enzimas - fabián rodríguez

Universidad Central de Venezuela

Facultad de Medicina

Escuela de Medicina José María Vargas

Caracas, Agosto 2012

Enzimas

Fabián Rodríguez

Médico Cirujano - UCV

Contenido1. Generalidades

• Definiciones• Estructura de una Enzima• Cofactores

2. Clasificación y Nomenclatura de las Enzimas3. Mecanismo de Acción

• Sitio Activo• Curso de una reacción química• Curso de una reacción catalizada• Disminución de la Energía de Activación• Interacción Enzima-Sustrato• Uso de la Energía de Fijación• Grupos catalíticos específicos

4. Cinética enzimática• Velocidad de reacción y tipos de reacción• Efecto de la Concentración de la Enzima• Efecto del pH• Efecto de la Temperatura• Efecto de la concentración de sustrato• Reacciones con múltiples sustratos

5. Inhibición Enzimática• Inhibición Irreversible• Inhibición Reversible

• Competitiva• No competitiva• Acompetitiva

6. Regulación Enzimática• Control a nivel de Sustrato• Control por Retroalimentación• Aolsterismo• Modulación covalennte• Zimógenos• Isoenzimas

GENERALIDADES

Generalidades

• Catalizador:

Sustancia que aumenta la velocidad o la rapidez de una reacción enzimática sin verse alterada ella misma en el proceso global

• Enzimas:

Catalizadores biológicos de alta especificidad,

en su mayoría son proteínas

NO ALTERAN EL EQUILIBRIO DE

LA REACCIÓN CATALIZADA

Definiciones

Generalidades

Enzima simple

Enzima conjugado

(Holoenzimas)

Apoenzima

Cofactor

Coenzima

Ión Metálico

Estructura de una Enzima

Grupoprostético

Generalidades

Cofactores

CLASIFICACIÓN Y

NOMENCLATURA

DE LAS ENZIMAS

Nomenclatura

ATP: glucosa fosfotransferasa(Hexoquinasa)

1) Nombre del sustrato, seguido del sufijo “asa”.

ATP + D-glucosa → ADP + D-glucosa 6-fosfato

2) Según la Comisión de Nomenclatura de las Enzimas:

EC 2.7.1.1

Clase:Transferasa

Subclase:Fosfotransferasa

Sub-subclase:Grupo hidroxilo

como aceptor

Sustratos:D-glucosa como

aceptor del fosfato

Clasificación de las enzimas

Clasificación de las enzimas

N° Clase Tipo de reacción

1 Oxidoreductasas Transfiere electrones

2 Transferasas Transfiere grupos

3 Hidrolasas Reacciones de hidrólisis (transferencia de

grupos al agua)

4 Liasas Adición de grupos a dobles enlaces o

formación de dobles enlaces por eliminación

de grupos

5 Isomerasas Transferencia de grupos dentro de la

molécula

6 Ligasas Formación de enlaces C-C, C-S, C-O y C-N

por reacciones acopladas al ATP

Clases

Clasificación de las Enzimas

• 1. Oxidoreductasas

o Deshidrogenasas: Lactato Deshidrogenasa

o Oxidasa: Citocromo Oxidasa

o Peroxidasas: Glutation Peroxidasa

o Catalasa:

o Oxigenasa: Ciclo Oxigenasa

o Hidroxilasa: Fenilalanina Hidroxilasa

Clases y Subclases


• 2. Transferasas

o Transcarboxilasas: Transaldolasa

o Metiltransferasas: O6-Metilguanina Metiltransferasa

o Aminotransferasas: Aspartato aminotransferasa

o Quinasas: Hexoquinasa

Clases y Subclases


• 3. Hidrolasas

o Esterasas: Colesterol esterasa

o Peptidasas: Aminopeptidasa

o Fosfolipasas: Fosfolipasa C

o Fosfatasas: Fosfoprotein fosfatasa

• 4. Liasas

o Descarboxilasas: Piruvato Descarboxilasa

o Deshidratasas: Fumarasa

o Sintasas: Glucógeno Sintasa

Clases y Subclases


• 5. Isomerasas

o Racemasas: α-Metilacil-CoA Racemasa

o Mutasas: 2-fosfoglicerato mutasa

o Epimerasas: Ribosa 5-Fosfato epimerasa

• 6. Ligasas

o Carboxilasas: Piruvato Carboxilasa

o Sintetasas: Acil CoA sintetasa

Clases y Subclases

MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS

Mecanismo de Acción

Sitio Activo

Microambiente especial“bolsa”

