocitos

A03P90 B07P3

1

1

1

1

1 1

n las CMSP es

puestas antes

imulaciones a

análisis de c

citoquinas qu

l límite a pa

btenidas en

no sensibiliz

nsibilizadas.

D87 Media

27 0,124

33 0,887

14 0,384

47 0,043

0 0,008

0 0,028

0 0,009

el análisis est

ho muestras

erólogas que

s CD3+/CD8+

357 B57P242

1

stimuladas.

evaluadas

adicionales

citometría se

ue liberaban

artir del cual

los ensayos

zadas. Estos

Desviaciónestándar

0,094

0,407

0,168

0,032

0,015

0,019

0,008

adístico

s

e

+

e

n

l

s

s

Figura III.22. Estrategia dee análisis de psob

84

olifuncionalidre líneas B se

dad de la respnsibilizadas.

Mono

secre

Mono

secret

Mono

secre

Trifun

Trifun

Trifun

Bifun

de IF

Bifun

de IL

Bifun

de IF

Bifun

de IL

Bifun

de IF

Bifun

de IF

puesta péptid

ofuncional

tora de IL-2

ofuncional

tora de IFN-

ofuncional

tora de MIP-1

ncional

ncional

ncional

ncional secretora

FN- y MIP-1

ncional secretora

L-2 y MIP-1

ncional secretora

FN- y MIP-1

ncional secretora

L-2 y MIP-1

ncional secretora

FN- y IL-2

ncional secretora

FN- y IL-2

o específica dde CMSP

Como

mien

el ob

Inicia

existí

estan

funci

la tra

valor

del a

homo

medi

facto

ya se

entre

(F6,30=

Cons

calcu

como

Cons

obten

cump

Como

signif

los e

B07P

tanto

de la

decir

lado,

de IL

ELISP

o se observa

tras que las

jetivo de po

almente se p

ían diferenc

ndarizados m

ón del logar

ansformació

es extremos

nálisis, los d

ogeneidad d

ante un ANO

res fijos “Cit

a frente a lín

e la magnitu

=43,623; p<1

iderando la

ló el desvío

o límite de p

iderando es

nidos con la

plen con el m

o se observ

ficativas fren

nsayos de E

357. En el r

o respuestas

s respuestas

, provenient

la elevada

2 sugiere qu

POT.

a, parecen e

respuestas m

oner a prueb

puso a prue

cias significa

mediante grá

itmo natural

n menciona

s que se resa

datos fueron

de varianza

OVA de 2 fac

toquina” y “A

neas B autólo

d según el t

10 12).

diferencia s

estándar pa

positivada m

te criterio d

as líneas B

mencionado c

va en la fig

nte al péptid

LISPOT. La m

resto de las

monofuncio

s secretoras

tes de linfoc

magnitud de

ue gran part

existir diferen

medidas fren

ba estas obse

eba el supue

ativas (p<10

áficos Q Q y

l normalizab

da. Analizan

altan en rojo

reanalizado

s (p=0,528)

ctores. El mis

Autóloga” (F

ogas o heter

tipo de resp

significativa

ra cada una

más allá del

de positivida

sensibilizad

criterio.

gura III.23.,

do A03P28, l

misma situac

combinacion

onales como

de IFN en

citos citotóxi

e respuesta

te de la resp

85

ncias import

nte a líneas B

ervaciones s

esto de igua

0 4). Por lo

y se determ

ba la distribu

ndo los dato

en la tabla I

os con la pru

). Los datos

smo arrojó c

F6,30=0,407; p

ólogas (F1,30=

uesta medid

observada e

de ellas y d

cual las res

ad se muest

das detallan

las muestr

as cuales fu

ción fue obs

nes de CMS

polifunciona

ncontradas p

cos capaces

monofuncio

puesta péptid

tantes en la

B autólogas

e realizó un

aldad de var

o tanto se

inó que la t

ción (ver An

os en gráfic

II.9. Luego d

ueba de Leve

s transform

omo resulta

p=0,868) y c

=2,307; p=0,

da como can

en la propor

icho valor m

puestas med

ran en las f

do con un

ras F197 y

eron detecta

servada para

P frente a d

ales. Los dat

por ELISPOT

de secretar

onal, tanto se

do específica

polifunciona

o heteróloga

análisis de A

rianza. Segú

procedió a

transformac

exo V). Por l

os de boxpl

de ser retirad

ene, la cual c

mados fuero

do ausencia

confirmó la i

139) y la dife

ntidad y tipo

rción de cad

multiplicado p

didas serían

iguras III.23

asterisco a

F289 no e

adas y confi

a la muestra

distintos pép

tos sugieren

eran respue

r también M

ecretora de

a no es dete

alidad de las

as parece no

ANOVA de d

ún la prueba

a analizar l

ión de los d

lo tanto se p

lot se identi

dos los valor

confirmó el s

on entonces

de interacci

gualdad de

erencia muy

o de citoquin

da tipo de re

por dos fue

considerada

. y III.24. lo

quellas resp

evidenciaron

rmadas prev

a F060 frente

ptidos se han

también que

estas polifun

MIP 1 y/o IL

MIP 1 com

ectada en los

s respuestas

o diferir. Con

dos factores.

a de Levene

os residuos

datos con la

procedió con

ificaron tres

res extremos

supuesto de

s analizados

ión entre los

la respuesta

significativa

nas distintas

espuesta, se

considerado

as positivas.

s resultados

puestas que

respuestas

viamente en

e al péptido

n observado

e la mayoría

ncionales, es

L 2. Por otro

mo secretora

s ensayos de

s

n

.

e

s

a

n

s

s

e

s

s

a

a

s

e

o

.

s

e

s

n

o

o

a

s

o

a

e

F

El en

confi

signif

de lo

polifu

Figura III.23. R

nsayo fue re

rmados en l

ficativa frent

os péptidos

uncionales.

Figura

Resultados ob

paci

ealizado tam

as curvas de

te al péptido

s A03P28 y

a III.24. Resul

btenidos en lo

entes previam

mbién para

e ELISPOT. Co

o A03P90 en

y B07P357

ltados obtenid

86

os ensayos de

mente caracte

otras mues

omo se obse

ninguna de l

se detectar

dos en los en

e polifunciona

erizados en la

stras con ot

erva en la fig

las muestras

ron tanto r

sayos adicion

alidad para pé

a sección 3.3.

tros péptido

gura III.24., n

s ensayadas,

respuestas m

nales de polifu

éptidos espec

os que no

no se observ

mientras qu

monofuncio

uncionalidad.

cíficos en

habían sido

vó respuesta

ue en el caso

nales como

o

a

o

o

III.3.6

A fin

técni

fenot

anter

pued

Mate

En la

novo

R

El gru

tetrá

previ

esque

amar

pacie

anális

mues

SSC q

asoci

6. Caracteriz

de estudiar

ca de tetrám

tipo del tota

riormente de

en analizar

eriales y Mét

figura III.25

. Los tetráme

Figura III

Estreptavidi

Recordar que

upo bajo an

meros tamb

amente en

ematiza en c

rillo para res

ente, se utiliz

sis tuvo que

stras analiza

que sugiere

ada al transp

zación del niv

r indicios de

meros. Se elig

al de los Li

esarrolladas

las células

todos y se uti

5. se muestra

eros A02P84

I.25. Control d

na (SAV). Se o

para la const

nálisis, inicial

bién detallad

los ensayos

color en la m

spuestas baj

zaron dos flu

e ser reducid

das, el análi

la muerte

porte de las

vel de agota

e agotamien

gió esta técn

nfocitos Cito

como ELISPO

respondedo

ilizó como in

a el control

4T y A03P28K

de síntesis de

observa que e

trucción final l

lmente cons

os. La selecc

s de ELISPOT

misma tabla (

as). Cuando

uorocromos

do ya que, co

sis de citom

de la mayo

muestras a

87

amiento de la

nto de la res

nica porque t

otóxicos esp

OT y Citome

oras. Se sigu

ndicio de ago

de producci

K se encontra

tetrámeros e

el agregado rá

la SAV se agre

forma tetram

sistía en las

ción de esto

T; la intensi

rojo para res

más de un

distintos par

omo se mue

metría de fluj

ría de las c

la ciudad de

a respuesta

spuesta inm

teóricament

pecíficos par

tría de flujo

uió la metod

otamiento el

ión de los te

aban ya sinte

en Gel SDS PA

ápido de SAV f

ega lentament

mérica.

muestras de

os pacientes

dad de la r

spuestas alta

tetrámero t

ra realizar el

estra en la fi

o muestra u

células. Esta

e Atlanta en E

epítope esp

mune péptido

te es la única

ra un péptid

para la liber

dología desc

marcador P

etrámeros pa

etizados prev

AGE luego del

forma todas la

te para favore

etalladas en

fue basada

espuesta an

as, naranja p

tuvo que se

l marcado. S

igura III.26.,

una alteració

elevada mo

Estados Unid

pecífica

o específica

a capaz de de

do, ya que

ración de cito

cripta en la

D 1.

ara los 6 con

viamente.

tratamiento

as variantes p

ecer la formac

la tabla III.

en la respue

nteriormente

para respuest

r evaluado e

in embargo,

en cuatro d

ón important

ortalidad ce

dos donde e

se utilizó la

eterminar el

las técnicas

oquinas sólo

sección de

nstruídos de

con

posibles.

ción de la

10. para los

esta medida

e medida se

tas medias y

en el mismo

el grupo de

de las nueve

te en FSC vs

lular estuvo

l análisis fue

a

l

s

o

e

e

s

a

e

y

o

e

e

s

o

e

A fin

indivi

simul

fluore

indica

tiemp

para

desag

en es

resum

citóm

vi

Una

contr

pépti

tiemp

negat

Cons

n de realiza

iduales y cé

ltánea de l

escente pas

a la cantidad

po que se en

distinguir c

gregada se d

sta subpobla

men los resu

metro de flujo

Figura III.2

Inicialmente

ables (IP nega

dificultad qu

rol negativo,

ido bajo aná

po, sea segu

tivo se utiliz

iderando qu

ar adecuada

lulas agrega

os parámet

a por el láse

d total de s

ncuentra baj

élulas indivi

determina la

ación se dete

ultados obte

o.

27. Estrategia

se selecciona

ativas) y de ba

ue presenta

, ya que el

álisis por un

ro que el pa

ó la proporc

ue el valor es

amente el

das. Esto es

tros “altura”

er. La “altur

eñal medida

jo el haz de

iduales de a

a proporción

ermina la pro

enidos y en

a de análisis u

n aquellas con

aja complejida

la técnica d

mismo deb

no distinto q

aciente no p

ción de célul

sperado par

89

análisis de

s posible cua

”, “área” y

ra” del pulso

a y el “anch

l laser. En la

agregadas. L

de células C

oporción qu

la figura III

utilizada para

n menor altur

ad. Sobre esta

posterior an

de tetrámer

bería consist

que tenga re

osea respue

as CD8 nega

a este porce

tetrámeros

ando el citó

“ancho” d

o indica la m

o” indica el

a figura III.27

Luego de se

CD8+ recono

e expresa el

I.28. se mue

distinguir cél

ra y ancho. Lu

a población se

nálisis.

ros para su

tir del tetrá

estricción po

esta específic

ativas que pr

entaje es 0,

s, debe dis

metro de flu

del pulso a

mayor intens

tamaño de

7. se muestr

leccionar la

ocidas por e

l marcador P

estran los re

ulas individua

ego se selecc

e seleccionan l

análisis es l

ámero utiliza

or el mismo

ca. Como ap

resentaban t

se utilizó el

stinguirse en

ujo permite

medida qu

sidad del pu

la célula de

ra la estrate

población C

l tetrámero.

PD 1. En la t

esultados ob

ales de agrega

ionan las pob

las células CD

a de no ten

ado pero ca

o alelo y qu

roximación

tinción por e

doble del v

ntre células

la medición

ue la célula

ulso, el área

e acuerdo al

egia utilizada

CD3+ viva y

. Finalmente

abla III.9. se

btenidos del

adas.

laciones

3+ para su

ner un claro

ambiando el

e, al mismo

a un control

el tetrámero.

alor medido

s

n

a

a

l

a

y

e

e

l

o

l

o

l

.

o

como

propo

que c

espec

realid

subpo

CD8+

célula

para

célula

posit

result

Pacie

F03

F04

F08

F17

F06

En

CD

Como

cump

aunq

A03P

que l

ellos.

o aproximac

orciones ma

cumplieron

cíficas que e

dad específi

oblación qu

+Tetrámero

as realmente

solucionar e

as CD8+tetrá

ivos estimad

tados correg

Ta

nte Péptid

37 A02P8

48 A02P8

A03P2

A03P90

A02P65

80 A02P8

A03P2

A03P90

A02P65

74 A02P8

60 B07P35

n negro se re

D8+marcadas

o se observa

plieron el cri

ue fueron ev

P90 en 1 de l

a proporción

.

ción al límit

yores de CD

este criterio

expresan PD

cas para el

ue represe

que podría

e específicas

este problem

ámero que

da en el cont

gidos se mue

abla III.11. Res

do

Porcencélulaque recel tetr

4T 0,

4T 0,

8K 0,

0Q 0,3

5Q 0,

4T 0,2

8K 0,2

0Q 0,

5Q 0,2

4T 0,7

57G 0,0

saltan aquella

s (tercera colu

a en la tabla

terio de pos

valuados sol

os 2 casos e

n de células

te de confia

8+ teñidas c

o. Un segund

1 es que si

tetrámero

nta al con

a expresar n

s y de esta m

ma que se ap

expresan PD

trol) corregir

estran tambié

sumen de los

ntaje deas CD8+conocenrámero

P

qe

102

164

,14

322

185

284

208

193

231

732

096

as marcacion

umna) superab

a, de las 11

sitividad. Tet

o en dos cas

valuados. El

expresando

90

anza para c

on el tetrám

do problema

iendo que p

sino que en

njunto de

niveles signi

manera alte

plicó en el pr

D 1 y con es

r la proporció

én en la tabl

resultados o

Porcentaje decélulas CD8ue reconocenel tetrámero

0,024

0,145

0,279

0,315

0,32

0,128

0,491

0,063

0,586

0,226

0

es exitosas, e

ba al doble ob

combinacio

trámeros com

sos. El A02P8

B07P357 fu

PD 1 fue me

considerar p

mero. En la ta

a que surge

parte de las

n cambio so

falsos posi

ificativamen

rar los porce

resente traba

e valor (y co

ón medida e

a III.11.

btenidos del

n

Porcentacélulas CTet+ q

expresan

26,5

39,1

42,4

40,8

44,6

37,9

44,4

39,9

39,9

89,8

74,7

es decir, aque

btenido en la p

nes de mue

mo el A02P6

84 fue positiv

e positivo en

enor al 50%

positivas las

abla III.9. se r

al analizar l

células CD8+

on falsos po

itivos provi

te distintos

entajes estim

ajo fue dete

onsiderando

n la població

análisis de te

je deCD8+uePD 1

PorccéluTe

expre

5

1

4

8

6

9

4

9

9

8

7

ellas donde e

población CD8

estra y tetrá

65 y el A03P

vo en 3 de lo

n el único ca

en tres caso

muestras q

resaltan las m

a proporció

+Tetrámero+

ositivos de

iene de la

de PD 1 q

mados. La a

erminar la pr

la proporció

ón CD8+Tetr

trámeros.

entaje deulas CD8+et queesan PD 1 a

48,0

38,5

40,9

68,7

69,2

el porcentaje

8 (cuarta colu

mero analiz

P28 resultaro

os 4 casos ev

so evaluado

os y casi 100%

que posean

marcaciones

n de células

+ no son en

marca, esta

a población

que aquellas

proximación

roporción de

ón de falsos

amero+. Los

Porcentajecorregido deagotamiento

19,9

37,4

39,4

99,2

74,7

de células

umna).

adas, solo 5

on negativos

valuados y el

o. Se observa

% en uno de

n

s

s

n

a

n

s

n

e

s

s

5

s

l

a

e

Figura III.28. Resulta

91

dos obtenidoos del análisis de tetrámeroos.

III.4.

El est

escap

del tr

logró

estuv

pacie

mililit

emba

Esto

la sec

en el

A par

escap

restri

todas

fuero

afinid

detal

en el

F

. Evaluació

tudio del imp

pe se realizó

ratamiento y

ó secuenciar

vo asociada a

entes con niv

tro de sang

argo, de las 3

sugiere que

cción de mat

34% (11/32

rtir de las se

pe así como

icción media

s las muestra

on resumidos

dad predicha

les de las se

Anexo VI. Lo

igura III.29. R

ón del impa

pacto del tra

mediante el

y luego de su

exitosamen

a la cantidad

veles indete

gre) y 2 pos

34 muestras

aun con baj

teriales y mé

) de los pacie

ecuencias vir

o también la

ante análisis

as disponible

s en la tabla

a por el alelo

ecuencias pe

os resultados

Resultados de

acto del tra

atamiento an

l análisis de

u inicio. Del t

te 29 y 6 de

d de virus en

ectables de v

seían valore

s exitosamen

a eficiencia,

étodos result

entes en los

rales obtenid

a afinidad p

in sílico. Ini

es de los pa

a III.4. Para c

o y se compa

ptídicas en c

s del análisis

l análisis in sí

92

atamiento

ntirretroviral

las secuencia

total de 50 se

e ellas, respe

la muestra:

virus en san

s cercanos

nte amplifica

la metodolo

tó relativam

cuales no se

das fue posib

predicha fre

cialmente se

cientes eval

cada epítope

aró con la ma

cada muestra

s se muestran

ílico de afinida

de ELISP

o antirretro

l en la selecc

as virales pre

egundas y 10

ectivamente

de las 26 m

ngre (debajo

a la indetec

adas, 11 prov

ogía de ultrac

ente exitosa

e detectaba e

ble evaluar t

ente al alelo

e analizó la s

uados en la

e analizado e

agnitud de la

a y los valor

n en la figura

ad frente a la

POT.

oviral

ción y persist

esentes en p

0 terceras m

. La baja efi

uestras no e

o de las 50 c

ctabilidad (5

venían del m

centrifugació

a ya que perm

el virus.

tanto la pres

o del gen H

secuencia am

sección ant

en ensayos d

a respuesta

es predichos

a III.29.

a magnitud de

tencia de mu

pacientes ant

muestras reco

ciencia de a

exitosas 21 p

copias de AR

53 y 72 cop

mismo tipo d

ón del virus

mitió secuen

sencia de mu

HLA para el

minoacídica

erior y cuyo

de ELISPOT s

medida. La t

s de afinidad

e respuesta en

utaciones de

tes del inicio

olectadas, se

mplificación

provenían de

RN viral por

pias/ml). Sin

e pacientes.

descripta en

nciar el virus

utaciones de

cual poseía

del virus en

s resultados

se analizó la

tabla con los

d se proveen

n ensayos

e

o

e

n

e

r

n

.

