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Entwicklung von Real-Time PCR Nachweissystemen für getränkerelevante Hefen

vorgelegt von

Diplom-Ingenieur

Hans-Henno Dörries

Angefertigt bei der Firma

BIOTECON Diagnostics GmbH

in Potsdam

Von der Fakultät III - Prozesswissenschaften

der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Ingenieurwissenschaften

- Dr.-Ing. -

genehmigte Dissertation Vorsitzender: Prof. Dr. rer. nat. L. Kroh Berichter: Prof. Dipl.-Ing. Dr. U. Stahl Berichterin: Dr.-Ing. K. Berghof-Jäger Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 01.03.2006

Berlin 2006 D 83

II

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dipl.-Ing. Dr. Ulf Stahl für die wissenschaftliche

Betreuung und Unterstützung beim Erstellen dieser Arbeit.

Frau Dr. Kornelia Berghof-Jäger danke ich für die hevorragende Unterstützung und die unun-

terbrochene Begeisterung für alle Ergebnisse dieser Arbeit.

Herrn Dr. Cordt Grönewald und Herrn Dr. Thomas Zippel möchte ich für ihre Hilfe bei der

Lösung von praktischen Problemen, für wertvolle Anregungen und ihre ständige Diskussi-

onsbereitschaft danken.

Ivonne Remus danke ich für die tatkräftige Unterstützung bei einigen der durchgeführten

Versuche.

Ganz besonders danke ich Jana Kohlmann für die große Geduld und die Unterstützung bei

der Anfertigung der schriftlichen Arbeit.

Herrn Dipl. Biol. Benjamin Junge danke ich für die kritische Durchsicht dieser Arbeit.

Allen Mitarbeitern der Firma BIOTECON Diagnostics GmbH danke ich für die Hilfsbereit-

schaft und angenehme Arbeitsatmosphäre.

Inhaltsverzeichnis

III

Inhaltsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis ............................. ............................................................. VI

Tabellenverzeichnis ............................... ............................................................... VII

Abkürzungsverzeichnis ............................. ............................................................ IX

Zusammenfassung................................... ............................................................. XII

1 Einleitung ....................................... ...........................................................................1

1.1 Getränkerelevante Hefen ........................ .................................................................1

1.1.1 Alkoholfreie Getränke ........................ ......................................................................2

1.1.2 Bier ......................................... ...................................................................................5

1.1.3 Wein......................................... ..................................................................................6

1.2 Nachweis und Identifizierung von getränkereleva nten Hefen .............................7

1.2.1 Kultivierungsabhängiger Nachweis............. ...........................................................8

1.2.2 Mikroskopie, Durchflusszytometrie und Immunoa ssay .....................................10

1.2.3 Elektrometrische Methoden und ATP-Messung.... ..............................................12

1.2.4 Phänotypische Identifizierung ................ ..............................................................13

1.2.5 Konventionelle, PCR-basierte Methoden ........ .....................................................13

1.2.6 Real-Time PCR-Methoden ....................... ..............................................................17

1.3 Ziele der Arbeit ............................... ........................................................................18

2 Material und Methoden ............................ ..............................................................19

2.1 Mikroorganismen ................................ ...................................................................19

2.2 Nährmedien..................................... ........................................................................22

2.3 Oligonucleotide ................................ ......................................................................24

2.4 Probenmatrices ................................. .....................................................................26

2.5 Anzucht von Mikroorganismen.................... .........................................................27

2.6 Extraktion von Nucleinsäuren................... ............................................................27

2.6.1 Mechanisch/thermische DNA-Extraktion ......... ....................................................27

2.6.2 Extraktion quantifizierbarer und RNA-freier D NA ...............................................27

2.6.3 Erweiterte, mechanisch/thermische DNA-Extrakt ion..........................................27

2.7 Konzentrationsbestimmung von DNA-Lösungen ...... .........................................28

2.7.1 Fluorometrische Bestimmung................... ............................................................28

2.7.2 Konzentrationsbestimmung über Absorptionsspek trometrie ...........................28

2.8 Agarosegelelektrophorese ....................... .............................................................28

2.9 Klonierung von PCR-Fragmenten.................. .......................................................29

2.9.1 Erzeugung von PCR-Fragmenten für die Klonieru ng .........................................29

2.9.1.1 EF-3-Gen Fragmente ..................................... .........................................................29

2.9.1.2 Interne Amplifikationskontrolle und Positiv kontrolle .........................................3 0

2.9.2 Reinigung von PCR-Fragmenten für die Klonieru ng ..........................................31

Inhaltsverzeichnis

IV

2.9.3 Ligation von gereinigten DNA-Fragmenten ...... ...................................................31

2.9.4 Transformation von E. coli Zellen............................................ .............................31

2.9.4.1 Herstellung kompetenter E. coli Zellen ............................................ ....................31

2.9.4.2 Transformationsansatz...................... ....................................................................31

2.9.4.3 Kontrolle der Transformation............... .................................................................31

2.9.5 Präparation von Plasmid-DNA .................. ............................................................32

2.9.6 Restriktionsverdau von Plasmid-DNA........... .......................................................32

2.10 Sequenzierung................................. .......................................................................32

2.11 Sequenzanalyse ................................ .....................................................................32

2.12 Zellzahlbestimmung............................ ...................................................................32

2.13 Real-Time LightCycler ® PCR .................................................................................33

2.13.1 Real-Time LightCycler ® PCR-Programme ..................................... .......................33

2.13.1.1 S. cerevisiae var. diastaticus Nachweis mit Hybridisierungssonden ...............3 3

2.13.1.2 Hefegesamtnachweis mit Hybridisierungssond en .............................................34

2.13.1.3 Hefegesamtnachweis mit SYBR ®-Green I ........................................... .................34

2.13.2 Real-Time PCR-Ansätze....................... ..................................................................35

2.13.2.1 S. cerevisiae var. diastaticus Nachweis mit Hybridisierungssonden ...............3 5

2.13.2.2 Hefegesamtnachweis mit Hybridisierungssond en .............................................35

2.13.2.3 Hefegesamtnachweis mit SYBR ®-Green I ........................................... .................36

2.14 Spezifitätstestung der Real-Time LightCycler ® PCR...........................................36

2.15 Sensitivitätstestung der Real-Time LightCycler ® PCR .......................................36

2.15.1 Sensitivität ermittelt mit quantifizierter, RNA-freier DNA ...................................36

2.15.2 Sensitivität ermittelt mit dotierten Probenm atrices ............................................ 36

2.15.3 Sensitivität ermittelt bei einer hohen Begle itflora............................................ ...36

2.16 Praxisnahe Testung der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus ......37

3 Ergebnisse ....................................... .......................................................................38

3.1 Entwicklung einer Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus ................38

3.1.1 Auswahl der STA1-3 Gene als Zielregionen ............................. ...........................38

3.1.2 Anordnung der Primer und Hybridisierungssonde n im STA Gen .....................39

3.1.3 Konstruktion der internen Amplifikationskontr olle und der Positivkontrolle ..40

3.1.4 Spezifität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus ........................42

3.1.5 Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus .....................45

3.1.6 Kompatibilität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus mit unterschiedlichen Probenmatrices................... ....................................................48

3.1.7 Anwendbarkeit der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus in der Praxis............................................. ..........................................................................49

3.1.7.1 Versuchsteil 1: Robustheit ................. ...................................................................49

3.1.7.2 Versuchsteil 2: Spezifität ................. ......................................................................51

3.1.7.3 Versuchsteil 3: Sensitivität............... .....................................................................51

Inhaltsverzeichnis

V

3.2 Entwicklung einer Real-Time Consensus-PCR für H efen...................................53

3.2.1 Auswahl des EF-3 Gens als Zielregion ............................... .................................53

3.2.2 Sequenzierung und Alignment des EF-3 Genbereichs....................................... 54

3.2.3 Sequenzvergleich des EF-3 Genbereichs ....................................... .....................55

3.2.4 Anordnung der Primer und Hybridisierungssonde n im EF-3 Gen ....................57

3.2.4.1 Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit SYBR ®-Green I..................................58

3.2.4.2 Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit Hybri disierungssonden...................58

3.2.5 Konstruktion der internen Amplifikationskontr olle und der Positivkontrolle ..59

3.2.6 Spezifität und Auswahl des Detektionssystems . ................................................61

3.2.6.1 Spezifität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit SYBR ®-Green I ..........61

3.2.6.2 Spezifität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit Hybridisierungssonden .............................. ...........................................................63

3.2.7 Sensitivität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit Hybridisierungssonden .............................. ...........................................................64

3.2.7.1 Sensitivitätstestung mit quantifizierter, R NA-freier DNA ...................................64

3.2.7.2 Sensitivität in Kombination mit der mechani sch/thermischen DNA-Extraktion..................................... ..................................................................66

3.2.7.3 Sensitivität in Kombination mit der erweite rten, mechanisch/thermischen DNA-Extraktion..................................... ..................................................................68

3.2.7.4 Detektionszeit für unterschiedliche Hefeart en ....................................................68

3.2.7.5 Sensitivität bei einer hohen Begleitflora .. ............................................................71

4 Diskussion ....................................... .......................................................................73

4.1 Beurteilung der STA1-3 und EF-3 Gene als Targetmoleküle........................... ...73

4.2 Spezifität und Sensitivität der Real-Time PCR-A ssays.......................................78

4.3 Anwendbarkeit der Real-Time PCR in Kombination mit der Probenaufarbeitung ................................. ..............................................................81

4.4 Ausblick ....................................... ...........................................................................92

5 Literatur........................................ ...........................................................................93

6 Anhang ........................................... .......................................................................110

6.1 Getestete Mikroorganismen ...................... ..........................................................110

6.2 Sequenzauswertung .............................. ..............................................................111

6.3 Real-Time RT-PCR............................... .................................................................124

6.3.1 RNA-Extraktion............................... ......................................................................124

6.3.2 Real-Time One-Step RT-PCR.................... ...........................................................124

6.3.3 Real-Time One-Step RT-PCR-Programm........... .................................................125

6.3.4 Real-Time One-Step RT-PCR-Ansätze............ ....................................................126

6.3.5 Ergebnisse der Real-Time One-Step RT-PCR..... ...............................................127

Abbildungsverzeichnis

VI

Abbildungsverzeichnis

Abb. 3.1: Anordnung der identischen Sequenzabschnitte der Gen e SGA1 und MUC1 in der STA Multigen-Familie.................................. ..............................38

Abb. 3.2: Anordnung der Primer und Hybridisierungssonden im STA1 Gen............39

Abb. 3.3: Sequenzvergleich der IAK mit dem STA1 Gen.............................................40

Abb. 3.4: Sequenzvergleich der PK mit dem STA1 Gen..............................................41

Abb. 3.5: Differenzierung zwischen der PK und positiven Probe n bei der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus.........................................42

Abb. 3.6: Amplifikation und Schmelzkurven-Analyse des STA Genfragments von S. cerevisiae. var. diastaticus Stämmen ........................................... ....43

Abb. 3.7: Agarosegelelektrophorese nach Real-Time PCR mit dem S. cerevisiae var. diastaticus System ............................................ ......................................44

Abb. 3.8: Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus..............46

Abb. 3.9: Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus bei einer hohen Begleitflora........................... ......................................................47

Abb. 3.10: Real-Time PCR Nachweis von S. cerevisiae var. diastaticus in Flaschenbier....................................... .............................................................52

Abb. 3.11: Schematische Darstellung der Aminosäuresequenz des Elongationsfaktors 3 von Hefen ..................... ...............................................53

Abb. 3.12: Dendrographische Auswertung der EF-3 Gensequenzen...........................57

Abb. 3.13: Konstruktion der Hybridisierungssonde Yff3 für das EF-3 Genfragment........................................ ............................................................59

Abb. 3.14: Sequenzvergleich der IAK mit dem EF-3 Gen von S. cerevisiae var. diastaticus .......................................................................................................60

Abb. 3.15: Agarosegelelektrophorese nach Real-Time PCR mit SYB R®-Green I ........61

Abb. 3.16: Schmelzkurven-Analyse von spezifischen Amplifikaten und Primerdimeren...................................... ...........................................................62

Abb. 3.17: Schmelzkurven-Analyse von unspezifisch amplifiziert er Bakterien-DNA...................................... ...........................................................63

Abb. 3.18: Schmelzkurven-Analyse unterschiedlicher Hefearten .. ..............................64

Abb. 3.19: Sensitivität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen . ...............................66

Abb. 3.20: Real-Time PCR Nachweis von D. bruxellensis in Orangensaft ..................69

Abb. 3.21: Sensitivität bei Anwesenheit einer hohen Begleitflo ra ...............................72

Abb. 6.1: Alignment der Nucleinsäuresequenzen des EF-3 Sequenzabschnitts (Position 2272-2637) mit Angabe der Primerpositione n............................111

Abb. 6.2: Real-Time One-Step RT-PCR .......................... .............................................127

Abb. 6.3: Agarosegelelektrophorese nach Real-Time One-Step RT -PCR................128

Abb. 6.4: Schmelzkurven-Analyse zur Kontrolle des DNA Abbaus . ........................128

Tabellenverzeichnis

VII

Tabellenverzeichnis

Tab. 2.1: Hefestämme......................................... ............................................................19

Tab. 2.2: Bakterienstämme .................................... ........................................................21

Tab. 2.3: Schimmelpilzstämme ................................. ....................................................22

Tab. 2.4: YM-Medium (yeast extract-malt extract broth) ....... ......................................22

Tab. 2.5: CASO-Bouillon ...................................... ..........................................................22

Tab. 2.6: Peptonwasser (gepuffert)........................... ....................................................23

Tab. 2.7: MRS-Bouillon ....................................... ...........................................................23

Tab. 2.8: LB-Medium (Luria-Bertani-Medium)................... ...........................................23

Tab. 2.9: LB-Agarplatten ..................................... ...........................................................23

Tab. 2.10: SOC-Medium ......................................... ..........................................................23

Tab. 2.11: Primer für die DNA-Kontrolle ....................... ..................................................24

Tab. 2.12: Primer zur Amplifikation von PCR-Fragmenten des EF-3 Gens.................24

Tab. 2.13: Primer für Real-Time PCR Nachweissysteme ........... ...................................24

Tab. 2.14: Mutageneseprimer zur Herstellung von internen Ampli fikations- kontrollen und Positivkontrollen................... ................................................25

Tab. 2.15: Hybridisierungssonden für die Real-Time PCR-Assays . ............................25

Tab. 2.16: Getränkeproben ..................................... .........................................................26

Tab. 2.17: Nährmedien ......................................... ............................................................26

Tab. 2.18: Prozessproben von Brauerei A....................... ...............................................26

Tab. 3.1: Spezifität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus .................43

Tab. 3.2: Abbaubarkeit von Amplifikaten des STA Gens mit dem Enzym UNG .......45

Tab. 3.3: Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus..............46

Tab. 3.4: Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus bei einer hohen Begleitflora........................... ......................................................47

Tab. 3.5: Amplifikation der IAK der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus bei einer hohen Begleitflora...................... .................................48

Tab. 3.6: Eignung der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus in Kombination mit der mechanisch/thermischen Aufarbei tung für unterschiedliche Probenmatrices .................... .............................................48

Tab. 3.7: Ergebnisse des Versuchsteils 1: Robustheit ......... ......................................50

Tab. 3.8: Ergebnisse des Versuchsteils 2: Spezifität ......... .........................................51

Tab. 3.9: Ergebnisse des Versuchsteils 3: Sensitivität....... ........................................52

Tab. 3.10: Sensitivitätstestung mit quantifizierter, RNA-freie r DNA............................65

Tab. 3.11: Eignung der Real-Time Consensus-PCR für Hefen in Ko mbination mit der mechanisch/thermischen Aufarbeitung für unt erschiedliche Probenmatrices und Hefearten....................... ...............................................67

Tabellenverzeichnis

VIII

Tab. 3.12: Eignung des Real-Time Consensus-PCR für Hefen in Ko mbination mit der erweiterten, mechanisch/thermischen Aufarbe itung für unterschiedliche Probenmatrices .................... .............................................68

Tab. 3.13: Detektionszeit für langsam wachsende Hefen......... ....................................69

Tab. 3.14: Detektionszeit in Abhängigkeit von der Hefeart und der Probenaufarbeitung................................. .......................................................70

Tab. 3.15: Sensitivität bei einer hohen Begleitflora.......... .............................................71

Tab. 6.1: Stämme für die Spezifitätstestung der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus ..............................................................................................110

Tab. 6.2: Distanz-Matrix: Prozentuale Übereinstimmung der EF- 3 Aminosäure-sequenzen innerhalb der Unterabteilung der Ascomyco ta ......................119

Tab. 6.3: Distanz-Matrix: Prozentuale Übereinstimmung der EF- 3 Aminosäure-sequenzen innerhalb der Unterabteilung der Basidiom ycota ..................124

Abkürzungsverzeichnis

IX


A Adenin Abb. Abbildung Acc. No. accession number AFLP amplified fragment length polymorphism ATCC American Type Culture Collection ATP Adenosintriphosphat aw Wasseraktivität B Cytosin, Guanin oder Thymin B. Brettanomyces BCD BIOTECON Diagnostics GmbH (Potsdam, Deutschland) bp Basenpaar BSA bovine serum albumin (Rinderserumalbumin) Bul. Bullera C Cytosin C. Candida Ci Citeromyces Cl. Clavispora Cr. Cryptococcus c. cerevisiae CBS Centraalbureau voor Schimmelcultures Cp crossing point dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytosintriphosphat dGTP Desoxyguanosintriphosphat D Adenin, Guanin oder Thymin D. Dekkera Deb. Debaryomyces DEFT direct epifluorescent filter technique DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonucleinsäure) DNase Deoxyribonuclease dNTP Desoxynucleotidtriphosphat; (dATP, dCTP, dGTP und dTTP und/oder dUTP) DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH dTTP Desoxytymidintriphosphat dUTP Desoxyuridintriphosphat E. Escherichia EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA enzyme linked immunosorbant assay En. Endomyces EPS extrazelluläre Polysaccharide et al. et alii (und andere) F. Filobasidiella fg Femtogramm (10-15 Gramm) FRET fluorescence resonance energy transfer G Guanin G. Guilliermondella g Gramm x g Vielfaches der Erdbeschleunigung g (g = 9,81 m s-2) GÄ Genomäquivalent H. Hanseniaspora Hy. Hyphopichia I Inosin I. Issatchenkia


X

IAK interne Amplifikationskontrolle ITS internal transcribed spacer ISO International Organization for Standardization K Guanin oder Thymin K. Kluyveromyces Ka. Kazachstania Kap. Kapitel KBE Koloniebildende Einheiten kbp Kilobasenpaare (103 Basenpaare) l Liter L. Lodderomyces La. Lachancea M Adenin oder Cytosin M. Metschnikowia Mbp Megabasenpaare (106 bp) MEA Malzextrakt Agar min Minuten ml Milliliter (10-3 Liter) mM millimolar (10-3 molar) MPN most probable number mRNA messenger RNA (Boten-RNA) MUCL Stammnummer der BCCM (Belgian co-ordinated Collection of Microorganisms) N Adenin, Cytosin, Guanin oder Thymin NCYC National Collection of Yeast Cultures ng Nanogramm (10-9 Gramm) nm Nanometer (10-9 Meter) OD optische Dichte P. Pichia past. pastorianus PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) pg Pikogramm (10-12 Gramm) pH negativer, dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration PK Positivkontrolle R Adenin oder Guanin R. Rhodotorula RAPD random amplified polymorphic DNA rDNA ribosomale DNA RFLP Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen RNA ribonucleic acid (Ribonucleinsäure) RNase Ribonuclease rRNA ribosomale RNA RT Reverse Transkriptase S Cytosin oder Guanin S. Saccharomyces Sch. Schizosaccharomyces sp. species Sp. Sporidiobolus T Thymin T. Torulaspora Tab. Tabelle TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TE Tris-EDTA-Puffer TGYA Trypton Glucose Hefeextrakt Agar Tr. Trichosporon


XI

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan var. variety (Varietät) VBNC viable but nonculturable VTT Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus, Kulturstammsammlung (Finnland) W Adenin oder Thymin X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-galactodid Y Cytosin oder Thymin Y. Yarrowia YM yeast extract-malt extract Z. Zygosaccharomyces µg Mikrogramm (10-6 Gramm) µl Mikroliter (10-6 Liter)

Zusammenfassung

XII

Zusammenfassung

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Real-Time PCR-Systeme zum Nachweis von geträn-

kerelevanten Hefen auf Basis der LightCycler® Technologie mit Hybridisierungssonden ent-

wickelt. Für beide Systeme wurden interne Amplifikationskontrollen und Positivkontrollen

hergestellt und zwei DNA-Extraktionssysteme bereitgestellt.

Ein hoch spezifischer und sensitiver Einzelnachweis für die wichtigste, bierschädliche Sac-

charomyces Fremdhefe, S. cerevisiae var. diastaticus, wurde entwickelt, indem die sequen-

ziellen Unterschiede zwischen den Glucoamylase kodierenden Genen von S. cerevisiae var.

diastaticus (STA1-3) und S. cerevisiae (SGA1) ausgenutzt wurden. Die hohe Nachweisemp-

findlichkeit des PCR-Systems von 5 bis 10 GÄ pro Reaktion ermöglichte in Kombination mit

einer schnellen, mechanisch/thermischen Probenaufarbeitung, die sich aus einem Zellauf-

schluss mit Glaskügelchen, hohen Temperaturen und dem Ionenaustauscher Chelex® 100

zusammensetzte, den Nachweis von 102 bis 103 S. cerevisiae var. diastaticus Zellen/ml bei

einer Hintergrundpopulation von 108 Zellen/ml S. cerevisiae. Die Robustheit des Systems

wurde durch Testung von 66 unterschiedlichen Probenmatrices, von denen sich nur eine als

ungeeignet für das Real-Time PCR-System herausstellte, gezeigt und die Praxistauglichkeit

wurde direkt bei vier Brauereien verifiziert. Der gesamte Assay mit Probenaufarbeitung und

PCR ist innerhalb von 2,5 Stunden durchführbar und damit signifikant schneller als kultivie-

rungsabhängige Methoden.

Die Sequenzierung eines Abschnitts des Gens des Elongationsfaktors 3 (EF-3) von 93 Hefe-

stämmen lieferte die Grundlage für die Entwicklung einer Real-Time Consensus-PCR zum

Nachweis von getränkerelevanten Hefen. Der Nachweis von allen 252 getesteten Hefe-

stämmen wurde bei dem Assay durch degenerierte Primer und Hybridisierungssonden er-

möglicht, ohne dass mit DNA von einer der 71 getesteten Bakterien falsch-positive Ergebnis-

se auftraten. Der Nachweis konnte nicht zur Identifizierung der Hefearten oder -gattungen

eingesetzt werden und die Abgrenzung zu den Schimmelpilzen, die ebenfalls das EF-3 Gen

enthalten, ließ sich nicht zu 100 % erreichen. Die Sensitivität des Systems lag in Abhängig-

keit von der Hefeart zwischen 10 und 250 GÄ pro Reaktion und in Kombination mit einer

Erweiterung der mechanisch/thermischen Probenaufarbeitung bei 103 bis 104 Zellen/ml. Bei

sehr niedrig kontaminierten Getränkeproben mit 1 bis 100 Zellen/ml war ein Nachweis nach

zwei bis drei Tagen Flüssiganreicherung in YM-Medium möglich.