Aminoácidos con grupos R específicos

Complementario al estado de transición

Un Sustrato se une al sitio activo


Curso de una Reacción Química

Estado Basal: contribución deuna molécula a la energía delsistema.

ΔG´°: indica la dirección de lareacción. Favorables si es (-)

Estado de Transición: estadointermedio entre los estadosbasales. Posee más energía

Energía de activación ΔG+:energía usada para ir del estadobasal al de transición.

S P

Que una reacción sea favorableno quiere decir que sea rápida

Barrera energética “colina”•Alineamiento de grupos•Formación de cargas•Reordenamiento de enlaces•Otras transformaciones


Curso de una Reacción Catalizada

E +S ES EP P +E

Una enzima aumenta la velocidadde la reacción al disminuir laenergía de activación.

Durante una reacción puedenformarse intermediarios dereacción

La enzima induce al sustrato aformar intermediarios de reacciónde menor energía que el estado detransición.


1. Reordenamiento de los enlaces covalentes

2. Energía de Fijación ΔGB– Puentes de Hidrógeno

– Enlaces iónicos

– Efecto Hidrofóbico

– Interacciones de van der Waals

Disminución de la Energía de Activación


Interacción Enzima Sustrato

Las enzimas son complementariasal Estado de Transición y NO alsustrato.

Modelo del Encaje InducidoDistorsión del sustrato y la enzima


1. Especificidad

2. Estimulante hacia el estado de transición en el cual hay:

• Reducción de la entropía de movimiento de las moléculas en solución

• Desolvatación

• Distorsión electrónica del sustrato

• Cambio en la conformación del enzima

Usos de la Energía de Fijación


Grupos Catalíticos Específicos

Grupos funcionales de las enzimas que interaccionan covalentemente o por transferencia y contribuyen a

la catálisis.


1. Catálisis ácido-básica


La transferencia de protonesdesde o hacia intermediarioscargados los estabiliza.

Catálisis ácido-base específica•Uso de los componentes delagua

Catálisis ácido-base general•Uso de ácidos o bases débiles oaminoácidos. Ej: Ribonucleasa


2. Catálisis Covalente

3. Catálisis por iones metálicos


La formación de un enlace covalente Enzima-Sustrato genera una ruta alterna.

Los iones metálicos ayudan a orientar al sustrato o reacciones REDOX. Ej: Enolasa


Mecanismo de Acción de la Quimotripsina


La Quimotripsina es un ejemplo de catálisis covalente (inter. Acil-enzima) y ácido-

base general.

Realiza además estabilización del estado de

transición (efecto de proximidad)

Estructura: 3 cadenas unidas por enlaces disulfuroSitio activo: aa apolares y residuos His57, Ser195, Asp102 y Gly193


Función del Mg ++ en la actividad de las quinasas

Todas las quinasas necesitan un ion

metálico divalente como el Mg2+ o el Mn2+ para

transferir el grupo fosfato.

La formación de los complejos con Mg++

apantalla parcialmente las cargas negativas e

influye sobre la conformación de los

grupos fosfato.


Lisozima

La lisozima rompe el enlace glicosídico entre el MurNAc y la GlcNAc

del peptidoglucano

La lisozima solo se une a los sitios B, D y F.

