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Enzym-Dynamik

an einzelnen Molekülen

Paul Käufl

Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 2

Enzym-Dynamik einzelner Moleküle

Quelle: (5)



● Bis vor ca. 20 Jahren: Chemische Reaktionen

(in Lösung) im Wesentlichen nur im Ensemble

untersucht

● Messung von Konzentrationen der Ausgangs-

(u.U. Zwischen-) und Endprodukte

● Einzelne Molekülparameter konnten kaum

untersucht werden



● Neue Verfahren (z.B. Fluoreszenzmikroskopie) erlauben die Beobachtung einzelner Moleküle während der Reaktion in Echtzeit

Quelle: (1)Fluoreszenzbild von COx


Cholesterol Oxidase (COx)

● Enzym● katalysiert Oxidation von Cholesterol

Quelle: (4)


Cholesterol Oxidase (COx)

Quelle: (2)Ribbon-Diagramm von COx


Flavin Adenin Dinukleotid (FAD)

Quelle: (3b)

Koenzym Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD)

im aktiven Zentrum nicht-kovalent gebunden


Flavin Adenin Dinukleotid (FAD)

fluoreszierend im oxidierten Zustand

Quelle: (1)


Experiment: COx in Aktion

● Gewinnung von COx aus Bakterium

(Brevibacterium sp.)

● kleine Anzahl COx – Moleküle (33)

in Agarose Gel (99% Wasser)

● Cholesterol (0,2 mM) / O2 (0,25 mM gesättigt)


Experiment: COx in Aktion

Pufferlösung: Agarose Gel● Keine Translation der COx Moleküle,

aber: Substrat Moleküle beweglich● schnelle Rotation ( >> 20 Hz) verhindert

Binden an das Gel

Fluoreszenz Mikroskopie● Rasterscan der Probe, HeCd-Laser (442 nm)● Detektion der Photonenemission / Molekül


Experiment: Beobachtungen

Quelle: (1)Rasterscan der Probe

Rasterscan der Probe:jeder Peak = einzelnes COx Molekül

Zeitliche Trajektorie eines Moleküls: „Blink“-Verhalten

Quelle: (1)


Emissionsverhalten eines Moleküls

Blink - Zyklus ⇔ Reaktionszyklus (FAD↔FADH

2)


Experiment

● Kontrollexperimente:

– Ohne Cholesterol kein Blinken

– Zyklenraten unabhängig von Anregungsintensität

– mittlere Zyklenraten ⇔ mittleren Reaktionsraten

aus Ensemble-Experimenten

(unter gleichen Bedigungen)


Auswertung des Experiments

● Lange Trajektorien (> 500 Zyklen, 10 – 20 min) ermöglichen statistische Analyse

● Trajektorien weisen stochastische Eigenschaften auf

→ Verteilung der An- und Aus-Perioden wird statistisch untersucht



Aus der Trajektorie ergibt sich ein Histogramm:

Quelle: (1)Verteilung der On-times bei 0.2 mM Cholesterol



Ein Schritt zurück...

Was erwarten wir eigentlich zu sehen?


Vom Ensemble zum Molekül

● Konzentrationen:[E], [S], [P]

● Konzentrationsrate: k[S] [P]

k

aus an

P● Zustand: An oder Aus● Wahrscheinlichkeit: P● Wahrscheinlichkeits-

verteilung: p(t)


Einfachstes Schema

E−FADan

⇄kb

kf

E−FADH2aus

d [FAD]

dt=−kf [FAD ]kb[FADH2]

d [FADH2]

dt=k f [FAD]−kb[FADH2]


Einfachstes Schema

[FAD ] ∝ exp−kfkbt

[FADH2] ∝ −exp−k fkbt

Quelle: (7)


Einfachstes Schema

● Wahrscheinlichkeitsverteilung

(Poisson-Prozess):

pont =ce−kt


Wahrscheinlichkeitsverteilung

Quelle: (1)

... aber es zeigt sich:


Reaktionskinetik

„Ping-Pong“-Mechanismus

E−FAD San

⇄k−1

k1

E−FAD⋅San

→k2

E−FADH2 Paus

E−FADH2O2aus

⇄k'−1

k'1

E−FADH2⋅O2aus

→k'2

E−FAD H2O2an


Reaktionskinetik

● Zwei Michaelis-Menten Reaktionen im Wechsel

● Reduktions-Reaktion → FAD an

Oxidations-Reaktion → FAD Aus

● Annahme: Weitere Reaktionsschritte sind keine

limitierenden Faktoren für die Gesamtreaktion

→ können vernachlässigt werden


Reaktionskinetik

● Aus den Reaktionsgleichungen mit

Zwischenprodukt erhält man:

pont =k1k2

k2−k1[e−k1t−e−k2t ]