1 Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Getränkerelevante Hefen

Die Anwesenheit von Mikroorganismen in Getränken kann aus drei Gründen für den Men-

schen von Interesse sein. Das Getränk kann zum einen pathogene Mikroorganismen beher-

bergen, die bei Aufnahme ein Gesundheitsrisiko für den Menschen darstellen. Zum anderen

können Mikroorganismen zu unerwünschten Veränderungen von Getränken führen, sodass

sie nicht mehr für den Verzehr geeignet sind. Dem gegenüber übernehmen einige Arten ent-

scheidende Prozesse bei der Produktion einer Vielzahl von Getränke, die durch Fermentati-

on hergestellt werden (Fleet 1992).

Hefen sind besonders für ihren positiven Beitrag bei der Herstellung von Getränken bekannt.

Die Gefahr sich über Getränke mit pathogenen Hefearten (Candida albicans, Candida tropi-

calis oder Cryptococcus neoformans) zu infizieren ist dagegen von untergeordneter Bedeu-

tung (Fleet 1992). Zu den Hefen zählen Pilze aus den Unterabteilungen der Asco- oder Ba-

sidiomycota, die einzellig oder mit Pseudohyphen vorliegen können, sich entweder vegetativ

durch Sprossung oder binäre Spaltung reproduzieren oder sexuelle Stadien bilden, die nicht

in Fruchtkörpern eingeschlossen sind (Boekhout und Phaff 2003).

Hefen können als Verderbniserreger von Getränken eine bedeutende Rolle spielen, wobei

hierzu oftmals auch Getränke wie z.B. Bier oder Wein zählen, bei deren Produktion Hefen

beteiligt waren. Visuell erkennbare Beeinträchtigungen wie Trübung und Bodensatzbildung

können dabei durch die gebildete Hefebiomasse hervorgerufen werden. Einige Hefearten

bilden bei ihrem Wachstum Pseudohyphen oder Zellverbände, die in klaren Getränken als

Partikel oder an der Oberfläche von Getränken als Filme sichtbar werden (Kato 1981, Pitt

und Hocking 1997). Die Produktion von extrazellulären, pektolytischen Enzymen kann

Fruchtsäfte ausklären. Sensorische Beeinträchtigungen durch Geruchs- oder Geschmacks-

veränderungen können durch primäre und sekundäre Stoffwechselendprodukte wie Alkoho-

le, organische Säuren, Aldehyde und Ester entstehen (Weidenbörner 1998). Eine der ex-

tremsten, sichtbaren Auswirkungen stellt sicher das Anschwellen oder die Bombage von

Produktverpackungen aufgrund einer starken CO2-Produktion dar (Fleet 1992).

Die Quellen, über die Hefen in Getränke gelangen, sind vielfältig und reichen von den Aus-

gangssubstanzen, Staub- und Luftkontaminationen, Insekten als Vektoren (z. B. Drosophila

spp.), Flaschenabfüllanlagen, Flaschenverschlüssen (Kronkorken, Korken) bis hin zu man-

gelhaft gereinigten Flaschen (Back 1994, Deák 1991, Fleet 1992, Mortimer und Polsinelli

1999). Nach Schätzungen sind 95 % aller Kontaminationen von alkoholfreien Getränken mit

Hefen, auf ungenügende Hygiene zurückzuführen (Stratford und James 2003). In der Braue-

rei wird eine Unterteilung der Kontaminationen in Primärkontaminationen, die im Prozess

1 Einleitung

2

vorkommen wie z. B. Kontaminationen der Anstellhefe, und Sekundärkontaminationen, die

bei der Abfüllung entstehen, vorgenommen (Back 1994, Fleet 1992).

Die Vermehrung von Hefen in einem Habitat hängt entscheidend von vier Parametergruppen

ab. Zu den intrinsischen Parametern zählen die Wasseraktivität (aw-Wert), der pH-Wert, das

Redoxpotential, das Nährstoffangebot und die Konzentration an Konservierungsmitteln. Für

Hefen bestehen teilweise Wachstumsvorteile gegenüber anderen Mikroorganismen, wenn

diese Parameter bestimmte Werte annehmen. Niedrige aw-Werte durch hohe Salz- oder Zu-

ckerkonzentrationen und niedrige pH-Werte können selektiv zu Gunsten von Hefen wirken.

Unter anaeroben oder semi-anaeroben Verhältnissen sind von den bekannten Hefearten ca.

ein Drittel in der Lage, ihren Energiestoffwechsel aufrechtzuerhalten und von aerober At-

mung auf Gärung umzustellen (Pasteur Effekt). Auch Resistenzen gegenüber Konservie-

rungsmitteln wie z. B. Benzoesäure, Sorbinsäure oder SO2 oder die direkte Nutzung dieser

Substanzen als Substrat sind bei einigen Arten möglich (Miller 1979, Steels et al. 1999a,

Steels et al. 2000). Von den extrinsischen Parametern sind bei Getränken besonders die

Temperatur und die Atmosphäre für Hefen von Bedeutung. Neben dem Aspekt, dass Hefen

teilweise anaerobe oder semi-anaerobe Verhältnisse tolerieren, können auch Toleranzen

gegenüber erhöhten CO2-Konzentrationen und niedrigen Temperaturen bestehen (Stratford

und James 2003, Steels et al. 1999a). Die Art der Herstellung und Abfüllung von Getränken

beeinflusst entscheidend die Anwesenheit von Hefen. Während vegetative Hefezellen in Ab-

hängigkeit von weiteren Parametern wie pH-Wert, Ethanol-Gehalt und Konzentration an Kon-

servierungsmitteln relativ schnell bei Temperaturen oberhalb von 65 °C abgetötet werden,

werden für Ascosporen wesentlich höhere D-Werte ermittelt (Fleet 1992).

Antagonismus oder Synergismus mit anderen Hefearten oder Mikroorganismen beeinflussen

ebenfalls das Wachstum von Hefen durch z. B. unterschiedliche Wachstumsgeschwindigkei-

ten, gebildete Endprodukte oder Killertoxine (Deák 1991).

1.1.1 Alkoholfreie Getränke

Die Gruppe der alkoholfreien Getränke, auch Soft-Drinks genannt, beinhaltet unterschiedli-

che Getränketypen wie Fruchtsäfte, Fruchtnektars, karbonisierte Getränke (Limonaden und

Cola-Limonaden), stille Getränke und Mineralstoffgetränke (isotonische Getränke), die unter-

schiedliche Anteile an Zusätzen wie Zucker, Frucht- oder Gemüseextrakten enthalten. Ge-

tränke wie Fruchtsäfte und -nektars, die in erster Linie aus Fruchtmuttersäften oder Saft- und

Aromakonzentraten hergestellt werden, bieten für ein mikrobielles Wachstum ein ideales

Nährstoffangebot (Weidenbörner 1998). Ein niedriger pH-Wert zwischen 2,5 und 4,5, hervor-

gerufen durch Fruchtsäuren, selektiert jedoch zu Gunsten von säuretoleranten Mikroorga-

nismen unter ihnen auch einige Hefearten (Back 1994). In Fruchtsaftkonzentraten wachsen

1 Einleitung

3

nahezu ausschließlich Hefen (Weidenbörner 1998). Karbonisierte, alkoholfreie Getränke, die

einen hohen Zuckeranteil, einen niedrigen pH-Wert, eine niedrige Sauerstoffkonzentration

und eine hohe CO2-Konzentration haben, bieten nur einer geringen Zahl an Hefen, Schim-

melpilzen und einigen säuretoleranten Bakterien (z. B. Lactobacillus und Acetobacter spp.)

gute Wachstumsbedingungen. Ein hoher CO2-Gehalt hat besonders gegenüber Bakterien

und Schimmelpilzen einen selektierenden Einfluss zugunsten von Hefen (Stratford und Ja-

mes 2003).

Aufgrund ihrer physiologischen Merkmale wurden Hefearten, die in alkoholfreien Getränken

vorkommen, von Davenport (1996) in Gruppen unterschiedlicher Relevanz klassifiziert. Die

wichtigste Gruppe aus obligaten Schadhefen bilden osmotolerante, stark gärfähige und ge-

genüber Konservierungsmitteln wie z. B. Essigsäure, Sorbinsäure und Benzoesäure resis-

tente Hefearten. Auch in sehr geringer Zahl führen Arten dieser Kategorie in jedem Fall zu

einem Verderb der Produkte, wenn sie ihren Vitaminbedarf decken können (Davenport

1996). Zu den wichtigsten Vertretern dieser Gruppe gehören Arten der Gattungen Saccha-

romyces, Dekkera (anamorph: Brettanomyces), Zygosaccharomyces und Schizosaccharo-

myces.

Saccharomyces cerevisiae und Saccharomyces bayanus (Synonym: S. uvarum) sind die am

weitesten verbreiteten Verursacher für den Verderb von karbonisierten und stillen, alkohol-

freien Getränken (Back 1999, Back und Anthes 1979). Eine größere Relevanz hat S. exiguus

(anamorph: Candida holmii) in Fruchtsäften und karbonathaltigen Getränken (Stratford und

James 2003).

Schizosaccharomyces pombe ist nicht so weit verbreitet, zeigt aber alle Charakteristika einer

Hefe mit hohem Verderbnispotential wie starke Gasproduktion durch Gärung, Resistenzen

gegenüber Konservierungsstoffen und Osmotoleranz (Davenport 1996). Das Wachstum die-

ser Art, die sich durch binäre Spaltung vermehrt, ist mit einer Verdoppelungszeit von 4 Stun-

den sehr langsam und kann zu einem verzögerten Verderb führen (Stratford und James

2003).

Das Wachstum von Dekkera Spezies (anamorph: Brettanomyces) kann besonders aufgrund

ihrer Resistenz gegenüber hohen CO2-Konzentrationen karbonathaltige, alkoholfreie Geträn-

ke aber auch Fruchtsäfte durch Geschmacks- und Geruchsveränderungen verderben (Back

und Anthes 1979, Ison und Gutteridge 1987, Sand und van Grinsven 1976, Heresztyn

1986a,b). Die wichtigsten Arten sind D. bruxellensis, D. anomala und D. naardensis (Daven-

port 1996).

Zu der Gattung Zygosaccharomyces gehören einige Arten, die aufgrund ihrer hohen Gärfä-

higkeit, Osmotoleranz und Resistenz gegenüber Konservierungsmitteln in hohem Maße zum

Verderb von Getränken führen können. Saure (pH 2,5 bis 5,0) Getränke und Getränke mit

1 Einleitung

4

einem hohen Zuckergehalt (z. B. Fruchtsäfte, Fruchtkonzentrate, Soft-Drinks, Zuckersirup)

sind ein ausgezeichnetes Habitat für diese Gattung. Die Art Z. rouxii kann bei aw-Werten von

0,62 wachsen und besitzt damit die höchste Osmotoleranz aller bekannten Hefearten (Erick-

son und McKenna 2000). Die Bildung von Filmen auf der Oberfläche von Getränken ist für

diese Gattung beschrieben worden (Kato 1981). Die wichtigsten, verderbniserregenden Ar-

ten sind Z. bailii, Z. bisporus, Z. rouxii und Z. mellis, die auch phylogenetisch eine separate

Gruppe innerhalb der Gattung Zygosaccharomyces bilden (Kurtzman und Robnett 1998).

Aber auch die Arten Z. cidri, Z. fermentati, Z. florentinus und Z. microellipsoides können als

Verderbniserreger auftreten, wobei Z. microellipsoides in Soft-Drink Produktionsanlagen weit

verbreitet ist (James und Stratford 2003). Die 1999 neu beschriebene Art Z. lentus ist osmo-

tolerant, resistent gegenüber Konservierungsmitteln und kann außerdem bei niedrigen Tem-

peraturen (z. B. 4 °C) wachsen (Steels et al. 1999a,b).

Opportunistische Verderbniserreger sind nach Davenport (1996) Hefearten, die nur durch

Produktionsfehler wie z. B. Unterdosierung von Konservierungsmitteln, Fehler bei der Pas-

teurisation, Reinigungsfehler oder Sauerstoffzufuhr während der Produktion von alkoholfrei-

en Getränken auftreten. Zu dieser Gruppe gehören Arten wie Debaryomyces hansenii, Can-

dida parapsilosis, Lodderomyces elongisporus, Hanseniaspora uvarum (anamorph: Kloecke-

ra apiculata), Pichia anomala (=Hansenula anomala) und Pichia membranaefaciens (ana-

morph: Candida valida). Die thermotolerante Art Candida magnoliae kann konzentrierten

Fruchtsaft verderben (Deák und Beuchat 1993). Pichia membranaefaciens und seltener Pi-

chia farinosa und Pichia fermentans bilden wie Issatchenkia orientalis beim Verderb Filme

auf der Oberfläche der Getränke aus (Back 1987, Loureiro und Malfeito-Ferreira 2003, Pa-

rish und Higgins 1989, Pitt und Hocking 1997).

Eine weitere Gruppe bilden Arten, die reine Hygiene-Indikatoren darstellen und selbst bei

hohen Zellzahlen nicht schädlich für das Produkt sind, deren Anwesenheit aber die Reini-

gungseffizienz und allgemeine Betriebshygiene anzeigt (Back 1994). Indikatorhefen sind oft

mit obligat schädlichen Hefen vergesellschaftet, sodass deren Nachweis die Rolle einer

Früherkennung hat. Im Bereich der Herstellung von alkoholfreien Getränken werden oft die

Hefearten Candida sake, Candida solani, Candida tropicalis, Clavispora lusitaniae, Crypto-

coccus albidus, Cryptococcus laurentii, Debaryomyces etchellsii, Rhodotorula glutinis, Rho-

dotorula mucilaginosa und Trichosporon cutaneum (=Trichosporon beigelii) nachgewiesen

(Back 1999, Davenport 1996).

1 Einleitung

5

1.1.2 Bier

Die hauptsächlich als Bierhefen eingesetzten Stämme gehören zu den Arten Saccharomy-

ces pastorianus (=S. carlsbergensis, untergärige Hefen) und S. cerevisiae (obergärige He-

fen), die zusammen mit S. bayanus und S. paradoxus den Saccharomyces sensu stricto

Komplex bilden (Vaughan Martini und Martini 1987a, Vaughan Martini 1989). In geringerem

Ausmaß werden auch Dekkera Arten z. B. in einigen belgischen Bieren und Mischkulturen

mit Milchsäurebakterien (Berliner Weisse) eingesetzt (Back 1994). Die Reinheit dieser An-

stellkulturen ist für jede Brauerei von entscheidender Bedeutung, da sich jede Kontamination

in Veränderungen des Fermentationsverhaltens und des Biergeschmacks auswirken kann.

Als Fremdhefen werden in Brauereien alle Hefestämme eingestuft, die nicht bewusst einge-

setzt werden. Demnach kann auch jede Brauhefe in einem anderen Brauprozess eine Kon-

tamination darstellen (Dufour et al. 2003). Besonders in Brauereien, die mit unterschiedli-

chen Hefestämmen zur Produktion von unterschiedlichen Biersorten arbeiten, besteht das

Risiko, eine Brauhefe mit einer charakteristisch anderen Brauhefe zu kontaminieren (Camp-

bell 2002). Für Primärkontaminationen der Kulturhefe und im Unfiltratbereich sind oft Arten

aus dem Saccharomyces sensu stricto Komplex, Saccharomyces exiguus (anamorph: C.

holmii) und Saccharomycodes ludwigii verantwortlich (Back 1994). Geschmacksfehler durch

phenolische Verbindungen, die durch Primärkontaminationen hervorgerufen werden und bis

ins Endprodukt gelangen, können z. B. durch Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus

Stämme verursacht werden, die über ein POF- (phenolic off flavour) Gen verfügen (Dufour et

al. 2003).

Wild- oder Fremdhefen der Gattungen Candida, Pichia (z. B. P. membranaefaciens), Deba-

ryomyces, Hanseniaspora, Issatchenkia, Kluyveromyces, Torulaspora, Schizosaccharomy-

ces, Cryptococcus, Filobasidium, Rhodotorula und Zygosaccharomyces sind ebenfalls als

Kontaminationen zu finden, sie sind jedoch weniger an die Fermentationsbedingungen an-

gepasst und sind daher für die Produktqualität weniger gefährlich (Barnett et al. 1983, Dufour

et al. 2003). Eine Kontamination des Sauerguts kann besonders durch thermotolerante Arten

wie Kluyveromyces marxianus (=Candida kefyr) oder Candida magnoliae erfolgen (Back

1994). Eine Reihe dieser Hefearten sind als Indikatorkeime wichtig, da sie zwar nicht direkt

bierschädlich sind, ihr Nachweis aber für die Betriebskontrolle wichtige Informationen über

die hygienischen Bedingungen liefert. Debaryomyces hansenii (anamorph: C. famata) kommt

häufig vergesellschaftet mit Bierschädlingen vor, besitzt aber selbst keine ausgeprägte Gär-

fähigkeit (Back, 1994).

Sekundärkontaminationen von Bier sind aufgrund der selektiven Bedingungen wie anaerobe

Atmosphäre, niedriger pH-Wert, Hopfenbitterstoffe, Alkoholgehalt, Mangel an Nährstoffen

und niedrige Temperaturen nur durch wenige Hefen und Bakterien möglich (Back 1994).

1 Einleitung

6

Neben den eigentlichen Brauhefen können Saccharomyces Arten oder Varietäten des Sac-

charomyces sensu stricto Komplexes (z. B. S. bayanus, Wildtypen von S. cerevisiae, S. c.

var. cratericus, S. c. var. ellipsoideus und S. c. var. chevalieri) im abgefüllten Bier in Abhän-

gigkeit vom Restnährstoffgehalt wachsen und dadurch zur Trübung, zu Bodensatz, zur Ü-

bersättigung mit CO2, zu Geruchs- und Geschmacksveränderungen führen (Back 1994).

Eine obligat bierschädliche Hefe ist S. c. var. diastaticus durch ihre Fähigkeit höhere Dextri-

ne und Stärke, die als Restnährstoffe im Endprodukt Bier vorliegen, über eine extrazelluläre

Glucoamylase zu verwerten (Dufour et al. 2003). Schon sehr geringe Zellzahlen dieser Hefe

können zu einer Übervergärung des Bieres führen (Campbell 2002).

Die Mehrheit der bierschädlichen Hefearten gehört zu der Gattung Saccharomyces. Nur ca.

20-30 % bilden Mitglieder einer anderen Gattung wie z. B. Candida, Dekkera, Pichia, Hanse-

niaspora, Debaryomyces, Torulaspora (Deák 1991). Wie in alkoholfreien Getränken können

auch im Bier schwach gärfähige Arten der Gattung Dekkera (anamorph: Brettanomyces) bei

ihrem Wachstum durch die Bildung von z. B. Essigestern für Geschmacks- und Geruchsver-

änderungen sorgen (Heresztyn 1986a,b). Arten wie Pichia anomala (=Hansenula anomala),

Pichia membranaefaciens und Kluyveromyces marxianus (=Candida kefyr) führen im Bier zu

Geschmacksfehlern durch die Bildung von Äthylacetat, flüchtigen Phenolen, Säuren und

Estern. Sie sind jedoch wie einige Candida Arten (z. B. C. boidinii, C. sake, C. intermedia, C.

vini, C. parapsilosis und C. tropicalis) auf Sauerstoff angewiesen und bilden daher beim

Wachstum auf Flüssigkeitsoberflächen Filme aus (Back 1994, Fleet 1992).

1.1.3 Wein

Am Anfang der Weinherstellung wird der Most von einer Mischpopulation unterschiedlicher

Hefearten dominiert, die zu einer spontanen Fermentation führen und je nach Ausmaß das

Endprodukt beeinflussen können. Zu diesen Arten zählen z. B. Metschnikowia pulcherrima,

Zygosaccharomyces sp., Kluyveromyces lactis, Lachancea thermotolerans (=Kluyveromyces

thermotolerans), Saccharomyces exiguus (anamorph: C. holmii), Debaryomyces hansenii

(anamorph: C. famata) Torulaspora delbrueckii, Hanseniaspora sp. (anamorph: Kloeckera

sp.), Issatchenkia orientalis, Pichia sp. (=Hansenula sp.), Cryptococcus albidus und Crypto-

coccus laurentii (Deák 1991, Back 1994, Dequin et al. 2003). In diesem Stadium der Fer-

mentation ist es schwierig, vorteilhafte und schädliche Aktivitäten der beteiligten Hefen von

einander abzugrenzen. Die Art Hanseniaspora uvarum (anamorph: Kloeckera apiculata) ist

wie Hanseniaspora vineae (anamorph: Kloeckera africana) oft an Weintrauben und im

Weinmost vorhanden und kann durch übermäßige Produktion von Acetat den Weinge-

schmack negativ beeinflussen (Back 1994, Weidenbörner 2000). Saccharomycodes ludwigii

kann selbst in stark geschwefeltem Most hohe Konzentrationen an Acetaldehyd produzieren

1 Einleitung

7

(Back 1994, Fleet 1992). Dagegen wird die Produktion von 4-Ethylphenol durch Dekkera sp.

(anamorph: Brettanomyces sp.) in Rotwein erst als störend angesehen, wenn eine Konzent-

ration von 620 µg/l überschritten wird (Chatonnet et al. 1992). Konzentrationen unterhalb von

400 µg/l wirken sich dagegen vorteilhaft auf die geschmackliche Komplexität des Weines aus

(Loureiro und Malfeito-Ferreira 2003). Im weiteren Verlauf der Fermentation selektieren die

Bedingungen wie z. B. die Zugabe von SO2 und die erhöhte Ethanolkonzentration zu Guns-

ten von S. cerevisiae oder seltener S. bayanus, die zumeist als Starterkulturen zugegeben

werden und die Fermentation abschließen (Fleet et al. 1984, Heard und Fleet 1985, Naumov

et al. 2000).

Nach Abschluss des Fermentationsprozesses ist für die Weinqualität jede weitere Aktivität

von Hefen schädlich (Deák 1991). Die Mehrheit der Hefearten, die für den Verderb von

Wein, der in Fässern und Tanks gelagert wird, verantwortlich sind, gehört zu den filmbilden-

den, aeroben oder schwach gärfähigen Arten wie C. vini, C. zeylanoides, C. rugosa, I. orien-

talis, P. anomala und P. membranaefaciens (Loureiro und Malfeito-Ferreira 2003, Minárik

1981). In Fässern gealterter Rotwein ist ein klassisches Habitat für die Gattung Dekkera (a-

namorph: Brettanomyces), die große Mengen Acetat durch die Oxidation von Ethanol bilden

kann (Back 1987). Selbst in Sherry, der mit mehr als 15 % Ethanol ein sehr ungeeignetes

Habitat für die meisten Mikroorganismen darstellt, kann die Art D. bruxellensis wachsen (I-

beas et al. 1996). Neben den genannten Arten sind außerdem für den Verderb von Weinen,

die nach GMP (good manufacturing practice) produziert und verpackt wurden, die ethanolto-

leranten Stämme der Hefearten Z. bailii und S. cerevisiae besonders gefährlich (Fleet 1992,

Loureiro und Malfeito-Ferreira 2003).