Rompe el enlace entre los sitios D y E gracias a la acción de los residuos

Glu35 y Asp52

Realiza catálisis covalente y ácido base

general. Posee un mecanismo de tensión

sobre el sustrato

B

A

C

F

CINÉTICA ENZIMÁTICA

Cinética Enzimática

Determina y estudia la velocidad de una reacción

y el modo en que esta se modifica

a consecuencia de la variación en

los valores de ciertos parámetros experimentales


1. Velocidad de Reacción

Cantidad de reactivo (sustrato) que ha reaccionado

por unidad de tiempo

Esta determinada por [S] y k (Constante de velocidad)

2. Reacción de Primer Orden

V= k[S]

2. Reacción de Segundo Orden

V= k[S1][S2]

Velocidad de Reacción y Tipos de Reacción


Efecto de la Concentración del EnzimaV

elo

cid

ad d

e r

eacció

n (

M/m

in)

Concentración de enzima (mM)

A mayor[E] mayor velocidad


Efecto del pH

Las enzimas tienen una mayor velocidad a un pH determinado


Efecto de la Temperatura

Un aumento en la temperatura eleva la

actividad de la enzima, hasta cierto punto

en el cual comienza a desnaturalizarse.


Efecto de la Concentración del Sustrato

Velocidad inicial V0

Velocidad cuando la [S] es mucho mayor a la [E]

Velocidad Máxima Vmax

Velocidad en la cual todas las moléculas de enzima están ocupadas o saturadas con

sustrato.


Expresión Cuantitativa de la Relación [S]-V0

↑

Paso limitante de la velocidad

En el inicio

V0 depende del paso limitante de velocidad

?



Se tiene entonces

[Et] = [E] + [ES] [E]= [Et] – [ES]

En base a [ES] en el estado estacionario

Despejando [ES]

Km



Sustituyendo

Considerando

A Vmax [ES] = [Et] V0= k2[ES] Vmax= k2[Et]

Sustituyendo se obtiene

Ecuación de

Michaelis-Menten



Cuando V0 = Vmax/2

Km = [S] cuando V0 = Vmax/2

Km es igual a la concentración de sustrato cuando se ha

alcanzado la mitad de la Vmax


1. Km

“Km es una medida de la concentración de sustrato para una catálisis eficaz”

2. Kcat (Número de recambio)• Equivale a la k del paso limitante

• Número de moléculas de sustrato recambiadas producto por molécula de enzima saturada en un segundo

3. Kcat/Km (Constante catalítica)

Significado de Km, Kcat y Kcat/Km

↑ Km = Baja afinidad↓ Km = Alta afinidad

Solo si k2 << k-1

↑ Kcat = Recambio alto↓ Kcat = Recambio bajo

↑ Kcat/Km = Alta eficiencia↓ Kcat/Km = Baja eficiencia Valor límite: 108 – 109 (mol/L)-1S-1


Gráfico de Lineweaver-Burk

Entre más se acerquen los puntos de corte de

los ejes a 0, Vmax será mayor

Km será mayor

Permite representar el valor de Vmax, debido a que representa

el S en concentraciones infinitas

1/Vmax alto = Vmax bajo-1/Km muy negativo = Km bajo


1. Mecanismo Secuencial

• Secuencial al Azar

• Secuencial ordenado

Reacciones con Múltiples Sustratos

Ej: Hexoquinasa

Creatina quinasa

Ej: Oxidaciones por NAD+

Los sustratos pueden unirse en cualquier orden

Primero debe unirse un sustrato y luego el siguiente


2. Mecanismo de Doble Desplazamiento (Ping Pong)

Reacciones con Multiples Sustratos

Ej: Aminotransferasas

Primero se une un sustrato y se libera un producto para que pueda

unirse el segundo sustrato

INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

Inhibición Enzimática

Los Inhibidores son agentes moleculares que

interfieren en la catálisis haciendo más lentas o

deteniendo las reacciones


Inhibición

Irreversible Reversible

CompetitivaNo

CompetitivaAcompetitiva

Clasificación de la Inhibición


Se unen covalentemente o destruyen un grupo del enzima

que es esencial para su funcionamiento

• Diisopropilfluorofosfato: Acetilcolinesterasa, Quimotripsina

Inhibición Irreversible


Análogos del Estado de Transición (Inhibidores suicidas)