n

s

e

a

n

s

a

s

n

Estos

la pr

signif

Luego

respu

de es

la pre

evide

que r

analiz

mues

Fi

Como

casos

surgi

fuero

En la

muta

mues

s resultados s

resencia de

ficativas (F3,8

o, mediante

uesta citotóx

scape cuando

edicción in s

encia de coex

representara

zado para ca

stran en la fig

igura III.30. Co

o se observa

s donde exis

miento del e

on analizadas

tabla III.10.

ado) en cada

stras.

sugieren que

secuencias

86=0,829; p=0

e análisis de

xica. Para cad

o cumplían la

sílico de afin

xistencia de

a la mayor v

ada epítope

gura III.30.

omparación d

a, la mayoría

ste un camb

escape ocurr

s en mayor d

se muestra

a muestra,

e la detecció

s peptídicas

0,481).

secuencia

da combinac

a condición d

nidad sugerí

más de una

entaja para

y comparad

de las variante

a de las sec

bio de frecu

rió en algún m

detalle para

para cada c

y en rojo a

93

ón de respue

de mayor

se evaluó la

ción de mues

de presentar

ía la desapa

variantes pe

el virus. El n

do en las pr

es salvajes ym

muestra

uencias pres

uencia entre

momento en

identificar e

combinación

quellos en

sta inmune p

afinidad, a

a existencia

stra péptido

r la mutación

arición del e

eptídicas se

número de p

rimeras y seg

mutadas enco

as.

sentaban ev

la primera

ntre ambas t

evidencia de

n analizada e

los cuales o

péptido espe

aunque las

o no de ev

o se identificó

n previamen

pítope, en l

seleccionó p

péptidos “sa

gundas mue

ontradas en la

videncia de e

y segunda

omas. Por es

selección ac

el estado de

ocurrió un c

ecífica estuv

diferencias

videncia de

ó aquellas co

te identifica

os casos en

para este aná

alvajes” y “m

estras. Los re

as primeras y

escape inmu

muestra sug

sta razón, la

ctiva de esca

cada epítop

ambio de e

o asociada a

no fueron

escape a la

on evidencia

da o cuando

que existía

álisis aquella

mutados” fue

esultados se

segundas

une y en los

giere que el

s secuencias

ape inmune.

pe (salvaje o

estado entre

a

n

a

a

o

a

a

e

e

s

l

s

.

o

e

Cuan

pépti

se m

secue

se en

Tabla

E

e

do se analiz

ido en los en

uestra en la

encia tendían

ncontraban e

III.10. Esquem

Pa

En la tabla se

casos donde

estuvo presen

ninguna de l

an estos dat

nsayos de EL

figura III.31

n a presenta

en estado sal

matización de

acienteAP1

F026

F027

F030

F037

F047

F048

F050

F060

F063

F070

F080

F087

F090

F119

F133

F155

F174

F182

F189

F197

F244

resume la com

la secuenciac

te en ambas m

as muestras y

tos en conju

ISPOT, no se

1., los epítop

ar mayores p

vaje en amb

el estado de l

A01125

A02P65

mparación de

ción fue exitos

muestras, en a

y en rojo, aque

se

94

unto con la m

e encontraro

pes donde ex

proporciones

bas muestras

os distintos e

A02P84

A03P28

secuencias v

sa). En naranja

azul las comb

ellas donde la

elección entre

magnitud de

n asociacion

xistía eviden

s de ensayos

s (61,9%).

epítopes en la

A24P30

B07P35

irales en las d

a se resaltan l

inaciones don

as secuencias

muestras.

e respuesta o

nes significat

cia de escap

negativos (7

s primeras y s

757

B40P95

BP

os muestras o

as combinacio

nde el escape

analizadas sug

observada fr

ivas. Sin emb

pe en base a

70,8%) que a

segundasmu

B40218

B57P242

obtenidas (en

ones donde e

no estuvo pre

gieren un pro

rente a cada

bargo, como

al análisis de

aquellos que

estras.

aquellos

l escape

esente en

ceso de

a

o

e

e

En la

en lo

comb

Como

ser re

A02P

anális

prese

el ree

pacie

pacie

epíto

A03P

emer

igualm

B40P

revirt

mues

al epí

tabla III.11.

os casos en l

binaciones an

o se observa

econocidas

P65, mientras

sis in sílico e

ente tesis qu

emplazo de u

ente ya pose

ente F244 tam

opes A02P84

P28 que en

rgieron muta

mente elim

95. Del paci

tió a salvaje

stra (hacia 20

ítope B40P9

se muestra

los que se e

nalizadas se

, el paciente

como de va

s que en 200

ra reconocid

ue fue demos

una variante

eía la varian

mbién evide

4 y B57P242

nuestro aná

aciones disti

inaron dicho

ente F050 s

en el segun

008). Finalm

5.

en detalle la

encontró evid

muestra en

e F048 prese

riantes que

07 poseía so

da por el alel

strada causa

salvaje por

nte de esca

ncia el surgi

. En el pacie

álisis está as

ntas a la ide

o epítope.

e obtuvieron

ndo tiempo

ente, el paci

95

a secuencia

dencia de se

el Anexo VI.

ntaba en 200

no podían

lo una varia

lo pero por o

a de escape.

una de esca

pe coexistie

miento de u

ente F197 e

sociada a la

entificada en

Este pacien

n 3 muestra

(hacia 2006)

iente F047 ta

peptídica y l

elección acti

04 la coexist

ser reconoc

nte, distinta

otro lado pre

Los paciente

pe entre los

endo con la

na mutación

emergió una

desaparició

n este estudi

te también

s donde llam

) y volvió a

ambién sele

Figura III.31.

medida en lo

según el esta

los distintos

los resultado

iva. El mism

tencia tanto

idas por el a

a todas las

esentaba la m

es F090 y F24

años 2004 y

salvaje en

n de escape

mutación d

n del epítop

io para el ep

presentó e

mativamente

mutar hacia

ccionó la mu

. Perfil de res

os ensayos de

ado (salvaje o

s epítopes baj

os del anális

o detalle pa

de variantes

alelo A02 en

anteriores, q

mutación de

44 también

y 2007, aunq

la primera

entre dichos

de escape en

pe. En el pa

pítope A24P3

escape para

e la mutació

el escape e

utación de es

puesta

e ELISPOT

o mutado) de

o estudio

is de escape

ara todas las

s que podían

n el epítope

que según el

scripta en la

presentaron

ue el primer

muestra. El

s años en los

n el epítope

aciente F027

30 pero que

el epítope

n de escape

en la tercera

scape frente

e

s

n

e

l

a

n

r

l

s

e

7

e

e

e

a

e

T

ID

A02P6

F04

F09

F24

A02P8

F24

A03P2

F19

A24P3

F02

F05

B40P9

F02

F04

B57P2

F24

En la

segun

de su

Tabla III.11. D

D

Fecha dtoma

muestr

65

48 08/01/20

25/10/20

90 12/03/20

01/07/20

44 12/11/20

31/05/20

84

44 12/11/20

31/05/20

28

97 12/08/20

31/05/20

30

27 09/12/20

04/12/20

50 12/01/20

04/12/20

17/07/20

95

27 09/12/20

04/12/20

47 08/01/20

04/07/20

242

44 12/11/20

31/05/20

tabla III.10.

nda muestra

urgimiento a

Detalle de las s

evidenc

de

a Tratamie

004 no

007 si

004 no

008 NA

004 no

007 no

004 no

007 no

004 no

007 no

003 no

006 si

004 no

006 no

008 NA

003 no

006 si

004 no

008 no

004 no

007 no

se observa

a. En la tabla

activo de mu

secuencias pe

cia cambios am

entoConteode CD4

521

227

187,2

27

NA

296

NA

296

699

314

150

300

337

455

300

150

300

87

630

NA

296

que no exis

III.11. se obs

utantes de e

96

eptídicas enco

minoacídicos

o4

CargaViral

88157

<50

122893

2162

4061

1317

4061

1317

4697

542

127093

1753

75282

64959

13024

127093

1753

409639

7121

4061

1317

stió reversió

serva que 4

scape entre

ontradas en la

asociados a e

Secuenciapeptídica

ILKQLHPA

..N.....

..D.....

..E.....

.......S

LIGQIQPS

....L...

....L...

ILGQLQPA

.I......

SLYNTVAT

..F....V

RLRPGGKK

........

........

KYRLKHMVW

......I.

.NN..QI.

KYRLKHIVW

R.Q.....

........

VEVRDTKEA

...K.....

IEVRDTKEA

..IK.....

TSTLQEQIG

..N.....A

n del escape

de los 7 paci

muestras n

asmuestras d

escape inmun

Afinidad

AL 0.280

. 0.526

. 0.592

. 0.357

. 0.432

L 0.451

. 0.374

. 0.374

AL 0.492

. 0.298

L 0.7890

V. 0.7937

KK 0.6070

Q 0.1234

P 0.0511

VW 0.4805

. 0.4508

. 0.0147

VW 0.4508

. 0.5875

. 0.5875

AL 0.321

.. 0.358

AL 0.253

.. 0.312

GW 0.536

A. 0.500

e a la forma

ientes donde

o han inicia

de pacientes d

ne.

Predicciónin sílico

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E

WB

WB

salvaje entr

e se encuent

do tratamie

donde se

Presencia demutación de

escape

si

si

si

si

si

no

no

no

no

no

no

si

no

si

si

si

si

si

si

no

si

No

Si

No

Si

No

Si

re primera y

tra evidencia

nto hasta el

ee

y

a

l

mom

indet

indag

obser

7 pac

grupo

escap

estar

21%

debe

Esta a

enten

repre

en la

trata

Fig

p

o

mento de la

tectables del

ga en la relac

rva que, si b

cientes (57,1

o de 11 pac

pe inmune. S

ía asociada

(corrección

ríamos aume

aparente aso

nderse en el

esenta a aqu

a figura III.3

miento se ob

gura III.32. Re

población vira

bserva, el aná

muestra se

secuenci

a segunda t

l virus en sa

ción entre el

ien la asocia

1%) que no h

cientes que

Si las propo

al bajo tama

de Yates).

entar el núm

ociación inve

l análisis de

uellos pacien

2., al compa

bserva que la

econstrucción

l presente en

álisis evidencia

relacionan co

ia aminoacídic

toma de m

ngre. Para u

l inicio de tra

ción no resu

han iniciado

iniciaron tra

rciones estim

año muestra

Para detec

mero total ac

ersa entre el

clones de p

ntes donde e

arar la dive

a misma dism

n filogenética

la primera (e

a un recambio

on una sola de

ca de los epíto

97

muestra, y e

uno de ellos

atamiento y

ulta significat

tratamiento

atamiento, s

madas son c

al ya que co

tar una aso

tual de 18 a

inicio del tr

pacientes co

el tratamient

rsidad viral

minuye dram

de las quasie

n cuadrado az

o poblacional

e las variantes

opes dentro d

en particula

el dato no

la presencia

tiva (Prueba

o presentan

sólo 2 (18,2%

correctas, la

n estos dato

ociación sign

60.

atamiento y

n niveles ind

to ha sido al

dentro en c

máticamente

especies virale

zul) y segunda

donde todas

presentes en

de los cuales s

ar sólo una

se encuentr

a de evidenc

a exacta de F

dicha eviden

%) evidencia

falta de un

os tenemos

nificativa co

la selección

detectables

tamente efe

cada pacien

al inhibirse

es en cuatro p

a (en círculo r

las variantes

n la primera. S

e evidenció se

a ha alcanz

a disponible

cia de selecci

Fisher, p=0,1

ncia, mientra

an cambios

na asociación

una potenci

n un 80% d

activa de es

de virus en

ectivo. Como

te antes y d

la replicació

pacientes. Se

rojo)muestra.

presente en la

Se detalla tam

elección posit

ado niveles

e. Cuando se

ión activa se

41), 4 de los

as que en el

asociados a

n estadística

ia de solo el

de potencia

scape puede

sangre, que

o se observa

después del

n viral.

muestra la

. Como se

a segunda

bién la

tiva.

s

e

e

s

l

a

a

l

a

e

e

a

l

III.5.

Arge

Finalm

es un

detal

carac

secue

datos

realiz

result

most

recom

difere

200

alred

ident

enco

todas

estru

recom

detal

. Análisis fi

entina

mente, dispo

na fuente de

ladamente.

cterizadas co

encia con el

s incluía var

zar la optimiz

tados obten

raron que

mbinación. A

entes posicio

(989 en HX

edor del nu

tificada prev

ntraron sign

s las secuen

cturas BF50

mbinación d

lan dichas re

filogenético

oner del con

e importante

Inicialmente

omo recomb

objetivo de

rias secuenc

zación, la reg

nidos a travé

las secuen

Ambas estru

ones: una de

XB2) en nue

cleótido 500

iamente par

nificativamen

cias con una

00 provenían

e la Forma R

egiones bajo

o de las se

njunto de sec

e evidencia

e se analiza

binantes BF

identificar d

ias virales c

gión viral baj

és del anális

ncias recom

ucturas pose

e ellas prese

estro alineam

0 (1301 en H

ra el análisis

nte asociado

a estructura

n de Brasil.

Recombinan

análisis junt

98

cuencias e

cuencias vira

evolutiva. E

ron un tota

y obtenida

istintos patr

caracterizada

jo estudio es

sis de recom

mbinantes B

eían un únic

entaba el pu

miento y la

HXB2). Cabe

s de asociaci

os al país de

BF200 prov

Además, e

nte Circulant

to con las qu

estudiadas

ales obtenida

s por ello q

l de 165 se

s de nuestr

ones de reco

as en Brasil.

staba constit

mbinación de

F presentab

o punto de

nto de reco

otra prese

destacar qu

ón al HLA. E

e muestreo

venían de Ar

el patrón BF

e Numero 1

ue se describ

y el inicio

as durante la

que nos prop

ecuencias de

o estudio y

ombinación.

Luego de a

tuida por un

esarrollado

ban dos es

recombinac

mbinación a

entaba el pu

e la primer

Estos patron

(p<0.001, pr

rgentina, mie

F200 es par

12 (CRF12_B

irán más ade

Figura

region

análisi

estruct

recom

Brasil.

altame

Argent

formas

identif

genom

repres

ARMA

análisi

de la epid

a presente te

pusimos ana

el gen gag p

y de bases d

Este nuevo

alinear las s

total de 114

mediante Bo

structuras d

ción aunque

alrededor de

unto de rec

estructura e

es de recom

rueba exact

entras que 1

rte de la es

F). En la figu

elante.

III.33. Esquem

nes genómicas

is. Las primera

turas son form

binantes circu

La cuarta es l

ente prevalen

tina. Las otras

s recombinan

ficadas en Arg

ma subtipo B e

entado por la

132. Las 3 reg

s se resaltan e

demia en

esis doctoral

alizarlas más

previamente

de datos de

conjunto de

secuencias y

47 bases. Los

ootScanning

distintas de

ubicado en

el nucleótido

combinación

era la misma

mbinación se

a de Fisher:

14 de las 26

structura de

ura III.33. se

ma de las

s virales bajo

as tres

mas

ulantes en

a CRF12_BF

te en

s 6 son

tes únicas

gentina. Un

es

a secuencia

giones bajo

encuadradas.

l

s

e

e

e

y

s

g

e

n

o

n

a

e

:

6

e

e

Con 

llevam

perte

anális

Figur

BootS

regió

Análi

conse

 

 

Este 

Amer

el  objetivo 

mos  a  cabo

enecían al su

sis se encon

a  III.33.).  L

Scanning  co

n,  y  las  rela

sis Bayesian

enso estricto

árbol  prese

ricano dejan

de  rastrear 

o  un  análisi

ubtipo F para

ntraba ubicad

uego  de  ed

n  el  objetivo

aciones  filog

o. Utilizando

o construido 

enta  un  gra

do parafilét

el  origen  d

is  filogenéti

a evitar efec

da entre  las

ditar  el  alin

o  de  confirm

genéticas  fu

o la primer m

a partir de e

n  clado  mo

icas a dicho 

99

del  subtipo  F

co  sobre  la

ctos confund

 posiciones 

neamiento,  t

mar  la  ausen

ueron  inferid

metodología 

ellos se mues

onofilético  q

clado todas

F  que  origin

a  máxima  re

didores por r

nucleotídica

todas  las  se

ncia  de  pun

das  por  los 

encontramo

stra en la figu

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura

subtip

media

Las  rmues

mues

mues

(rojo Las escon cy círc

 

que  agrupa 

s  las secuenc

nó  estas  for

egión  dond

recombinació

as 1401 y 19

ecuencias  fu

tos  de  reco

métodos  de

os un total d

ura III.34.  

a III.34. Reconpo  F.  El  a

ante el métod

ramas  se  colstras  de  origestras  de  origestras  de  origeen particular structuras de círculos verdeulos azules pa

a  todas  las

cias no perte

mas  recomb

e  todas  las

ón. Las regió

951 en HXB2

ueron  reana

mbinación  d

e  Máxima  P

e 38 árboles

nstrucción filoanálisis  fue do de Máxima

orean  en  veen  brasilero, en  argentinoen  de  afuerapara muestra

recombinació

s para  la estrara la estructu

s  secuencias

enecientes a

binantes  BF,

s  secuencias

ón final bajo

2  (dataset 1,

alizadas  por

dentro  de  la

Parsimonia  y

s óptimos. El

ogenética deldesarrollado

a Parsimonia.

erde  para  lasazul  para  laso  y  gris  paraa  de  América

as de España).ón se detallanructura BF500ura BF200. 

s  de  origen

l continente

, 

s 

o 

, 

r 

a 

y 

l 

l o . s s a a . n 0 

n 

e 

Amer

propo

clado

agrup

enco

clado

Para

analiz

traba

consi

Carib

que

corre

y Bra

arbol

ricano. Dent

orciones sign

o Brasilero s

paron en un

ntraba en el

o monofilétic

realizar la r

zamos el ge

ajo de recon

derado el m

be y correspo

se solicito

espondientes

asil (dataset

les óptimos c

tro del clad

nificativamen

olo cuatro d

clado mono

l 48,5% (n=6

cos) y las rest

reconstrucció

n env en lug

nstrucción fi

mejor disponi

ondientes a

a los auto

s a genomas

2, Figura II

cuyo consen

do american

nte diferente

de las 25 (1

ofilético. En

67) de las se

tantes 39,2 (

ón de la ep

gar del gen g

logenética d

ible actualm

individuos i

ores dicho

completos d

I.33.). Utiliza

so se muest

100

no, dos clad

es (p<0,001)

16%) secuen

cambio, den

ecuencias, la

(n=54) corres

idemia B, a

gag. Esto se

de la epidem

ente debido

nfectados m

alineamient

del HIV de su

ando el mét

ra en la figur

Fi

B.

pa

de

co

or

Am

dos recíproc

) las secuenc

cias tenían

ntro del clad

BF500 en e

spondían a s

diferencia d

e debe a que

mia B en Est

o a la incorpo

muy tempran

to y se in

ubtipo B prev

todo de Má

ra III.35.