1.2 Nachweis und Identifizierung von getränkereleva nten Hefen

Für die Qualitätskontrolle und die Qualitätssicherung in der Getränkeindustrie sind möglichst

schnelle und zuverlässige Methoden zum Nachweis und zur Identifizierung von Hefen not-

wendig, um die mikrobielle Stabilität der Endprodukte sicherzustellen. Die Sensitivität dieser

Methoden muss so hoch sein, dass z. B. eine Zelle in 100 ml Wein nachweisbar ist (Loureiro

und Malfeito-Ferreira 2003). Je schneller die Ergebnisse für die mikrobiologischen Untersu-

chungen vorliegen, desto aktiver und schneller kann im Herstellungsprozess reagiert werden

oder die Auslieferung der Produkte erfolgen. Eine genaue Identifizierung der detektierten

Hefen bietet, neben der Möglichkeit deren Schädlichkeitspotential zu beurteilen, auch die

Möglichkeit eine Kontamination bis zu ihrem Ursprung zu verfolgen und damit Verbesserun-

gen des Produktionsablaufes einzuleiten (van der Vossen und Hofstra 1996). Eine große

Anzahl an unterschiedlichen Methoden steht für diese Zwecke zur Verfügung, um Hefen auf-

1 Einleitung

8

grund von phänotypischen oder genotypischen Merkmalen zu detektieren und/oder zu identi-

fizieren.

1.2.1 Kultivierungsabhängiger Nachweis

Klassische, mikrobiologische Methoden zum Nachweis von Hefen basieren auf der Kultivie-

rung und Anreicherung von Hefen mit festen oder flüssigen Nährmedien, nachdem von der

Ursprungsprobe eine geeignete Verdünnungsreihe hergestellt wurde. Zur Verdünnung, die

üblicherweise dekadisch im 1:10 Verhältnis vorgenommen wird, werden Medien wie Pep-

tonwasser (0,1 %), Salzlösungen (0,85 %), Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0) oder Mischungen

dieser Komponenten verwendet. Die Kultivierung erfolgt normalerweise bei Temperaturen

zwischen 25 und 28 °C für 5 Tage, kann jedoch bei langsam wachsenden Arten (Z. bailii,

D./B. bruxellensis) auch bis zu 14 Tage in Anspruch nehmen (Deák 1991, Millet und Lon-

vaud-Funel 2000, Rodrigues et al. 2001).

Eine große Anzahl an unterschiedlichen, komplexen, nährstoffreichen und unselektiven Me-

dien wird verwendet, die Zucker als Energiequelle (z. B. Glucose, Fructose, Sucrose), ver-

daute Proteine als Stickstoffquelle (z. B. Pepton, Trypton, Casein) und komplexe Zusätze

(z. B. Hefeextrakt, Malzextrakt) enthalten (Loureiro und Malfeito-Ferreira 2003). Im Idealfall

sollten die Medien den Nährstoffansprüchen möglichst aller relevanten Hefen genügen, das

Wachstum von geschädigten Hefen unterstützen, Bakterienwachstum unterdrücken und ein

Überwachsen von Schimmelpilzen vermeiden (Fleet 1992). Oft ist jedoch auch nur der sum-

marische Nachweis von Hefen und Schimmelpilzen erforderlich (Anonymus 1987, Deák

2003). Einige der wichtigsten Universalmedien sind der Glucose-Hefeextrakt Agar (GYE),

der Plate-Count Agar (PCA), der Trypton-Glucose-Hefeextrakt Agar (TGYA), der Kartoffel-

Dextrose Agar (PDA), der Malzextrakt Agar (MEA) der Hefeextrakt-Malzextrakt Agar (YMA

oder MYGPA), der Hefeextrakt-Pepton-Glucose Agar (YPGA) und der Sabouraud-Dextrose

Agar (SDA).

Das Bakterienwachstum wird entweder durch den Zusatz von Antibiotika (z. B. Oxytetracyc-

lin, Chlortetracyclin, Chloramphenicol, Gentamycin oder Streptomycin) oder durch Absen-

kung des pH Wertes auf 3,5 unterdrückt, wobei die Verwendung von Antibiotika bevorzugt

wird, da die Wiederfindungsrate höher ist (Beuchat 1979, Cava und Hernandez 1994). Hefe-

extrakt-Glucose-Chloramphenicol Agar (YGCA) wird als ISO-Standardmedium empfohlen

(Anonymus 1987). Falls das Wachstum von Schimmelpilzen, die eine Agarplatte komplett

überwachsen können, problematisch ist, werden Zusätze wie z. B. Bengalrot, Dichloran und

Natrium- oder Kaliumpropionat zu dem Medium gegeben (Henson 1981, King et al. 1979).

Dichloran-Bengalrot-Chloramphenicol Agar (DRBC) ist ein oft verwendetes Medium, das

sowohl Bakterien als auch Schimmelpilze inhibiert. Beim Einsatz dieser Medien ist zu be-

1 Einleitung

9

rücksichtigen, dass deren Zusammensetzung auch das Wachstum von Hefen negativ beein-

flussen kann (Banks und Board 1987, Chilvers et al. 1999).

Neben den Universalmedien werden selektive Medien eingesetzt, die auf die Ansprüche ei-

nes Industriezweiges (z. B. Brauereien, Winzereien) oder der nachzuweisenden Hefearten

(z. B. D. bruxellensis) abgestimmt sind. In Brauereien werden selektive Medien verwendet,

um Fremdhefen in sämtlichen Bereichen des Produktionsprozesses nachweisen zu können.

Ein Nachweis muss hier teilweise so selektiv sein, dass nicht nur Fremdhefen der Gattungen

Brettanomyces, Candida, Debaryomyces, Pichia, Torulaspora oder Zygosaccharomyces,

sondern auch als Fremdhefen eingeordnete S. cerevisiae Varietäten, die sich von der Brau-

hefe nur in wenigen Eigenschaften unterscheiden, nachzuweisen sind (Back 1987). Außer-

dem muss der Nachweis nicht nur selektiv, sondern auch sehr sensitiv sein, wenn sehr ge-

ringe Zellzahlen einer Fremdhefe in der Anstellhefe detektiert werden müssen. Eine Reihe

von selektiven Medien wurde entwickelt, da kein einzelnes Medium für den Nachweis aller

Kontaminationen geeignet ist. Die Selektivität wird dabei durch Zugabe von für S. cerevisiae

inhibierenden Substanzen (Kupfersulfat, Cycloheximid, Fuchsinsulfit), von Nährstoffen, die

von S. cerevisiae nicht verwertet werden (Lysin, Nitrat, Xylose, Dextrin), durch Farbstoffe

(Kristallviolett, Bromkresolgrün), durch Inkubation bei 37 °C oder durch eine Kombination

dieser Bedingungen erreicht. (Deák 1991, Back 1994).

Für osmotolerante Hefen wie z. B. Z. rouxii werden Verdünnungslösungen und Medien mit

hohen, prozentualen Anteilen an Glucose, Glycerol oder Sucrose verwendet, die eine ver-

minderte Wasseraktivität aufweisen und die Zellen vor einem osmotischen Schock bewahren

(Beuchat und Hocking 1990). Medien wie z. B. Dichloran-18 % Glycerol Agar (DG18), Malz-

extrakt-Hefeextrakt Agar mit 30 % Glucose (MY30G), Plate-Count Agar mit 52 % Sucrose

oder Trypton-Hefeextrakt Agar mit 10 % Glucose (TY10G) können in Kombination mit Ver-

dünnungslösungen wie z. B. 40 % Glucose oder 30 % Glycerol verwendet werden, um os-

motolerante Hefen in konzentrierten Produkten (z. B. Saftkonzentrate) nachzuweisen (And-

rews et al. 1997, Beuchat et al. 1998, Hocking und Pitt 1980). Ein weiterer in diesem Bereich

eingesetzter Agar ist der Orangenfruchtsaftagar (Back 1999).

Hefen wie z. B. Zygosaccharomyces bailii, Pichia membranaefaciens und Schizosaccharo-

myces pombe, die Resistenzen gegen Säuren und Konservierungsmittel aufweisen, können

mit angesäuerten Universalmedien wie MEA oder TGYA selektiv nachgewiesen werden (Ho-

cking 1996).

Als Techniken kommen sowohl das Plattengussverfahren als auch das Oberflächenverfah-

ren mit Spatel oder Spiralplater zum Einsatz. Vergleiche der beiden Techniken zeigten, dass

das Oberflächenverfahren zu höheren Zellzahlen führt, da beim Plattengussverfahren höhere

Temperaturen (ca. 45 °C) eingesetzt werden, die zu einem Hitzestress bei Hefen führen kön-

1 Einleitung

10

nen (Deák 2003). Die Sensitivität des Oberflächenverfahrens ist dagegen durch das geringe-

re, einsetzbare Probenvolumen von normalerweise 0,1 ml gegenüber dem beim Platten-

gussverfahren eingesetzten 1,0 ml vermindert. Wenn die initiale Zellzahl sehr klein ist, kön-

nen demnach Hefen bei Anwendung des Oberflächenverfahrens unentdeckt bleiben (Deák

1991). Dies kann besonders bei Hefen wie z. B. Z. bailii problematisch sein, die schon bei

sehr geringen Zellzahlen Produkte schädigen können. Schon das Inokulum von einer Zelle

Z. bailii kann eine Dose mit karbonathaltigem Soft-Drink verderben (Pitt und Hocking 1997,

Davenport 1996). Solche geringen Inokula können entweder durch Anwendung von Memb-

ranfiltern mit einem Porendurchmesser von 0,45 µm oder durch Voranreicherung in geeigne-

ten, flüssigen Nährmedien vor dem Gebrauch von festen Nährmedien detektiert werden (Pitt

und Hocking 1997).

Eine weitere klassische, kultivierungsabhängige Methode ist die „most probable number“

(MPN) Technik, die in Kombination mit selektiven Medien zur Bestimmung von Hefearten

eingesetzt werden kann, die nur einen geringen prozentualen Anteil an einer Gesamtpopula-

tion haben (Rodrigues et al. 2001).

Die routinemäßige Detektion und Quantifizierung von Hefen über Koloniebildende Einheiten

(KBE) ist einfach, günstig und allgemein akzeptiert. Nachteile der kultivierungsabhängigen

Methoden sind jedoch in dem hohen Arbeitsaufwand, der geringen Reproduzierbarkeit und

der langsamen Datengenerierung, die mindestens drei bis fünf Tage Kultivierung benötigt, zu

sehen. Die erhaltenen Daten sind demnach für eine Qualitäts- und Prozesskontrolle nur ein-

geschränkt verwendbar (Deák 1995). Mit weiterentwickelten Methoden wie dem ISO-GRID®

Membranfiltrationssystem, das die Membranfiltration mit der MPN Technik verbindet, lässt

sich die benötigte Zeit bis zum Ergebnis auf zwei Tage reduzieren (Entis und Lerner 1996).

Auch die Anwendung von Petrifilm® YM Platten [3M Microbiology] oder SimPlate® YM Platten

[Biocontrol Systems] liefert in kürzerer Zeit vergleichbare Ergebnisse wie die Verwendung

konventioneller Nährmedien (Beuchat et al. 1990 und 1991, Ferrati et al. 2005, Vlaemynck

1994).

1.2.2 Mikroskopie, Durchflusszytometrie und Immunoa ssay

Neben den kultivierungsabhängigen Methoden wird seit langem die Mikroskopie zur direkten

Quantifizierung von Hefen verwendet, wobei in Kombination mit einer Anfärbung mit Methy-

lenblau eine Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen möglich ist (Back 1994,

Smart et al. 1999). Die Lebensfähigkeit von Hefezellen lässt sich auch sehr präzise mit Me-

thoden der Epifluoreszenzmikroskopie, die auf der Anfärbung mit Fluoreszenzfarbstoffen wie

z. B. Acridinorange beruhen, ermitteln (Back 1994, Betts et al. 1989). In Kombination mit der

Membranfiltration ist diese als „direct epifluorescent filter technique“ (DEFT) bekannte Me-

1 Einleitung

11

thode sehr effizient bei der Detektion von Hefen in Bier, Wein oder karbonathaltigen Geträn-

ken (Hope und Tubb 1985, Rodrigues und Kroll 1986). Ein Nachteil der mikroskopischen

Techniken stellt die eingeschränkte Sensitivität dar, die bei der DEFT bei 103 Zellen/ml liegt,

jedoch bei filtrierbaren Proben wie Bier und Wein durch Filtration von größeren Volumina

leicht zu erreichen ist. Eine Automatisierung ist durch die Kopplung mit einem Bildauswer-

tungssystem möglich (Pettipher et al. 1992). Die Fluoreszenz In Situ Hybridisierung, die e-

benfalls auf der Detektion durch Epifluoreszenzmikroskopie beruht, wurde zum Nachweis

von D. bruxellensis (anamorph: B. bruxellensis) angewendet (Stender et al. 2001). Der Test

beruht auf fluorescein-markierten „peptide nucleic acid“ Sonden, die mit einem artspezifi-

schen Sequenzbereich der 26 S rRNA hybridisieren.

Die Durchflusszytometrie ist eine effektive Methode zur schnellen Zellzahlbestimmung (15

bis 30 min) von Hefen in Bier (Jespersen et al. 1993). Eine Differenzierung zwischen Hefen,

Pilzen und Bakterien ist möglich und in Kombination mit Fluoreszenzsonden können Aussa-

gen über die Lebensfähigkeit der Zellen gemacht werden (Deere et al. 1998, Millard et al.

1997).

Eine weitere Möglichkeit, um z. B. Fremdhefen in obergäriger Anstellhefe zu detektieren,

bietet die Immunofluoreszenzmethode, bei der fluoreszenzmarkierte Antikörper spezifisch an

Antigene auf der Oberflächen von Hefen binden und mit der Epifluoreszenzmikroskopie

nachweisbar sind (Campbell 2002). Eine Differenzierung zwischen lebenden und toten Zel-

len ist jedoch mit dieser Methode nicht möglich. Einige weitere Immunoassays zur Detektion

von Hefearten sind beschrieben worden, die mit polyklonalen Antikörpern extrazelluläre Po-

lysaccharide (EPS) oder lebende Hefezellen mit der ELISA (enzyme linked immunosorbant

assay) Technik nachweisen (García et al. 2004, Marcilla et al. 1999, Middelhoven und No-

termans 1988 und 1993, Yoshida et al. 1991). Der Nachweis über EPS war jedoch nicht

spezifisch genug und die Produktion der EPS zu sehr von den jeweiligen Wachstumsbedin-

gungen abhängig, um für eine Anwendung in der Lebensmittelindustrie geeignet zu sein

(Middelhoven und Notermans 1988 und 1993). Mit polyklonalen Antikörpern, die gegen le-

bende Zellen gerichtet waren, wurden höchstens 104 bis 105 KBE/ml in Orangensaft oder

Milch nachgewiesen (García et al. 2004, Yoshida et al. 1991). Die Spezifität der Systeme

war immer eingeschränkt auf einige wenige, für das jeweilige Lebensmittel relevante Arten,

die nicht alle gleich sensitiv nachzuweisen waren. Ein weiteres ELISA-System wurde für den

Nachweis von Brettanomyces-Kontaminationen in Wein beschrieben (Kuniyuki et al. 1984).

1 Einleitung

12

1.2.3 Elektrometrische Methoden und ATP-Messung

Mikroorganismen verändern durch ihr Wachstum die elektrischen Eigenschaften (Kapazität,

Leitfähigkeit und Impedanz) ihrer Umgebung. Diese Veränderungen können elektronisch

gemessen werden und die Detektionszeit, als die Zeit bis diese Veränderung messbar wird,

ist direkt proportional zu der mikrobiellen Ausgangspopulation (Fleet 1992, Deák und Beu-

chat 1994). Wenn diese Methode gegen eine konventionelle, kultivierungsabhängige Metho-

de kalibriert wurde, kann sie zur Bestimmung der Zellzahl genutzt werden (Deák 1995). Ver-

glichen mit der Ermittlung der KBE verringert sich mit dieser Methode, die auch leichter zu

automatisieren ist, der Zeitaufwand auf 10 bis 30 % (Deák 1995). Die Entwicklung von selek-

tiven Medien, die das Wachstum von Bakterien unterdrücken und den Probenmatrices ange-

passt wurden, ermöglicht den Nachweis von 102 bis 103 Hefezellen/ml nach 12 bis 24 Stun-

den (Connolly et al. 1988, Schaertel et al. 1987, Watson-Craik et al. 1990, Zindulus 1984).

Durch die indirekte Messung der Leitfähigkeit, bei der die produzierte CO2-Menge nach Ab-

sorption in einer alkalischen Lösung gemessen wird, kann die Methode unabhängig vom

Wachstumsmedium eingesetzt werden (Deák und Beuchat 1994). Zur Anwendung kam die

Impedanz Methode bereits zur Überwachung von unterschiedlichen Probenmatrices wie O-

rangensaftkonzentrat (Weihe et al. 1984), Wein (Henschke und Thomas 1988) und Bier (E-

vans 1982).

Die ATP-Messung über Biolumineszenz ist eine schnelle und sensitive Methode, da unter

optimalen Bedingungen 10 Zellen/ml innerhalb von 5 Minuten nachweisbar sind (Fleet 1992).

Besonders für Bereiche der Getränkeindustrie wie die Herstellung von Bier und karbonathal-

tigen Getränken ist die Methode als Summenparameter zur Überwachung geeignet (Hope

und Tubb 1985, Hysert et al. 1976, La Rocco et al. 1985, Miller und Galston 1989). Wenn die

Filtration von Endprodukten (z. B. Bier) über Membranfilter möglich ist, kann die Sensitivität

noch in den Bereich von einigen Zellen pro Liter verbessert werden (Takahashi et al. 2000).

Eine Differenzierung zwischen Bakterien, Hefen und Pilzen ist mit dieser Methode jedoch

nicht möglich, da alle lebenden Mikroorganismen ATP enthalten. Auch können falsch-

positive Ergebnisse durch die benutzten Filter, Medien und das Endprodukt auftreten. Daher

hat diese Methode in der Lebensmittelindustrie den Stellenwert einer universellen Hygiene-

überwachung z. B. bei der Überprüfung der Reinigungseffektivität und der Sterilitätskontrolle

von Lebensmitteln (Fleet 1992, Hawronskyj und Holah 1997, Krämer 1997).

1 Einleitung

13

1.2.4 Phänotypische Identifizierung

Methoden zur Identifizierung können in der Praxis nicht nur angewendet werden, um zwi-

schen Hefearten zu differenzieren und die relevante Spezies, die für den Verderb verantwort-

lich ist, zu erkennen, sondern auch, um den Ausgangspunkt für den Verderb in einer Produk-

tionslinie auszumachen (van der Vossen und Hofstra 1996). Typischerweise benötigt man

zur Identifizierung von Reinkulturen über phänotypische Merkmale 50 bis 100 Tests, um ge-

nügend morphologische, physiologische und biochemische Charakteristika zur sicheren,

taxonomischen Einordnung zu erhalten. Diese Prozedur ist arbeitsintensiv, zeitaufwendig,

benötigt ein besonderes Maß an Erfahrung und kann aufgrund der Instabilität von physiolo-

gischen Merkmalen, zu unklaren Ergebnissen führen (Deák 1995, Scheda und Yarrow

1966). Einige kommerziell erhältliche Hefeidentifizierungssysteme (wie z. B. API 20C, API ID

32C [BioMerieux] oder Biolog MicroLog YT Station [Biolog]) können diesen Aufwand mini-

mieren, sind allerdings für den Bereich der Getränkeindustrie nur begrenzt einsetzbar (Török

und King 1991). Die Saccharomyces sensu stricto Gruppe lässt sich z. B. nicht differenzieren

oder Z. bailii von Z. bisporus unterscheiden (Baleiras Couto et al. 1996b).

1.2.5 Konventionelle, PCR-basierte Methoden

Die Bemühungen, die Genauigkeit und Zuverlässigkeit von Nachweisen und Identifizierun-

gen zu erhöhen, führten in den letzten Jahren in zunehmendem Maße zur Nutzung genotypi-

scher Differenzierungsmerkmale. Die Fortschritte in der Molekularbiologie haben dies durch

die Entwicklung einer großen Anzahl an DNA- und RNA-basierten Methoden für die Identifi-

zierung und Charakterisierung ermöglicht. Unterschiede der genomischen DNA, der rRNA

oder der Mitochondrien-DNA von Hefen können mit Hilfe der DNA-DNA Hybridisierung (Tö-

rök et al. 1993, Vaughan Martini und Martini 1987b), der Dot Blot Hybridisierung mit Oligo-

nucleotid-Sonden (Kosse et al. 1997), der Restriktionsenzym Analyse, der Puls-Feld-

Gelelektrophorese (Vezinhet et al. 1990, Guillamón et al. 1996), des Restriktionsfragment-

Längenpolymorphismus (RFLP) (Belloch et al. 1997, Guillamón et al. 1994, 1997, Versavaud

und Hallet 1995), des DNA-Fingerprinting und der DNA-Sequenzierung (Kurtzman und Rob-

nett 1998) bestimmt werden. Für die Anwendbarkeit in der Routine der Lebensmittelindustrie

sind diese Methoden jedoch zu arbeitsaufwändig und zeitintensiv (van Vossen und Hofstra

1996).

Eine Weiterentwicklung bei den molekularbiologischen Methoden in Bezug auf Zeit- und Ar-

beitsaufwand konnte durch die Einbeziehung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die von

Kary Mullis 1983 erdacht und von Saiki et al. (1985) zuerst angewandt wurde, erzielt werden.

Bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird ein spezifisches DNA-Fragment über einen

1 Einleitung

14

enzymatischen Prozess, der von einem Temperaturzyklus abhängig ist, amplifiziert. Dabei

wird die DNA zunächst in einem ersten Schritt (Denaturierungsschritt) bei hoher Temperatur

(z. B. 95 °C) denaturiert, sodass zwei spezifische Oligonucleotide als Primer mit den kom-

plementären Strängen hybridisieren können. Diese Oligonucleotide sind so angeordnet, dass

sie das zu amplifizierende DNA-Fragment einschließen. Damit die Hybridisierung (Annea-

lingschritt) stattfindet, wird die Temperatur in einem zweiten Schritt auf die so genannte An-

nealingtemperatur abgesengt, die unterhalb der Schmelztemperatur der Oligonucleotide

liegt. Abschließend verlängert eine thermostabile DNA-Polymerase, nachdem die optimale

Temperatur für dieses Enzym eingestellt wurde, die Oligonucleotide (Elongationsschritt). Als

Resultat wird die DNA zwischen den beiden Oligonucleotiden verdoppelt. Wird das dreistufi-

ge Temperaturprofil mehrere Male wiederholt, kann das DNA-Fragment zwischen den Oligo-

nucleotiden exponentiell amplifiziert werden (Saiki et al. 1988). Im Gegensatz zu konventio-

nellen Methoden können hiermit Proben direkt getestet werden, ohne dass eine Kultivierung

nötig ist. Außerdem sind PCR-Methoden schnell, sehr spezifisch und können zum Nachweis

von sehr geringen DNA-Mengen verwendet werden (Atkins und Clark 2004, van der Vossen

und Hofstra 1996). Die einzelnen PCR-abhängigen Methoden zum Nachweis und zur Identi-

fizierung von Hefen unterscheiden sich in der Spezifität der Primer, der Stringenz der PCR-

Bedingungen, der weiteren Behandlung der Amplifikate und der Detektionsmethode für die

Amplifikate.