Debido a la reacción enzimática se convierte en un compuesto muy reactivo

• Alopurinol: Xantino oxidasa

Inhibición Irreversible


Inhibición IrreversibleNombre Origen Modo de acción

Cianuro Almendras amargas Reacciona con iones metálicos de enzimas (Fe, Zn, Cu), inhibe la citocromo oxidasa (complejo IV)

Diisopropilfluorofosfato (DFP) Sintético Inhibe enzimas con serina en el lugar activo, somo la acetilcolinesterasa

Sarín Sintético (gas nervioso) Como el DFP

Fisostigmina Semillas de Physostigmina venosum Como el DFP

Paratión Sintético (insecticida) Como el DFP, pero especialmente inhibidor de la acetilcolinesterasa de insectos

N-Tosil-1fenilalaninaclorometilcetona (TPCK)

Sintético Reacciona con la His 57 de la quimotripsina

Penicilina Del hongo Penicillium notatum Inhibe la transpeptidasa (Glicopeptidil transferasa) de la pared celular bacteriana

Antiinflamatorios no esteroideso(AINES)

Sintéticos y semisintéticos Inhiben la Ciclooxigenasa con afinidad variable.

Inhibidores de la proteasa Síntéticos Inhibe la proteasa del HIV

Nombre (Suicidas) Origen Modo de acción

Alopurinol Sintético Inhibe la xantino oxidasa

N,N-dimetilpropargilamina Sintético Inhibe la monoaminaoxidasa

Ácido clavulánico, Sulbactam, Tazobactam

Sintético Inhibe las β-lactamasas


1. Inhibición Competitiva

El inhibidor se une al mismo sitio que el sustrato

Inhibición Reversible

Suministrando más sustrato puede superarse la inhibición


1. Inhibición Competitiva


Lovastatina: HMG – CoA reductasa Metanol: Alcohol Deshidrogenasa

Metotrexato: Dihidrofolato reductasa Malonato: Succinato Deshidrogenasa

Cuando la enzima este saturada con sustrato, no habrá inhibidor.

Vmax =

Km: ↑

Vmax: =

Se requiere mayor [S] para alcanzar Vmax/2

Km ↑


2. Inhibición No Competitiva

El inhibidor se une a un sitio distinto al del sustrato. Se une tanto a E como ES


No puede superarse la inhibición suministrando más sustrato


2. Inhibición No Competitiva


Km: =

Vmax: ↓

La unión del inhibidor altera el Kcat de la enzima.

Disminuye la [E] funcional

Vmax ↓

La unión del sustrato no es afectada por el inhibidor. Se requiere la

misma [S] para alcanzar la Vmax/2

Km =

Desoxiciclina: Colagenasa Plomo: Enzimas con grupos SH


3. Inhibición Acompetitiva

El inhibidor se une a un sitio distinto al del sustrato. Se une solo al ES


No puede superarse la inhibición suministrando más sustrato


3. Inhibición Acompetitiva


Km: ↓

Vmax: ↓

VmaxI

Vmax

KmKmI

La unión del inhibidor altera el Kcat de la enzima.

Disminuye la [E] funcional

Vmax ↓

El inhibidor induce la formación de mas ES para

poder formar ESI

Km ↓

Herbicida glicofosfato: enzima de la vía de síntesis de aa aromáticos

REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Regulación Enzimática

Control a Nivel de Sustrato

Glucosa Hexoquinasa Glucosa 6-FosfatoATP ADP

Control por Retroalimentación Negativa

A B C D E


Control por Retroalimentación Negativa

Síntesis de Iso a partir de Tre en bacteriasLas altas concentraciones de Iso inhiben a

la Treonina deshidratasa

Síntesis de AMP y GMPLas altas concentraciones de AMP y/o

GMP inhiben a la PRPP sintetasa


Homoalosterismo

Modificación del sitio activo Liberación de subunidades catalíticas

Heteroalosterismo

Alosterismo

El sustrato actúa como Modulador.