gura III.35. R

. Al igual que

ara el subtipo

e Máxima P

oloreadas tam

rigen argenti

mérica (en ne

camente mo

cias de Argen

una estructu

do Argentino

el 12,3% (n=

subtipo F pur

de lo realiza

e recienteme

tados Unido

oración de se

namente en

cluyeron se

viamente ide

áxima Parsim

Reconstrucció

el análisis pa

B fue desarro

Parsimonia. L

mbién según o

ino (en azul

egro).

onofiléticos

ntina y Brasi

ura BF200, q

o la estructu

17, cinco de

ro en el gen

ado para la

ente se ha p

os cuyo set

ecuencias de

la epidemia

ecuencias d

entificados e

monia obtuv

n filogenética

ara el subtipo

ollado median

as ramas se

origen brasiler

) y origen d

agrupan en

l: dentro del

que además

ura BF200 se

e ellas en un

gag.

epidemia F,

publicado un

de datos es

e la zona del

. Es por ello

el gen env

en Argentina

imos cuatro

a del subtipo

o F, el análisis

nte el método

e encuentran

ro (en verde),

del resto de

n

l

s

e

n

,

n

s

l

o

v

a

o

o

s

o

n

,

e

Difer

Figur

recíp

anter

orige

Argen

secue

Con

segm

recom

alinea

entre

recon

mues

con s

relac

B. El

proba

regió

entes estrat

a III.35., enc

rocamente

riormente, la

n argentino

ntina. El “cla

encias de los

el objetivo

mento de su

mbinantes B

amiento la r

e las posicio

nstrucción fi

stra en la fig

secuencias r

iones filogen

análisis de o

able al resto

n de subtipo

egias de bús

contramos q

monofilétic

a optimizació

para el otro

ado Argenti

s Estados Un

de identific

ubtipo B pre

BF de Brasil

región bajo

ones 3087 y

logenética m

gura III.36., e

recombinant

néticas no pu

optimización

de las secue

o B de estas r

squeda no lo

que todas las

cos. Al igua

ón de caract

o. El “clado B

ino” poseía

idos.

car el origen

esente en la

para un to

análisis pose

y 3597 del

mediante Má

el consenso e

tes BF de B

udieron ser r

n de caracte

encias en el

recombinant

101

ograron iden

s secuencias

al que par

teres sugirió

Brasilero” po

11 secuenci

n del subtip

a secuencia

otal de 102

eía un total

HXB2 (data

áxima Parsim

estricto pres

rasil y secue

resueltas y co

res mostro

“clado CRF12

tes particula

ntificar mejo

de Argentin

ra las secu

un origen b

oseía 14 secu

ias de Argen

po B que or

de dicha r

secuencias

de 500 cara

aset 3, Figu

monia obtuv

senta a las 1

encias B de

olapsaron en

que la CRF1

2_BF”, sugiri

res.

ores arboles.

na y Brasil a

uencias de

brasilero para

uencias de B

ntina, dos s

riginó la CR

recombinant

seleccionad

acteres, ubic

ra III.33.). L

vimos 49 árb

13 secuencia

Argentina y

n el nodo cor

12_BF es de

iendo un orig

Figura I

filogenética

en la CRF

muestra el a

método de

muestra el

según las ref

Como se m

grupaban en

subtipo F

a uno de los

Brasil y 10 se

ecuencias d

RF12_BF, ana

te y la may

das. Luego d

cada dentro

Luego de de

boles óptimo

s CRF12_BF

y Brasil. El

rrespondient

e hecho el a

gen monofil

III.36. Re

de la región

F12_BF. Nue

análisis desarr

Máxima Pa

origen de

ferencias deta

uestra en la

n dos clados

analizadas

s clados y un

ecuencias de

e Brasil y 3

alizamos un

yoría de las

de editar el

del gen pol

esarrollar la

os. Como se

en un clado

resto de las

te al subtipo

ncestro más

ético para la

econstrucción

de subtipo B

evamente se

rollado con el

rsimonia. Se

las muestras

lladas.

a

s

s

n

e

3

n

s

l

l

a

e

o

s

o

s

a

n

B

e

l

e

s

Finalm

tiemp

Debid

tamb

TACM

simul

árbol

(figur

Estim

F am

III.37

1970

mente, cons

po al ancest

do a que am

bién una esti

MC y las tasa

laciones de

l. Para los d

ra III.37.).

mamos la máx

ericanas a lo

.A), y para la

s[TMRCA 19

siderando la

tro común m

mbas epidem

imación del

as de substit

Monte Carlo

atasets 1 y

xima probab

os comienzo

a introducció

972 (95%HPD

as filogenias

más cercano

mias poseen

año en el c

tución media

o que permi

3 obtuvimos

bilidad para e

os de la déca

ón de las cep

D: 1970 – 19

102

reconstruid

(TACMC) ta

orígenes m

cual se inició

ante un aná

te que las t

s distribucio

Figura

cercano

para lo

subtipo

entre

represe

TACMC

estimad

distribu

casi idé

argenti

muestr

estimad

por Gil

subtipo

subtipo

para la

represe

origen

el ancestro c

ada de 1970

pas de subti

974) para el

das anterior

anto para el

monofiléticos,

ó cada una d

lisis bayesia

asas de sub

ones ligeram

III.37. Estimac

o (TACMC). S

os distintos TA

o F. La primer

los subtipos

enta el TACM

C para la epid

do para este

ución que es u

énticas que re

no y el cla

ra en el con

dos con el m

bert et al[7] q

os B y D (prim

o B en Amér

a CRF12_BF. L

enta el TACM

a las estructu

común más r

0 (TMRCA: 1

po B en Sud

clado argent

mente, nos

subtipo B c

, la estimac

de dichas ep

no basado e

stitución var

ente asimét

ción del tiem

Se muestran

ZZZZZéZZZÁÁÁ

ZZéZZZZZZZZ

MC para el

demia de subt

estudio es re

una superpos

epresentan lo

do B brasile

ntexto de ot

ismo dataset

que represen

mera distribuc

rica (segunda

La distribució

MC para las ce

ras tipo CRF1

eciente de la

1969; 95%HP

damérica tam

tino y 1972

propusimos

como para e

ión de los T

pidemias. Est

en cadenas d

ríen entre la

tricas para e

po al ancestro

los gráficos

CMC para la

n representa l

La segunda

subtipo F a

tipo B. El prin

epresentado p

ición de dos d

os TACMC pa

ero. Esta inf

ros dos TAC

y previamen

ta la divergen

ción) y la intr

a distribución

n mostrada e

epas de subti

2_BF.

as secuencia

PD: 1959 – 1

mbién a com

(95%HPD: 1

s estimar el

el subtipo F.

TACMC sería

timamos los

de Markov y

as ramas del

el parámetro

o común más

de densidad

epidemia de

a divergencia

distribución

mericano. B.

ncipal TACMC

por la tercera

distribuciones

ra el clado B

formación se

CMC también

nte descriptos

ncia entre los

roducción del

n). C. TACMC

en esta figura

po B que dio

s de subtipo

1978, Figura

ienzo de los

969 – 1974)

l

.

a

s

y

l

o

s

d

e

a

n

.

C

a

s

B

e

n

s

s

l

C

a

o

o

a

s

)

para

diver

(TMR

orige

1966

(0,00

subti

estim

de la

estim

T

Est

po

pri

like

me

tre

gtr

gtr

gtr

gtr

gtr

sit

sit

uc

uc

co

co

tre

sky

el clado b

gencia entre

RCA: 1956, 9

n de las secu

(95%HPD: 1

0374 – 0,004

po F. analiza

mamos la má

década de

maciones se d

abla III.12. De

tadístico

osterior

ior

elihood

eanRate

eeModel.rootH

r.ac

r.ag

r.at

r.cg

r.gt

eModel.alpha

eModel.pInv

ld.mean

ld.stdev

efficientOfVaria

variance

eeLikelihood

yline

brasilero, Fig

e los subtipo

95%HPD: 193

uencias de s

1962 – 1969

64) para el g

ando las reg

xima probab

1970 (TMRC

detalla en la

etalle de los e

Datas

Me

110

11

99

1,

eight

7,

1,

ation

6,

99

10

gura III.37.B

os virales F1

35 – 1972). L

ubtipo B am

), respectiva

gen env del s

iones de sub

bilidad para e

CA: 1969, 9

tabla III.12.

estadísticos ob

set 1 (Subtipo F

edia E

025,772

100,177

925,595

,64E 03

50,097

0,296

0,865 1

0,209

,61E 02

0,149

0,493

0,229 1

,65E 03

0,456 2

0,478 2

,28E 03 8

925,595

033,642

103

B]. Además,

1 y F2 alred

Las estimaci

ericanas con

amente. Las

subtipo B y 0

btipo B de la

el ancestro c

5%HPD: 194

btenidos en lo

F gag) Data

ESS M

288,075 55

210,314

191,025 5

269,647

504,68

899,059

374,083

676,264

275,534

201,065

1417,53

937,733

266,069

172,768

168,515

990,252

191,025 5

226,825

estimamos

dedor de fin

ones para d

n el dataset 2

tasas de sub

0,00167 (0,0

as secuencias

común más c

46 – 1981, F

os análisis filo

aset 2 (Subtipo

Media

5742,037

659,577

55082,46

4,19E 03

50,873

0,5

0,988

0,184

0,188 1

0,183

0,583

0,192

4,22E 03

0,194

0,196

4,52E 03 1

55082,46

602,535

s la máxima

nales de 195

ivergencia e

2 fue 1953 (9

bstitución es

0115 – 0,002

s recombina

cercano de la

Figura III.37.

ogenético por

o B env) Da

ESS

451,943

447,648

245,187

234,56

672,1

4717,204

974,567

1943,266

16443,704

6901,98

3427,117

8646,682

321,588

1029,341

1029,613

10209,668

245,187

1231,041

a probabilid

50s, comienz

entre subtipo

95%HPD: 194

timadas fue

210) para el

antes BF en e

a CRF12_BF

C). La estad

r el método b

ataset 3 (CRF12

Media

7258,805

535,633

6723,173

1,31E 03

53,149

0,211

1,284

0,117

0,129

0,102

0,902

0,401

1,31E 03

0,276

0,281

1,54E 02

6723,173

530,599

dad para la

zo de 1960s

o B y D, y el

47 – 1959) y

ron 0,00419

gen gag del

el dataset 3,

a comienzos

ística de las

bayesiano

2_BF pol)

ESS

266,28

207,007

1122,17

257,282

157,972

9405,613

7067,154

5621,594

4741,266

13502,683

27359,796

28479,785

259,431

1938,911

1938,829

19417,768

1122,17

205,038

a

s

l

y

9

l

,

s

s

Finalm

trans

en pa

aque

II.17.

proba

obten

con H

de SI

q75=

F

M

mente, se u

scurrido desd

articular, dis

llos que han

de materia

abilidad del T

nida para el

HIV 1 en la r

DA. Como s

1985).

Figura III.38. E

Markov. A. Se

donde puede

transición dep

probabilidad

subtipo B en

probabilid

utilizó un m

de el momen

stinguir los c

n conducido

ales y métod

TACMC para

subtipo B co

egión se pue

e muestra e

Estimación de

e muestra la e

en encontrars

penden de las

d para el TACM

n la recombina

dad obtenida

modelo de M

nto de la inf

casos de SID

a la muerte

dos y en el

a la introducc

ontenido en

ede determi

en la figura I

el año de dete

estructura bás

se cada uno de

s variables qu

MC del subtipo

ante CRF12_B

con el modelo

104

Markov de

fección hasta

A diagnostic

e del pacient

Anexo VII).

ción del subt

la CRF12_B

nar el año m

II.38., el valo

ección de los

sica del mode

e los individuo

e se detallan e

o F1 en Sudam

BF (ídem figur

o de Markov p

la epidemia

a el moment

cados por re

te sin ser de

De esta m

tipo F en Arg

F) como la p

más probable

or medio pa

primeros caso

lo con los seis

os hipotéticos

en la figura. B

mérica (ídem f

a III.37.C). En

para los prime

a del HIV p

to de progre

econocimient

etectados (ve

manera utiliza

gentina (que

probabilidad

e de reconoc

ra dicho año

os de SIDA me

s estadíos mut

s analizados. L

B. Se muestran

figura III.37.A)

rojo se muest

eros casos de

ara predeci

esión a SIDA

to de sintom

er detalles e

ando la dist

resulta supe

de la prime

cimiento del

o fue 1981 (

ediante un m

tuamente exc

Las probabilid

n las distribuc

) y para el TAC

tra la distribu

SIDA en la reg

r el tiempo

y muerte, y

matología de

en la sección

tribución de

erpuesta a la

era infección

primer caso

(q25=1978 –

odelo de

cluyentes

ades de

ciones de

CMC del

ción de

gión.

o

y

e

n

e

a

n

o

–

IV. DISCUSIÓN

IV.1.

El pre

que

come

anális

casos

de m

regio

como

analiz

desar

En es

result

datos

podrí

por l

realiz

proce

todas

viral

Si bie

ident

epide

estud

recom

subti

Europ

IV.2.

a la

En es

el fin

B ci

. Las muta

esente traba

son blanco

enzar resalta

sis de datos

s determinar

ayor recono

nes que, en

o un conjunt

zados. De es

rrollo de una

ste sentido, l

taba ideal p

s como son

íamos identi

a respuesta

zado sobre t

edimiento si

s formas, las

Nef como las

en existen v

tificación de

emiología m

dios tambié

mbinantes e

po B podría

pa.

. El HIV 1 S

respuesta

ste sentido, n

al de la secc

rculantes e

aciones de

ajo de tesis

de la resp

ando que la

fue de carác

r característi

ocimiento po

n promedio,

o y que no s

sta manera,

a futura vacu

a estrategia

para llevar a

secuencias v

ificar las reg

a inmune m

odo el geno

gnificaba al

s proteínas v

s más inmun

varios traba

e mutacione

olecular par

n en nuest

entre los sub

an ser signif

Subtipo B d

inmune lu

nuestro anál

ción de Resul

en Argentin

escape en

doctoral tuv

uesta inmun

aproximació

cter poblacio

icas de la re

or la respuest

resultaran m

son necesaria

los resultad

una.

de identifica

cabo este o

virales y car

giones del pr

mediada por

ma viral; sin

comienzo de

virales codifi

nogénicas.

ajos publicad

es de escap

rticular de n

ro país. No

btipos B y F

ficativament

de Argenti

uego de su

lisis filogené

ltados y com

a podrían

106

las varian

vo como pro

ne del hosp

ón utilizada

onal. Esto qu

spuesta inm

ta inmune d

más frecuen

amente las m

dos aportará

ación de mu

objetivo ya q

acterización

roteoma vira

los genes H

embargo de

el presente

icadas por e

dos previam

e mediante

uestra regió

o solamente

F sino que t

e distintas

ina acumul

introducci

tico del orig

mentado más

provenir d

ntes del HIV

opósito pode

pedador en

para el dise

uiere decir q

mune individu

e un individu

temente rec

mejor recono

n al conjunt

taciones de

que, con un

de los gene

al que fuera

HLA I. Idealm

ebido a la co

trabajo, el a

el gen gag, s

mente en rev

análisis es

ón justifica la

e debido al

ambién deb

a las de otr

ló mutacio

ión desde

en de la epid

s adelante, m

de un núm

V en Argen

er identifica

nuestra po

eño de los d

que no se pla

ual como se

uo. En camb

conocidas en

ocidas en cad

to de inform

escape med

conjunto re

es HLA de lo

n más frecu

mente, el a

omplicación

análisis se lim

se considera

vistas intern

stadístico [3

a necesidad

hecho de

bido a que la

ras regiones

ones que fa

Norteamé

demia en Ar

muestra que

mero muy

ntina

r los epítope

oblación. Es

distintos exp

anteó en nin

ría, por ejem

bio, se busca

n la població

da uno de lo

mación releva

iante análisi

elativamente

os individuos

uentemente

nálisis debe

metodológic

mitó al gen v

n, junto con

nacionales a

4,46,54,55,6

de realizar e

que circule

as mismas v

s como Nort

avorecen la

érica

rgentina, des

las variante

reducido d

es del HIV 1

importante

erimentos y

nguno de los

mplo, el sitio

ron aquellas

ón infectada

os individuos

ante para el

s estadístico

e sencillo de

s infectados,

reconocidas

ería haberse

ca que dicho

viral gag. De

n la proteína

acerca de la

65,91,92], la

este tipo de

en variantes

variantes de

teamérica o

a evasión

scripto hacia

s de subtipo

e variantes

1

e

y

s

o

s

a

s

l

o

e

,

s

e

o

e

a

a

a

e

s

e

o

a

o

s

norte

geog

conse

en 24

aque

(OR<

analiz

result

subti

(Figu

amin

amin

A24,

menc

preva

un ca

haya

de la

camb

Previ

acum

idea a

sus d

result

relati

tiemp

evide

comú

30 y

epíto

espec

segun

por la

respe

eamericanas

ráfico bien p

enso Argenti

4 posiciones

llas mutacio

1) que incre

zan secuenc

tados de est

po B de Arge

ra III.37) y,

oácido Lisin

oácidos Arg

A01 y A02

cionadas) se

alencia en nu

ambio simila

realizado un

s secuencias

bios, no han

amente se

mulación de m

analizando d

datos y enc

tado de la p

iva de las va

po. Nuestro

encia que ap

ún. Aunque s

alelos A24)

ope SLYNTVA

cifica[49]; y

ndo residuo

a molecular

ectivamente

que han

podría justif

ina con la se

s de la prote

ones de esca

ementaron s

ias de subtip

ta tesis pod

entina provi

como se ob

na (K), Treo

inina (R), Va

(para los c

encuentran

uestro país e

r en dicha p

n análisis tem

s consenso d

llegado a alc

ha sugerido

mutaciones

dos mutacion

contraron q

propagación

riantes porta

estudio en c

oya la hipóte

solo una de

) luego de l

ATL con restr

las mutacio

del epítope

de HLA de a

[93]). Tamb

colonizado

icar una dife

ecuencia con

eína viral Ga

ape identifica

su frecuenci

po B proveni

ría realizarse

no de la epi

serva en la

onina (T) y

alina (V) y A

cuales posee

entre los m

es muy simi

oblación. Sin

mporal de e

de dicho país

canzar frecue

o que asoci

de escape[3

nes comunes

ue estas m

de un virus

adoras de m

cambio ident

esis de que s

las cuatro pe

a corrección

icción A02 fu

nes V83A en

NSSQVSQN

cuerdo al an

bién encont

107

nuestra reg

erenciación

nsenso de Est

g dentro de

adas en nue

a en el subt

entes de los

e inicialmen

demia de Es

figura III.9.,

Serina (S)

Asparagina (

en restricció

más prevalen

lar a la de E

n embargo, n

ste tipo de m

s de donde s

encias mayor

aciones neg

34,54,65]. En

s de escape.