Die DNA-Zielregion, die neben taxonomischen Untersuchungen auch zur Entwicklung von

Nachweis- und Identifizierungssystemen für Hefen am häufigsten eingesetzt wird, ist das in

allen Hefen in hoher Kopienzahl vorhandene, ribosomale Gen-Cluster, das aus den Genen

für die 26 S, 18 S, 5,8 S rRNA und teilweise auch 5 S rRNA und deren ITS- (internal transc-

ribed spacer 1 und 2) Regionen besteht (Kurtzman 1994, White et al. 1990). Diese Region

weist sowohl hoch konservierte als auch hoch variable Bereiche auf, sodass unterschiedlich

spezifische PCR-Primer abgeleitet werden können. Die Amplifikation und anschließende

Sequenzierung der D1/D2 Region der 26 S rDNA mit universalen Primern scheint, eine zu-

verlässige Methode zur Arttypisierung von Hefen der Unterabteilung Ascomycota zu sein

(Kurtzman und Robnett 1998). Die Mehrheit der Hefen der Unterabteilung Basidiomycota

lässt sich ebenfalls über die Sequenz der D1/D2 Region identifizieren und die Variabilität der

ITS1- oder der ITS2-Region scheint, zur Differenzierung zwischen phylogenetisch nah ver-

wandten Arten geeignet zu sein (Fell et al. 2000, Scorzetti et al. 2002). Klinisch relevante

Hefen konnten allein aufgrund der Längenpolymorphismen der gebildeten PCR-Produkte der

ITS1- und ITS2-Regionen identifiziert werden (Chen et al. 2001, Turenne et al. 1999).

Auch wenn die Mehrzahl der PCR-Systeme besonders im klinischen Bereich die ribosoma-

len Gene als Target nutzt, wurden auch gattungs-, art- und stammspezifische Systeme für

1 Einleitung

15

andere Zielregionen entwickelt. Ein Beispiel für eine gattungsspezifische PCR ist das System

von Yamagishi et al. (1999), bei dem das FLO1 Gen nur bei Arten der Gattung Saccharomy-

ces vervielfältigt wird. Der stammspezifische Nachweis von Saccharomyces cerevisiae var.

diastaticus war mit den STA1-3 Genen als Targetregion möglich (Yamauchi et al. 1998).

Falls mit einem einzelnen Primerpaar keine ausreichende Spezifität erreicht wird, kann der

Einsatz einer Nested-PCR sinnvoll sein, die auch sensitiver ist (Atkins und Clark 2004). Bei

dieser Methode wird nach der ersten PCR mit dem dabei erhaltenen Fragment als Target

eine zweite PCR durchgeführt. Bei dieser zweiten PCR wird ein Primerpaar verwendet, das

komplementär zu einer innerhalb des ersten Produktes liegenden Sequenz ist. Ibeas et al.

(1996) konnten eine Nested-PCR zur Detektion von Dekkera sp. in Sherry entwickeln. Ver-

schiedene PCR-Systeme können zu einer so genannten Multiplex-PCR kombiniert werden,

um in einer Probe das Vorhandensein von unterschiedlichen Arten simultan zu prüfen. Eine

Differenzierung zwischen S. cerevisiae, S. bayanus und deren Hybriden, die wichtig im Be-

reich der Wein- und Bierherstellung sein kann, war durch eine Multiplex-PCR ebenso mög-

lich (Torriani et al. 2004) wie die Unterscheidung zwischen S. cerevisiae, Z. bailii und Z. rou-

xii (Pearson und McKee 1992).

Weitere Möglichkeiten, ohne Sequenzierung Polymorphismen im Genotyp aufzudecken, bie-

ten die RAPD-PCR (random amplified polymorphic DNA-PCR) und das PCR-Fingerprinting.

Die RAPD-PCR beruht auf der Nutzung von kurzen Primern aus 5 bis 15 Nucleotiden, mit

willkürlichen Sequenzen, die bei niedrigen Annealingtemperaturen (z. B. 36 °C) angewendet

werden und mit zufällig im Genom verteilten, homologen Sequenzen hybridisieren. Balairas

Couto et al. (1995) konnten mit der Methode zwischen einigen für Verderbnis relevanten

Hefearten wie z. B. Z. bailii, Z. rouxii und S. cerevisiae differenzieren und Xufre et al. (2000)

konnten sie zur Differenzierung von Saccharomyces sp. in einer Winzerei anwenden. Das

PCR-Fingerprinting ist im Hinblick auf die Reproduzierbarkeit robuster als die RAPD-PCR,

da höhere Annealingtemperaturen verwendet werden (van der Vossen und Hofstra 1996).

Diese Methode konnte unter Verwendung von Mikrosatelliten-Primern wie z. B. (GTG)5,

(GAC)5, (GACA)4, der M13 Sequenz (GAGGGTGGCGGTTCT) und anderen sich wiederho-

lenden DNA-Sequenzen zur Identifizierung von Hefen bis zur Spezies- oder Subspeziesebe-

ne verwendet werden (Baleiras Couto et al. 1996a,b, de Barros Lopes et al. 1998, Hierro et

al. 2004, Lavallee et al. 1994, Lieckfieldt et al. 1993, Meyer et al. 1993).

Bei der Kombination aus PCR und RFLP werden die PCR-Produkte mit Restriktionsendo-

nucleasen geschnitten, um ein charakteristisches Restriktionsmuster zu erhalten. Diese Me-

thode wurde besonders auf rDNA und deren ITS-Regionen angewendet, um Differenzierun-

gen auf Subspezies oder Stammebene zu ermöglichen (Baleiras Couto et al. 1995, Molina et

al. 1993, Niesters et al. 1993, Vilgalys und Hester 1990). Mit einer PCR-RFLP, die die Regi-

1 Einleitung

16

on zwischen den 5 S und 26 S rRNA Genen als Target hatte, war eine Differenzierung zwi-

schen Brauereihefen und Fremdhefen sogar zu sehr nah verwandten Stämmen wie S. cere-

visiae var. diastaticus möglich (Yamagishi et al. 1999).

Eine weitere DNA-Fingerprinting Methode ist die AFLP- („amplified fragment length poly-

morphism“) Technik, bei der Restriktionsfragmente der gesamten, genomischen DNA nach

einem Ligationsschritt selektiv mit Primern amplifiziert werden, die am 3´-Ende spezifisch für

die Restriktionsschnittstelle sind (Vos et al. 1995). Diese Methode konnte erfolgreich zur Un-

terscheidung von Hefestämmen und zur Artidentifizierung von Hefeisolaten eingesetzt wer-

den (de Barros Lopes et al. 1999, Perpète et al. 2001).

Eine PCR-Technik, die potentiell zum Nachweis und zur Differenzierung zwischen lebenden

und toten Zellen geeignet ist, ist die Umkehrtranskriptions-PCR oder Reverse Transkriptase-

PCR (RT-PCR). Das Targetmolekül ist hierbei mRNA, die in einem ersten Schritt mit einer

Reverse Transkriptase (RTase) in DNA umgeschrieben und in einem zweiten Schritt durch

eine PCR amplifiziert wird. Die Differenzierung zwischen lebensfähigen, lebensfähigen aber

nicht kultivierbaren („viable but nonculturable“, VBNC) und toten Zellen erfolgt unter der An-

nahme, dass die Halbwertszeit der mRNA sehr kurz ist und daher nach dem Tod einer Zelle

sehr schnell nicht mehr nachzuweisen ist (Sheridan et al. 1998). Von Vaitilingom et al. 1998

wurde eine RT-PCR zur Detektion von lebensfähigen Bakterien, Schimmelpilzen und Hefen

in pasteurisierter Milch mit Primern entwickelt, die spezifisch für Gene der Elongationsfakto-

ren EF-Tu und EF-1α sind.

Bei allen bisher erwähnten PCR-Methoden erfolgt nach der Amplifikation eine elektrophoreti-

sche Auftrennung der Amplifikate der Länge nach in Agarose- oder Polyacrylamidgelen. Der

Nachweis der Amplifikate kann dann in einem letzten Schritt mit unterschiedlichen Methoden

detektiert werden, wobei hier nur die Möglichkeiten der Bindung von unspezifischen Fluores-

zenzfarbstoffen (z. B. Ethidiumbromid), die Markierung der in der PCR eingesetzten Oligo-

nucleotide mit radioaktiven/fluoreszierenden Nucleotiden oder die Hybridisierung der Amplifi-

kate mit radioaktiven/fluoreszierenden Oligonucleotiden (Southern Blot) genannt werden

sollen. Auch der colorimetrische Nachweis von PCR-Produkten der ITS-Regionen von hefe-

artigen Pilzen über Enzym-Immunoassays wurde erfolgreich zur Identifizierung verwendet

(Lindsley et al. 2001).

1 Einleitung

17

1.2.6 Real-Time PCR-Methoden

Trotz der wesentlichen Erleichterungen in der täglichen Laborarbeit, die die verhältnismäßig

leicht zu automatisierende Methode der PCR mit sich gebracht hat, bedeutet der sensitive,

reproduzierbare und spezifische Nachweis der PCR-Produkte noch immer einen hohen Zeit-

und Arbeitsaufwand. Um das Automatisierungsniveau der PCR zu erhöhen und nicht nur

qualitative sondern auch quantitative Aussagen zu ermöglichen, wurde ein so genanntes

homogenes Assay entwickelt, bei dem die Amplifikation und der Nachweis des PCR-

Produktes simultan in einem Reaktionsgefäß möglich ist. Dies gelang erstmals 1993 durch

die Weiterentwicklung des 1991 von Holland et al. beschriebenen 5´-Nuclease PCR-Assays

unter Ausnutzung der 5´-Exonukleaseaktivität der Taq DNA-Polymerase und Einbeziehung

von fluorogenen Sonden zur Detektion der Amplifikation (Lee et al. 1993). Die fluorogenen

Sonden dieses so genannten TaqMan™ PCR-Systems sind am 5´-Ende mit einem fluores-

zierenden Reporter-Farbstoff und am 3´-Ende mit einem Quencher-Farbstoff markiert. Der

Quencher-Farbstoff nimmt zunächst über einen Fluoreszenz- (oder Förster-) Resonanz-

Energie-Transfer (FRET) die Absorptionsenergie des Reporter-Farbstoffs auf und unter-

drückt damit dessen Fluoreszenz. Während der PCR hybridisiert die Sonde zusammen mit

den Primern an den Amplifikaten und in der Extensionsphase wird die Sonde durch die 5´-3´-

Exonuklease Aktivität der Taq DNA-Polymerase hydrolysiert. Dadurch werden die räumliche

Nähe und damit auch der FRET zwischen Reporter und Quencher unterbrochen. Entspre-

chend der Akkumulation von PCR-Produkten steigt die Fluoreszenz durch freie Reportermo-

leküle mit jedem PCR-Zyklus an und kann mit einem geeigneten Detektionssystem während

der Amplifikation gemessen werden.

Neben dem TaqMan™-System existieren eine Reihe von weiteren Varianten der so genann-

ten Real-Time PCR wie das Molecular-Beacons-System, das Scorpions™-System und das

Hybridisierungssonden-System, die alle auf unterschiedliche Weise den FRET zwischen

Fluoreszenzfarbstoffen ausnutzen, die sich in ihren Spektren überlagern (Caplin et al. 1999,

Tyagi und Kramer 1996, Whitcombe et al. 1999). Für das Nachweissystem mit Hybridisie-

rungssonden sind zwei fluoreszenzmarkierte Sonden notwendig, die zusammen mit den

Primern an die Amplifikate hybridisieren und dadurch in räumliche Nähe gebracht werden.

Nach Anregung des so genannten Donator-Farbstoffes der einen Sonde mit Licht einer be-

stimmten Wellenlänge kann diese Energie über einen FRET auf den Reporter-Farbstoff der

anderen Sonde übertragen werden. Der Repoter-Farbstoff emittiert dann die übertragene

Energie als Licht einer bestimmten Wellenlänge, die zur Online-Verfolgung der Amplifikation

gemessen wird.

Eine sequenzunabhängige Detektion von Amplifikaten ist mit Fluoreszenzfarbstoffen wie

SYBR®-Green I möglich, die unspezifisch besonders bei doppelsträngiger DNA zwischen

1 Einleitung

18

benachbarten Basen eines Strangs interkalieren. In diesem Zustand absorbieren diese Farb-

stoffe Licht einer bestimmten Wellenlänge und strahlen diese aufgenommene Energie wieder

als Licht mit einer längeren Wellenlänge ab. Für die praktische Anwendung in der Getränke-

industrie wurden bereits zwei artspezifische, quantitative Real-Time PCR-Systeme im

SYBR®-Green-Format für die Hefeart Dekkera/Brettanomyces bruxellensis entwickelt (Dela-

herche et al. 2004, Phister und Mills 2003).

1.3 Ziele der Arbeit

In dieser Arbeit sollten Real-Time PCR Nachweissysteme auf Basis der LightCycler® Tech-

nologie entwickelt werden, die für eine Anwendung in der Qualitätskontrolle und Qualitätssi-

cherung der Getränkeindustrie geeignet sind. Ein System sollte die obligat bierschädliche

Hefe Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus spezifisch und sensitiv in unterschiedlichen

Probenmatrices wie der Anstellhefe, dem Jungbier und dem Endprodukt nachweisen. Für die

Sterilitätskontrolle und die betriebliche Hygieneüberwachung sollte eine weitere Real-Time

Consensus-PCR für alle getränkerelevanten Hefen entwickelt werden.

Zunächst sollten spezifische Genregionen gesucht und falls notwendig Sequenzinformatio-

nen für diese Regionen neu generiert werden. In einem weiteren Schritt sollten von den Se-

quenzen und Sequenzalignments spezifische Oligonucleotide wie Primer und Sonden abge-

leitet werden. Die Spezifität der Systeme sollte sowohl mit einer möglichst großen Anzahl an

Targetorganismen als auch mit Mikroorganismen, die als Begleitflora eine Rolle spielen kön-

nen, getestet werden. Für die praktische Anwendung der Real-Time PCR-Systeme sollte

außerdem die Konstruktion und Implementierung von internen Amplifikationskontrollen erfol-

gen, um negative Ergebnisse aufgrund von Inhibitionen der PCR erkennen zu können. Die

kompletten Real-Time PCR-Systeme in Kombination mit geeigneten Probenaufarbeitungs-

methoden sollten abschließend mit möglichst praxisnahen Proben auf ihre Sensitivität getes-

tet werden. Damit wären schnelle, selektive und sensitive Werkzeuge für die mikrobiologi-

sche Kontrolle von Getränken verfügbar.

2 Material und Methoden

19


2.1 Mikroorganismen

Zusätzlich zu den in der Tabelle 2.1 aufgeführten und taxonomisch bestimmten Hefestäm-men wurden nicht näher bestimmte Fremdhefen von den Brauereien A (12 Isolate), B (8 Iso-late) und D (34 Isolate) bezogen und ebenfalls in den Spezifitäts- und Sensitivitätstests ein-gesetzt. Tab. 2.1: Hefestämme

Spezies Stamm/Herkunft Spezies Stamm/Herkunft Bullera dendrophila DSM 70745 Pichia membranaefaciens Brauerei F Candida albicans ATCC 10231 Pichia methanolica DSM 2147 Candida boidinii DSM 70024 Pichia minuta DSM 70718 Candida boidinii DSM 70033 Pichia ohmeri BCD 862 Candida boidinii DSM 70034 Pichia pini DSM 70385 Candida boidinii Brauerei F Pichia trehalophila DSM 70391 Candida cariosilignicola DSM 2148 Pichia stripitis CBS 5773 Candida catenulata DSM 70136 Rhodotorula sp. ATCC 20254 Candida chilensis ATCC 22076 Rhodotorula glutinis BCD 3530 Candida diddensiae DSM 70042 Rhodotorula minuta DSM 70408 Candida ernobii DSM 70858 Rhodotorula rubra BCD 4081 Candida ethanolica Brauerei F Saccharomyces bayanus BCD 1256 Candida freyschussii DSM 70047 Saccharomyces bayanus BCD 1392 Candida friedrichii DSM 70050 Saccharomyces bayanus DSM 70412 Candida fructus CBS 6381 Saccharomyces bayanus Brauerei F Candida glabrata BCD 8932 Saccharomyces cerevisiae DSM 1333 Candida glaebosa CBS 5691 Saccharomyces cerevisiae DSM 70416 Candida haemulonii DSM 70624 S. carlsbergensis BCD 728 Candida inconspicua MUCL 27868 (=S. pastorianus) Candida intermedia BCD 685 Saccharomyces cerevisiae ATCC 44075 Candida krusei BCD 689 Saccharomyces cerevisiae CBS 6503 Candida magnoliae DSM 70638 Saccharomyces cerevisiae ATCC 42296 Candida maltosa BCD 806 S. cerevisiae var. diastaticus BCD 1257 Candida multigemmis DSM 70862 S. cerevisiae var. diastaticus BCD 1432 Candida norvegica DSM 70863 S. cerevisiae var. diastaticus BCD 1433 Candida palmae Brauerei F S. cerevisiae var. diastaticus BCD 1499 Candida parapsilosis ATCC 20384 S. cerevisiae var. diastaticus BCD 1501 Candida parapsilosis Brauerei F S. carlsbergensis BCD 2573 Candida pseudointermedia Brauerei F (=S. pastorianus) Candida quercitrusa Brauerei F S. carlsbergensis BCD 2574 Candida rhagii CBS 4237 (=S. pastorianus) Candida rugosa BCD 814 S. carlsbergensis BCD 2581 Candida sake CBS 2920 (=S. pastorianus) Candida sake BCD 1054 S. carlsbergensis ATCC 9080 Candida salmanticensis ATCC 16042 (=S. pastorianus) Candida santamariae CBS 4515 Saccharomyces cerevisiae ATCC 12341 Candida santamariae CBS 4261 Saccharomyces cerevisiae ATCC 18790 Candida solani BCD 818 Saccharomyces cerevisiae ATCC 28383 Candida succiphila DSM 2149 Saccharomyces cerevisiae DSM 70452 Candida tenuis BCD 819 S. cerevisiae var. diastaticus BCD 13974


20

Tab. 2.1: Fortsetzung

Spezies Stamm/Herkunft Spezies Stamm/Herkunft Candida tropicalis ATCC 20247 S. cerevisiae var. diastaticus BCD 13980 Candida tropicalis ATCC 20326 S. cerevisiae var. diastaticus DSM 70487 Candida versatilis DSM 6956 S. cerevisiae var. diastaticus VTT C-68059 Candida vini DSM 70184 S. cerevisiae var. diastaticus VTT C-70060 Candida viswanathii ATCC 20385 S. cerevisiae var. diastaticus VTT C-82101 Candida zeylanoides BCD 690 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei A Citeromyces matritensis DSM 70187 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei A Citeromyces matritensis BCD 1062 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei A Clavispora lusitaniae DSM 70102 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei A Clavispora lusitaniae Brauerei F S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei A Cryptococcus albidus DSM 70197 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei A Cryptococcus curvatus DSM 70022 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei E Cryptococcus curvatus BCD 2578 Saccharomyces cerevisiae Brauerei E Cryptococcus flavus BCD 823 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei C Cryptococcus flavescens Brauerei F S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei C Cryptococcus humicola DSM 70067 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei D Cryptococcus laurentii BCD 824 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei D Cryptococcus neoformans BCD 3511 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei D Debaryomyces etchellsii ATCC 20126 Saccharomyces cerevisiae Brauerei D Debaryomyces hansenii BCD 589 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei B Debaryomyces hansenii BCD 3512 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei B Debaryomyces marama ATCC 11627 Saccharomyces cerevisiae Brauerei F Debaryomyces vanrijiae DSM 70252 Saccharomyces cerevisiae Brauerei F Dekkera anomala DSM 70727 Saccharomyces cerevisiae Brauerei F Dekkera anomala DSM 70732 Saccharomyces castellii Brauerei F Dekkera bruxellensis DSM 3429 Saccharomyces exiguus BCD 1491 Dekkera bruxellensis DSM 70726 Saccharomyces exiguus BCD 1493 Dekkera custersiana DSM 70736 Saccharomyces exiguus MUCL 29838 Endomyces fibuliger BCD 3514 Saccharomyces kluyveri DSM 70517 Endomyces fibuliger DSM 70554 Saccharomyces pastorianus NCYC 73 Filobasidium capsuligenum DSM 70253 Saccharomyces pastorianus DSM 6580 Guilliermondella selenospora DSM 3431 Saccharomycopsis fibuligera ATCC 9947 Hanseniaspora guilliermondii DSM 70285 Schizosaccharomyces BCD 14122 Hanseniaspora uvarum BCD 3526 octosporus Hanseniaspora uvarum ATCC 9774 Schizosaccharomyces DSM 70573 Hanseniaspora vineae DSM 70283 octosporus Hyphopichia burtonii BCD 859 Schizosaccharomyces pombe DSM 70572 Hyphopichia burtonii DSM 3505 Schizosaccharomyces pombe BCD 773 Issatchenkia orientalis CBS 5147 Sporidiobolus johnsonii BCD 778 Kazachstania unispora BCD 877 Sporidiobolus johnsonii BCD 4982 Kluyveromyces marxianus DSM 70106 Sporidiobolus johnsonii DSM 70847 Kluyveromyces marxianus BCD 811 Stephanoascus ciferrii DSM 70749 Kluyveromyces marxianus DSM 70792 Torulaspora delbrueckii CBS 5636 Kluyveromyces marxianus BCD 2563 Torulaspora delbrueckii CBS 6339 Kluyveromyces marxianus BCD 5186 Torulaspora delbrueckii DSM 70607 Kluyveromyces lactis DSM 70807 Trichosporon cutaneum DSM 70684 Lachancea thermotolerans CBS 6340 Willipsis saturnus DSM 70388 Lachancea thermotolerans CBS 137 Yarrowia lipolytica ATCC 20225 Lodderomyces elongisporus DSM 70320 Yarrowia lipolytica ATCC 20226 Metschnikowia lunata CBS 5946 Yarrowia lipolytica BCD 2003 Metschnikowia pulcherrima DSM 70321 Yarrowia lipolytica BCD 2556


21


Spezies Stamm/Herkunft Spezies Stamm/Herkunft Metschnikowia reukaufii DSM 70337 Zygosaccharomyces bailii BCD 1424 Pichia angusta DSM 70277 Zygosaccharomyces bailii MUCL 28823 Pichia anomala BCD 1082 Zygosaccharomyces bisporus DSM 70415 Pichia anomala DSM 70783 Zygosaccharomyces cidri MUCL 31280 Pichia anomala Brauerei F Zygosaccharomyces MUCL 27824 Pichia anomala Brauerei F fermentati Pichia canadensis CBS 601 Zygosaccharomyces DSM 70506 Pichia carsonii DSM 70392 florentinus Pichia farinosa BCD 861 Zygosaccharomyces lentus CBS 8516 Pichia fermentans DSM 70090 Zygosaccharomyces DSM 6959 Pichia fermentans BCD 711 microellipsoides Pichia guilliermondii BCD 804 Zygosaccharomyces rouxii DSM 70835 Pichia membranaefaciens DSM 70178 Zygosaccharomyces rouxii ATCC 48230