El modulador es diferente

al Sustrato


Alosterismo

Efecto de la unión de un Modulador


Modificación Covalente

La unión covalente de una molécula a la enzima modifica su

actividad; activándola o inactivándola


Modificación Covalente

2 ATP

2 ADP

Glucagon (H)

Adrenalina (M)

↑[cAMP]

2 H2O

2 Pi

Insulina

Glucógeno Fosforilasa b

(menos activa)

- OH HO -

Glucógeno Fosforilasa a

(más activa)

- Pi Pi -

Fosfoprotein

Fosfatasa 1

(PP1)

Fosforilasa b

quinasa


• Modulación por Fosforilación

Modulación Covalente

En general las enzimas activas fosforiladas actúan en el Post-absortivo y Ayunoy las activas desfosforiladas actúan en el Absortivo

Activas Fosforiladas Activas Desfosforiladas

Fructosa 2,6-bifosfatasa Piruvato Quinasa L

Fosforilasa Quinasa Piruvato Deshidrogenasa

Glucógeno Fosforilasa Fosfofructoquinasa 2

Triacilglicérido Lipasa Glucógeno Sintasa

LLP de Tejido Adiposo

HMG-CoA Reductasa quinasa HMG-CoA-Reductasa

Acetil-CoA Carboxilasa


Regulación de la Síntesis

Inducidas Por Insulina Inducidas Por Cortisol

Glucoquinasa Proteasas

Piruvato Quinasa Arginasa

Ácido Graso SintasaArgininosuccinasa

Argininosuccinato Sintetasa

Acetil-CoA CarboxilasaGlucosa 6-fosfatasa

PEP Carboxiquinasa

En general las enzimas inducidas por Insulina actúan en el Absortivoy las inducidas por el Cortisol actúan en el Post-Absortivo y Ayuno


Zimógenos

Zimógeno Enzima Activa + Peptido(s) reguladores


Isoenzimas

oCatalizan la misma reacción en diferentes tejidos

oDiferentes secuencias de aminoácidos

o Diferentes cadenas

o Diferentes Km

Hexoquinasa I

Hexoquinasa II Km= 0,04 – 0,17 mM

Hexoquinasa III

Hexoquinasa IV (Glucoquinasa) Km= 10 mM


Isoenzimas

Lactado deshidrogenasa (LDH)• Posee 4 subunidades (H y

M)• Su aumento en sangre es

indicativo de necrosis• Existe 5 isoformas, cuya

distribución varía según eltejido necrosado.

Creatinfosfato quinasa (CPK)• Posee 2 subunidades (M y B)• Su aumento en sangre es

indicativo de necrosismuscular o cerebral.

• En el infarto de miocardioaumenta la proporción de laisoforma CPK-MB

• Alemán, I (2010). Enzimas Presentación en Power Point. Cátedra deBioquímica, Escuela de Medicina José María Vargas – UCV

• Castillo, F y Roldán, M (2005). Biotecnología Ambiental, Editorial TébarFlores; Madrid, España

• Mathews, C; van Holde, K y Ahern, K (2003). Bioquímica, 3a Edición, PearsonEducación; Madrid, España

• Nelson, D y Cox, M (2009). Lehninger Principios de Bioquímica, 5a Edición,Ediciones Omega; Barcelona, España; pp 71 – 117

• Stryer, L; Berg, J; Tymocko, Tom (2007). Bioquímica, 6a edición, EditorialReverté, España

Bibliografía

“Nunca me he encontrado con un enzima aburrido”

Arthur Kornberg, 1975

“El primer paso de la ignorancia es presumir de saber

y mucho sabrían si no pensaran que saben”

Baltasar Gracian

Gracias

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