utaciones a

fundador en

utaciones de

tificó cuatro

se han acum

ermanece si

n filogenétic

ue previame

n el séptimo

Y con restric

nálisis in sílic

tramos para

gión. Y lueg

molecular. D

tados Unido

e una región

estro estudio

tipo B, son

Estados Uni

te con la fig

stados Unido

las posicion

fueron pau

N). Resulta

ón los epíto

tes en Argen

stados Unid

no existen re

manera que

se observa q

ritarias.

gativas (OR<

n particular,

Sin embargo

altamente p

n la població

e escape y sa

mutaciones

ulado en el t

gnificativam

ca, la mutac

ente demostr

o residuo de

cción A01 es

o (IC50 104

las cuatro

go la diverg

De hecho, a

s se observa

total de 39

o a través de

claramente

idos. Un prim

gura III.35 d

os a mediado

nes P30, P83

latinamente

interesante

pes que co

ntina (Figura

os de mane

eportes de E

sólo dispon

ue, en caso

<1) podrían

Leslie et al

o, Battachary

revalentes e

ón, apoyándo

alvaje perma

s de escape a

tiempo hasta

ente asociad

ción T84V en

rada que dis

l epítope SL

s probable q

nM a 162 nM

mutaciones

gencia por

l comparar

an aminoácid

99 aminoácid

e asociacione

minoritarias

mer análisis g

onde se obs

os de la déca

3 y P125 que

reemplazad

recordar qu

ntienen las

a III.3). Por o

ra que podr

Estados Unid

nemos de la

de haber oc

ser el resu

[54] han exp

ya et al [46]

eran probab

ose en que l

anecían cons

altamente p

a volverse el

da al alelo H

n el octavo

minuye la re

LYNTVVTL y S

que reduzcan

M y 61 nM a

s (que actua

aislamiento

la secuencia

dos distintos

dos. Es más,

es negativas

s cuando se

global de los

serva que el

ada de 1970

e poseían el

das por los

ue las alelos

mutaciones

otro lado, su

ía esperarse

os donde se

información

currido estos

ultado de la

plorado esta

reevaluaron

blemente el

a frecuencia

stantes en el

revalentes y

l estado más

LA (posición

residuo del

espuesta CTL

S125N en el

n la afinidad

15,205 nM,

almente son

o

a

s

,

s

e

s

l

0

l

s

s

s

u

e

e

n

s

a

a

n

l

a

l

y

s

n

l

L

l

d

,

n

altam

domi

preva

anális

que 7

enco

Intere

molé

mues

conju

estad

por H

que e

subti

Cons

amin

parec

incre

respu

IV.3.

desa

clínic

Debid

antirr

posib

a sel

droga

Anali

las po

sitios

en nu

proba

mente preva

naban uno d

alencia en el

sis de otras

7 de las 10 i

ntraban ubic

esantemente

cula HLA y

stra en la tab

unto de dato

dística. Por lo

HLA sí exista

encontramos

po B podría

iderando qu

oacídicas fija

cen mostrar

mentos grad

uesta inmune

. La acum

arrollo del

co de la inf

do a que a

retroviral fu

bilidad de qu

ección med

as antirretro

zando estas

osiciones 12

s de clivaje: V

uestro estud

able que fue

lentes tanto

de los dos su

l tiempo (p<

regiones del

identificadas

cadas dentro

e, cuatro de

tres de ella

bla III.2, exce

os no nos p

o tanto, es p

an aunque n

s que cambi

estar relacio

ue a nivel

adas se enc

r un fenóm

duales en m

e mediada p

ulación de

tratamien

fección

nalizamos s

ue desarroll

e los increm

iada por dro

virales sería

regiones en

25 y 357) se

VSQNY/PIVQ

dio se encue

era independ

o en subtipo

ubtipos viral

0,05; Chi cu

l gen gag qu

s (aparte de

o de epítope

ellas se enco

as demostra

epto para aq

permite dete

posible que a

o fuéramos

aron signific

onado con el

de hospeda

contraban as

meno similar

mutaciones a

or HLA.

e las muta

nto antirre

secuencias d

lado y se

mentos de pre

ogas antirre

n aquellos d

ncontramos q

encontraban

QN y KARVL/

ntran ubicad

diente de las

108

B como F)

es, tres de e

adrado para

ue cambiaro

las 2 previa

es conocidos

ontraban ub

aban una re

quellas 3 aso

ectar mayor

aquellas aso

capaces de

cativamente

menor tama

ador se dem

sociadas a re

r a nivel po

a lo largo d

aciones ob

etroviral d

del HIV en

volvió prog

evalencia de

etrovirales. E

onde ocurre

que dos de l

n ubicadas d

AEAMS. Sin

das en esos

fuerzas sele

que en tiem

ellas mostran

a tendencias,

n significativ

amente iden

y las restan

icadas espec

educción sig

ociaciones, la

res asociacio

ciaciones qu

detectarlas.

en el tiemp

año muestra

mostró que

espuesta CT

oblacional, s

de la proteí

bservadas

de las últim

un período

gresivamente

e algunas mu

En la proteín

e el clivaje m

las mutacion

dentro de ep

embargo, ni

sitios espec

ctivas que ac

mpos tempra

ndo increme

, Tabla III.2)

vamente en

ntificadas po

tes 3 dentro

cíficamente e

gnificativa de

as limitacion

ones debido

ue confirman

. También, e

o en el subt

l del primero

la mayoría

L [38,41,94,9

sugiriendo q

na Gag pod

no estaría

mas décad

de tiempo

e más efici

utaciones obs

na Gag, los

mediado por l

nes analizada

pítopes que

inguna de la

cíficos y por

ctúan sobre

anos de la e

entos signific

. De hecho,

el tiempo, e

r análisis est

o de epítope

en el sitio de

e la afinida

nes inherente

o a la falta

n una selecci

el bajo núme

tipo F compa

o.

a de las su

95], nuestro

que la may

dría ser dirig

a relaciona

das ni con

o donde el

iente, consi

servadas fue

sitios bajo

la enzima vir

as (aquellas

se superpon

s mutacione

lo tanto su

los sitios de

epidemia no

cativos de su

mediante el

encontramos

tadístico) se

es predichos.

e anclaje a la

d. Como se

es a nuestro

de potencia

ión mediada

ero de sitios

arado con el

bstituciones

s resultados

yoría de los

gidos por la

ada con el

el estadío

tratamiento

deramos la

eran debidas

presión por

ral Proteasa.

ubicadas en

nían con dos

es analizadas

selección es

clivaje.

o

u

l

s

e

.

a

e

o

a

a

s

l

s

s

s

a

l

o

o

a

s

r

.

n

s

s

s

Resul

de la

diagn

obten

que

enfer

estad

hacie

de pr

IV.4.

el tie

Clasif

difere

negat

mant

asoci

Otras

encue

posic

podrí

indivi

encue

subya

relac

ident

el me

del H

restri

[47,9

lta importan

a infección.

nóstico que

nidas de indi

cambios en

rmedad, se e

díos tempran

endo a las mu

revalencia de

. Las muta

empo

ficando las m

entes dinám

tivas y asoci

tenido const

aciones neg

s mutacione

entran ubic

ciones 76 en

ían haber p

iduos que n

entra en baj

acente a la

ionada con

tificadas a tr

ejor caracter

HIV [50,54]. T

icción A03 q

8].

nte también m

De hecho,

es común e

ividuos que

n las mutac

esperaba qu

nos de la in

uestras toma

e mutaciones

aciones de

muestras de

micas en el t

aciones posi

antes en el

ativas (ahor

es encontrad

adas en res

nuestro est

erdido su a

no poseen e

a prevalenci

tendencia h

el costo e

avés de asoc

rizado y se h

También den

ue se ha dem

mencionar q

considerand

en nuestro

se encontrab

ciones de e

e la mayoría

nfección[91]

adas incluso

s de escape C

e escape ha

acuerdo al

tiempo para

itivas. Aquel

tiempo a un

a el estado

das que han

siduos de a

udio (tercer

asociación co

el alelo selec

ia en la pobl

hacia la acum

en el “fitne

ciaciones po

a demostrad

ntro de este

mostrado qu

109

que se han an

do el retras

país es pro

ban en estad

escape estu

a de las mut

y que persi

en estadíos

CTL.

an present

OR de asoc

a las mutaci

las identifica

na baja preva

consenso) h

n aumentad

anclaje a la

residuo del

on el alelo

ctivo, algo q

ación (como

mulación o l

ess” de la m

ositivas, la T2

do que dismi

grupo se enc

ue revierte e

nalizado mue

o del mom

obable que l

díos avanzad

uvieran influ

taciones de e

istieran lueg

avanzados d

tado tres c

ciación con l

ones de esc

adas por aso

alencia, mie

an aumenta

do su preva

molécula

epítope ELR

HLA como

que ocurriría

o el alelos HL

a permanen

mutación se

242N en el e

inuye signific

cuentra la m

en ausencia d

estras tomad

ento de inf

la mayoría d

dos de la infe

uenciados p

escape CTL f

go de varios

de infección

comportam

os alelos HL

cape identif

ociaciones po

ntras que aq

ado significat

lencia signif

HLA, como

RSLYNTV con

consecuenci

a mucho m

LA B08 para

ncia a baja p

eleccionada.

epítope TW1

cativamente

mutación K28

de presión m

das en el est

fección al m

de las mues

ección. Si bie

por la prog

fueran selec

años de in

apropiadas

mientos di

LA, fue posib

icadas por a

ositivas pare

quellas ident

tivamente e

ficativament

las mutacio

restricción

ia de su pro

ás rápido si

la posición 7

prevalencia

Entre las

0 con restric

e la capacida

8QR del epíto

mediada por

adío crónico

momento de

stras fueran

en es posible

resión a la

ccionadas en

fección [41]

para análisis

istintos en

ble observar

asociaciones

cen haberse

tificadas por

n el tiempo.

te y que se

ones en las

B08[96,97]),

opagación a

i el alelo se

76). La razón

podría estar

mutaciones

cción B57 es

d replicativa

ope RK9 con

el alelo A03

o

e

n

e

a

n

]

s

n

r

s

e

r

.

e

s

,

a

e

n

r

s

s

a

n

3

IV.5.

adap

Por o

que t

decir

limita

posit

analiz

ident

enco

sugie

encue

selec

muta

la re

comu

IV.6.

subt

Los re

pobla

prese

epíto

que l

de la

replic

progr

son n

exper

progr

respu

carga

trans

son c

. La acu

ptativame

otro lado, nu

tienen releva

, encontrars

ados a cam

iva). En el

zadas se enc

tidad proteó

ntrado a tr

eren que la

entra altam

ción negativ

ación en la p

plicación de

unicación pe

. La acum

tipos virale

esultados pr

ación, podría

encia del esc

ope frente a

os virus se a

a epidémia

cativa. En c

resivamente

necesariame

rimentos de

resivamente

uesta inmun

a viral, lo q

smisión por e

característica

umulación

nte

uestro anális

ancia signific

se bajo selec

biar pueden

presente es

cuentran suj

ómica del H

avés de OR

acumulació

ente limitad

va el escape

osición 30 (t

el HIV 1 al m

rsonal).

ulación de

es mediada

resentados e

a ser un fact

cape en el a

la respuesta

daptan hacia

mundial d

contraste, A

menos capa

nte contrad

e competen

menos viru

e a nivel po

que al mism

evento de ex

as esperable

de escap

sis de tasas d

cativa para e

cción negativ

n evoluciona

studio encon

etas a selecc

HIV), dos de

Rs negativos

n de escap

do a cambi

e es más pr

también iden

menos en lí

e estas mu

a por la sel

en la figura II

tor relevante

ncestro tem

a inmune me

a una evasió

el HIV/SIDA

rien et al [

acitado en e

ictorios con

ncia son c

ulento para

blacional de

mo tiempo e

xposición. Ta

es para un v

110

pe ocurre

dS/dN podrí

el “fitness” v

va) mientras

ar adaptativ

ntramos que

ción negativ

e las cuatro

s se encuen

e es posible

ar, mientras

robable que

ntificada a tr

neas de cél

utaciones p

lección inm

II.9. sugieren

e para la ada

mprano daría

ediada por e

n más eficie

A implica qu

[99] han de

l tiempo en

estos hallaz

onsecuencia

el hospedad

escripta en n

es esperabl

anto una me

irus mejor a

e en siti

ía aportar da

viral se encu

s que aquell

vamente (es

e, mientras

a (esto es, s

o posiciones

ntran bajo s

e en aquell

s que en p

revierta. T

ravés de aso

ulas T huma

podría con

mune

n que el subt

aptación a la

a al subtipo

l alelo HLA q

nte de la res

ue se mejo

emostrado q

el hospedad

zgos ya que

as esperada

dor, y una in

nuestro estud

e que resu

enor virulenc

adaptado a l

ios capac

atos ya que

entren bajo

los sitios qu

s decir, enco

que la may

elección hac

(84 y 125

selección po

as posicione

posiciones q

ambién exis

ociación nega

anas (C.S. A

nducir a u

tipo viral, al

a respuesta

que la porta

que la selecc

spuesta inmu

ora progresi

que el HIV

dor humano.

un reducido

as para un

ncrementada

dio conducir

lte en may

cia como una

a población

ces de ev

se espera q

limitación f

e se encuen

ontrarse baj

yoría de las

cia la conser

) donde el

ositiva. Estos

es donde el

ue se encu

ste evidencia

ativa) no tien

Adamson y E

una conver

menos B y F

inmune deb

a una ventaj

ciona. La idea

une a lo largo

ivamente su

parece hab

. Nuestros re

o “fitness” re

virus que

a eficiencia

ría a niveles

ores probab

a mayor tran

de hospeda

volucionar

ue los sitios

funcional (es

ntran menos

jo selección

s posiciones

rvación de la

escape fue

s resultados

l HIV no se

entran bajo

a de que la

ne efecto en

E. O. Freed,

rgencia de

F en nuestra

ido a que la

a a nivel de

a general de

o del tiempo

u capacidad

berse vuelto

esultados no

eplicativo en

se vuelve

en evadir la

mayores de

bilidades de

nsmisibilidad

adores en la

r

s

s

s

n

s

a

e

s

e

o

a

n

,

e

a

a

e

e

o

d

o

o

n

e

a

e

e

d

a

que

mayo

recie

es un

IV.7.

Los e

pacie

se re

vírge

ellos

que

tratad

muta

signif

obten

indet

III.11

Los p

blanc

10 po

camb

de ep

in síli

estad

6 con

de EL

total

tiemp

incre

ident

Con r

sintet

circula [100

ores tasas de

ntemente se

n mejor pred

. La eviden

ensayos inm

entes luego d

ealizó sobre

nes de trata

habían inici

permanecían

dos para ev

aciones iden

ficativament

ner amplific

tectables en

).

primeros res

co de la resp

osiciones (ap

biado con un

pítopes virale

ico (Tabla III.

dística (Tabla

n restricción

LISPOT pudim

de 10 posi

po, la mitad

mentando s

tificadas por

respecto al t

tizaron los p

]. Es import

e decaimient

e ha demost

ictor de la pr

ncia inmun

unológicos i

de un prome

individuos c

amiento mie

ado para en

n sin tratam

valuar el imp

ntificadas, c

e el conjunt

caciones po

sangre (alre

ultados obte

puesta inmun

parte de las

a tendencia

es capaces d

.2). De esta

a III.1) 10 pép

para alelos

mos confirm

ciones de la

son blanco

ignificativam

ORs negativ

total de 12 p

péptidos par

tante aclara

to de células

rado que el

rogresión a S

nológica ap

in vitro se r

edio de 3 año

con diagnóst

ntras que pa

ntonces el tr

miento para

pacto de los

como se d

o de datos a

ositivas deb

dedor de la

enidos perm

ne según el

dos identific

significativa

de ser recono

manera, se s

ptidos que h

poco frecue

ar reconocim

a proteína v

confirmado

mente su pre

vos.

posiciones d

ra 9 de ellos

111

ar que mayo

CD4 que es

decaimiento

SIDA[101].

poya las pr

ealizaron so

os. Es import

tico reciente

ara el mome

atamiento a

la segunda

s antirretrov

detallará má

a analizar me

bido al gra

mitad de los

mitieron conf

análisis de t

cadas por as

en el tiempo

ocidos por u

sintetizaron,

abían sido s

entes en nue

miento en 5

viral Gag qu

de respuest

evalencia en

onde se enc

ya que para

ores niveles

asociado a u

o de los CD4

redicciones

obre segunda

tante record

e de la infec

ento de tom

antirretrovira

toma nos

virales sobre

ás adelante

ediante secu

n número

s pacientes q

firmar algun

endencia. En

sociación est

o y que adem

uno o más al

, junto con a

ugeridos epí

estra poblac

de los 10 pé

ue cambiaro

a inmune es

el tiempo y

contró asocia

a los restant

de carga v

un virus más

y no el incre

s del anális

as muestras

ar que la pri

cción y por

ma de la segu

al. La posibil

permitió te

e la selecció

e, pero al

uenciación al

de pacient

que iniciaron

os de los ep

n dicho anál

tadística con

más se encon

elos HLA seg

aquellos iden

ítopes por es

ión. Como r

éptidos estud

n con tende

specífica cuy

y que se sum

ación a un a

tes 3 no se d

viral pueden

s virulento; s

emento de l

sis estadís

tomadas a

imera toma

lo tanto era

unda muestr

idad de tene

ener grupos

ón y persiste

mismo tie

l reducir la c

tes con ca

n tratamiento

pítopes que

isis se había

alelos HLA)

ntraban ubic

gún el anális

ntificados po

ste análisis, d

esultado de

diados, es de

encia signifi

ya variante d

man a las 3 p

alelo HLA (Ta

disponía de

conducir a

sin embargo,

a carga viral

tico

los mismos

de muestras

an pacientes

ra, varios de

er pacientes

controles y

encia de las

mpo limitó

apacidad de

rgas virales

o, ver Figura

se suponían

n detectado

que habían

cadas dentro

is predictivo

or asociación

descartando

los ensayos

ecir, que del

cativa en el

de escape ha

previamente

abla III.1), se

información

a

,

l

s

s

s

e

s

y

s

ó

e

s

a

n

o

n

o

o

n

o

s

l

l

a

e

e

n

adicio

pudie

los pr

no se

ser d

alelos

detec

evalu

por lo

en es

pacie

sentid

de m

en só

respu

Por o

frecu

respu

que

preve

muta

dicha

poseí

para

meno

los al

una m

preva

IV.8.

depe

Con e

respu

del p

onal que pu

eron confirm

rimeros ensa

e encontró re

ebido a un p

s fue 4, 2 y

ctara respue

uada (15 pac

o tanto lo m

stimular la r

entes portad

do, estos res

utaciones de

ólo 4 pacient

uestas positiv

otro lado, e

encia del 75

uesta. El 50%

nuestros res

enir la prese

ación emergi

a respuesta.