Tab. 2.2: Bakterienstämme

Spezies Stamm/Herkunft Spezies Stamm/Herkunft Acetobacter pasteurianus DSM 3509 Lactobacillus perolens DSM 12744 Achromobacter xylosoxidans DSM 30026 Lactobacillus sakei DSM 20494 Acinetobacter baumanii BCD 10388 Lactococcus lactis DSM 20729 Acinetobacter calcoaceticus DSM 1139 subsp. lactis Aeromonas hydrophila DSM 30188 Leuconostoc citreus DSM 20188 Bacillus alcalophilus DSM 485 Leuconostoc mesenteroides DSM 20241 Bacillus badius BCD 2929 subsp. mesenteroides Bacillus cereus DSM 508 Macrococcus caseolyticus DSM 20597 Bacillus firmus DSM 1530 Megasphaera cerevisiae DSM 20462 Bacillus stearothermophilus DSM 456 Micrococcus luteus BCD 3906 Brevundimonas vesicularis DSM 7226 Moraxella catarrhalis DSM 9143 Brochotrix campestis DSM 4712 Pantoea agglomerans DSM 3493 Brochotrix thermospacta DSM 20171 Pectinatus cerevisiiphilus DSM 20467 Carnobacterium piscicola DSM 20730 Pectinatus frisingensis DSM 6306 Citrobacter freundii DSM 30040 Pediococcus damnosus DSM 20331 Clostridium perfringens BCD 8800 Pediococcus inopinatus DSM 20285 Corynebacterium glutamicum DSM 20300 Pediococcus parvulus DSM 20332 Delftia acidovorans DSM 39 Pediococcus claussenii DSM 14800 Enterobacter cloacae DSM 30054 Pediococcus pentosaceus DSM 20336 Enterobacter sakazakii DSM 4485 Planococcus kocurii DSM 3493 Enterococcus faecalis DSM 2570 Plesiomonas shigelloides DSM 8224 Erysipelothrix rhusiopathiae DSM 5055 Proteus mirabilis DSM 788 Escherichia coli DSM 30083 Proteus vulgaris DSM 2140 E. coli Serovar O157:H7 BCD 5579 Pseudomonas aeruginosa DSM 288 Jonesia denitrificans DSM 20603 Salmonella enterica subsp. BCD 14151 Klebsiella oxytoca DSM 5175 enterica Serovar Enteritidis Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Salmonella senftenberg BCD 6173 Kurthia zopfii DSM 20580 Serratia marcescens DSM 1636 Lactobacillus brevis DSM 20054 Shewanella putrefaciens DSM 6067 Lactobacillus casei DSM 20011 Shigella boydii DSM 7532 Lactobacillus collinoides DSM 20515 Shigella sonnei BCD 4301 Lactobacillus coryniformis DSM 20001 Sporosarcina urea DSM 2281 Lactobacillus delbrueckii DSM 20072 Staphylococcus aureus DSM 20231 Lactobacillus hilgardii DSM 20051 subsp. aureus


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Spezies Stamm/Herkunft Spezies Stamm/Herkunft Lactobacillus kefiri DSM 20588 Streptococcus uberis DSM 20569 Lactobacillus lindneri DSM 20690 Weissella confusa DSM 20196 Lactobacillus parabuchneri DSM 5707 Yersinia enterocolitica subsp. DSM 4780 Lactobacillus plantarum DSM 20174 enterocolitica

Tab. 2.3: Schimmelpilzstämme

Spezies Stamm/Herkunft Spezies Stamm/Herkunft Absidia sinosa BCD 3485 Hyalodendron lignicola DSM 1877 Alternaria alternata BCD 12263 Monilia sp. BCD 8535 Aspergillus flavus ATCC 9643 Mucor circinelloides BCD 6069 Aspergillus fumigatus DSM 819 Paecilomyces variotii CBS 62866 Aspergillus parasiticus DSM 2038 Penicillium crustosum BCD 6994 Aureobasidium pullulans DSM 3042 Penicillium funiculosum DSM 1960 Botrytis cinerea DSM 4709 Phialophora hoffmannii DSM 2693 Cephalosporium aphidicola ATCC 28300 Phomopsis phaseoli CBS 42250 Claviceps purpurea DSM 714 Phytophthera infestans MUCL 43045 Diaporthe citri DSM 1159 Rhizopus nigricans BCD 3506 Eremascus albulus BCD 12125 Syncephalastrum racemosum BCD 162 Fusarium oxysporum BCD 14059 Talaromyces flavus BCD 12179 Fusarium cerealis BCD 14058 Trichoderma viride BCD 352 Fusarium culmorum DSM 62184 Verticillium sp. BCD 13586 Geomyces pannorum DSM 2689 Wallemia sebi DSM 5329

2.2 Nährmedien

Für die Nährmedienherstellung wurden nur Chemikalien und Nährmedienzusätze der Firmen Merck, Roth und Sigma-Aldrich verwendet, die vom Hersteller für den Gebrauch in der Mik-robiologie ausgewiesen waren. Die Nährmedien wurden bei 121 °C für 15 Minuten autokla-viert. Tab. 2.4: YM-Medium (yeast extract-malt extract bro th)

3,0 g/l Hefeextrakt 3,0 g/l Malzextrakt 5,0 g/l Pepton 10,0 g/l D(+)-Glucose 15,0 g/l Agar-Agar

Die Zugabe von Agar-Agar wurde optional je nach Verwendung vorgenommen. Tab. 2.5: CASO-Bouillon

17,0 g/l Pepton aus Casein 3,0 g/l Pepton aus Sojamehl 2,5 g/l D(+)-Glucose 5,0 g/l NaCl 2,5 g/l K2HPO4 7,3 ± 0,2 pH-Wert bei 25 °C


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Tab. 2.6: Peptonwasser (gepuffert)

10,0 g/l Pepton aus Casein 5,0 g/l NaCl 3,5 g/l Na2HPO4 1,5 g/l KH2PO4 7,0 ± 0,2 pH-Wert bei 25 °C

Tab. 2.7: MRS-Bouillon

10,0 g/l Pepton aus Casein 8,0 g/l Fleischextrakt 4,0 g/l Hefeextrakt 20,0 g/l D(+)-Glucose 2,0 g/l K2HPO4 1,0 g/l Tween® 80 2,0 g/l Di-Ammoniumhydrogencitrat 5,0 g/l Natriumacetat 0,2 g/l MgSO4 0,04 g/l MnSO4 5,7 ± 0,2 pH-Wert bei 25 °C

Tab. 2.8: LB-Medium (Luria-Bertani-Medium) (Sambroo k et al. 1989)

10,0 g/l Trypton 5,0 g/l Hefeextrakt 5,0 g/l NaCl 0,1 g/l Ampicillin

Die Zugabe von Ampicillin erfolgte erst kurz vor der Verwendung des Mediums. Tab. 2.9: LB-Agarplatten

10,0 g/l Trypton 5,0 g/l Hefeextrakt 5,0 g/l NaCl 0,1 g/l Ampicillin 0,08 g/l X-Gal 0,5 mM IPTG 15,0 g/l Agar-Agar

Die Zugabe von Ampicillin erfolgte, nachdem das autoklavierte Medium auf ca. 50 °C abge-kühlt war. Tab. 2.10: SOC-Medium

0,2 g/l Trypton 0,05 g/l Hefeextrakt 10,0 mM NaCl 2,5 mM KCl 2,0 mM Glucose 10,0 mM MgCl2 • 6 H2O 10,0 mM MgSO4 • 7 H2O

Die Herstellung erfolgte gemäß den Angaben, die in der Vorschrift für das pGEM®-T Vektor Kit [Promega] gemacht werden.


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2.3 Oligonucleotide

Die verwendeten Oligonucleotide wurden von den Firmen Thermo Electron Corporation (Primer), MWG-Biotech (Primer) und Metabion (Hybridisierungssonden) bezogen. Die Nomenklatur der Basen in den Nucleinsäuresequenzen entspricht den Vorgaben der NC-IUB (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry): A= Adenin; C= Cytosin; G= Guanin; T= Thymin; I= Inosin; N= A/C/G/T; Y= C/T; R= A/G; M= A/C; K= G/T; S= C/G; W= A/T; D= A/G/T; B= C/G/T Tab. 2.11: Primer für die DNA-Kontrolle

Bezeichnung Sequenz 5´-3´ Zielregion Referenz ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 18S rDNA White et al. 1990 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC 26S rDNA White et al. 1990

Tab. 2.12: Primer zur Amplifikation von PCR-Fragmen ten des EF-3 Gens

Bezeichnung Sequenz 5´-3´ Zielregion Referenz HS03 GAATTYTCTYTKGCWTAYGG EF-3 Gen Uritani et al. 1999 HS04 TGACTYCTTCARACCYS EF-3 Gen Uritani et al. 1999 HS09 ACARTGYTBYTCDATYTC EF-3 Gen HS10 ATGGMGITWCCANWCYGGTGA EF-3 Gen HS12/IV TGGCGATACCAAACCGGTGAAG EF-3 Gen HS12/V TGGCGGTTCCATACCGGTGAGG EF-3 Gen HS12/VI TGGCGATACCAGACTGGTGAGG EF-3 Gen HS12/VII TGGCGATACCAGACCGGTGAGG EF-3 Gen HS12/VIII TGGAGATACCAGACCGGTGAGG EF-3 Gen HS12/IX TGGAGGTTCCAGACCGGTGAGG EF-3 Gen HS14/III CCATGACTTTCTTTTCGAAACCTC EF-3 Gen HS14/IV CGAGAATCTTCTTCTCGAAACCAC EF-3 Gen HS14/V CAAGAACCTTCTTTTCGAAACCTC EF-3 Gen HS14/VI CCATAACCTTCTTCTCGAAACCAC EF-3 Gen HS14/VII CGAGGACCTTCTTCTCGAAACCAC EF-3 Gen HS14/VIII CGAGGACCTTCTTCTCGAACCCAC EF-3 Gen HSwb1 ITIITIITIGAYGARCCIACYAACCATYTNG EF-3 Gen HSabc3 CIAIIACIAIYTTIACYTTYTGRCCACCNG EF-3 Gen

Tab. 2.13: Primer für Real-Time PCR Nachweissysteme

Bezeichnung Sequenz 5´-3´ Zielregion HS11/I GGTGAGGATAGAGAAACCATGG EF-3 Gen HS11/II GGTGAGGATAGAGAAACTATGG EF-3 Gen HS11/III GGTGAGGATAGAGAGACCATGG EF-3 Gen HS11/IV GGTGAGGATAGAGAGACTATGG EF-3 Gen Ha1f WCTGGTGAAGATTTGGARGCTATGG EF-3 Gen Ha2f CYGGTGARGAYMGWGAAACCATGG EF-3 Gen Ha3f WCYGGTGAAGATMGWGAAACTATGG EF-3 Gen Ha4f GGTGARGAYMGWGAGACCATGG EF-3 Gen Ha5f CYGGTGARGAYMGWGAGACTATGG EF-3 Gen Hb1f GAGGCCGAGCTTGCCAAGATG EF-3 Gen Hb2f CCGATGCCGAAAAGGAGAAGATG EF-3 Gen Hb3f SYGAGGAGGAGRAGAAGAAGATG EF-3 Gen Hb4f TGACCGARGAAGAGAWRCAAAAGATG EF-3 Gen Hb5f GCCGAGGAAGAGGCCAAGATG EF-3 Gen Hb6f ACCGGTGARGAYTTGGARGARMTG EF-3 Gen Hb7f ACNGGTGAGGAYMTYGARGA EF-3 Gen Ha1r CTCTTCAARGCYTCAGCACGGTC EF-3 Gen Ha2r CGKWGGCAAGWGCTTCCTTCATATC EF-3 Gen Ha3r CCRGADGCYAAWGCTTCCTTCATATC EF-3 Gen


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Bezeichnung Sequenz 5´-3´ Zielregion Ha4r GACCDGADGCYAAAGCTTCTTTCATATC EF-3 Gen Ha5r GARGCMARRGCCTCCTTCATGTC EF-3 Gen Ha6r CRGAWGCMARAGCCTCCTTCATATC EF-3 Gen Ha7r GACCWGAWGCTAAGGCTTCTTTCATATC EF-3 Gen Ha8r CGGAAGCCAAAGCTTCCTTCATGTC EF-3 Gen Hb1r CAAGTTCMAKRACYTTCTTTTCGAAACCTC EF-3 Gen Hb2r CTCSAKRAYCTTCTTCTCGAAACCAC EF-3 Gen Hb3r GAGGACCTTCTTCTCGAASCCAC EF-3 Gen HT1r GCYARWGCTTCCTTCATATC EF-3 Gen HT2r GADGCYAARGCTTCTTTCATATC EF-3 Gen HT3r GCMARRGCYTCCTTCATRTC EF-3 Gen HT4r CAARGCYTCAGCACGGTC EF-3 Gen HT5r GACCTTCTTCTCGAASCCAC EF-3 Gen HT6r RAYYTTCTTYTCGAAACCWC EF-3 Gen Yfa1 GTGARGAYMGWGARACCATG EF-3 Gen Yfa2 GGTGARGAYMGWGARACTATG EF-3 Gen Yfs1 GGTGAAGATTTGGARGCTATG EF-3 Gen SD1f TTGCGAATACACTACTGAAGC STA1-3 Gen SD1r CGTATACCACTGTCCCATTCAT STA1-3 Gen

Tab. 2.14: Mutageneseprimer zur Herstellung von int ernen Amplifikationskontrollen

und Positivkontrollen

Bezeichnung Sequenz 5´-3´ Zielregion SDip1r TGGCACTGGAAGAACGTATCGGATAATGATACATAGGTGGTTG STA1-3 Gen GTACAG SDip1f CATTATCCGATACGTTCTTCCAGTGCCATCAAAGCTGCGGCGG STA1-3 Gen TG SDpo3f CACAACAAAGGCTGTACCAACCACCTATGT STA1-3 Gen SDpo3r ACATAGGTGGTTGGTACAGCCTTTGTTGTG STA1-3 Gen Yip1r TGGCACTGGAAGAACGTATCGGATAATGTGTTCTTGAACTTTCT EF-3 Gen TCTG Yip1f CATTATCCGATACGTTCTTCCAGTGCCAATTGGTATGAAATCTG EF-3 Gen AAAG

Die Veränderungen in der Sequenz gegenüber dem Wildtyp wurden unterstrichen. Tab. 2.15: Hybridisierungssonden für die Real-Time PCR-Assays

Bezeichnung Sequenz 5´-3´ Zielregion SDR1f LCRed-640-TTGACTTTGGCAAGGGCATTCTCGA-Pho STA1-3 Gen SDF1f CACAACAAAGTCTGTACCAACCACCTATGT-Fluo STA1-3 Gen LMRST1 LCRed-705-CATTATCCGATACGTTCTTCCAGTGCCA-Pho IAK Yff1 GAGTTGCTGGTRTICAYKCIAGAAGAAAGTTYAAGAAC-Fluo EF-3 Gen Yff2 GAGTTAAAGAAATTITGGCYAGAAGAAARTTYAARAAT-Fluo EF-3 Gen Yff3 GAGTTCAAGARATTCAYGCIAGAAGRAARTTCAAGAAC-Fluo EF-3 Gen Yff4 GAGTTCAAGGTATTCAYGCTMGAMGIAAGTTYAAGAAC-Fluo EF-3 Gen Yff5 GACGAGCTTGTIGSCMGIAAGAAGYTSAAGCARTC-Fluo EF-3 Gen Yff6 GATTTTGGGTATYCACAGCCGTMGIAAGCTYAARAAC-Fluo EF-3 Gen Yff8 GTGTGAACGARGTTCTGTCCCGCCGTAARTTYAARAAC-Fluo EF-3 Gen Yfr1 LCRed-640-CTTAYGARTAYGARGTTTCTTGGITITTGGGTGA

GAAC-Pho EF-3 Gen

Yfr2 LCRed-640-CTTAYGAATATGAAATTGGITGGTAYTTRGKTGA GAAC-Pho

EF-3 Gen

Yfr3 LCRed-640-CYTAYGARTAYGAITGTTCTTTCACTTTGGGTGA GAAC-Pho

EF-3 Gen


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Bezeichnung Sequenz 5´-3´ Zielregion Yfr4 LCRed-640-CYTAYGARTAYGARTGTTCTTTCTTGTTIGGTGA

GAAC-Pho EF-3 Gen

Yfr5 LCRed-640-TACGARTACGAARTITCITTCAARGGTCTWTCWT CTGC-Pho

EF-3 Gen

Yfr7 LCRed-640-TWCGAGTACGAGGTIWCSTTCAAGGSIMTGT CGTC-Pho

EF-3 Gen

Yfr8 LCRed-640-CTTAYGARTAYGARGTCTCGTACCTGCTCGGAGA CAAC-Pho

EF-3 Gen

LCRed-640 oder 705: LightCycler®-Red-640 oder 705 Fluorophor, Pho: Phosphat, Fluo: Fluorescein 2.4 Probenmatrices

Tab. 2.16: Getränkeproben

Getränk Hersteller Alkoholfreies Bier (Jever Fun) Jever Alkoholfreies Bier Bitburger Apfelsaft (naturtrüb, Direktsaft) Dietz Apfelsaft (klar) Kaufland Biermixgetränk (Bibop) Bitburger Coca-Cola Coca-Cola Eistee (Tropical Mango) Nestle Gatorade Pepsi-Cola Light Bier Bitburger Orangensaft Kaufland Pils Oettinger Pils Bitburger Radler Oettinger Rotwein (Chianti) Italien Schwarzbier (Köstritzer) Bitburger Traubensaft Kaufland Weißwein (Riesling) Deutschland

Tab. 2.17: Nährmedien

Medium Hersteller SSL-Bouillon Döhler SSL-Bouillon/alkoholfreies Bier (50/50 v/v) Brauerei D NBB-Bouillon Brauerei D MRSF-Bouillon (MRS-Bouillon mit 1 % Fructose und 1/3 An-teil alkoholfreies Pils)

Brauerei D

Tab. 2.18: Prozessproben von Brauerei A

Probe Vorwürze Würze (Pfanne voll) Würze (Plattenkühler-Auslauf) Retourwasser/ Vorspülwasser Gär- und Lagerkeller Desinfektionsmittelwanne Jungbier (Lagerkeller) Wasser aus Kastenwäscher


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2.5 Anzucht von Mikroorganismen

Die Hefen wurden bei 25 bis 28 °C in 20 ml YM-Medium auf einem Schüttler (150 U/min) für 48 Stunden angezogen. Die Schimmelpilze wurden bei 25 bis 28 °C auf YM-Agarplatten für sieben Tage kultiviert. Die Bakterien wurden je nach Spezies in CASO-Bouillon oder MRS-Bouillon bei Temperaturen zwischen 30 und 37 °C für 24 Stunden angereichert. 2.6 Extraktion von Nucleinsäuren

2.6.1 Mechanisch/thermische DNA-Extraktion

1 ml einer Flüssiganreicherung oder Probe wurden in einem Reaktionsgefäß zusammen mit Zirkonium/Glas-Kügelchen [Roth] 1 min bei 8000 x g (Hefen und Schimmelpilze) oder 5 min bei 10000 x g (Bakterien) zentrifugiert. Für Bakterienkulturen wurden 150 mg Zirkoni-um/Glas-Kügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 mm und für Hefe- und Schimmelpilzkul-turen 500 mg Zirkonium/Glas-Kügelchen mit einem Durchmesser von 0,5 mm verwendet. Die sedimentierten Zellen wurden mit 200 µl einer 5 %-igen (w/w) Chelex® 100 [Bio-Rad] Lösung resuspendiert und 10 min bei 95 °C inkubiert. Anschließend erfolgte der mechani-sche Aufschluss mit dem MagNA Lyser Instrument [Roche Diagnostics] für 1 min bei 6500 Einheiten oder alternativ mit dem Disruptor Genie Instrument [Scientific Industries] für 10 min. Abschließend wurden die Zelllysate 15 min bei 95 °C inkubiert und 5 min bei 13000 x g zentrifugiert. Die Proben wurden direkt in der PCR eingesetzt, bei -20 °C gelagert oder wie unter 2.6.2 beschrieben weiter aufgereinigt. 2.6.2 Extraktion quantifizierbarer und RNA-freier D NA

Quantifizierbare/RNA-freie DNA wurde präpariert, indem sich an die unter 2.6.1 beschriebe-ne Methode eine Aufreinigung mit dem „High Pure PCR Template Preparation Kit“ [Roche Diagnostics] anschloss, wobei die in dem Protokoll für die Zelllyse und den Proteinase K Verdau vorgesehenen Schritte ausgelassen wurden. Nach dieser Aufreinigung wurden die in 50 µl eluierten Nucleinsäuren mit 1 µl RNase A (10 mg/ml) [Sigma-Aldrich] 10 min bei 37 °C inkubiert. Die RNase A wurde aus den Proben durch eine erneute Aufreinigung mit dem „High Pure PCR Template Preparation Kit“ entfernt. Das endgültige Elutionsvolumen betrug 50 µl. Verdünnungen der DNA wurden für PCR Experimente mit Heringssperma-TE-Puffer (10,0 µg/ml Heringssperma DNA [Roche Diagnostics], 0,5 mM EDTA [Sigma-Aldrich], 1,0 mM Tris-HCl [Sigma-Aldrich], pH=7,6) hergestellt. 2.6.3 Erweiterte, mechanisch/thermische DNA-Extrakt ion

Die unter 2.6.1 beschriebene Methode wurde für komplexe Probenmatrices erweitert, wobei bis auf Isopropanol (absolut) [Roth] alle eingesetzten Komponenten aus dem „High Pure PCR Template Preparation Kit“ [Roche Diagnostics] stammten. Die sedimentierten Proben wurden zusätzlich zu den 200 µl der 5 %-igen (w/w) Chelex® 100 Suspension mit 200 µl Bin-depuffer und 40 µl Proteinase K versetzt, resuspendiert und 10 min bei 72 °C inkubiert. An-schließend wurde wie unter 2.6.1 beschrieben verfahren. Die abschließende Aufreinigung erfolgte nach Zugabe von 100 µl Isopropanol mit dem „High Pure PCR Template Preparation Kit“ den Herstellerangaben entsprechend. Das Elutionsvolumen betrug 50 µl.


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2.7 Konzentrationsbestimmung von DNA-Lösungen

2.7.1 Fluorometrische Bestimmung

Die Konzentration von RNA-freien DNA-Lösungen wurde fluorometrisch mit dem „Pi-coGreen® dsDNA Quantification Kit“ [Molecular Probes] und dem LightCycler® 2.0 Instrument [Roche Diagnostics] bestimmt. Das „PicoGreen dsDNA quantification reagent“ wurde für die Messung 1:50 mit 1 x TE-Puffer verdünnt und je 15 µl in eine LightCycler® Kapillare [Roche Diagnostics] pipettiert. Nach Zugabe von 5 µl der DNA-Probe oder 5 µl der dekadisch ver-dünnten Lambda Standard DNA (Konzentrationsbereich: 10 ng–10 pg) wurden die Proben mit dem LightCycler® 2.0 Instrument gemessen. Die Messung erfolgte bei 530 nm mit fol-gendem Programm:

Analysis Mode Cycles Segment Target Tem-perature

Ramp Rate

Hold Time

Acquisition Mode

None 1 Incubation 40 °C 20 °C/s 10 s None Quantification 20 Fluorescence Measuring 40 °C 20 °C/s 1 s Single None 1 Ending 40 °C 20 °C/s 30 s None

Alle weiteren Einstellungen wurden auf 0 gesetzt. Die Auswertung erfolgte mit der Analysenmethode „Nucleic Acid Quantification“ der Light-Cycler® Software 4.0. Die Standardgerade wurde mit der als Standard eingesetzten Lambda DNA berechnet. Die Konzentration der DNA-Proben musste zur Berechnung innerhalb des Bereichs der Standardgeraden liegen. 2.7.2 Konzentrationsbestimmung über Absorptionsspek trometrie

Die Konzentrationsbestimmung über die Messung der optischen Dichte (OD) bei einer Wel-lenlänge von 260 nm wurde bei gereinigter Plasmid-DNA und zur Kontrolle von Oligonucleo-tiden angewendet. Die Messungen erfolgten mit dem Ultrospec 4000 Photometer UV/Visible Spectrophotometer der Firma Pharmacia Biotech. Ein OD-Wert von 1 entspricht bei einer Wellenlänge von 260 nm einer DNA-Konzentration von 50 µg/ml. 2.8 Agarosegelelektrophorese

PCR-Fragmente, DNA-Extraktionen, gereinigte und linearisierte Plasmide wurden je nach Größe zur Kontrolle in 1 bis 2 %-igen (w/v) Agarosegelen [Biozym] der Größe nach bei einer angelegten Spannung zwischen 100 und 120 V elektrophoretisch aufgetrennt. Die Proben wurden zum Auftragen mit 1/5 (v/v) Ladepuffer (0,25 % (w/w) Bromphenolblau [Merck], 0,25 % (w/w) Xylencyanol FF [Sigma-Aldrich], 30,0 % (w/w) Glycerin [Roth]) versetzt. 1 x TBE-Puffer (90 mM Tris-Borat, 2,0 mM EDTA, pH=8,3 bei 25 °C) [Merck] wurde als E-lektrophoresepuffer und der DNA-Längenstandard VI (154, 220, 234, 298, 394, 453, 517, 653, 1033, 1230, 1766 und 2176 bp) [Roche Diagnostics] zur Größenbestimmung verwen-det. Die DNA-Banden wurden durch Anfärbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbro-mid (0,3 µg/ml) [Merck] und Bestrahlung bei 312 nm mit dem Gel-Dokumentationssystem E.A.S.Y Win32 [Herolab] sichtbar gemacht und dokumentiert.