Wahrscheinlichkeitsverteilung pon

(t)

...was gut zu den gemessenen Daten passt:

[S]=0.2 mMk

1=2.9 s-1

k2=17 s-1


Wahrscheinlichkeitsverteilung pon

(t)

Erhöhung der Cholesterol-Konzentration

[S]=2 mMk

1=33 s-1

k2=17 s-1


Ergebnisse der Analyse

● mittlere An-Zeiten werden kürzer

● k1∝ Cholesterol-Konzentration,

k2 bleibt konstant

● Die Verteilung der Aus-Zustände bleibt unverändert

→ Konsistenz mit Michaelis-Menten

Erhöhung der Cholesterol-Konzentration


Michaelis-Menten-Mechanismus

Quelle: (6)

V 0=Vmax [S ]

Km[S]

pre-steady-state: v0 ~ [S]

Sättigung: v = Vmax

= const.


Bisher: 1 Molekül

→ Jetzt: Vergleich der Reaktionsraten mehrerer Moleküle

Unordnung von k2


Statische Unordnung

Sättigungsfall: k

2 soll

limitierende Rate werden

also: k2 << k

1

→ Verwendung eines langsameren Substrats (5-pregene-3β-20α-diol),

mit k2=3,9 s-1


p(t) im Sättigungsfall

Quelle: (1)

[S]=2 mMk

2=3.9 s-1


p(t) im Sättigungsfall

E−FADan

⇄kb

kf

E−FADH2aus

sehr praktisch:

hier reicht also das

reversible Schema aus!


Reaktionsraten k2 mehrerer Moleküle

Mittlere Raten von 33 COx Molekülen

starke Streuung


Statische Unordnung

→ statische Inhomogenität der Moleküle

Ursachen:

● Posttranslationale Modifikationen ● statische Verformung der Enzym-Moleküle


Dynamische Unordnung

Neben statischen Inhomogenitäten:

dynamische Fluktuationen

der Raten einzelner Moleküle

Ohne Einzelmolekül-Analyse

nicht zu entdecken!


Dynamische Fluktuationen

x y

aufeinander folgende Zyklen x, y

m=1 m=10m


Dynamische Fluktuationen

Ein molekulares Gedächtnis?

Quelle: (1)

m=1 m=10


Memory-Effekt

● Diagonales Merkmal für m=1

● → p(x,y) ≠ p(x)p(y)

● für m=10 keine Korrelation mehr


Autokorrelation

r m=⟨t 0t m⟩

⟨t2⟩t m=t m−⟨t ⟩

Quelle: (1)


Memory-Effekt

→ k2 fluktuiert auf Zeitskala ≈ 1s

ist vergleichbar mit 1/k2 → Memory-Effekt

Quelle: (8)


Woher kommt diese Fluktuation?

● Spektrale Analyse ergibt:

Emissions-Spektrum fluktuiert auf der gleichen Zeitskala wie k

2

● Konformative Veränderungen des Proteins um das FAD-Molekül

→ Subzustände des Enzyms


2-Stufen-Modell

Simulation mit diesem Modell liefert tatsächlich ein ähnliches Gedächtnis-Verhalten


Was wurde also beobachtet?

● COx-Reaktion folgt im Wesentlichen dem

Michaelis-Menten-Schema

● statische Unordnung der Reaktionsraten

bedingt durch die Umgebung

● Molekül-spezifische dynamische Unordnung

erzeugt Memory-Effekt


Einzelmolekül vs. Ensemble

● Konzentrationsmessungen im GG● für Fließgleichgewicht o. während

der Reaktion: Stop-Flow, o.ä.

● Untersuchungen statischer und dynamischer Fluktuationen, u.U. mit biologischer Funktion

● im Ensemble nicht sichtbare, molekulare Eigenschaften


Quellen

(1) Lu et al., SCIENCE vol.282, p.1877 (1998)

(2) RCSB Protein Data Bankhttp://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3COX

(3) Wikipedia

a) http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Cholesterol_oxidase&oldid=171284374

b) http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Flavin-Adenin-Dinukleotid&oldid=38470261

(4) A. Vrielink, L. F. Lloyd, D. M. Blow, J. Mol. Biol. 219, 533 (1991)

(5) http://elm-asse-kultur.de/PDF/bb3-2005.pdf

(6) D. Nelson, M. Cox, Lehninger Biochemie, Springer-Verlag (2001)

(7) Ch. E. Mortimer, U. Müller, Chemie, Das Basiswissen der Chemie (2001)

(8) http://bernstein.harvard.edu/research/enzymatickinetics.htm

http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3COX

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Cholesterol_oxidase&oldid=171284374

http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Flavin-Adenin-Dinukleotid&oldid=38470261

http://elm-asse-kultur.de/PDF/bb3-2005.pdf

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