ían el alelo,

los epítope

ores frecuen

elos tanto H

mejor adapt

alencia, podr

. Las mut

endiente d

el objetivo d

uesta inmune

péptido. Es

udiera defini

mar respuest

ayos de ELIS

espuesta inm

problema de

y 4, respecti

esta específi

cientes). Es i

ás probable

espuesta inm

dores del ale

sultados apo

e escape. Pa

tes pero la A

vas en meno

el epítope m

5% en los in

% de los pac

sultados sug

ntación del

ió luego de

Los epítopes

el último a

es con restri

cias de reco

HLA A como H

tación del v

ría ejercer pr

taciones d

de su posici

de evaluar el

e se llevaron

importante

r un epítope

a específica

POT pero res

mune, en el

tamaño mu

vamente. En

ica a pesar

nteresante q

es que la va

mune. De he

elo A24 pose

ortarían a la

ara las otras

A02P83 y A0

os del 30% de

mas reconoc

ndividuos qu

cientes que r

gieren que d

epítope (com

montarse la

s A03P90 y B

lcanzando t

cción para e

nocimiento s

HLA B en nu

irus a la res

resiones sele

de escape

ión relativ

l impacto de

n a cabo los e

recordar qu

112

e a ser sinte

frente a 5 d

sultó negativ

caso de los

uestral ya qu

n el caso de

de ser el s

que esta pos

ariante escap

echo, 13 de

eían la varia

teoría de de

dos posicion

02P84 conte

e los pacient

cido en nue

ue poseían

respondiero

dicha mutac

mo se explic

a respuesta i

B07P357 fuer

ambién resp

el alelo A02

siendo que l

estra poblac

spuesta med

ectivas mayo

impactarí

va al sitio d

e las mutacio

ensayos adic

ue la mayor

etizado. Los

de ellos (el B

vo en los sub

epítopes B5

e el número

el epítope A

segundo ale

sición haya s

pe se haya tr

las 14 mues

ante de esca

esaparición d

nes con ORs

nidas dentro

tes.

estro análisi

el alelo y a

n, presentab

ción parece

cara más ade

inmune espe

ron reconoci

puestas de e

2 (A02P64 y

a frecuencia

ción (Figura I

diada por es

ores que el re

ían en el

de anclaje d

ones identifi

cionales de E

ría de las m

ensayos inm

B57P242 hab

bsiguientes).

7P242, A11P

de paciente

A24P30 resu

lo mas prev

sido identific

ransmitido y

stras exitosa

ape en el ep

de epítopes

negativos, la

o del epítope

is resultó se

lcanzando m

ban la mutac

eliminar la

elante) pode

ecífica perm

idos por el 5

elevada mag

y A02P84) se

del alelo A0

II.3). Esta ob

ste alelo qu

esto de los al

reconocim

del epítope

cadas como

ELISPOT con

mutaciones i

munológicos

bía resultado

De los 4 pa

P118 y A01P

es estudiado

lta llamativo

valente en l

cada por OR

y de esta ma

amente secu

pítope A24P

virales por a

a A01P125 f

e SLYNTVAT

er el A03P2

magnitudes

ción de esca

respuesta e

mos asegura

itiéndole al

50% de los pa

gnitud. Es lla

e hayan enc

02 duplica la

bservación pu

ue, debido a

lelos.

miento de

e

potenciales

curvas de co

identificadas

s finalmente

o positivo en

ra los cuales

125 pudiera

s con dichos

o que no se

a población

negativos y

nera, fallara

uenciadas en

P30. En este

acumulación

fue evaluada

L mostraron

28, con una

elevadas de

ape y siendo

especifica al

ar que dicha

virus evadir

acientes que

amativo que

contrado las

del resto de

uede sugerir

a su elevada

e maneras

s escape a la

oncentración

s parecieran

e

n

s

a

s

e

n

y

a

n

e

n

a

n

a

e

o

l

a

r

e

e

s

e

r

a

s

a

n

n

corre

sólo u

como

podrí

posic

La pr

más

recon

TCR p

nuev

(ubic

muy

podía

III.16

espec

pobla

recon

En es

citotó

La po

B07P

dos p

simila

obser

escap

Los e

ya qu

anter

En re

se en

Con r

fuero

esponder a e

una de las 9

o anclaje al

ían interferi

ción siguiente

rimer implica

eficiente un

nocimiento p

particular pe

o TCR. En e

ada en el sit

difícilmente

a disminuir e

), pero ser

cificidad (co

aciones citot

nocimiento e

ste sentido,

óxicos “anti

osibilidad de

357S que se

pacientes do

ares a las o

rvaron difere

pe parece re

ensayos reali

ue no eviden

riormente, h

esumen, exce

ncontraron ev

respecto a lo

on limitados

escape al rec

donde se co

HLA (A03P2

r con la uni

e al sitio de a

ancia que tie

n escape qu

por un linfoc

ero que perm

este sentido,

tio de anclaje

e reconocida

el reconocim

también su

omo fue en

tóxicas con d

en F197 sugi

existe una p

escape” [102

una interfer

e encuentra

nde fue ensa

observadas

encias en la

ducir el reco

izados sobre

nciaron difer

habían demo

epto para el

videncias de

os ensayos d

. En el prim

onocimiento

onocía o pre

8, ver Tabla

ón al HLA y

anclaje.

ene la posici

ue previene

ito citotóxico

mite la prese

, los resulta

e) muestran

; mientras q

miento por la

sceptible al

el pacient

diferentes es

iere que en

publicación q

2].

rencia con la

ubicada al la

ayada (Figura

para la mu

s respuestas

onocimiento

e el epítope

rencias entre

ostrado difer

mencionado

e alteracione

de medición

mer caso de

113

o por el TCR

dijo el epíto

a III.1). Sin e

ya que 4 de

ión del esca

e la present

o) que una m

entación en

ados de las

que en los

que la muta

respuesta e

reconocimi

e F48). Si

specificidade

el paciente

que demues

a presentació

ado del sitio

a III.19), y de

tación A03P

s al péptido

inmune.

A02P84 arro

e los péptido

encias de re

o epítope A0

s al reconoci

de polifunci

bido a la fa

y no a la un

pe se encon

embargo, aq

las restante

pe es que se

tación en e

mutación que

el HLA y po

curvas de E

dos paciente

ción A02P65

específica (co

ento por ot

bien en el

es, el hecho

F048 emerg

stra el surgim

ón podría se

o de anclaje

e hecho se o

P28Q anteri

B40P218 do

ojaron result

os A02P84T

econocimient

02P84, para

imiento inm

onalidad y t

alta de célu

nión con la m

traba ubicad

uellas ubica

es 8 se enco

e espera que

l HLA (y po

e previene e

r lo tanto el

ELISPOT para

es evaluados

5Q (ubicada

omo fue en

tra població

presente tr

de que la m

gió la especif

miento de p

r real consid

disminuyó e

bservan redu

ormente me

onde la mut

tados en alg

y A02P84V q

to en estudi

los otros cua

une por mut

etrámeros, l

las para rea

molécula del

da en el sitio

das en otra

ontraban ub

e sea signific

or lo tanto

el reconocimi

reconocimi

a la mutació

s la variante

en medio d

el paciente

ón citotóxica

rabajo no d

mutación pue

ficidad contr

poblaciones d

derando que

el reconocim

ucciones de

encionada.

ación identif

guna forma i

que, como s

os de otros

atro epítope

tación.

os resultado

alizar varias

HLA, ya que

o reconocido

s posiciones

icadas en la

cativamente

también el

iento por un

ento por un

ón A03P28Q

mutada era

del epítope)

F197, Figura

a con nueva

distinguimos

eda evadir el

ra el escape.

de linfocitos

la mutación

miento en los

la respuesta

También se

ficada como

nesperados,

se mencionó

grupos [49].

es analizados

os obtenidos

mediciones

e

o

s

a

e

l

n

n

Q

a

)

a

a

s

l

.

s

n

s

a

e

o

,

ó

.

s

s

s

paral

la ciu

En re

suger

epíto

mues

fuero

epíto

estim

La té

const

propo

atribu

A03P

existe

De he

como

con la

realiz

casos

espec

respu

IV.9.

infec

Los a

virale

sílico

a una

debe

como

proye

que p

figura

elas y en el s

dad de Atlan

elación con la

rido una aso

ope de mane

stral analizad

on en la ma

opes mas com

mular una res

écnica de t

trucción de

orción de la

uyera a algú

P28K y A02P6

en controles

echo, el cont

o fueron las m

a asociación

zar este estu

s donde apa

cíficas mostr

uestas polifu

. Las muta

cción y el in

nálisis de se

es presentes

de la afinida

a asociación

ser interpre

o se mencion

ecto no imp

posee valore

a III.29. los g

segundo caso

nta para real

a evaluación

ociación entr

ra que un es

do no nos p

ayoría de la

múnmente re

spuesta espe

etrámero re

los tetrámer

as muestras

ún problema

65Q. En este

s para asegur

trol consistir

muestras uti

entre los pé

dio en Atlan

rentemente

raban bajos

ncionales en

aciones de

inicio del tr

cuenciación

en las mue

ad por la mo

positiva ent

etada como

nó anteriorm

actan signifi

es de afinid

grupos de ba

o debido a la

lizar las med

de la polifun

e la polifunc

scape tempr

permite inda

as muestras

econocidos e

ecífica polifun

esultó meto

ros fueron to

. Analizando

a en la mue

e punto es im

rar la unión

ría en probar

ilizadas en e

éptidos men

nta no nos pe

la técnica r

niveles de a

ncontradas p

e escape s

ratamiento

en las segun

stras donde

olécula del H

re dicha afin

una mayor

mente, la may

icativamente

ad muy red

aja, media y

114

a elevada mo

iciones.

ncionalidad,

cionalidad en

ano previene

agar en dich

evaluadas,

en nuestro e

ncional.

odológicame

odos adecua

o la tabla II

estra F048 y

mportante ac

de las moléc

rlo sobre mu

ste estudio.

ncionados y e

ermitió avan

resultó exito

agotamiento

para los epíto

se seleccio

o podría pr

ndas muestra

se evaluó la

LA que prese

nidad y la res

proporción

yoría de las

e en la afini

ucidos cuan

y alta respue

ortalidad cel

un trabajo p

n la respuest

e el agotami

ha asociació

positivas, y

estudio (A02P

ente complic

ados, la mar

I.11. la falta

por otro la

clarar que e

culas sintétic

estras que s

De manera q

el alelo HLA

zar más en e

osa demostró

que resulta

opes analizad

onan tamb

revenir est

as permitiero

a respuesta

entaba a cad

spuesta med

de escape e

mutaciones

dad por el H

do seleccion

esta, los tres

ular en las m

previo realiza

ta específica

iento. En nue

n. De todas

y demostraro

P65, A02P84

cada. Si bie

rcación fue n

a de marca

do un prob

n el desarro

cas de HLA c

e conozcan p

que el probl

sintético. El

el análisis. De

ó que la may

a, por otro la

dos.

bién en est

te fenómen

on conocer e

inmune. Re

da epítope se

dida. Sin emb

en el grupo n

de escape a

HLA, excepto

na la variant

s valores má

muestras tran

ado Streeck

a y el estado

estro estudio

s formas, los

on la capac

4, A03P28 y B

en los cont

negativa en

podría exp

lema en los

llo de los tet

on el péptid

positivas par

ema podría

tiempo disp

e todas form

yoría de las

ado, consiste

tadíos tard

no

el estado de

alizando pre

e observó un

bargo, esta t

no responde

nalizadas en

o la mutació

te de escap

s bajos corr

nsportadas a

et al [37] ha

mutado del

o, el tamaño

s resultados

cidad de los

B07P357) de

troles de la

una elevada

licarse si se

tetrámeros

trámeros no

o a analizar.

ra el péptido

relacionarse

ponible para

mas, aquellos

células CD8

ente con las

díos de la

los epítopes

edicciones in

na tendencia

endencia no

edor ya que,

n el presente

ón A03P28Q

e (ver en la

esponden al

a

a

l

o

s

s

e

a

a

e

s

o

.

o

e

a

s

8

s

a

s

n

a

o

,

e

Q

a

l

menc

interp

más e

El an

más p

de se

supo

de es

tardía

la ten

un be

de la

trata

result

trans

antirr

favor

IV.10

Estud

pand

dispe

subse

Nues

indep

Unido

los p

Estad

de B

obten

clado

tiemp

cionado epít

pretarse com

eficientemen

álisis de sec

prevalentes

elección ent

ne que la re

scape y en n

as de la infec

ndencia de e

eneficio adic

evolución v

miento exce

tados sugie

smisión de l

retroviral po

reciendo, en

0. Breve di

dios previos

emia del HI

ersión global

ecuentemen

tros resulta

pendientes c

os. Estos res

rimeros caso

dos Unidos y

rasil. Nuestr

nidas previa

o de subtipo

po y muy poc

tope portan

mo una mayo

nte presenta

uenciación t

que las salva

re tomas de

spuesta inm

nuestros dat

cción, estado

estos cambio

cional para la

viral. En este

eden al indiv

ren nuevos

las variantes

odría torcer

última insta

iscusión ac

han estimad

IV y a la int

del HIV com

te se dispers

ados sugiere

con cepas pr

sultados son

os de SIDA f

y nuestra epi

ras estimaci

mente por g

o B de Arge

co tiempo de

ndo la muta

or predispos

ado por el ale

también perm

ajes en los p

e muestra.

mune montad

tos se obser

o clínico cara

os tardíos a o

a terapia ant

e sentido, e

iduo infecta

beneficios

s de escape

r las curvas

ncia, a los nu

cerca del o

do el tiempo

troducción d

menzó con la

saron al rest

en que la

rovenientes

consistentes

fueron ident

demia BF se

iones para e

grupos bras

entina sugirie

espués del in

115

ación de es

sición a mon

elo.

mitió confirm

acientes est

Este hecho

da en la prim

rva que el e

acterístico en

ocurrir en pa

tirretroviral

es conocido

do y alcanza

poblacional

e a la respu

de acumu

uevos individ

origen de la

o al origen d

del HIV en A

a introducció

o de América

epidemia B

de Brasil y o

s con los dat

tificados en

e supone que

el clado de

ileros [19,10

endo que a

ngreso del su

scape). De

ntar una resp

mar que las

udiados y de

resulta part

moinfección e

scape es fac

n el conjunto

acientes que

al prevenir e

que los ben

an una reduc

es al preve

uesta inmun

lación de e

duos infectad

a epidemia

de las cepas

América[6,7,

ón de cepas d

a y del mund

B argentina

otras proven

tos epidemio

individuos q

e posee una

subtipo B

04] y similar

mbas introd

ubtipo B a No

manera que

puesta inmu

variantes de

e hecho perm

ticularmente

es la fuerza

ctible de ocu

o de pacient

no han inici

el escape po

neficios de la

cción de la t

enir la selec

ne. En este

escape y de

dos.

a del HIV 1

del grupo M

,103]. Se sa

del subtipo B

do.

comenzó c

nientes direc

ológicas de n

que reporta

cercana rela

de Brasil so

res a nuestr

ducciones oc

orteamérica

e esta tend

ne cuando e

e escape fue

mitió eviden

e interesante

selectiva de

urrir tambié

tes bajo estu

ado tratamie

or reducción

a expansión

ransmisibilid

cción y por

sentido el

esaparición d

1 en Argen

M[6] respon

abe que un

B en Estados

con dos int

ctamente de

nuestra epid

ban haber v

ación con la e

on consisten

as estimacio

currieron ca

.

dencia debe

el epítope es

ron siempre

ciar eventos

e porque se

mutaciones

n en etapas

udio. Incluso,

ento sugiere

significativa

y acceso al

dad. Nuestro

lo tanto la

tratamiento

de epítopes

tina

sables de la

brazo de la

s Unidos que

troducciones

e los Estados

emia ya que

viajado a los

epidemia BF

ntes con las

ones para el

si al mismo

e

s

e

s

e

s

s

,

e

a

l

o

a

o

s

a

a

e

s

s

e

s

F

s

l

o

La mo

locale

a las

las d

distri

epide

inicio

enco

Trinid

Cons

epide

camb

solo u

De a

introd

para

en es

que p

temp

geno

sugie

gene

recom

descr

recom

En re

histo

conti

introd

Para

África

luego

orige

onofilia de e

es de transm

regiones de

iferentes ep

bución ya q

emias region

o de una epi

ntrado en n

dad & Tobag

iderando la

emia B con

bios de pobla

unas muy po

cuerdo a nu

ducción del

explicar su o

ste caso tam

podría ser ex

pranos de la

mas de CRF1

ere un event

rando la fo

mbinantes es

ripto previam

mbinantes en

esumen, apl

ria evolutiva

nental. De a

ducidas en S

comienzos d

a ocurrió en

o de su intro

n a la recom

estas epidem

misión incluso

otras epidem

pidemias alre

que la distri

nales con orí

demia el nú

nuestro estu

go[106] y otra

reconstrucc

la epidemia

ación pudier

ocas cepas de

uestros resu

HIV 1 en Su

origen mono

mbién encont

xplicada por

colonización

12_BF posea

to de recom

orma recomb

s probable q

mente [11,1

n Brasil. Para

icando méto

a del HIV en

acuerdo a nu

Sudamérica

de 1970 una

n Sudamérica

oducción ocu

mbinante CRF

mias locales ta

o cuando se

mias vecinas

ededor del

bución glob

ígenes polifi

mero limitad

udio y prev

as regiones d

ción filogené

a Americana

ron haber co

el HIV coloni

ultados, una

udamérica (c

ofilético. Al ig

tramos evide

la divergenc

n. Incluso, e

an un ancestr

mbinación oc

binante sub

que haya gen

112 114] y d

a la mayoría

odos de má

n América fu

uestros resu

proveniente

segunda int

a establecie

urrió un eve

F12_BF dand

116

ambién sugi

encuentran

s como es el

mundo no

bal de la ep

léticos. Sin e

do de cepas

iamente sug

del Mundo [

ética genera

comenzand

onducido a su

izaran exitos

a situación s

con cepas de

gual que lo q

encia de una

cia de las cep

l hecho de q

ro común m

currió en un

bsecuenteme

nerado otras

de acuerdo

de las forma

áxima parsim

uimos capac

ltados una o

es de Nortea

roducción d

ndo la epide

ento de reco

do origen a l

ere que se a

n en poblacio

caso de Arge

necesariame

idemia del

embargo, en

circulantes

gerido para

107 111].

l donde se

do en la reg

ucesivos cue

samente Amé

similar pudo

el subtipo F

que encontra

a epidemia

pas en amba

que las regio

as cercano a

n hospedado

ente identifi

formas reco

a nuestros

as recombina

monia para l

ces de rastre

o muy pocas

mérica y en

e cepas del H

emia de sub

ombinación c

a epidemia B

limentan pri

ones muy ce

entina y Bras

ente siguiero

HIV permite

n los momen

puede cond

epidemias

encontró un

gio de USA/

ellos de bote

érica.

o haber ocu

) y la misma

amos para la

F diferenciad

s poblacione

ones de sub

a ellas que a

or co infecta

cada como

ombinantes e

resultados,

antes.