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2.9 Klonierung von PCR-Fragmenten

2.9.1 Erzeugung von PCR-Fragmenten für die Klonieru ng

PCR-Fragmente für die Klonierung wurden mit dem Themocycler GeneAmp 9700 [Perkin Elmer] erzeugt. Eingesetzt wurden entweder die Super Taq DNA-Polymerase [HT Biotechno-logy], die FastStart Taq DNA-Polymerase [Roche Diagnostics] oder die Taq DNA-Polymerase [Biomaster] inklusive des jeweiligen 10 x PCR-Puffers. Die Aktivität der einge-setzten Super Taq DNA-Polymerase [HT Biotechnology] wurde vor der Zugabe zum Master-Mix (alle Komponenten ohne DNA) mit dem TaqStart® Antikörper [Clontech Laboratories] den Herstellerangaben folgend blockiert. Die Aktivierung der Taq DNA-Polymerase erfolgte durch einen einleitenden Temperaturschritt bei 95 °C für 5 min. Die Nucleotide (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) stammten von der Firma Roche Diagnostics und das MgCl2 wurde von der Firma Sigma-Aldrich bezogen. 2.9.1.1 EF-3-Gen Fragmente

Die Amplifizierbarkeit der DNA-Proben wurde mit dem universalen Primerpaar ITS1/ITS4 getestet. Sequenzabschnitte des EF-3-Gens wurden für die Sequenzierung mit fünf Primer-kombinationen amplifiziert. Von Hefen aus der Unterabteilung Ascomycota wurde ein PCR-Produkt entweder direkt mit einem der Primerpaare HS10/HS09 und HS10/HS04 oder in einer Nested- oder Semi-Nested-PCR generiert, indem zunächst in einer separaten, vorge-schalteten PCR ein Amplifikat mit dem Primerpaar HS03/HS04 erzeugt wurde. Mit den Pri-merpaar HSwb1/Hsabc3 und dem Primermix HS12IV-IX/HS14/III-VIII wurde von Hefen der Unterabteilung Basidiomycota ein Amplifikat erzeugt. Das folgende PCR-Programm wurde je nach verwendeten Primern (Tab. 2.11 und Tab. 2.12) mit der geeigneten Annealingtempera-tur eingesetzt: Schritt Anzahl Zyklen Temperatur [°C] Zeit [min] verwendete Primer Initiale Denaturierung 1 95 5,0 Denaturierung 35 95 0,5 Annealing 45 0,5 HSwb1/HSabc3 50 0,5 HS03/HS04 50 0,5 HS10/HS04 52 0,5 HS10/HS09 58 0,5 ITS1/ITS4 62 0,5 HS12IV-IX/HS14/III-VIII Elongation 72 1,0 Finale Elongation 1 72 10,0

Die Reaktionsbedingungen der PCR waren bis auf die eingesetzten Primer und Primerkon-zentrationen identisch: Komponente Volumen Endkonzentration Primerpaar 10 x PCR-Puffer 2,5 µl 1 x MgCl2 (50 mM) 1,5 µl 3,0 mM dNTP-Mix (je 10 mM) 0,5 µl 0,2 mM (je Nucleotid) Primer (je 100 µM) 0,6 µl 1,2 µM (je Primer) HSwb1/HSabc3 2,0 µl 4,0 µM (je Primer) HS03/HS04 2,0 µl 4,0 µM (je Primer) HS10/HS09 2,0 µl 4,0 µM (je Primer) HS10/HS04 0,6 µl 0,2 µM (je Primer) HS12IV-IX/HS14/III-VIII Taq DNA-Polymerase (5/6 U/µl) 1,2 µl 1,0 U/Reaktion Template variabel H2O ad. 25 µl


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2.9.1.2 Interne Amplifikationskontrolle und Positiv kontrolle

Die PCR-Fragmente für die Herstellung der internen Amplifikationskontrolle und der Positiv-kontrollen (IAK und PK) der beiden Real-Time PCR Nachweissysteme, die auf einer Detekti-on mit Hybridisierungssonden beruhten, wurden über PCR-Mutagenese, wie bei Higuchi et al. (1988) beschrieben, hergestellt. Für die Herstellung der Kontrollen wurden jeweils zwei komplementäre Mutageneseprimer (Tab. 2.14) verwendet, die entweder eine Basenfehlpaa-rung in die Sondenbindungsregion einfügten (PK) oder die komplette Sequenz einer Sonde durch eine neue Sequenz substituierten (IAK). Dabei wurden alle PCR-Ansätze mit dem folgenden PCR-Programm durchgeführt:

Schritt Anzahl Zyklen Temperatur [°C] Zeit [min] Initiale Denaturierung 1 95 5,0 Denaturierung 35 95 0,5 Annealing 50 0,5 Elongation 72 1,0 Finale Elongation 1 72 10,0

Mit zwei PCR-Reaktionen wurden zunächst für jede Kontrolle zwei überlappende PCR-Fragmente hergestellt, die die gewünschte Veränderung gegenüber der natürlichen Sequenz am 3´- (Fragment A) bzw. am 5´-Ende (Fragment B) aufwiesen. Die Primerkombinationen für die Kontrollen waren wie folgt:

Real-Time PCR-Nachweissystem Kontrolle PCR-Fragment A PCR-Fragment B 5´-Primer 3´-Primer 5´-Primer 3´-Primer S. cerevisiae var. diastaticus IAK SD1f SDip1r SDip1f SD1r PK SD1f SDpo3r SDpo3f SD1r Hefen Gesamtnachweis IAK HS10 Yip1r Yip1f HS09

Die Reaktionsbedingungen bei der Amplifikation der PCR-Fragmente A und B mit den Muta-geneseprimern waren die folgenden:

Komponente Volumen Endkonzentration 10 x PCR-Puffer 2,5 µl 1 x MgCl2 (50 mM) 1,5 µl 3,0 mM dNTP-Mix (je 10 mM) 0,5 µl 0,2 mM (je Nucleotid) Primer (je 10 µM) 5,0 µl 1,0 µM (je Primer) FastStart Taq DNA Polymerase (5 U/µl) 0,5 µl 2,5 U/Reaktion S. c. var. diastaticus (DSM 70487) DNA 1,0 µl 1,0 ng/Reaktion H2O ad. 25 µl

Die PCR-Fragmente A und B wurden mit dem QIAquick PCR Purification Kit oder dem QIA-quick Gel Extraction Kit [Qiagen] gereinigt, bevor sie in der abschließenden PCR eingesetzt wurden. Die PCR, bei der durch Annealing der beiden PCR-Fragmente A und B im Bereich der Mutageneseprimer, anschließender Elongation zu einem doppelsträngigen Gesamtfrag-ment und abschließender Amplifikation mit den im Gesamtfragment außen liegenden Pri-mern (SD1f/SD1r oder HS10/09) das PCR-Fragment C hergestellt wurde, wurde unter den folgenden Reaktionsbedingungen durchgeführt:

Komponente Volumen Endkonzentration 10 x PCR-Puffer 2,5 µl 1 x MgCl2 (50 mM) 1,5 µl 3,0 mM dNTP-Mix (je 10 mM) 0,5 µl 0,2 mM (je Nucleotid) Primer (je 10 µM) 5,0 µl 1,0 µM (je Primer) Biomaster Taq (5 U/µl) 0,25 µl 1,25 U/Reaktion PCR-Fragment A und B 2,0 µl H2O ad. 25 µl


31

2.9.2 Reinigung von PCR-Fragmenten für die Klonieru ng

Die Kontrolle der Amplifikate erfolgte über Agarosegelelektrophorese (Kap. 2.8). Die PCR-Produkte wurden mit dem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt. Amplifikate, die nach der Auftrennung im Agarosegel mit einem Skalpell bei Bestrahlung mit UV-Licht (365 nm) aus-geschnitten wurden, wurden mit dem QIAquick Gel Extraction Kit [Qiagen] gereinigt. 2.9.3 Ligation von gereinigten DNA-Fragmenten

PCR-Produkte wurden mit dem pGEM®-T Vector Kit [Promega] den Herstellerangaben ent-sprechend ligiert. Die Ligationsansätze (5 µl 2 x Puffer, 0,4 µl pGEM-T Vector, 0,8 µl T4 DNA Ligase und 3,8 µl PCR-Produkt) wurden bei 4 °C für 16 Stunden inkubiert. 2.9.4 Transformation von E. coli Zellen

2.9.4.1 Herstellung kompetenter E. coli Zellen

Kompetente E. coli XL-1 Blue Zellen [Stratagene] wurden mit der Magnesi-um-/Calciumchlorid Methode hergestellt. Aus einer E. coli XL-1 Blue Vorkultur, die über Nacht bei 37 °C in LB-Medium (Tab. 2.8) angezogen wurde, wurden 0,5 ml in 50 ml LB-Medium überimpft und mit 150 U/min bis zum Erreichen einer OD550 nm von ca. 0,5 bei 37 °C inkubiert. Alle folgenden Schritte erfolgten bei 4 °C und mit auf 4 °C gekühlten Lösungen. Die Zellen wurden nach einer Inkubation von 15 min auf Eis zentrifugiert (5000 x g, 10 min), in 20 ml 0,1 M MgCl2 resuspendiert und erneut zentrifugiert (5000 x g, 10 min). Das Zellpellet wurde in 10 ml 0,1 M CaCl2 resuspendiert, 20 min auf Eis inkubiert und erneut zentrifugiert (5000 x g, 10 min). Anschließend wurden die Zellen in 1,0 ml 0,1 M CaCl2 resuspendiert, 250 µl 87 % (v/v) Glycerin zugegeben und nach einer Inkubation von 5 min auf Eis wurden Aliquots von je 100 µl bei -80 °C eingefroren. 2.9.4.2 Transformationsansatz

100 µl kompetente E. coli XL-1 Blue Zellen wurden mit 5 µl Ligationsansatz vorsichtig ge-mischt und 20 min auf Eis inkubiert. Der nachfolgende Hitzeschock erfolgte bei 42 °C im Wasserbad für 2 min. Nach einer weiteren Inkubation für 10 min auf Eis wurden 500 µl SOC-Medium (Tab. 2.10) zugegeben und die Ansätze 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. 100 µl des Transformationsansatzes wurden anschließend auf LB-Platten (Tab. 2.9) ausgestrichen und 24 Stunden bei 37 °C inkubiert. Nach einer Inkubation der Platten für 2 Stunden bei 4 °C wurden die gewünschten Klone aufgrund der Blau-Weiß-Selektion ausgewählt. Da die PCR-Fragmente alle kleiner als 1 kbp waren, wurden neben weißen auch blaue Kolonien für die Testung ausgewählt. 2.9.4.3 Kontrolle der Transformation

Der Erfolg der Klonierungen wurde mit der PCR kontrolliert, wobei die Bedingungen wie bei der Herstellung der PCR-Produkte gewählt wurden (Kap. 2.9.1). Von weißen und blauen Kolonien wurden 2,0 ml Flüssigkulturen mit LB-Medium (Tab. 2.8) mit Ampicillin (100 µg/ml) angesetzt und 24 Stunden bei 37 °C inkubiert. 100 µl der Flüssigkulturen wurden 10 min bei 95 °C inkubiert und anschließend bei 13000 x g für 5 min zentrifugiert. 1 µl des Überstandes wurde in der PCR eingesetzt und das Ergebnis über Agarosegelelektrophorese (Kap. 2.8) ausgewertet. Die Lagerung der positiven Klone erfolgte bei -80 °C in 80 % (v/v) Glycerin.


32

2.9.5 Präparation von Plasmid-DNA

Für Sequenzierungen wurden 4 ml einer Flüssigkultur (LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin, 24 Stunden, 37 °C) mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit [Qiagen] den Herstellerangaben fol-gend präpariert. Die Plasmid-DNA wurde in 100 µl Elutionspuffer aufgenommen. Plasmid-DNA für die interne Amplifikationskontrolle (IAK) oder die Positivkontrollen (PK) wur-den aus 50 ml Flüssigkultur (LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin, 24 Stunden, 37 °C) mit dem QIAprep Spin Midiprep Kit [Qiagen] den Herstellerangaben folgend präpariert. 2.9.6 Restriktionsverdau von Plasmid-DNA

Die internen Amplifikationskontrollen (IAK) und die Positivkontrollen (PK) wurden nach der Reinigung mit der Restriktionsendonuclease Sac I oder Sca I [New England BioLabs] lineari-siert. 170 µl der gereinigten Plasmid-DNA wurden mit 10 µl Enzym (10 U/µl), 20 µl NE-Puffer 1 (Sac I) oder 20 µl H-Puffer (Sca I) und 2 µl BSA versetzt, 2 Stunden bei 37 °C und ab-schließend 20 min bei 65 °C inkubiert. Der Erfolg der Linearisierung wurde über Agarosege-lelektrophorese kontrolliert (Kap. 2.8). Verdünnungen der Kontrollen wurden für den späteren Gebrauch mit Heringssperma-TE-Puffer (10,0 µg/ml Heringssperma DNA [Roche Diagnostics], 0,5 mM EDTA [Sigma-Aldrich], 1,0 mM Tris-HCl [Sigma-Aldrich], pH=7,6) hergestellt und bei -20 °C gelagert. 2.10 Sequenzierung

Gereinigte Plasmid-DNA mit einem Sequenzabschnitt des EF-3 Gens und die über PCR-Mutagenese hergestellten Kontrollen (IAK und PK) wurden von der Firma GATC Biotech mit den Standardprimern M13-forw und M13-rev sequenziert. 2.11 Sequenzanalyse

Distanz Matrices und Alignments von bekannten und selbst erzeugten Sequenzen wurden mit dem Align X Programm aus dem Programmpaket Vector NTI® Suite 7.0 [InforMax] er-stellt. Das Programm nutzt einen modifizierten CLUSTAL W Algorithmus (Needleman und Wunsch 1970, Thompson et al. 1994) und erstellt Stammbäume über die Neighbour-Joining Methode (Saitou und Nei 1987). Die Schmelztemperatur von Oligonucleotiden wurde mit der MeltCalcPro Software (Professi-onal Edition, Version 2.06) berechnet (Schütz und von Ahsen 1999, von Ahsen et al. 1999). 2.12 Zellzahlbestimmung

Zellzahlen von Hefekulturen wurden licht-mikroskopisch mit einer Neubauer Zählkammer bestimmt. Von einer dekadischen Verdünnungsreihe, die mit gepuffertem Peptonwasser (Tab. 2.6) hergestellt wurde, wurde die Verdünnungsstufe ausgezählt, bei der zwischen 50 und 200 Zellen in einem Großquadrat lagen. Die Zellzahl der Hefekultur ergab sich indem die vier Großquadrate ausgezählt, der Mittelwert gebildet wurde und dieser Wert mit 104 und der Verdünnungsstufe multipliziert wurde. Zusätzlich zu der Zellzahl wurden die Koloniebildenden Einheiten (KBE) mit YM-Agar Platten (Tab. 2.4) durch Ausplattieren geeigneter Verdünnungsstufen ermittelt.


33

2.13 Real-Time LightCycler ® PCR

Alle Real-Time LightCycler® PCR Versuche wurden mit einem LightCycler® 1.2 Instrument oder einem LightCycler® 2.0 Instrument in 20 µl LightCycler® Kapillaren durchgeführt und mit der LightCycler® Software 3.5 oder 4.0 ausgewertet [Roche Diagnostics]. Die spezifische Amplifikation der Target-DNA oder der Positivkontrolle wurde bei den auf dem Einsatz von Hybridisierungssonden basierenden Real-Time LightCycler® PCR-Systemen im Fluores-zenzkanal 640/Back 530 bzw. F2/Back F1 analysiert. Die spezifische Amplifikation der inter-nen Amplifikationskontrolle wurde im Fluoreszenzkanal 705/Back 530 bzw. F3/Back F1 de-tektiert. Real-Time PCR-Reaktionen, die mit SYBR®-Green I [Molecular Probes] durchgeführt wurden, wurden im Fluoreszenzkanal 530 bzw. F1 ausgewertet. Die eingesetzte FastStart Taq DNA Polymerase [Roche Diagnostics] inklusive des 10 x PCR-Puffers, die Nucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP und dUTP) und BSA (bovine serum albumin) stammten von der Firma Roche Diagnostics. Eine 1 M MgCl2-Stammlösung wurde von der Firma Sigma-Aldrich bezogen. 2.13.1 Real-Time LightCycler ® PCR-Programme

2.13.1.1 S. cerevisiae var. diastaticus Nachweis mit Hybridisierungssonden

Das PCR-Programm zum Nachweis von S. cerevisiae var. diastaticus mit Hybridisierungs-sonden bestand aus folgenden vier Teilprogrammen:

Teilprogramm Anzahl Zyklen Analysis Mode UNG Inkubation und initiale Denaturierung 1 None Amplifikation 45 Quantification Schmelzkurven-Analyse 1 Melting Curves Kühlen 1 None

Die Teilprogramme hatten folgende Temperaturprofile:

UNG Inkubation und initiale Denaturierung Target [°C]

Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode

37 00:02:00 20 0 0 0 None 95 00:15:00 20 0 0 0 None

Amplifikation Target [°C]

Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode

95 00:00:02 20 0 0 0 None 64 00:00:30 20 50 0.5 5 Single 72 00:00:15 20 0 0 0 None

Schmelzkurven-Analyse Target [°C]

Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode

95 00:00:00 20 0 0 0 None 38 00:01:00 20 0 0 0 None 80 00:00:00 0.1 0 0 0 Continuous

Kühlung Target [°C]

Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode

40 00:00:30 20 0 0 0 None


34

2.13.1.2 Hefegesamtnachweis mit Hybridisierungssond en

Das PCR-Programm zum Nachweis von Hefen mit Hybridisierungssonden bestand aus fol-genden vier Teilprogrammen:

Teilprogramm Anzahl Zyklen Analysis Mode UNG Inkubation und initiale Denaturierung 1 None Amplifikation 45 Quantification Schmelzkurven-Analyse 1 Melting Curves Kühlen 1 None


UNG Inkubation und initiale Denaturierung Target [°C]

Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode

37 00:02:00 20 0 0 0 None 95 00:15:00 20 0 0 0 None


Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode

95 00:00:05 20 0 0 0 None 60 00:01:00 20 40 0.5 0 Single 72 00:00:15 20 0 0 0 None


Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode



Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode

40 00:00:30 20 0 0 0 None 2.13.1.3 Hefegesamtnachweis mit SYBR ®-Green I

Das PCR-Programm zum Nachweis von Hefen mit SYBR®-Green I [Molecular Probes] be-stand aus den gleichen vier Teilprogrammen wie der Nachweis mit Hybridisierungssonden. Einige Einstellungen in den Teilprogrammen Amplifikation und Schmelzkurven-Analyse wur-den jedoch angepasst:


Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode

95 00:00:05 20 0 0 0 None 62 00:00:30 20 0 0 0 None 72 00:00:15 20 0 0 0 Single


Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode



35

2.13.2 Real-Time PCR-Ansätze

Bei der Amplifikation der STA1-3 Gen-Fragmente wurde statt dTTP dUTP verwendet und bei der Amplifikation des EF-3 Gen-Fragments wurden dTTP und dUTP zu gleichen Teilen (je 0,1 mM) eingesetzt, um den Einsatz von Uracil-N-Glycosylase (UNG) (hitze-instabil, 1 U/µl) [Roche Diagnostics] zum Abbau von PCR-Produkten aus vorangegangenen PCR-Ansätzen zu ermöglichen, die versehentlich in die Reaktionen verschleppt wurden. 2.13.2.1 S. cerevisiae var. diastaticus Nachweis mit Hybridisierungssonden

Komponente Volumen Endkonzentration 10 x PCR-Puffer 2,0 µl 1 x MgCl2 (100 mM) 0,5 µl 2,5 mM dNTP-Mix (je 10 mM) 0,4 µl 0,2 mM (je Nucleotid) BSA (30 µg/µl) 1,5 µl 2,25 µg/µl 3´-Primer SD1f (10 µM) 1,2 µl 0,8 µM 5´-Primer SD1r (10 µM) 1,2 µl 0,8 µM LC-Fluorescein Sonde SDF1f (10 µM) 0,1 µl 0,05 µM LC-Red-640 Sonde SDR1f (10 µM) 0,6 µl 0,3 µM LC-Red-705 Sonde LMRST1 (10 µM) 0,4 µl 0,2 µM Taq DNA Polymerase (5 U/µl) 0,4 µl 2,0 U/Reaktion Uracil-DNA-Glycosylase (1 U/µl) 0,1 µl 0,1 U/Reaktion IAK (0,2 fg/µl) 1,0 µl 0,2 fg/Reaktion Probe 5,0 µl H2O ad. 20 µl

2.13.2.2 Hefegesamtnachweis mit Hybridisierungssond en

Komponente Volumen Endkonzentration 10 x PCR-Puffer 2,0 µl 1 x MgCl2 (100 mM) 0,8 µl 4,0 mM dATP, dCTP, dGTP (je 10 mM) 1,2 µl 0,2 mM (je Nucleotid) dTTP, dUTP (je 10mM) 0,2 µl 0,1 mM (je Nucleotid) BSA (30 µg/µl) 0,5 µl 0,75 µg/µl 3´-Primer-Mix Yfa1-2, HS11/I-IV, Hb6f-7f (je 10 µM) 0,4 µl 0,2 µM (je Primer) 3´-Primer Yfs1 (10µM) 0,2 µl 0,1 µM 5´-Primer-Mix HT1r-3r, HT5r-6r (10 µM) 0,4 µl 0,2 µM (je Primer) 5´-Primer HT4r (10 µM) 0,2 µl 0,1 µM LC-Fluorecein Sonden-Mix Yff1-4, 6 (je 10 µM) 0,15 µl 0,075 µM (je Sonde) LC-Fluorecein Sonde Yff5 (10 µM) 0,2 µl 0,1 µM LC-Fluorecein Sonde Yff8 (10 µM) 0,1 µl 0,05 µM LC-Red-640 Sonden-Mix Yfr1-4 (je 10 µM) 0,3 µl 0,15 µM (je Sonde) LC-Red-640 Sonden-Mix Yfr5, 7 (je 10 µM) 0,4 µl 0,2 µM (je Sonde) LC-Red-640 Sonde Yfr8 (10 µM) 0,15 µl 0,075 µM LC-Red-705 Sonde LMRST1 (10 µM) 0,4 µl 0,2 µM Taq DNA Polymerase (5 U/µl) 0,4 µl 2,0 U/Reaktion Uracil-DNA-Glycosylase (1 U/µl) 0,1 µl 0,1 U/Reaktion IAK (0,5 fg/µl) 1,0 µl 0,5 fg/Reaktion Probe 5,0 µl H2O ad. 20 µl


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2.13.2.3 Hefegesamtnachweis mit SYBR ®-Green I

Komponente Volumen Endkonzentration 10 x PCR-Puffer 2,0 µl 1 x MgCl2 (100 mM) 0,7 µl 3,5 mM dATP, dCTP, dGTP (je 10 mM) 1,2 µl 0,2 mM (je Nucleotid) dTTP, dUTP (je 10mM) 0,2 µl 0,1 mM (je Nucleotid) BSA (30 µg/µl) 0,5 µl 0,75 µg/µl 3´-Primer-Mix Ha1f-5f, Hb1f-5f (je 10 µM) 0,4 µl 0,2 µM (je Primer) 5´-Primer-Mix Ha1r-8r (10 µM) 0,4 µl 0,2 µM (je Primer) 5´-Primer-Mix Hb1r-3r (10 µM) 0,4 µl 0,2 µM (je Primer) SYBR®-Green I (100-fach) 0,05 µl 0,25-fach Taq DNA Polymerase (5 U/µl) 0,4 µl 2,0 U/Reaktion Uracil-DNA-Glycosylase (1 U/µl) 0,1 µl 0,1 U/Reaktion Probe 5,0 µl H2O ad. 20 µl

2.14 Spezifitätstestung der Real-Time LightCycler ® PCR

Die PCR-Systeme wurden mit DNA von Zielorganismen und Nicht-Zielorganismen, die mit den im Kap. 2.6.1 und Kap. 2.6.2 beschriebenen Methoden gewonnen wurde, getestet. Zu-sätzlich wurden die im Kap. 2.4 aufgeführten Probenmatrices, mit den DNA-Extraktionsmethoden, die im Kap. 2.6.1 und Kap. 2.6.3 beschrieben wurden, getestet. 2.15 Sensitivitätstestung der Real-Time LightCycler ® PCR

2.15.1 Sensitivität ermittelt mit quantifizierter, RNA-freier DNA

Die Sensitivität der PCR-Systeme wurde mit quantifizierter (Kap. 2.7.1), RNA-freier DNA (Kap. 2.6.2) von Hefen bestimmt. Die Umrechnung der quantifizierten DNA-Mengen auf Ge-nomäquivalente (GÄ) erfolgte mit den bekannten Genomgrößen von S. cerevisiae (12,1 Mbp), Schizosaccharomyces pombe (13,8 Mbp) und Cryptococcus neoformans (21,0 Mbp). 2.15.2 Sensitivität ermittelt mit dotierten Probenm atrices

10 ml Probenmatrix wurden 1:10 mit YM-Medium verdünnt und 48 Stunden bei 28 ± 2 °C auf einem Schüttler bei 150 U/min inkubiert. Die Dotierung mit ausgezählten Hefekulturen erfolg-te entweder vor oder nach der Anreicherung, um die Nachweisgrenze und die Detektionszeit der PCR-Systeme zu ermitteln. Die Probenaufarbeitungen wurden mit den mecha-nisch/thermischen DNA-Extraktionsmethoden (Kap. 2.6.1 und Kap. 2.6.3) durchgeführt. 2.15.3 Sensitivität ermittelt bei einer hohen Begle itflora

Die PCR-Systeme wurden mit Aufarbeitungen von dotierten Proben getestet, die neben den Zielorganismen eine sehr hohe Begleitflora an S. cerevisiae (DSM 1333) Zellen (S. cerevisi-ae var. diastaticus Nachweissystem) oder E. coli (DSM 30083) Zellen (Hefegesamtnach-weissystem) aufwiesen. 1 ml einer S. cerevisiae Kultur (YM-Medium) mit 1 x 108 Zellen/ml oder 1 ml einer E. coli Kultur (Peptonwasser) mit 1 x 1010 KBE/ml wurden mit unterschiedli-chen Zellzahlen der jeweiligen Zielorganismen inokuliert und mit einer der mecha-nisch/thermischen DNA-Extraktionsmethoden (Kap. 2.6.1 und Kap. 2.6.3) aufgearbeitet. Die Zellzahlen der Hefekulturen wurden wie im Kap. 2.12 beschrieben ermittelt. Die Zellzahl der E. coli Kultur wurde als KBE/ml mit Caso-Agar bestimmt.


37

2.16 Praxisnahe Testung der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus

Das komplette S. cerevisiae var. diastaticus Real-Time PCR-System wurde von vier Braue-reien (A-D) in Kombination mit der mechanisch/thermischen DNA-Extraktionsmethode (Kap. 2.6.1) getestet. Von jeder Brauerei wurden undotierte Probenmatrices aus unterschiedlichen Bereichen des Brauprozesses in zwei Probenvolumina (1,0 ml und 0,1 ml) getestet (Ver-suchsteil 1). Außerdem untersuchte jede Brauerei S. cerevisiae var. diastaticus Reinkulturen, die aus dem eigenen Prozess isoliert wurden oder von Kulturstammsammlungen bezogen wurden (Versuchsteil 2). Mit 4 bis 5 unterschiedlichen Probenmatrices wurde die Sensitivität des PCR-Systems nach Dotierung mit 102, 103 oder 104 Zellen/ml S. cerevisiae var. diastati-cus getestet (Versuchsteil 3). Zum Einsatz kamen sowohl LightCycler® 1.2 Instrumente (Brauerei A, B und D) als auch LightCycler® 2.0 Instrumente (Brauerei B und C) [Roche Di-agnostics]. Die mechanisch/thermische Probenaufarbeitung wurde bei zwei Brauereien (A und B) mit dem Disruptor Genie [Scientific Industries] und bei den beiden anderen Brauerei-en mit dem MagNA Lyser Instrument [Roche Diagnostics] durchgeführt. Die Brauerei A teste-te das PCR-System außerdem beim Versuchsteil 1 in Kombination mit Proben, die mit dem MagNA Pure DNA Isolation Kit III [Roche Diagnostics] aufgearbeitet wurden.

3 Ergebnisse

38

3 Ergebnisse

3.1 Entwicklung einer Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastati-cus

3.1.1 Auswahl der STA1-3 Gene als Zielregionen

Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus Stämme besitzen als physiologisches Unter-

scheidungsmerkmal zu anderen Stämmen der gleichen Art die Fähigkeit Stärke zu Glucose,

Maltose und Dextrinen abzubauen (Andrews und Gilliland 1952). Die hierfür verantwortliche

extrazelluläre Glucoamylase (1,4-α-Glucosidase, EC 3.2.1.3) wird von einem von drei unab-

hängigen Genen der Multigen-Familie STA kodiert, die auf den Chromosomen IV (STA1), II

(STA2) und XIV (STA3) im Genom angeordnet sind (Tamaki 1978, Erratt und Stewart 1978,

Pretorius und Marmur 1988, Bignell und Evans 1990). Der größte Teil der codierenden Se-

quenz der STA Gene ist identisch mit dem Gen SGA1 (Chromosom IX), das bei allen S. ce-

revisiae Stämmen vorkommt und eine intrazelluläre, sporulations-spezifische Glucoamylase

kodiert (Pretorius und Marmur 1988).

Abb. 3.1: Anordnung der identischen Sequenzabschnit te der Gene SGA1 und MUC1 in der STA Multigen-Familie

Die Gene SGA1 und MUC1, die in allen S. cerevisiae Stämmen vorkommen, beinhalten jeweils Se-quenzabschnitte, die in einer veränderten Anordnung auch in den Genen STA1-3 vorkommen. Die STA Multigen-Familie ist im Gegensatz zu den Genen SGA1 und MUC1 nur in S. cerevisiae var. di-astaticus zu finden. Eine direkte Sequenzwiederholung im S1 Sequenzabschnitt von 129 bp Länge ist nicht in den STA Genen enthalten. In der Konfiguration der STA Gene kodiert die SGA1 Sequenz die katalytische Domäne und die S2-S1 Sequenzen bilden den Promotor, ein hydrophobes, membran-gängiges Leaderpeptid und einen Threonin/Serin-reichen Bereich (Abbildung verändert nach Vivier et al. 1997).

S. cerevisiae

129 bp

3´ 5´ S2

3´ S1

5´

3´ 5´ 1530 bp 780 bp 2538 bp

1530 bp

SGA1 MUC1

2538 bp 909 bp

STA

S2 SGA1 S1

S. cerevisiae var. diastaticus

3 Ergebnisse

39

Die STA Gene unterscheiden sich jedoch von dem SGA1 Gen in zwei zusätzlichen Se-

quenzabschnitten (S1 und S2), die ein hydrophobes, membrangängiges Leaderpeptid und

einen Threonin/Serin-reichen Bereich kodieren (Yamashita et al. 1985b, 1987). Diese Se-

quenzabschnitte S1 und S2, die in den STA Genen in der 5´-Region nebeneinander vorlie-

gen, sind ebenfalls bei allen S. cerevisiae Stämmen im Gen MUC1 (=Flo11) (Chromosom IX)

vorhanden und sind dort ca. 2,5 kbp getrennt von einander angeordnet (Lambrechts et al.

1995, 1996). Die genaue Anordnung der Genabschnitte verdeutlicht die Abbildung 3.1.

3.1.2 Anordnung der Primer und Hybridisierungssonde n im STA Gen

Die Sequenzen der Gene STA1 und STA2 (GenBank Acc. No. X02649.1 und X13857.1)

dienten als Grundlage für die Konstruktion der Primer und Hybridisierungssonden. Der 5´-

Primer SD1f wurde im S1 Bereich (Position 848-868) und der 3´-Primer SD1r im SGA Be-

reich (Position 1086-1107) platziert, da diese Bereiche nur in den STA Genen nebeneinan-

der angeordnet sind. Das resultierende Amplifikat hatte eine Länge von 260 bp. Die Sonden

SDF1f (Position 962-991) und SDR1f (Position 994-1018) wurden so konstruiert, dass sie im

Übergangsbereich zwischen den Sequenzabschnitten S1 und SGA hybridisieren. Das mit

Fluorescein markierte 3´-Ende der Donator-Sonde SDF1f schloss mit dem Ende des S1 Se-

quenzabschnitts ab. Der Targetbereich der Akzeptor-Sonde SDR1f, die mit dem LightCyc-

ler®-Red 640 Fluorochrom am 5´-Ende markiert wurde, begann zwei Basen nach Beginn des

SGA Sequenzabschnitts (Abb. 3.2).

841------------SD1f--------------------------------------------900 CTGGTACTGG CGAATACACT ACTGAAGCTA CCGCCCCTGT TACAACAGCT GTCACAACCA 901------------------------------------------------------------960 CCGTTGTTAC CACTGAATCC TCTACGGGTA CTAACTCCGC TGGTAAGACG ACAACTAGTT 961-----------SDF1f----------------------------SDR1f----------1020 ACACAACAAA GTCTGTACCA ACCACCTATG TATTTGACTT TGGCAAGGGC ATTCTCGATC 1021----------------------------------------------------------1080 AAAGCTGCGG CGGTGTATTT TCAAACAACG GCTCTTCGCA AGTGCAGCTG CGGGATGTAG 1081-----------SD1r----------1110 TCTTGATGAA TGGGACAGTG GTATACGATT Abb. 3.2: Anordnung der Primer und Hybridisierungss onden im STA1 Gen

Dargestellt ist der Sequenzabschnitt des STA1 Gens (5´ - 3´ Orientierung, GenBank Acc. No. X02649.1), der bei der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus mit dem 5´-Primer SD1f und dem 3´-Primer SD1r amplifiziert wurde. Die Primer lagen im S1 (SD1f) bzw. SGA (SD1r) Sequenzbe-reich. Die Detektion der Amplifikate erfolgte mit den Hybridisierungssonden SDF1f und SDR1f, die im Übergangsbereich der S1 und SGA Sequenzabschnitte hybridisierten.

3 Ergebnisse

40

3.1.3 Konstruktion der internen Amplifikationskontr olle und der Positiv-kontrolle

Falsch-negative Ergebnisse, die durch Inhibition von PCR-Reaktionen auftreten können,

wurden durch den Einsatz einer linearisierten Plasmid-DNA, die in jeder PCR-Reaktion kon-

kurrierend eingesetzt wurde, ausgeschlossen. Der Nachweis der Amplifikation dieser inter-

nen Amplifikationskontrolle (IAK), deren Sequenz bis auf den Austausch der Zielregion der

Hybridisierungssonde SDR1f durch Einbau eines komplett neuen Sequenzabschnittes iden-

tisch mit der Sequenz des Wildtyps war, erfolgte mit der LightCycler®-Red 705 markierten

Akzeptor-Sonde LMRST1. Konstruiert wurde die interne Amplifikationskontrolle über PCR-

Mutagenese mit den Primern SDip1f und SDip1r (Kap. 2.9.1.2). Nach Ligation der PCR-

Produkte in den Vektor pGEM®-T (Kap. 2.9.3), Transformation in E. coli XL-1 Blue Zellen

(Kap. 2.9.4.2), Kontrolle der Klone über PCR (Kap. 2.9.4.3) und Linearisierung der gereinig-

ten Plasmide mit der Restriktionsendonuclease Sca I (Kap. 2.9.6) wurde der Erfolg der Her-

stellung durch Sequenzierung (Kap. 2.10) und Alignment (Kap.2.11) mit der Sequenz des

STA1 Gens bestätigt (Abb. 3.3). Bei allen weiteren Versuchen wurde von der IAK je Reaktion

0,2 fg eingesetzt.

841-----------SD1f----------------------------------------900 IAK -------TGGCGAATACACTACTGAAGCTACCGCCCCTGTTACAACAGCTGTCACAACCA STA1 CTGGTACTGGCGAATACACTACTGAAGCTACCGCCCCTGTTACAACAGCTGTCACAACCA 901-------------------------------------------------------960 IAK CCGTTGTTACCACTGAATCCTCTACGGGTACTAACTCCGCTGGTAAGACGACAACTAGTT STA1 CCGTTGTTACCACTGAATCCTCTACGGGTACTAACTCCGCTGGTAAGACGACAACTAGTT 961----------SDF1f-----------------------SDR1f-LMRST1----1020 IAK ACACAACAAAGTCTGTACCAACCACCTATGTATCATTATCCGATACGTTCTTCCAGTGCC STA1 ACACAACAAAGTCTGTACCAACCACCTATGTATTTGACTTTGGCAAGGGCATTCT---CG 1021-----------------------------------------------------1080 IAK ATCAAAGCTGCGGCGGTGTATTTTCAAACAACGGCTCTTCGCAAGTGCAGCTGCGGGATG STA1 ATCAAAGCTGCGGCGGTGTATTTTCAAACAACGGCTCTTCGCAAGTGCAGCTGCGGGATG

1081-----------SD1r----------------------------1130 IAK TAGTCTTGATGAATGGGACAGTGGTATACG-------------------- STA1 TAGTCTTGATGAATGGGACAGTGGTATACGATTCAAACGGCGCTTGGGAC Abb. 3.3: Sequenzvergleich der IAK mit dem STA1 Gen

Das Alignment zeigt die Sequenzen der IAK des Real-Time PCR Nachweissystems für S. cerevisiae var. diastaticus und die Wildtyp Sequenz des STA1 Gens (GenBank Acc. No. X02649.1). Die Primer SD1f und SD1r sowie die Hybridisierungssonde SDF1f waren für beide Sequenzen spezifisch. Die Hybridisierungssonde SDR1f war für die Wildtyp-Sequenz und die Sonde LMRST1 für die IAK-Sequenz spezifisch. Die Markierung der Sonden SDR1f und LMRST1 mit unterschiedlichen Fluores-zenzfarbstoffen ermöglichte eine Unterscheidung zwischen IAK und Wildtyp Amplifikaten in der PCR.

3 Ergebnisse

41

Mit dem Einsatz einer Positivkontrolle (PK) können die eingesetzten Reagenzien und die

Herstellung des PCR-Mixes kontrolliert werden. Die PK wurde auf die gleiche Weise wie die

IAK hergestellt (Kap. 2.9.1.2), jedoch wurde nicht die gesamte Zielsequenz einer Sonde

ausgetauscht, sondern im Targetbereich der Sonde SDF1f eine Punktmutation eingefügt

(Abb. 3.4). Durch diese Punktmutation war eine Differenzierung zwischen der PK und positi-

ven Ergebnissen über die Schmelzkurven-Analyse im Kanal 640/Back 530 möglich. Diese

Differenzierung war notwendig, um ein positives Ergebnis, das durch Verschleppung von

Plasmid-DNA der PK in den Reaktionsansatz zustande kommen könnten, sicher ausschlie-

ßen zu können. Die Hybridisierungsonde SDF1 schmolz ca. 4 °C früher vom Amplifikat der

PK ab als beim Wildtyp (Abb. 3.5). Die PK war über den Schmelzhöchstwert (Maximum der

negativen ersten Ableitung der Fluoreszenz, aufgenommen über die Temperatur, -(d/dT)) bei

ca. 58 °C deutlich von positiven Proben zu unterscheiden, bei denen die Sonde SDF1f ab 62

°C abschmolz. In der Real-Time PCR wurden 5 fg je Reaktion eingesetzt.

841-----------SD1f----------------------------------------900 PK -------TGGCGAATACACTACTGAAGCTACCGCCCCTGTTACAACAGCTGTCACAACCA STA1 CTGGTACTGGCGAATACACTACTGAAGCTACCGCCCCTGTTACAACAGCTGTCACAACCA 901-------------------------------------------------------960 PK CCGTTGTTACCACTGAATCCTCTACGGGTACTAACTCCGCTGGTAAGACGACAACTAGTT STA1 CCGTTGTTACCACTGAATCCTCTACGGGTACTAACTCCGCTGGTAAGACGACAACTAGTT 961----------SDF1f-------------------------SDR1f---------1020 PK ACACAACAAAGGCTGTACCAACCACCTATGTATTTGACTTTGGCAAGGGCATTCTCGATC STA1 ACACAACAAAGTCTGTACCAACCACCTATGTATTTGACTTTGGCAAGGGCATTCTCGATC 1021-----------------------------------------------------1080 PK AAAGCTGCGGCGGTGTATTTTCAAACAACGGCTCTTCGCAAGTGCAGCTGCGGGATGTAG STA1 AAAGCTGCGGCGGTGTATTTTCAAACAACGGCTCTTCGCAAGTGCAGCTGCGGGATGTAG 1081----------SD1r-----------------------------1130 PK TCTTGATGAATGGGACAGTGGTATACG----------------------- STA1 TCTTGATGAATGGGACAGTGGTATACGATTCAAACGGCGCTTGGGACAGT Abb. 3.4: Sequenzvergleich der PK mit dem STA1 Gen

Das Alignment zeigt die Sequenzen der PK des Real-Time PCR Nachweissystems für S. cerevisiae var. diastaticus und die Wildtyp Sequenz des STA1 Gens (GenBank Acc. No. X02649.1). Die Primer SD1f und SD1r sowie die Hybridisierungssonde SDR1f waren für beide Sequenzen spezifisch. Die Hybridisierungssonde SDF1f war für die Wildtyp Sequenz 100-%ig spezifisch. Bei der PK bestannt im Bereich der Bindungsstelle der Sonde SDF1f die Nucleotidfehlbindung T:C. Bei der Schmelzkurven-Analyse verminderte diese Fehlbindung zwischen den Amplifikaten der PK und der Sonde SDF1f die Schmelztemperatur gegenüber dem Wildtyp um ca. 4 °C, sodass eine klare Abtrennung zwischen positiven Proben und der PK möglich war.

3 Ergebnisse

42

Abb. 3.5: Differenzierung zwischen der PK und posit iven Proben bei der Real-Time

PCR für S. cerevisiae var. diastaticus

Dargestellt ist die Schmelzkurven-Analyse im Kanal 640/Back 530, die bei der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus eine Differenzierung zwischen der PK und positiven Proben zuließ. Die Real-Time PCR wurde mit 2500 GÄ (blaue Linie), 1000 GÄ (grüne Linie), 100 GÄ (rote Linie) und 10 GÄ (blaue Punkte) quantifizierter, RNA-freier DNA (Kap. 2.6.2) von S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487) durchgeführt. Von der PK wurden 5 fg (schwarze Linie) eingesetzt und als Negativkon-trolle wurde PCR-H2O (rote Punkte) verwendet. 3.1.4 Spezifität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus

Die Spezifität der Real-Time PCR wurde mit 25 S. cerevisiae var. diastaticus Stämmen, 24

weiteren Saccharomyces Stämmen, 32 anderen, brauereirelevanten Hefearten und 18 Bak-

terienarten getestet. Nur die 25 S. cerevisiae var. diastaticus Stämme wurden nach mecha-

nisch/thermischer DNA-Extraktion (Kap. 2.6.1) mit dem System qualitativ nachgewiesen

(Tab. 3.1 und Abb. 3.6). Die Cp-Werte der Isolate lagen zwischen 15 und 25, da nicht quanti-

fizierte DNA eingesetzt wurde. Detaillierte Angaben zu den getesteten Stämmen zeigt die

Tabelle 6.1 im Anhang. Die IAK wurde in allen Reaktionsansätzen, die negativ im Kanal

640/Back 530 waren, amplifiziert und wurde demnach nicht durch eine konkurrierende Bil-

dung unspezifischer Amplifikate unterdrückt. Die Schmelzkurven-Analyse zeigte, dass bei

allen Stämmen die Sonden ihren Schmelzhöchstwert, bei der die Fluoreszenzabnahme ein

Maximum erreichte, bei ca. 62 °C hatten (Abb. 3.6).

3 Ergebnisse

43

Tab. 3.1: Spezifität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus

Getestete Gruppen Anteil positiv getesteter Stämme S. cerevisiae var. diastaticus 25/25 nicht-diastaticus Saccharomyces sp. 0/24 weitere Hefearten 0/32 Bakterienarten 0/18

Die Testung erfolgte mit DNA-Proben, die mit der mechanisch/thermischen Extraktionsmethode ge-wonnen wurden (Kap. 2.6.1). Angegeben wurde die Anzahl an Stämmen, die mit der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus nachgewiesen wurden, an der Gesamtheit der getesteten Stämme.