la reconstru

ear la dispe

cepas del s

un lapso de

HIV provenie

btipo F. En l

con una cep

BF de Argen

imariamente

ercanas geog

sil. El estable

on el mismo

e el establec

ntos más tem

ducir al even

en San Fra

na direccion

/el Caribe, lo

ella que perm

urrido con u

a lógica pue

epidemia de

da en Argen

es en los mo

btipo B de lo

cualquier ot

ado con sub

CRF12_BF.

en Argentina

, también o

cción filoge

ersión del vi

ubtipo B de

e tiempo mu

entes probab

los primeros

pa de subtip

tina, mientra

e de eventos

gráficamente

ecimiento de

o patrón de

cimiento de

mpranos del

to fundador

ancisco[105],

alidad de la

os sucesivos

mitieron que

una segunda

de aplicarse

el subtipo B,

ntina y Brasil

mentos más

os diferentes

ro subtipo B

btipos B y F

Esta forma

a que se han

otras formas

nética de la

rus a escala

l HIV fueron

uy reducido.

blemente de

s momentos

o B que dio

as que otras

s

e

e

e

e

l

r

,

a

s

e

a

e

,

l

s

s

B

F

a

n

s

a

a

n

.

e

s

o

s

cepas

lugar

tamb

casos

1980

princ

casos

IV.11

El pr

recon

meca

obten

de re

mien

avanz

mom

adicio

Por o

evide

posib

signif

una d

dismi

En es

vacun

signif

eficac

en su

estud

hecho

comp

blanc

s F se hayan

a estructur

bién apoyado

s de SIDA qu

. La constitu

ipalmente e

s de SIDA fue

1. Conclusi

esente traba

nocimiento i

anismos más

nido de los e

espuesta inm

tras que el e

zados, demu

mentos de la

onal al preve

otro lado, e

encia de que

bles compo

ficativament

de ellas (la m

inuir en el tie

ste sentido

na ya que el

fica que vac

cia disminuid

u capacidad

dio, deberían

o, la observ

pletamente l

co de la resp

distribuido

ras recombin

os por las pr

ue concuerda

ución de tod

ntre mediad

eran reconoc

iones final

ajo de tesis

inmune sob

s frecuentem

ensayos inm

mune medi

estudio de m

uestra que

a infección.

enir dicho es

el análisis de

las mutacio

rtamientos

e en el tiem

mutación en

empo, aunqu

nuestros res

hecho de q

cunas que re

da. Por lo ta

de propaga

n ser un fac

vación de q

la presentac

puesta inmu

en Brasil y r

nantes más

redicciones r

an con el rec

das las epid

os de los 60

cidos.

les

permitió ca

re las cepas

mente selecc

unológicos c

ada por HL

muestras ser

la selección

En este sen

cape por red

e las muest

nes de escap

en el tie

po o domina

la posición 3

ue no signific

sultados apo

que algunas

econozcan e

anto, identifi

arse como a

ctor clave a

ue la mayo

ción en la m

ne, presenta

117

recombinado

diversas. Lo

realizadas co

conocimient

demias del H

y mediados

aracterizar r

s del HIV 1

cionados par

confirma la a

LA I demost

riadas en pa

n del escap

ntido, el inic

ducción signi

tras antiguas

pe selecciona

mpo: mant

ar persistent

30 para el su

cativamente

ortan datos

mutaciones

epítopes que

car mutacio

aquellas clas

tener en cu

oría de las m

olécula del

a a la estrate

o independie

os años esti

on el modelo

o del SIDA e

HIV en Amér

de los 70, va

regiones de

circulantes

ra evadir dic

aproximació

rando recon

acientes, la m

e viral se e

cio del trata

ificativa de la

s de la epid

adas por la r

tenerse a

emente un s

ubtipo F) se

e (p= 0,106).

hacia la rac

tienen el po

e las contie

nes de esca

ificadas com

enta para e

mutaciones

HLA y en ca

egia de iden

entemente c

mados para

o de Markov

en la primera

rica ocurrió

arios años an

la proteína

en nuestra

cha respuest

n estadística

nocimiento

mayoría de e

extiende má

amiento pue

a evolución v

demia nos h

espuesta cit

una baja

subtipo viral.

ha encontra

cionalidad de

otencial de a

nen podrían

pe CTL que

mo “asociaci

l desarrollo

de escape

ambio sean

tificación es

con otras cep

dichos eve

v acerca de l

a mitad de l

en menos

ntes de que

viral Gag d

región e id

ta. El conjun

a de estudio

citotóxico p

ellos en esta

ás allá de lo

ede tener u

viral.

ha permitid

otóxica han

prevalencia,

. Interesante

ado con una

etrás del dis

acumularse e

n eventualm

se encuentr

ones positiv

de futuras

parecieran

capaces de

stadística de

pas B dando

ntos se ven

los primeros

a década de

de 10 años,

los primeros

de frecuente

entificar los

nto de datos

poblacional

polifuncional

ados clínicos

os primeros

un beneficio

o encontrar

seguido tres

, aumentar

emente, solo

tendencia a

seño de una

en el tiempo

ente ver su

en limitadas

vas” en este

vacunas. De

no prevenir

ser también

mutaciones

o

n

s

e

,

s

e

s

s

l

l

s

s

o

r

s

r

o

a

a

o

u

s

e

e

r

n

s

de es

futur

nuest

hospe

pobla

subti

ejerc

sufici

eficac

scape como

as vacunas

tros resultad

edador, pod

acional. Fina

po viral sug

ida sobre e

ientemente

ces para eva

o una estrate

aun habiend

dos sugieren

ría también

almente, la

giere una ve

el virus por

fuerte como

dir la respue

egia importa

do evidencia

que la selec

determinar

presencia d

entaja evolu

el reconoci

o para induc

esta inmune

118

ante para la

a de capacid

cción mediad

un número

del estado e

utiva relacio

imiento a t

ir una conve

de la poblac

a identificac

ad de escap

da por HLA,

importante

escape como

nada al mis

ravés de la

ergencia de s

ción en la que

ión de epíto

pe por parte

que como se

de los camb

o parte del

smo y que

s moléculas

subtipos vira

e circulan.

opes a ser

e del virus. E

e sabe ocurr

bios direccion

genoma na

la presión d

s de HLA po

ales hacia va

incluidos en

En conjunto,

re a nivel del

nales a nivel

tural de un

de selección

odría ser lo

ariantes más

n

,

l

l

n

n

o

s

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VI. ANEXOS

130

VI.1. ANEXO I – Detalle de los pacientes incluidos en el análisis de asociación

genética y polimorfismos virales enrolados en la primera etapa.

Id Id Id Fecha de Fecha recepción Número de Genotipos HLA Conteo Carga

Muestra CNRS Paciente Nacimiento primera muestra Edad muestras HLA-A HLA-B de CD4 Viral

F001 126872 MJORU 3/19/1949 3/24/2003 54 2 2 24 40 49 ND 500000

F002 127197 FVIAR 12/12/1981 4/2/2003 21 1 24 68 35 40 599 658

F004 127617 MJUOS 7/8/1955 4/10/2003 47 1 2 26 7 38 129 169011

F006 131874 MJOCO 7/29/1950 7/4/2003 52 1 24 68 51 7 113 500000

F008 135675 MJUAC 12/1/1967 9/18/2003 35 1 31 25 18 39 ND ND

F009 136042 FMADU 11/5/1959 9/26/2003 43 1 2 31 39 62 185 41039

F011 136115 FMAFA 12/8/1976 9/29/2003 26 1 2 2 18 50 421 63874

F012 136116 FNAEX 1/3/1966 9/29/2003 37 1 2 2 39 51 236 112521

F013 137096 MADBA 12/23/1964 10/15/2003 38 1 1 11 51 49 466 2441

F014 137617 MJAES 9/1/1969 10/22/2003 34 1 2 68 51 40 ND 23464

F017 139194 MLUVA 2/6/1943 11/11/2003 60 1 3 68 62 62 293 74838

F018 139197 MBAGI 1/31/1948 11/11/2003 55 2 1 29 51 8 9 61315

F021 139357 MANCA 10/2/1968 11/13/2003 35 2 2 2 39 35 190 187395

F022 139741 MMAAL 10/27/1969 11/19/2003 34 1 2 31 NA NA ND 275157

F023 140088 MENCI 9/2/1952 11/24/2003 51 2 1 2 8 58 231 51048

F024 140089 FLOAS 9/16/1975 11/24/2003 28 2 24 68 35 53 162 181288

F025 140098 MGUMI 11/9/1963 11/24/2003 40 1 2 24 51 40 108 116908

F026 140992 MMAFA 10/18/1972 12/9/2003 31 2 2 23 40 49 519 451371

F027 141027 MJUDU 9/19/1968 12/9/2003 35 2 24 24 35 40 150 127093

F028 141074 MHERI 10/4/1965 12/10/2003 38 2 11 68 62 35 95 368953

F030 141420 FPALE 9/20/1975 12/15/2003 28 2 1 2 37 7 272 64755

F031 141836 MOSPO 4/28/1955 12/19/2003 48 1 2 26 27 18 76 49478

F032 141837 FLOSA 4/14/1959 12/19/2003 44 1 24 32 8 49 248 11541

F033 141945 FGLSU 2/22/1964 12/22/2003 39 1 23 68 44 39 502 7878

F034 141946 FALHA 7/26/1959 12/22/2003 44 1 1 11 51 48 295 450716

F035 141955 MCARO 6/3/1974 12/22/2003 29 1 2 2 62 18 47 500000

F036 142030 FROGA 8/7/1956 12/23/2003 47 1 3 33 35 14 4 500000

F037 142108 MFRRI 1/27/1977 12/29/2003 26 2 2 2 48 35 543 6102

F038 142109 MBEVA 5/21/1961 12/29/2003 42 1 2 24 62 41 135 500000

F039 142117 MSAFA 5/10/1972 12/29/2003 31 1 1 2 76 62 513 327466

F040 142118 MALFU 6/7/1962 12/29/2003 41 2 1 3 7 57 255 344685

F041 142189 MRIGO 12/20/1973 12/30/2003 30 1 2 31 15 62 123 96026

F042 142190 MFRCH 6/20/1975 12/30/2003 28 1 2 24 70 39 50 844

F043 142191 FOLSA 5/26/1947 12/30/2003 56 1 24 29 35 44 638 75040

F044 142271 MOSDO 1/19/1945 1/5/2004 58 2 24 26 38 52 121 175113

F046 142440 FNADE 5/3/1979 1/7/2004 24 2 11 24 38 35 555 2461

F047 142524 MALTO 6/4/1968 1/8/2004 35 2 2 68 40 44 87 409639

F048 142525 MPEPE 2/20/1968 1/8/2004 35 2 2 3 39 35 521 88157

F050 142683 FANBA 4/6/1955 1/12/2004 48 3 24 68 35 39 337 75282

F053 142785 MCLGO 4/7/1969 1/14/2004 34 1 2 11 44 35 123 106632

F054 143129 FMACA 5/23/1973 1/21/2004 30 1 3 30 8 38 ND 500000

F055 143333 FNESA 10/25/1953 1/26/2004 50 1 2 3 7 40 78 339539

F056 143401 MMAPI 12/20/1966 1/27/2004 37 1 3 24 57 39 722 46683

F057 143402 MROCA 8/30/1958 1/27/2004 45 1 24 34 70 35 93 125869

F058 143403 MCABA 7/10/1978 1/27/2004 25 1 2 32 7 62 797 1991

F059 143428 MJUHU 6/14/1954 1/28/2004 49 1 2 2 62 40 471 6900

131

F060 143511 FNABR 4/19/1980 1/29/2004 23 2 1 24 7 44 351 28694

F061 143512 MROCA 8/2/1976 1/29/2004 27 1 24 34 70 35 134 106638

F062 143617 FSIGA 9/3/1967 2/2/2004 36 1 2 3 18 18 381 143820

F063 143705 MRATE 5/15/1950 2/3/2004 53 3 2 30 35 41 144 20208

F064 143735 MFEDE 9/23/1977 2/4/2004 26 1 26 30 13 27 238 63237

F067 144177 MOSFA 9/8/1948 2/13/2004 55 1 2 11 27 48 277 33900

F068 144245 FCLAG 11/8/1966 2/16/2004 37 1 1 2 57 50 277.2 12178

F069 144303 MJOMA 8/13/1962 2/17/2004 41 1 1 2 51 50 280.33 199019

F070 144418 FSAGO 10/14/1972 2/18/2004 31 2 1 2 7 40 1078.56 7097

F071 144419 MMAFE 10/18/1972 2/18/2004 31 1 2 23 40 49 275.2 163637

F072 144498 MMICE 4/6/1961 2/19/2004 42 3 2 3 14 51 341.55 22234

F073 144561 FESGO 2/19/1963 2/19/2004 41 1 2 24 7 62 388.96 21051

F074 144640 MLULO 12/6/1975 2/20/2004 28 1 68 68 53 53 288 130651

F075 144707 MRUCA 12/12/1962 2/23/2004 41 1 2 2 51 50 39.1 500000

F076 144747 MMAAL 12/21/1976 2/24/2004 27 1 3 24 7 35 338.1 51049

F078 144954 MHODE 12/12/1975 2/27/2004 28 1 2 23 58 35 402.04 130097

F079 144958 MOMMA 3/8/1977 2/27/2004 26 1 25 31 58 62 317.52 28838

F080 145022 MANDA 4/30/1952 3/1/2004 51 3 2 3 57 39 518.7 78246

F081 145121 FLACO 12/29/1949 3/2/2004 54 2 2 24 62 51 402.56 11330

F083 145272 FANPE 11/26/1966 3/4/2004 37 1 68 31 39 39 194.4 33436

F085 145369 FMAPI 10/22/1971 3/5/2004 32 3 24 33 41 52 150.08 4089

F086 145370 MSIDI 11/27/1968 3/5/2004 35 1 2 3 62 51 159.6 139850

F087 145371 MGEMI 3/23/1976 3/5/2004 27 2 3 31 7 45 528.96 216838

F088 145456 FEJAR 7/16/1972 3/8/2004 31 1 11 68 35 14 6.7 500000

F090 145739 FFATO 3/27/1988 3/12/2004 15 2 2 31 35 53 187.2 122893

F092 146095 MDAPE 7/28/1965 3/18/2004 38 1 68 33 14 39 36.12 223153

F093 146196 MGAAB 12/17/1969 3/19/2004 34 1 30 66 52 48 415.8 9672

F095 146198 FMALO 5/31/1977 3/19/2004 26 2 24 33 40 14 371.28 27498

F096 146341 MNELU 2/18/1968 3/23/2004 36 2 26 31 51 38 77.52 167276

F099 146488 MJUBR 6/23/1981 3/25/2004 22 1 30 31 62 13 1101.6 5082

F100 146489 MFABE 4/26/1967 3/25/2004 36 2 2 2 62 13 518 69413

F101 146501 MSAPI 2/7/1972 3/25/2004 32 1 3 31 39 62 319 37627

F104 146741 MOSCH 11/12/1951 3/30/2004 52 1 31 31 51 39 4.83 500000

F105 146742 MJULU 1/6/1961 3/30/2004 43 1 1 68 8 14 114.66 500000

F106 146743 MELVE 7/3/1966 3/30/2004 37 1 2 68 40 35 364.14 6108

F107 146744 FADPA 6/23/1975 3/30/2004 28 1 31 31 51 48 245.52 100370

F108 146811 MRIHE 5/6/1962 3/31/2004 41 1 30 68 14 39 244.8 57540

F109 146814 FROMO 9/23/1976 3/31/2004 27 1 24 68 40 7 436.24 28397

F110 146997 MLUMI 5/15/1985 4/2/2004 18 1 2 3 62 7 395.56 146058

F112 147393 MSADE 09/11/1962 4/15/2004 41 1 3 31 47 39 299.7 21892

F115 147461 FVILI 9/6/1970 4/15/2004 33 1 1 24 57 7 229.4 2876

F116 147525 MROFU 6/15/1959 4/15/2004 44 1 24 66 41 8 155.55 215648

F117 147560 MGUBA 4/1/1976 4/16/2004 28 1 3 68 51 7 427.68 152637

F118 147659 MMIOR 11/13/1962 4/16/2004 41 1 2 31 62 39 36.3 82688

F119 147712 FBEVE 8/21/1965 4/19/2004 38 2 3 24 40 14 281.3 26733

F121 148165 MRUTO 12/27/1979 4/26/2004 24 1 2 24 62 7 371.91 5922

F124 148325 MMICO 21/12/1978 29/04/2004 25 1 2 3 41 47 71.44 449778

F132 149099 MWAAG 3/24/1975 5/11/2004 29 3 31 31 60 60 245 49085

F133 149269 MJECA 12/7/1982 5/13/2004 21 2 2 2 62 35 362 16882

F143 149800 FPACU 12/29/1977 5/21/2004 26 2 25 74 7 51 513 8462

F148 149864 FMAZA 1/20/1960 5/24/2004 44 2 11 24 14 52 84 263181

F155 150493 FMASO 5/27/1972 6/4/2004 32 2 24 68 18 35 618 9926

F158 151034 MRIGA 12/2/1968 6/14/2004 35 3 30 31 44 39 588 34201

132

F171 152147 MANFA 11/29/1964 7/5/2004 39 3 31 68 48 39 136 99222

F174 152594 FRABA 8/30/1968 7/13/2004 35 2 2 68 18 35 184 173594

F182 153114 FGLEN 3/9/1977 7/22/2004 27 2 2 32 8 48 213 >500000

F189 153643 MGUOC 3/18/1970 8/2/2004 34 2 2 X 44 51 107 226533

F197 154296 FALSI 6/16/1972 8/12/2004 32 2 2 3 27 18 699 4697

F235 158693 FMACA 5/9/1962 10/28/2004 42 3 1 30 8 41 266 2780

F244 159622 MSIPU 8/12/1974 11/12/2004 30 2 2 36 57 35 NA 4061

F278 165041 MMAAL 12/18/1981 2/24/2005 23 2 29 31 44 38 675 11891

F279 165082 FMABE 8/15/1978 2/25/2005 26 2 31 68 39 48 291 27529

F280 165180 FCIRU 9/23/1986 2/28/2005 18 2 2 33 60 14 385 10835

F284 165339 MENDI 4/8/1978 3/2/2005 26 3 24 x 39 37 293 9983

F285 165340 MROTO 8/16/1950 3/2/2005 54 2 1 24 14 51 788 460467

F288 165393 FPACU 5/16/1980 3/3/2005 24 2 1 24 14 51 384 79062

F289 165436 MBEMO 7/25/1972 3/3/2005 32 2 1 3 57 7 61 39645

133

VI.2. ANEXO II Detalle de las características de las segundas y terceras muestras

tomadas en la segunda etapa.

Número de

muestra

Fecharecepción

de la muestraId

CNRSConteo de CD4

Carga Viral

Resultados análisis de activación inmune

Muestra Tratamiento CD4DR+38+ CD8DR+38+

F001 2 si 4/30/2007 207402 876 <50 17.261 9.328

F018 2 si 3/27/2007 205977 138 <50 3.915 2.821

F021 2 si 1/31/2007 203551 351 72 12.284 4.882

F023 2 si 3/16/2007 205534 755 <50 7.686 5.709

F024 2 si 6/28/2007 209904 627 <50

F026 2 no 8/19/2008 226966 209 >500000

F027 2 si 12/4/2006 200586 300 1753

F028 2 si 7/17/2008 225660 370 <50

F030 2 si 2/15/2007 204299 383 1798 33.357 10.883

F037 2 no 2/15/2007 204300 741 711 18.346 8.055

F040 2 si 3/23/2007 205780 942 < 50 5.008 2.368

F044 2 si 3/5/2007 204936 456 <50 5.286 3.144

F046 2 si 7/24/2008 225935 174 <50 37.047 8.157

F047 2 no 7/4/2008 225138 630 7121

F048 2 si 10/25/2007 214983 227 <50

F050 2 no 12/4/2006 200663 455 64959

F050 3 NA 7/17/2008 225661 300 13024

F060 2 NA 9/25/2007 213800 44 107070

F063 2 si 12/20/2006 201610 304 805

F063 3 si 7/18/2008 225724 449 <50

F070 2 no 7/3/2008 225079 1143 1264 20.669 8.367

F072 2 si 2/23/2007 204589 293 <50 23.947 7.86

F072 3 si 9/3/2008 227613 420 <50

F080 2 si 12/7/2006 200944 655 <50

F080 3 si 7/30/2008 226180 559 <50

F081 2 NA 7/10/2008 225328 307 60958

F085 2 si 4/17/2007 206763 287 160 16.211 6.503

F085 3 si 7/25/2008 226005 477 <50

F087 2 si 3/6/2007 204994 336 <50 12.196 5.779

F090 2 NA 7/1/2008 224955 27 2162

F095 2 si 3/29/2007 206091 266 <50 25.193 5.897

F096 2 si 7/24/2008 225936 74 11260 71.205 23.22

F100 2 NA 12/27/2007 217875 551 7280

F119 2 si 7/8/2008 225278 582 <50 66.741 24.049

F132 2 si 5/7/2007 207584 363 <50 25.451 8.496

F132 3 si 7/11/2008 225398 588 <50

F133 2 NA 7/1/2008 224954 194 3027

F143 2 no 5/24/2007 208442 442 23260

F148 2 si 5/11/2007 207825 532 <50 No hay células

F155 2 si 5/28/2007 208507 288 2693 55.011 20.588

F158 2 si 5/24/2007 208443 423 <50

F158 3 si 9/12/2008 228104 368 <50

F171 2 si 5/21/2007 208253 180 <50

F171 3 si 7/15/2008 225502 295 <50

F174 2 si 5/10/2007 207766 126 269779

F182 2 si 7/11/2008 225395 370 408

F189 2 si 1/16/2008 218519 159 852

F197 2 no 5/31/2007 208652 314 542 64.537 23.454

134

F235 2 si 6/5/2007 208797 406 53 21.569 3.743

F235 3 si 7/29/2008 226142 441 <50 No hay células

F244 2 no 5/31/2007 208651 296 1317 23.339 7.357

F278 2 no 7/8/2008 225277 580 26673 16.875 6.292

F279 2 no 7/25/2008 226006 255 8088

F280 2 no 6/22/2007 209599 442 28590

F284 2 no 6/25/2007 209656 663 <50 5.238 1.737

F284 3 si 7/7/2008 225205 850 <50 3.253 3.203

F285 2 si 6/25/2007 209655 356 <50 8.278 3.833

F288 2 si 7/7/2008 225204 445 <50 1.205 6.802

F289 2 si 6/12/2007 209117 166 <50 13.065 10.36

135

VI.3. ANEXO III –OUTPUT del análisis de corrección filogenética

A continuación se detallan los resultados de la corrección filogenética desarrollada sobre las 22

posiciones donde se encontró un polimorfismo significativamente asociado con un alelo de los genes

HLA (valor q < 0,2). Se llevaron a cabo 5 corridas por posición. Cuando el mejor modelo que ajustó a

los datos resultó ser el modelo independiente, se muestra en la sexta columna.

DEPENDIENTE MODEL INDEPENDENT MODEL DEPENDIENTE MODEL INDEPENDENT MODEL

Trial LikelihoodHarmonic

Mean

Acceptance Rate

LikelihoodHarmonic

Mean

Acceptance Rate

Best model or LR

Trial LikelihoodHarmonicMe

an

Acceptance Rate

LikelihoodHarmonic

Mean

Acceptance Rate

Bestmodelor LR

P30_A24 P12_B491 -79,909 -0,27 -80,979 -0,283333 2,141052 1 -43,936 -0,303333 -44,618 -0,23 1,36343 2 -80,063 -0,246667 -82,588 -0,303333 5,048832 2 -47,563 -0,383333 -43,912 -0,326667 Independent 3 -79,745 -0,256667 -80,998 -0,303333 2,505056 3 -50,098 -0,273333 -43,184 -0,333333 Independent 4 -79,869 -0,28 -80,949 -0,326667 2,160222 4 -43,231 -0,33 -43,937 -0,29 1,411416 5 -80,034 -0,323333 -81,155 -0,316667 2,241514 5 -43,256 -0,396667 -43,839 -0,356667 1,16582 P83_A02 P55_A031 -74,160 -0,33 -73,432 -0,263333 Independent 1 -58,711 -0,303333 -63,039 -0,32 8,656066 2 -74,577 -0,366667 -73,703 -0,336667 Independent 2 -58,725 -0,223333 -62,976 -0,386667 8,501514 3 -73,972 -0,363333 -73,675 -0,393333 Independent 3 -59,391 -0,28 -63,239 -0,373333 7,697352 4 -74,563 -0,24 -74,271 -0,33 Independent 4 -58,636 -0,243333 -63,069 -0,39 8,8667 5 -74,161 -0,313333 -73,699 -0,346667 Independent 5 -59,079 -0,363333 -63,151 -0,376667 8,144018 P125_A01 P90_B401 -69,711 -0,253333 -68,555 -0,216667 Independent 1 -62,562 -0,26 -60,692 -0,283333 Independent 2 -69,651 -0,336667 -68,832 -0,25 Independent 2 -62,627 -0,26 -60,742 -0,27 Independent 3 -69,192 -0,233333 -69,167 -0,263333 Independent 3 -61,816 -0,253333 -59,865 -0,303333 Independent 4 -70,543 -0,333333 -68,962 -0,246667 Independent 4 -62,132 -0,27 -60,111 -0,316667 Independent 5 -69,216 -0,29 -69,495 -0,25 0,559012 5 -61,616 -0,293333 -60,263 -0,27 Independent P28_A03 P146_A021 -68,414 -0,313333 -77,153 -0,263333 17,477414 1 -95,943 -0,26 -96,498 -0,353333 1,10969 2 -68,686 -0,263333 -78,305 -0,26 19,23724 2 -96,319 -0,286667 -96,548 -0,35 0,458024 3 -68,630 -0,27 -77,913 -0,313333 18,564472 3 -96,687 -0,253333 -96,542 -0,366667 Independent 4 -69,576 -0,296667 -77,007 -0,226667 14,863502 4 -95,949 -0,25 -96,378 -0,313333 0,856946 5 -69,609 -0,313333 -77,644 -0,26 16,071304 5 -95,916 -0,263333 -96,524 -0,346667 1,216658 P46_A24 P215_A011 -74,510 -0,236667 -76,025 -0,27 3,0299 1 -71,102 -0,31 -68,838 -0,366667 Independent 2 -74,646 -0,236667 -75,389 -0,27 1,48498 2 -69,856 -0,263333 -68,598 -0,293333 Independent 3 -74,692 -0,296667 -75,389 -0,273333 1,394476 3 -69,876 -0,293333 -68,181 -0,286667 Independent 4 -75,268 -0,37 -75,934 -0,24 1,331736 4 -69,459 -0,32 -68,119 -0,34 Independent 5 -74,473 -0,253333 -75,473 -0,323333 1,99874 5 -69,365 -0,223333 -68,609 -0,343333 Independent P81_B40 P339_A011 -50,939 -0,256667 -51,632 -0,33 1,38668 1 -61,280 -0,386667 -60,927 -0,39 Independent 2 -50,381 -0,253333 -51,254 -0,343333 1,744834 2 -61,818 -0,38 -60,804 -0,353333 Independent 3 -50,726 -0,293333 -52,302 -0,336667 3,15293 3 -61,837 -0,4 -60,764 -0,39 Independent 4 -50,445 -0,233333 -51,213 -0,316667 1,536788 4 -61,902 -0,326667 -61,042 -0,376667 Independent 5 -50,879 -0,316667 -51,668 -0,326667 1,577856 5 -61,577 -0,39 -61,331 -0,343333 Independent P118_A11 P312_B491 -33,662 -0,32 -36,381 -0,323333 5,437886 1 -60,804 -0,263333 -61,359 -0,373333 1,111334 2 -34,337 -0,236667 -36,532 -0,29 4,39053 2 -62,973 -0,283333 -61,437 -0,276667 Independent 3 -33,420 -0,31 -36,155 -0,326667 5,471404 3 -60,716 -0,316667 -61,128 -0,256667 0,823558 4 -33,820 -0,253333 -36,029 -0,306667 4,418136 4 -60,553 -0,306667 -61,112 -0,216667 1,119274 5 -33,743 -0,246667 -36,257 -0,27 5,027364 5 -61,315 -0,333333 -60,714 -0,226667 Independent P242_B57 P342_A241 -44,783 -0,246667 -48,827 -0,39 8,087374 1 -56,254 -0,323333 -54,463 -0,29 Independent 2 -45,069 -0,36 -50,875 -0,373333 11,610946 2 -56,548 -0,316667 -54,907 -0,296667 Independent 3 -45,489 -0,303333 -49,088 -0,36 7,198572 3 -56,623 -0,256667 -54,746 -0,316667 Independent 4 -45,866 -0,296667 -49,073 -0,33 6,412982 4 -58,037 -0,316667 -54,228 -0,306667 Independent 5 -45,519 -0,356667 -49,089 -0,4 7,139418 5 -56,630 -0,21 -54,705 -0,28 Independent P303_B08 P342_A311 -47,024 -0,203333 -47,167 -0,223333 0,285048 1 -39,333 -0,326667 -38,603 -0,31 Independent 2 -47,315 -0,293333 -47,264 -0,303333 Independent 2 -39,717 -0,29 -39,587 -0,313333 Independent 3 -47,225 -0,243333 -47,288 -0,246667 0,125084 3 -40,592 -0,306667 -39,134 -0,27 Independent 4 -47,557 -0,22 -47,498 -0,2 Independent 4 -38,993 -0,253333 -38,455 -0,223333 Independent 5 -47,926 -0,29 -47,155 -0,286667 Independent 5 -39,465 -0,22 -38,684 -0,293333 Independent P65_A02 P357_A111 -78,613 -0,266667 -79,734 -0,336667 2,24172 1 -53,572 -0,22 -55,381 -0,326667 3,318628 2 -78,611 -0,253333 -80,122 -0,306667 3,021794 2 -52,822 -0,3 -54,681 -0,363333 3,71707 3 -78,806 -0,32 -79,944 -0,346667 2,274386 3 -53,117 -0,273333 -54,656 -0,333333 3,077676 4 -78,469 -0,303333 -79,920 -0,353333 2,901506 4 -53,645 -0,35 -56,699 -0,31 6,109122 5 -78,805 -0,343333 -79,850 -0,286667 2,090716 5 -53,122 -0,22 -56,591 -0,366667 6,938418 P357_B07 P372_A311 -73,839 -0,31 -75,075 -0,373333 2,47302 1 -62,109 -0,256667 -59,910 -0,246667 Independent 2 -74,004 -0,3 -75,016 -0,353333 2,143562 2 -59,910 -0,286667 -59,792 -0,323333 Independent 3 -73,801 -0,313333 -75,054 -0,243333 2,505346 3 -59,895 -0,3 -59,211 -0,223333 Independent 4 -73,942 -0,3 -75,784 -0,276667 3,683128 4 -60,503 -0,273333 -59,253 -0,236667 Independent 5 -73,864 -0,283333 -74,894 -0,32 2,060035 5 -59,829 -0,28 -59,230 -0,316667 Independent

136

VI.4. ANEXO IV – INPUT y OUTPUT del análisis de medidas repetidas

A continuación se detallan los valores medidos de prevalencia de las distintas mutaciones en los tres

intervalos de tiempo bajo análisis. Se detalla también la prevalencia en cada subtipo viral y el nivel

del factor entre sujetos al que pertenecen según lo detallado en la sección correspondiente de

resultados.

Niveles del factor de Medidas Repetidas Subtipo Nivel del factor

Posición 1987 1997 1998 2002 2003 2006 Viral entre sujetos

P028 25 35 29,1 B 1

P028 9,1 25 14,3 F 1

P030 12,5 40 43,6 B 2

P030 100 66,7 71,4 F 3

P046 6,3 25 14,5 B 1

P046 72,7 66,7 71,4 F 1

P055 18,8 25 14,3 B 1

P055 0 8,3 3,3 F 1

P065 0 20 7,1 B 1

P065 0 16,7 16,7 F 1

P081 0 15 10,7 B 1

P081 4,8 12,1 11,9 F 1

P083 52,4 63,6 76,1 F 2

P083 100 95 98,2 B 3

P084 18,7 45 54,4 B 2

P084 95,2 97 97 F 3

P118 6,3 10 8,9 B 1

P118 14,3 18,2 19,4 F 1

P125 25 50 46,4 B 2

P125 100 90,9 100 F 3

P242 0 5 10,5 B 1

P242 14,3 15,2 10,1 F 1

P357 18,8 35 40,4 B 1

P357 9,5 18,2 21,7 F 1

A continuación se detalla la salida del análisis de medidas repetidas realizado sobre los datos de la

tabla anterior con el programa SPSS V12.0

General Linear Model

137

Within-Subjects Factors

Measure: MEASURE_1

T1

T2

T3

factor1

1

2

3

Dependent

Variable

Between-Subjects Factors

4

4

16

0

1

2

Asociacion

N

Box's Test of Equality of Covariance Matricesa

30,646

1,498

12

285,481

,124

Box's M

F

df1

df2

Sig.

Tests the null hypothesis that the observed covariance

matrices of the dependent variables are equal across groups.

Design: Intercept+Asociacion

Within Subjects Design: factor1

a.

Multivariate Testsc

,474 9,007a 2,000 20,000 ,002

,526 9,007a 2,000 20,000 ,002

,901 9,007a 2,000 20,000 ,002

,901 9,007a 2,000 20,000 ,002

,930 9,124 4,000 42,000 ,000

,256 9,762a 4,000 40,000 ,000

2,179 10,352 4,000 38,000 ,000

1,769 18,574b 2,000 21,000 ,000

Pillai's Trace

Wilks' Lambda

Hotelling's Trace

Roy's Largest Root

Pillai's Trace

Wilks' Lambda

Hotelling's Trace

Roy's Largest Root

Effect

factor1

factor1 * Asociacion

Value F Hypothesis df Error df Sig.

Exact statistica.

The statistic is an upper bound on F that yields a lower bound on the significance level.b.

Design: Intercept+Asociacion

Within Subjects Design: factor1

c.

138

Mauchly's Test of Sphericityb

Measure: MEASURE_1

,826 3,830 2 ,147 ,852 1,000 ,500

Within Subjects Effect

factor1

Mauchly's W

Approx.

Chi-Square df Sig.

Greenhous

e-Geisser Huynh-Feldt Lower-bound

Epsilona

Tests the null hypothesis that the error covariance matrix of the orthonormalized transformed dependent variables is

proportional to an identity matrix.

May be used to adjust the degrees of freedom for the averaged tests of significance. Corrected tests are displayed in

the Tests of Within-Subjects Effects table.

a.

Design: Intercept+Asociacion

Within Subjects Design: factor1

b.

Tests of Within-Subjects Effects

Measure: MEASURE_1

720,217 2 360,108 11,620 ,000

720,217 1,703 422,875 11,620 ,000

720,217 2,000 360,108 11,620 ,000

720,217 1,000 720,217 11,620 ,003

1749,560 4 437,390 14,114 ,000

1749,560 3,406 513,626 14,114 ,000

1749,560 4,000 437,390 14,114 ,000

1749,560 2,000 874,780 14,114 ,000

1301,546 42 30,989

1301,546 35,766 36,391

1301,546 42,000 30,989

1301,546 21,000 61,978

Sphericity Assumed

Greenhouse-Geisser

Huynh-Feldt

Lower-bound

Sphericity Assumed

Greenhouse-Geisser

Huynh-Feldt

Lower-bound

Sphericity Assumed

Greenhouse-Geisser

Huynh-Feldt

Lower-bound

Source

factor1

factor1 * Asociacion

Error(factor1)

Type III Sum

of Squares df Mean Square F Sig.

Tests of Within-Subjects Contrasts

Measure: MEASURE_1

664,909 1 664,909 18,820 ,000

55,308 1 55,308 2,075 ,164

1274,066 2 637,033 18,031 ,000

475,494 2 237,747 8,922 ,002

741,934 21 35,330

559,612 21 26,648

factor1

Linear

Quadratic

Linear

Quadratic

Linear

Quadratic

Source

factor1

factor1 * Asociacion

Error(factor1)

Type III Sum

of Squares df Mean Square F Sig.

139

Estimated Marginal Means

Análisis de ANOVA de 1 factor para analizar tendencias en el tiempo

Para el nivel 1: Asociaciones positivas (aquellas con OR>1)

Levene's Test of Equality of Error Variancesa

1,062 2 21 ,364

,163 2 21 ,851

,008 2 21 ,992

T1

T2

T3

F df1 df2 Sig.

Tests the null hypothesis that the error variance of the

dependent variable is equal across groups.

Design: Intercept+Asociacion

Within Subjects Design: factor1

a.

Tests of Between-Subjects Effects

Measure: MEASURE_1

Transformed Variable: Average

127136,391 1 127136,391 191,655 ,000

54986,605 2 27493,302 41,446 ,000

13930,545 21 663,359

Source

Intercept

Asociacion

Error

Type III Sum

of Squares df Mean Square F Sig.

Grand Mean

Measure: MEASURE_1

51,465 3,718 43,734 59,196

Mean Std. Error Lower Bound Upper Bound

95% Confidence Interval

Test of Homogeneity of Variances

Prevalencia

,034 2 45 ,966

Levene

Statistic df1 df2 Sig.

140

Para el nivel 2: asociaciones negativas que dominan un subtipo viral (aquellas con OR<1 y el

subtipo en el cual siempre dominaron)

Para el nivel 3: asociaciones negativas que no dominan un subtipo viral (aquellas con OR<1 y en el

subtipo viral que no dominan)

ANOVA

Prevalencia

743,225 2 371,613 1,372 ,264

12185,734 45 270,794

12928,959 47

Between Groups

Within Groups

Total

Sum of

Squares df Mean Square F Sig.

Test of Homogeneity of Variances

Prevalencia

2,778 2 9 ,115

Levene

Statistic df1 df2 Sig.

ANOVA

Prevalencia

265,527 2 132,763 1,031 ,395

1159,250 9 128,806

1424,777 11

Between Groups

Within Groups

Total

Sum of

Squares df Mean Square F Sig.

Test of Homogeneity of Variances

Prevalencia

,453 2 9 ,649

Levene

Statistic df1 df2 Sig.

141

ANOVA

Prevalencia

1758,435 2 879,217 4,193 ,052

1887,107 9 209,679

3645,542 11

Between Groups

Within Groups

Total

Sum of

Squares df Mean Square F Sig.

142

-3 -2 -1 0 1 2 3 4

Observed Value

-2

-1

0

1

2

Exp

ec

ted

No

rma

l V

alu

e

Normal Q-Q Plot of Standardized Residual for Respuesta

-6 -4 -2 0 2

Observed Value

-6

-4

-2

0

2

Exp

ec

ted

No

rmal

Va

lue

Transforms: natural log

Normal Q-Q Plot of Standardized Residual for Respuesta

VI.5. ANEXO V – OUTPUT del análisis estadístico de la respuesta basal de linfocitos

CD3+/CD8+ frente a líneas B no sensibilizadas

-6 -4 -2 0 2

Observed Value

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

Dev

iati

on

fro

m N

orm

al

Transforms: natural log

Detrended Normal Q-Q Plot of Standardized Residual for Respuesta

-3 -2 -1 0 1 2 3 4

Observed Value

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

De

via

tio

n f

rom

No

rmal

Detrended Normal Q-Q Plot of Standardized Residual for Respuesta

143

Levene's Test of Equality of Error Variances(a)

Dependent Variable: Ln_Rta

F df1 df2 Sig.

,939 13 30 ,528

Tests the null hypothesis that the error variance of the dependent variable is equal across groups.

a Design: Intercept+Citoquina+Autologa+Citoquina * Autologa

Tests of Between Subjects Effects

Dependent Variable: Ln_Rta

SourceType III Sumof Squares df

MeanSquare F Sig.

Corrected Model 97,772(a) 13 7,521 20,467 ,000

Intercept 276,130 1 276,130 751,459 ,000

Citoquina 96,178 6 16,030 43,623 ,000

Autologa ,848 1 ,848 2,307 ,139

Citoquina *Autologa

,898 6 ,150 ,407 ,868

Error 11,024 30 ,367

Total 364,039 44

Corrected Total 108,796 43

a R Squared = ,899 (Adjusted R Squared = ,855)

2 4 6

Citoquina

-5,00

-4,00

-3,00

-2,00

-1,00

0,00

Ln

_R

ta

144

VI.6. ANEXO VI – Detalle de las secuencias peptídicas encontradas en las distintas

muestras junto con el análisis de predicción y afinidad de epítopes

Alelo A01

Paciente CNRS Fecha Tratamiento CD4 CV A01P125 Aff Ep Esc

F070 144418 18/02/2004 no 1078,56 7097 ´----VSQNY 0 si

225079 03/07/2008 no 1143 1264 ......... 0 si

F235 158693 28/10/2004 no 266 2780 NSSQVSQNY 0.6197 E no

F285 165340 02/03/2005 no 788 460467 ´----VSQNY 0 si

F288 165393 03/03/2005 no 384 79062 NA

Alelo A02

Paciente CNRS Fecha Tratamiento CD4 CV A02P65 Aff Ep Esc A02P84 Aff Ep Esc

F001 126872 24/03/2003 no ND 500000 ILEQLQSSL 0.3493 si SLFNAVATL 0.9547 E no

..G...P.. 0.5666 E no

F021 139357 13/11/2003 no 190 187395 IIRQLQPSL 0.2058 si SLYNAVAVL 0.9279 E si

....T.... 0.7811 E si

F023 140088 24/11/2003 no 231 51048 ILGQLHPSL 0.5278 E si SLYNTIAVL 0.8528 E si

F026 140992 09/12/2003 no 519 451371 LLGQLQPSL 0.5948 E no SLYNTIAVL 0.8528 E si

I........ 0.5666 E no

226966 19/08/2008 no 209 >500000 I......A. 0.4926 E no ......... 0.8528 E si

I......S. 0.5666 E no

F030 141420 15/12/2003 no 272 64755 IIGQLQPSL 0.353 si SLFNTIAVL 0.8644 E si

204299 15/02/2007 si 383 1798 .......A. 0.298 si ......... 0.8644 E si

F037 142108 29/12/2003 no 543 6102 ILGQLQPSL 0.566 E no SLYNTIAVL 0.8528 E si

204300 15/02/2007 no 741 711 ......... 0.566 E no ......... 0.8644 E si

F047 142524 08/01/2004 no 87 409639 IMGQLQSAL 0.371 si SVYNTVATL 0.5534 E no

225138 04/07/2008 no 630 7121 .LIH..PT. 0.612 E no .LF...... 0.8053 E no

F048 142525 08/01/2004 no 521 88157 ILKQLHPAL 0.280 si SLYNTVAVL 0.7811 E si

..N...... 0.526 E si

..D...... 0.592 E si

..E...... 0.357 si

214983 25/10/2007 si 227 <50 .......S. 0.432 E si ......... 0.7811 E si

F063 143705 03/02/2004 no 144 20208 ILGQLQPSL 0.566 E no SLFNTVAVL 0.7937 E si

201610 20/12/2006 si 304 805 ......... 0.566 E no ......... 0.7937 E si

225724 18/07/2008 si 449 <50 NA

F070 144418 18/02/2004 no 1078,56 7097 IIGQLQPSL 0.353 si SLFNTVAVL 0.7937 E si

225079 03/07/2008 no 1143 1264 ......... 0.353 si ......... 0.7937 E si

.....H... 0.318 si

F072 144498 19/02/2004 no 341,55 22234 IIEQLKPSL 0.147 si SLYNTIAVL 0.8528 E si

F080 145022 01/03/2004 no 518,7 78246 IITQLQPSL 0.396 E no SLYNTVAVL 0.7811 E si

200944 07/12/2006 si 655 <50 ......... 0.396 E no ......... 0.7811 E si

226180 30/07/2008 si 559 <50 ......... 0.396 E no ......... 0.7811 E si

F081 145121 02/03/2004 no 402,56 11330 IIAQLQPSL 0.493 E no SLFNTVAVL 0.7937 E si

F090 145739 12/03/2004 no 187,2 122893 LIGQIQPSL 0.451 E no SLYNTIAVL 0.8528 E si

....L.... 0.374 si ....A.... 0.9998 E si

224955 01/07/2008 NA 27 2162 ....L.... 0.374 si ......... 0.9998 E si

F100 146489 25/03/2004 no 518 69413 ILGQLQPSL 0.566 E no SLYNTIAVL 0.8528 E si

F133 149269 13/05/2004 no 362 16882 LIGQIQPSL 0.451 E no SLYNTIAVL 0.8528 E si

.M..L.... 0.599 E no .....L... 0.8041 E si

224954 01/07/2008 NA 194 3027 ....L.... 0.3746 si .....L... 0.8041 E si

.M....S.. 0.5382 E no

F174 152594 13/07/2004 no 184 173594 ILGQLQPSL 0.566 E no SLYNTVAVL 0.7811 E si

145

207766 10/05/2007 si 126 269779 ......... 0.566 E no ......... 0.7811 E si

F182 153114 22/07/2004 no 213 >500000 IIGQLHSSL 0.218 si SLYNTIAVL 0.8528 E si

225395 11/07/2008 si 370 408 ......... 0.218 si ......... 0.8528 E si

F189 153643 02/08/2004 no 107 226533 ILRQLQPSL 0.416 E no SLFNTVAVL 0.7937 E si

218519 16/01/2008 si 159 852 ..E...... 0.481 E no ......... 0.7937 E si

..G...... 0.566 E no

..R..H... 0.373 E si

..K..Q... 0.396 E no

F197 154296 12/08/2004 no 699 4697 ILGQLQPSL 0.566 E no SLYNTVATL 0.7890 E no

208652 31/05/2007 no 314 542 .......A. 0.492 E no ......... 0.7890 E no

F244 159622 12/11/2004 no NA 4061 ILGQLQPAL 0.492 E no SLYNTVATL 0.7890 E no

208651 31/05/2007 no 296 1317 .I....... 0.298 si ..F....V. 0.7937 E si

Alelo A03

Paciente CNRS Fecha Tratamiento CD4 CV A03P28 Aff Ep Esc A03P90 Aff Ep Esc

F040 142118 29/12/2003 no 255 344685 RLRPGGKKR 0.4458 E no FVHRKVEVK 0.3794 E NC

F048 142525 08/01/2004 no 521 88157 RLRPGGKKQ 0.2004 si CVHQRIEVR 0.1234 NC

214983 25/10/2007 si 227 <50 ......... 0.2004 si ......... 0.1234 NC

F072 144498 19/02/2004 no 341,55 22234 RLRPEGKKR 0.3824 E si YVHRRVEVK 0.2808 NC

F080 145022 01/03/2004 no 518,7 78246 RLRPGGKKQ 0.2004 si CVHQRIEVR 0.1234 NC

0.3727 E ......A.. NC

200944 07/12/2006 si 655 <50 ......... 0.3727 E si ......A.. 0.1234 NC

226180 30/07/2008 si 559 <50 ......... 0.4119 E si ......T.. 0.1234 NC

F087 145371 05/03/2004 no 528,96 216838 RLRPGGKKK 0.4117 E no FVHQRVEVK 0.6070 E NC

204994 06/03/2007 si 336 <50 ......... 0.4458 E no ...RK.... 0.6070 E NC

F119 147712 19/04/2004 no 281,3 26733 RLRPGGKKQ 0.4117 E si FVHQRVEVK 0.1234 NC

225278 08/07/2008 si 582 <50 ......... 0.4117 E si ......... 0.1234 NC

F197 154296 12/08/2004 no 699 4697 RLRPGGKKK 0.3865 E no CVHQKIEVK 0.6070 E NC

208652 31/05/2007 no 314 542 ........Q 0.4143 E si ....R..I. 0.1234 NC

........P si 0.0511

F289 165436 03/03/2005 no 61 39645 QLRPGGKKK 0.3737 E no FVHQKVEVK 0.4241 E NC

Alelo A11

Paciente CNRS Fecha Tratamiento CD4 CV A11P118 Aff Ep Esc A11P357

F028 141074 10/12/2003 no 95 368953 `-----AADT 0 NC GVGGPSHKAR 0.319 si

NC

F046 142440 07/01/2004 no 555 2461 KTQQQAADK 0.635 WB NC GVGGPGHKAR 0.273 no

Alelo A24

Paciente CNRS Fecha Tratamiento CD4 CV A24P30 Aff Ep Esc

F001 126872 24/03/2003 no ND 500000 KYRLKHLVW 0.4970 E si

F024 140089 24/11/2003 no 162 181288 KYRLKHVVW 0.4469 E si

F027 141027 09/12/2003 no 150 127093 KYRLKHMVW 0.4805 E si

......I.. 0.4508 E si

200586 04/12/2006 si 300 1753 .NN..QI.. 0.0147 si

F044 142271 05/01/2004 no 121 175113 KYRLKHIVW 0.4508 E si

F046 142440 07/01/2004 no 555 2461 KYRLKHIVW 0.4508 E si

F050 142683 12/01/2004 no 337 75282 KYRLKHIVW 0.4508 E si

200663 04/12/2006 no 455 64959 R.Q...... 0.5875 E no

225661 17/07/2008 NA 300 13024 ......... 0.5875 E si

F060 143511 29/01/2004 no 351 28694 KYRMKHLIW 0.4593 E si

213800 25/09/2007 NA 44 107070 ...L..IV. 0.4508 E si

F081 145121 02/03/2004 no 402,56 11330 KYRMKHLIW 0.4593 E si

146

F085 145369 05/03/2004 no 150,08 4089 KYRLKHIVW 0.4508 E si

F095 146198 19/03/2004 no 371,28 27498 KYRLKHIVW 0.4508 E si

F119 147712 19/04/2004 no 281,3 26733 QYRMKHLIW 0.3838 E si

225278 08/07/2008 si 582 <50 ......... 0.3838 E si

F155 150493 04/06/2004 no 618 9926 KYRLKHIVW 0.4508 E si

208507 28/05/2007 si 288 2693 ......... 0.4508 E si

F284 165339 02/03/2005 no 293 9983 NA

209656 25/06/2007 no 663 <50 NIDLKHIVW 0.0229 si

F285 165340 02/03/2005 no 788 460467 KYKLKHIVW 0.4929 E no

Q........ 0.4190 E no

F288 165393 03/03/2005 no 384 79062 NA

Alelo B07

Paciente CNRS Fecha Tratamiento CD4 CV B07P357 Aff Ep Esc

F030 141420 15/12/2003 no 272 64755 GPGHKARVL 0.6483 E no

204299 15/02/2007 si 383 1798 ......... 0.6483 E no

F040 142118 29/12/2003 no 255 344685 GPGHKARVL 0.6483 E no

F060 143511 29/01/2004 no 351 28694 GPGHKARVL 0.6483 E no

213800 25/09/2007 NA 44 107070 ......... 0.6483 E no

F070 144418 18/02/2004 no 1078,56 7097 GPGHKARVL 0.6483 E no

225079 03/07/2008 no 1143 1264 ......... 0.6483 E no

F087 145371 05/03/2004 no 528,96 216838 GPGHKARVL 0.6483 E no

204994 06/03/2007 si 336 <50 ......... 0.6483 E no

F289 165436 03/03/2005 no 61 39645 GPGHKARVL 0.6483 E no

Alelo B40

Paciente CNRS Fecha Tratamiento CD4 CV B40P95 Aff Ep Esc B40P215 Aff Ep Esc

F001 126872 24/03/2003 no ND 500000 IDVKDTKEAL 0.050 si AEWDRLHPV 0.444 WB no

F026 140992 09/12/2003 no 519 451371 IDVKDTKEAL 0.050 si AEWDRLHPV 0.444 WB no

226966 19/08/2008 no 209 >500000 .......... 0.050 si ......... 0.444 WB no

F027 141027 09/12/2003 no 150 127093 VEVRDTKEAL 0.321 no ADWDRLHPV 0.079 si

200586 04/12/2006 si 300 1753 ...K...... 0.358 si NA

F047 142524 08/01/2004 no 87 409639 IEVRDTKEAL 0.253 no AEWDRLHPV 0.444 WB no

225138 04/07/2008 no 630 7121 ..IK...... 0.312 si ......... 0.444 WB no

F070 144418 18/02/2004 no 1078,56 7097 VDVKDTKDAL 0.064 si AEWDRLHPV 0.444 WB no

225079 03/07/2008 no 1143 1264 .......... 0.064 si ......... 0.444 WB no

F095 146198 19/03/2004 no 371,28 27498 IEIKDTKEAL 0.312 si AEWDRLHPV 0.444 WB no

..V....... 0.285 si

F119 147712 19/04/2004 no 281,3 26733 VEVKDTKEAL 0.358 si ADWDRLHPA 0.050 si

225278 08/07/2008 si 582 <50 .......... 0.358 si ......... 0.050 si

Alelo B57

Paciente CNRS Fecha Tratamiento CD4 CV B57P242 Aff Ep Esc

F040 142118 29/12/2003 no 255 344685 TSTPQEQIQW 0.686 SB no

F080 145022 01/03/2004 no 518,7 78246 TSNLQEQIQW 0.500 WB si

200944 07/12/2006 si 655 <50 .......... 0.500 WB si

226180 30/07/2008 si 559 <50 .......... 0.500 WB si

F244 159622 12/11/2004 no NA 4061 TSTLQEQIGW 0.536 WB no

208651 31/05/2007 no 296 1317 ..N.....A. 0.500 WB si

F289 165436 03/03/2005 no 61 39645 TSNLQEQIQW 0.500 WB si

147

148

VI.7. Anexo VII – Validación del modelo de Markov de la epidemia del HIV

A continuación se presentan los principales resultados que, si bien exceden los objetivos específicos

de la presente tesis doctoral, validan el modelo utilizado en la última sección.

Una vez construido el modelo, la etapa en ausencia de tratamiento (historia natural de la infección)

fue comparada con la obtenida en el seguimiento de una cohorte de individuos primoinfectados

(Cohorte CASCADE). Los resultados se muestran en la figura A.VII.1. y muestran la concordancia entre

las predicciones del modelo y lo observado en pacientes infectados.

Figura A.VII.1. Comparación de las predicciones del modelo y los datos observados en la cohorte

CASCADE acerca del tiempo a SIDA y muerte desde la primoinfección.

Para validar la etapa de tratamiento, el principal análisis consistió en comparar las curvas de

supervivencia predichas con las observadas en una cohorte de Dinamarca (Lohse et al Ann Intern

Med. 2007; 146:87 95). Se observa en la figura A.VII.2. que la curva predicha por el modelo se solapa

con la correspondiente a los pacientes bajo regímenes de tratamiento actuales. En particular, se

observa que el modelo predice que un diagnóstico tardío de la infección modifica los niveles de

supervivencia hacia regímenes anteriores menos eficientes.

149

Figura A.VII.2. Comparación de las curvas de sobrevida observadas y predichas por el modelo. En

celeste claro es muestran las curvas observadas en pacientes reales para los tres períodos de

tratamiento. En azul se muestran las predicciones del modelo y en particular, en negro se muestra la

curva sobrevida predicha para aquellos individuos con SIDA al momento del diagnóstico.

Mas allá de los objetivos específicos de la presente tesis de doctorado, cabe destacar dos resultados

principales del modelo de Markov desarrollado: La primera se muestra en la figura A.VII.3. y

corresponde al impacto del diagnóstico temprano en la expectativa de vida. La segunda se muestra

en la figura A.VII.4. y corresponde al impacto del diagnóstico temprano en la mortandad en el primer

año de tratamiento y, a nivel poblacional, en la proporción de individuos que requieren tratamiento

al momento del diagnóstico.

Figura A.VII.3. Estimaciones de la expectativa de vida según el estadío clínico al momento del

diagnóstico. Aunque a simple vista las diferencias no parezcan importantes, el rango de años cubierto

por el eje Y cubre toda la vida de un individuo. La infección por HIV reduce la media de expectativa de

vida media en 10 años mientras que, si el diagnóstico es logró tardíamente, la expectativa de vida media

150

se reduce otros 10 años mas (20 años menos que el individuo no infectado, siguiendo los esquemas de

tratamiento actuales).

Figura A.VII.4. Impacto del retardo en el diagnóstico sobre la mortandad en el primer año de

tratamiento y el requerimiento de tratamiento. En la figura se detallan las predicciones para cada

parámetro según el tiempo transcurrido entre el momento de la infección y el diagnóstico. Obsérvese

que logrando diagnosticar a todos los individuos dentro de los primeros 5 años de infección se lograría

reducir la mortalidad en el primer año de tratamiento a proporciones muy reducidas y al mismo tiempo

la gran mayoría de los individuos no necesitarían tratamiento y el médico podría realizar un seguimiento

más detallado para optimizar el inicio del tratamiento cuando fuera necesario.