Abb. 3.6: Amplifikation und Schmelzkurven-Analyse d es STA Genfragments von S.

cerevisiae. var. diastaticus Stämmen

Die Real-Time PCR wurde mit DNA von 25 S. cerevisiae var. diastaticus Stämmen (blaue Linien) ge-testet. Die DNA-Extraktion erfolgte mit der mechanisch/thermischen Methode (Kap. 2.6.1), nachdem die S. c. var. diastaticus Stämme 48 Stunden in YM-Medium angezogen wurden. Zur Kontrolle der PCR wurden 5 fg der PK (schwarze Linie) eingesetzt. Als Negativkontrolle (rote Linie) wurde undotier-tes YM-Medium zusammen mit den Hefestämmen aufgearbeitet und in der PCR eingesetzt. Die Versuche zur Spezifität wurden auch ohne IAK durchgeführt und anschließend über Aga-

rosegelelektrophorese aufgetrennt, um die Länge der gebildeten Amplifikate zu kontrollieren

und mögliche unspezifische PCR-Produkte zu detektieren. Die IAK wurde bei diesen Versu-

chen nicht eingesetzt, da das gebildete Fragment mit 263 bp fast die gleiche Länge wie das

beim Wildtyp gebildete Amplifikat hatte und demnach über Agarosegelelektrophorese nicht

von diesem zu unterscheiden gewesen wäre. Die mit DNA von S. cerevisiae var. diastaticus

amplifizierten PCR-Produkte hatten alle eine Länge von 260 bp. Bei den getesteten „Nicht“-

Targetorganismen wurde keine Amplifikation beobachtet. Die Abbildung 3.7 zeigt Agarose-

gelelektrophorese Ergebnisse nach Real-Time PCR mit DNA einiger S. cerevisiae var. di-

astaticus Stämme (Typstämme und Brauereiisolate) und nahe verwandter Saccharomyces

sp..

3 Ergebnisse

44

Abb. 3.7: Agarosegelelektrophorese nach Real-Time P CR mit dem S. cerevisiae var. diastaticus System

Die Real-Time PCR wurde ohne IAK und mit DNA-Proben, die mit der mechanisch/thermischen Ex-traktionsmethode gewonnen wurden (Kap. 2.6.1), durchgeführt. Die Agarosegelelektrophorese wurde mit je 5 µl der Reaktionsansätze in einem 2-%igen Gel durchgeführt (Kap. 2.8). A.:

1: Molekulargewichtsmarker VI 7: S. cerevisiae var. diastaticus (VTT C-70060) 2: Saccharomyces cerevisiae (DSM 1333) 8: S. cerevisiae var. diastaticus (VTT C-82101) 3: S. cerevisiae var. diastaticus (BCD 1257) 9: Saccharomyces pastorianus (DSM 6580) 4: Saccharomyces exiguus (BCD 1491) 10: Saccharomyces bayanus (DSM 70412) 5: Saccharomyces exiguus (BCD 1493) 11: S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487) 6: S. cerevisiae var. diastaticus (VTT C-68059) 12: Negativkontrolle

B.:

1: Molekulargewichtsmarker VI 8: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei A) 2: S. cerevisiae (Brauerei D, Brauhefe) 9: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei A) 3: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei D) 10: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei A) 4: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei D) 11: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei A) 5: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei B) 12: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei A) 6: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei B) 13: S. cerevisiae var. diastaticus (BCD 1257) 7: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei A) 14: Negativkontrolle

3 Ergebnisse

45

Die Anwendbarkeit des Enzyms Uracil-N-Glycosylase (UNG), das zum Abbau von Amplifika-

ten aus vorherigen Reaktionen bei jeder PCR-Reaktion eingesetzt wurde, wurde mit aufge-

reinigten (Kap. 2.9.2) und quantifizierten Amplifikaten (Kap. 2.7.2) von S. c. var. diastaticus

(DSM 70487) getestet. Amplifikatmengen zwischen 103 und 107 Amplifikaten je Reaktion

wurden mit der UNG vollständig abgebaut und die Kontrollen ohne UNG wurden alle amplifi-

ziert (Tab. 3.2).

Tab. 3.2: Abbaubarkeit von Amplifikaten des STA Gens mit dem Enzym UNG

Cp-Werte im Kanal 640/Back 530 Amplifikatmenge [Kopien/Reaktion] ohne UNG mit UNG

103 28,13 negativ 104 25,05 negativ 105 20,70 negativ 106 17,96 negativ 107 14,97 negativ

Die Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus wurde mit bzw. ohne 0,1 U/Reaktion UNG mit unterschiedlichen Mengen an Amplifikaten des STA Gens von S. cerevisiae var. diastaticus durchge-führt. Die Amplifikate wurden zuvor aufgereinigt und quantifiziert (Kap. 2.9.2 und 2.7.2). 3.1.5 Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus

Die Sensitivität der Real-Time PCR wurde mit fluorometrisch quantifizierter, RNA- und Prote-

in-freier DNA (Kap. 2.6.2 und Kap. 2.7.1) der S. cerevisiae var. diastaticus Stämme DSM

70487 und VTT C-82101 getestet. Außerdem wurde das System unter Einbeziehung der

mechanisch/thermischen DNA-Extraktion mit dotiertem YM-Medium evaluiert. Das YM-

Medium wurde mit 102, 103 oder 104 Zellen/ml S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487)

und zusätzlich mit 108 Zellen/ml S. cerevisiae (DSM 1333) dotiert (Kap. 2.15.3). Mit den S.

cerevisiae Zellen als Begleitflora wurde getestet, ob sich eine lineare Amplifikation aufgrund

der auch bei S. cerevisiae vorhandenen Bindungssequenzen der Primer SD1f und SD1r in

den Genen SGA1 und MUC1 störend auf das PCR-System auswirkt. Beide Instrumente für

den mechanischen Zellaufschluss (MagNA Lyser und Disruptor Genie) wurden getestet.

Die mit quantifizierter DNA ermittelte Nachweisempfindlichkeit des PCR-Systems lag zwi-

schen 5 (96 % positive Proben) und 10 (100 % positive Proben) Genomäquivalenten pro

Reaktionsansatz (Tab. 3.3 und Abb. 3.8). 1 GÄ wurde noch in 11 von 24 getesteten Proben

nachgewiesen. Bei einer angenommenen Genomgröße von S. cerevisiae von 12,2 Mbp

(GenBank) entsprach 1 GÄ 13,3 fg DNA. Unterschiede zwischen den ermittelten Cp-

Mittelwerten der beiden untersuchten S. cerevisiae var. diastaticus Stämme wurden nicht

festgestellt.

3 Ergebnisse

46

Tab. 3.3: Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus

S. c. var. diastati-cus Stamm

DNA Konzentration [GÄ/Reaktion]

Anteil positiver Proben

Cp-Mittelwerte (640/Back 530)

1000 12/12 = 100 % 27,59 ± 0,17 100 12/12 = 100 % 30,64 ± 0,16 50 12/12 = 100 % 31,49 ± 0,28 25 12/12 = 100 % 32,19 ± 0,31 10 12/12 = 100 % 32,85 ± 0,44 5 12/12 = 100 % 32,95 ± 0,34

DSM 70487

1 6/12 = 50 % 33,29 ± 0,79 1000 12/12 = 100 % 27,81 ± 0,28 100 12/12 = 100 % 30,87 ± 0,22 50 12/12 = 100 % 31,63 ± 0,24 VTT C-82101 25 12/12 = 100 % 32,35 ± 0,40 10 12/12 = 100 % 32,99 ± 0,58 5 11/12 = 92 % 33,04 ± 0,35 1 5/12 = 42 % 33,31 ± 0,98

Die Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus wurde mit quantifizierter, RNA-freier DNA (Kap. 2.6.2) von zwei S. cerevisiae var. diastaticus Stämmen (DSM 70487 und VTT C-82101) getestet.

Abb. 3.8: Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus

Dargestellt sind die Amplifikationskurven im Kanal 640/Back 530, die mit der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus mit 1000 GÄ (schwarze Linie), 100 GÄ (rote Linie), 50 GÄ (grüne Linie), 25 GÄ (baue Linie), 10 GÄ (schwarze Punkte), 5 GÄ (rote Punkte) und 1 GÄ (grüne Punkte) quantifizier-ter, RNA-freier DNA (Kap. 2.6.2) von S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487) generiert wurden. Als Negativkontrolle wurde PCR-H2O (blaue Punkte) verwendet.

3 Ergebnisse

47

Die Sensitivität des Real-Time PCR-Systems unter Einbeziehung der Probenaufarbeitung

und bei einem Hintergrund von 108 Zellen/ml S. cerevisiae lag zwischen 102 und 103 Zel-

len/ml (Tab. 3.4 und Abb. 3.9). Umgerechnet auf das in der PCR eingesetzte Probenvolumen

von 5 µl entsprach dies ca. 2,5 bis 25 GÄ pro Reaktionsansatz, wenn eine 100-%ige DNA-

Extraktion vorausgesetzt wird. Durch die mechanisch/thermische DNA-Extraktion oder die

Begleitflora entstanden demnach keine Sensitivitätsverluste. Beide Instrumente waren für

den mechanischen Zellaufschluss (MagNA Lyser oder Disruptor Genie) geeignet. Über die

Schmelzkurven-Analyse waren positive Proben von der PK zu unterscheiden (Abb. 3.9).

Tab. 3.4: Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus bei einer

hohen Begleitflora

Instrument S. c. var. diastaticus [Zellen/ml]



104 6/6 = 100 % 31,13 ± 0,40 103 6/6 = 100 % 33,05 ± 0,19 MagNA Lyser 102 4/6 = 67 % 33,82 ± 0,30

104 6/6 = 100 % 30,58 ± 0,63 Disruptor Genie 103 6/6 = 100 % 33,43 ± 0,99 102 3/6 = 50 % 34,52 ± 0,75

Die Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus wurde mit dotierten Proben, die mecha-nisch/thermisch mit dem MagNA Lyser oder Disruptor Genie Instrument aufgearbeitet wurden, getes-tet (Kap. 2.6.1). Hierfür wurde YM-Medium mit 108 Zellen/ml S. cerevisiae (DSM 1333) und der jewei-ligen Konzentration an S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487) dotiert.

Abb. 3.9: Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus bei einer hohen Begleitflora

Dargestellt sind die Amplifikationskurven (links) und die Schmelzkurven-Analyse (rechts), die mit der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus und mechanisch/thermisch aufgearbeiteten, dotierten Proben (Kap. 2.6.1) generiert wurden. Die Proben (YM-Medium) waren mit 104 Zellen/ml (grüne Linie), 103 Zellen/ml (rote Linie), 102 Zellen/ml (blaue Linie) S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487) do-tiert. Alle Proben waren zusätzlich mit 108 Zellen/ml S. cerevisiae (DSM 1333) dotiert. Als Kontrollen wurden eine undotierte Probe (grüne Punkte) und die PK (schwarze Linie) mitgeführt.

3 Ergebnisse

48

Die Amplifikation der internen Amplifikationskontrolle wurde in Proben, die nur mit 108 Zel-

len/ml S. cerevisiae dotiert wurden, nicht negativ beeinflusst (Tab. 3.5).

Tab. 3.5: Amplifikation der IAK der Real-Time PCR f ür S. cerevisiae var. diastaticus

bei einer hohen Begleitflora

Instrument S. cerevisiae [Zellen/ml]



MagNA Lyser 108 8/8 = 100 % 33,90 ± 0,80

Disruptor Genie 108 8/8 = 100 % 34,29 ± 0,52

Die IAK der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus wurde mit Proben (YM-Medium), die mit 108 Zellen/ml S. cerevisiae (DSM 1333) dotiert und mechanisch/thermisch mit dem MagNA Lyser oder Disruptor Genie Instrument aufgearbeitet wurden, getestet (Kap. 2.6.1). 3.1.6 Kompatibilität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus

mit unterschiedlichen Probenmatrices

Die Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus wurde mit 16 unterschiedlichen Anrei-

cherungsmedien, Prozessproben und Endprodukten getestet (Herkunft siehe Kap. 2.4). Do-

tiert wurden je 1 ml Probe mit 103 oder 104 Zellen/ml S. cerevisiae var. diastaticus (DSM

70487). Die mechanisch/thermische Aufarbeitung der Proben erfolgte zum Vergleich mit dem

MagNA Lyser und Disruptor Genie Instrument.

104 Zellen/ml wurden in allen Probenmatrices unabhängig vom verwendeten Probenaufarbei-

tungsinstrument 100-%ig nachgewiesen (Tab. 3.6). 103 Zellen/ml waren in den Proben SSL

Bouillon, Desinfektionsmittelwanne, Pils (Bitburger), Biermixgetränk (Bibop) im Gegensatz zu

den restlichen Probenmatrices nicht 100-%ig nachweisbar.

Tab. 3.6: Eignung der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus in Kombinati-

on mit der mechanisch/thermischen Aufarbeitung für unterschiedliche Pro-benmatrices

Anteil positiver Proben im Kanal 640/Back 530 Probenmatrix Instrument

104 Zellen/ml 103 Zellen/ml MagNA Lyser 3/3 = 100 % 0/3 = 0 % SSL-Bouillon Disruptor Genie 3/3 = 100 % 2/3 = 67 % MagNA Lyser 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % SSL-Bouillon/alkoholfreies

Bier (50/50 v/v) Disruptor Genie 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % MagNA Lyser 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % NBB-Bouillon Disruptor Genie 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % MagNA Lyser 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % MRSF-Bouillon Disruptor Genie 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % MagNA Lyser 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % Vorwürze Disruptor Genie 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % MagNA Lyser 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % Würze (Pfanne voll) Disruptor Genie 3/3 = 100 % 3/3 = 100 %

3 Ergebnisse

49


Anteil positiver Proben im Kanal 640/Back 530 Probenmatrix Instrument

104 Zellen/ml 103 Zellen/ml MagNA Lyser 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % Würze (Plattenkühler-

Auslauf) Disruptor Genie 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % MagNA Lyser 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % Retourwasser Disruptor Genie 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % MagNA Lyser 3/3 = 100 % 1/3 = 33 % Desinfektionsmittelwanne Disruptor Genie 3/3 = 100 % 0/3 = 0 % MagNA Lyser 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % Jungbier Disruptor Genie 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % MagNA Lyser 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % Wasser aus Kastenwäscher Disruptor Genie 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % MagNA Lyser 3/3 = 100 % 2/3 = 67 % Pils (Bitburger) Disruptor Genie 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % MagNA Lyser 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % Light Bier (Drive) Disruptor Genie 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % MagNA Lyser 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % Biermixgetränk (Bibop) Disruptor Genie 3/3 = 100 % 2/3 = 67 % MagNA Lyser 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % Schwarzbier (Köstritzer) Disruptor Genie 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % MagNA Lyser 3/3 = 100 % 3/3 = 100 % Alkoholfreier Bier Disruptor Genie 3/3 = 100 % 3/3 = 100 %

1ml der jeweiligen Probenmatrix wurden mit 103 bzw. 104 Zellen/ml S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487) dotiert, mechanisch/thermisch aufgearbeitet (Kap. 2.6.1) und je 5 µl in der Real-Time PCR eingesetzt. Alle undotierten Proben und alle dotierten Proben, die im Kanal 640/Back 530 nega-tiv waren, waren im für die IAK spezifischen Kanal 705/Back 530 positiv. 3.1.7 Anwendbarkeit der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus

in der Praxis

Die Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus und die mechanisch/thermische Aufar-

beitungsmethode wurde von vier Brauereien getestet. Die Testung gliederte sich in drei Ver-

suchsteile. Im ersten Versuchsteil wurden Proben aus der Routine getestet, um die Robust-

heit des Systems in Bezug auf die interne Amplifikationskontrolle zu testen. Der zweite Ver-

suchsteil umfasste den Test von S. cerevisiae var. diastaticus Reinkulturen (Typstämme o-

der Eigenisolate der Brauereien). Die Sensitivität des Systems wurde in einem dritten Teil mit

Verdünnungsreihen von unterschiedlichen, dotierten Probenmaterialien getestet (Kap. 2.16).

3.1.7.1 Versuchsteil 1: Robustheit

Je Probenart wurden zwei Probenvolumina aufgearbeitet und mit dem PCR-System im Dup-

likat getestet (Tab. 3.7). Bis auf eine Probe (Hygieneabstrich, Brauerei D) wies keine Probe

eine Kontamination mit S. cerevisiae var. diastaticus auf. Die IAK wurde nur bei den Pro-

benmatrices Presshefe (Brauerei C), Hefe-Lagertank (Brauerei C) und Laugetank (Brauerei

B) inhibiert. Die Reduktion des Probevolumens von 1,0 ml auf 0,1 ml beseitigte die Inhibition

3 Ergebnisse

50

bei den Probematrices Presshefe und Hefe-Lagertank jedoch nicht bei der Probenmatrix

Laugetank. Eine Reduktion des Probevolumens verbesserte auch bei den Proben Sauer-

gut 3, Hefetank, Säuretank (Brauerei B) und Sirup (Brauerei D) die Amplifikation der IAK. Die

drei eingesetzten Methoden zur Probenaufarbeitung (MagNA Pure DNA Isolation Kit III

[Brauerei A], mechanisch/thermischer Aufschluss mit MagNA Lyser [Brauerei C und D] oder

Disruptor Genie [Brauerei B]) waren für die Anwendung bei unterschiedlichen Probenmatri-

ces geeignet.

Tab. 3.7: Ergebnisse des Versuchsteils 1: Robusthei t

Cp-Werte F3/BackF1 oder 705/Back530 je Probenvolumen Brauerei Probe

1,0 ml 0,1 ml A Würze 35,48 34,32 33,62 33,43 Erntehefe 34,01 34,12 33,32 34,27 Pallanlage = Hefebiergewinnung 33,91 34,05 34,42 34,49 Hefereinzucht 34,40 33,60 34,06 33,92 Filtereinlauf + Kieselgur 34,15 34,23 34,02 33,80 Recycling-Wasser mit Desinfektionsmittel 34,47 34,16 34,28 33,80 Kronenkorken 3 Tage in Pils 33,72 34,52 33,63 34,48 Spülwasserflasche mit Ringerlösung ausgespült 33,63 34,00 34,10 33,73 Abstrich verkeimte Zapfanlage mit Fremdhefe 33,60 34,09 33,93 34,31 Lactobacillus lindneri in betriebseigenem Medium 34,65 33,79 33,73 34,18 0,5 l Dose Schwarzbier vor der Pasteurisierung 34,51 33,97 33,89 34,07 0,33 l Dose Pils aus der Abfüllung 34,11 33,79 33,93 34,61 B Sauergut 2 34,22 33,97 34,56 32,94 Sauergut 3 40,28 34,69 35,13 33,91 Jungbierkühler 34,27 33,18 35,22 34,59 Hefetank 39,25 36,41 35,17 33,62 Säuretank 34,46 > 40 35,93 32,61 Laugetank - - - - Seperator-Unfiltrat 35,18 34,10 35,07 33,55 Puffertank Unfiltrat 35,15 34,06 34,54 34,17 KG-Filter 36,25 33,30 35,25 34,47 ZHF-Filter 34,30 33,83 35,26 34,00 Spülwasser 35,29 35,12 33,25 33,87 Alkoholfreies Bier 32,97 33,47 33,57 34,51 C Presshefe - - 34,63 34,55 Hefe-Lagertank - - 34,04 35,68 Anzuchttank 33,69 34,10 33,23 32,82 Würzekühler 33,09 32,88 33,08 33,60 Standwasser 33,11 32,48 32,32 32,72 Fermentationstank (Tag 0) 33,12 34,06 33,30 32,50 Fermentationstank (Tag 3) 34,64 34,54 33,16 32,74 Fermentationstank (RUH) 33,63 33,18 33,08 33,11 Lagerbiertank 32,26 32,86 32,21 32,68 Filtration 32,86 32,76 32,90 33,49 Helles Bier 33,06 32,62 33,18 33,22 Flasche vor der Pasteurisation 32,91 32,81 32,84 33,07 Flasche nach der Pasteurisation 32,25 32,70 32,94 32,93 Würze 33,30 32,51 32,50 33,03

3 Ergebnisse

51


Cp-Werte F3/BackF1 oder 705/Back530 je Probenvolumen Brauerei Probe

1,0 ml 0,1 ml D Pils 34,28 33,78 33,76 33,66 Pils+NBB-C Bouillon 35,01 34,51 33,87 35,10 MRSF Bouillon (Charge 1) 34,30 34,15 34,61 33,56 MRSF Bouillon (Charge 2) 34,43 33,49 34,53 34,27 Kieselgur Einlauf 33,87 33,75 33,77 33,80 Reinzuchthefe 33,96 34,01 34,24 33,99 Jungbier 34,33 33,99 33,89 34,55 Hefebier 34,01 34,09 33,68 34,06 Anstellwürze 33,51 35,02 33,84 34,49 MRS Bouillon 34,18 33,82 33,70 34,14 Hygieneabstrich in SSL Bouillon* 32,23 31,86 32,34 32,87 Sirup (für die Herstellung von Biermixgetränken) 35,02 38,02 33,81 34,02

Alle Proben der Brauereien B, C und D wurden mit der mechanisch/thermischen DNA-Extraktionsmethode (Kap. 2.6.1) behandelt und 5 µl des Eluats in der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus eingesetzt. Die Proben der Brauerei A wurden mit dem MagNA Pure DNA Isolation Kit III behandelt. Die Amplifikation der IAK wurde im Kanal F3/Back F1 bzw. 640/Back 530 detektiert. *: Probe war positiv im Kanal F2/Back F1 (1,0 ml: Cp-Werte 32,09 und 31,71; 0,1 ml: Cp-Werte 32,17, 32,71). 3.1.7.2 Versuchsteil 2: Spezifität

Alle 19 Reinkulturen (Eigenisolate oder Stämme aus Stammsammlungen) wurden bei den

Brauereien mit dem Real-Time PCR-System als S. cerevisiae var. diastaticus identifiziert

(Tab. 3.8). Bei der Schmelzkurven-Analyse waren die Proben mit einem Schmelzhöchstwert

oberhalb von 62 °C eindeutig von der PK mit einem Schmelzhöchstwert von ca. 58 °C zu

unterscheiden.

Tab. 3.8: Ergebnisse des Versuchsteils 2: Spezifitä t

Brauerei S. c. var. diastaticus Stämme Ergebnis A 4 Eigenisolate positiv DSM 70487 positiv B 5 Eigenisolate positiv C 2 Eigenisolate positiv DSM 70487 positiv VTT C-82101 positiv D 5 Eigenisolate positiv

Die Proben der Hefestämme wurden mit dem mechanisch/thermischen DNA-Extraktionsverfahren aufgearbeitet (Kap. 2.6.1) und mit der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus getestet. 3.1.7.3 Versuchsteil 3: Sensitivität

Unabhängig von der Probenaufarbeitung und den Probenmatrices war bei 17 von 19 Pro-

benmatrices ein Kontaminationslevel von 102 Zellen/ml mit der Real-Time PCR für S. cerevi-

siae var. diastaticus nachweisbar (Tab. 3.9 und Abb. 3.10). Nur bei den Probenmatrices

Reinzuchthefe und SSL-Bouillon lag der nachweisbare Level bei 103 Zellen/ml.

3 Ergebnisse

52

Tab. 3.9: Ergebnisse des Versuchsteils 3: Sensitivi tät

Cp-Wert (640/Back530 bzw. F2/BackF1) je Zellzahl [Zellen/ml] Brauerei Probenmatrix

104 103 102 undotiert

A Jungbier 29,28 32,98 33,17 - Stabibier 29,70 32,34 33,88 - Pils 31,53 33,12 34,05 - Würze 30,43 32,96 34,54 - B MRS Bouillon 27,74 30,88 32,14 - Würze 26,94 30,47 33,92 - NBB Bouillon 26,18 30,47 33,92 - Dunkles Bier 27,50 30,52 32,61 - Biermixgetränk 27,93 29,14 32,55 - C Hefe-Lagertank 29,63 31,44 33,60 - Fermentationstank 29,62 32,86 33,98 - Biertank (hell) 29,52 32,70 32,50 - Lagerbiertank 29,66 32,11 32,84 - Flaschenbier 29,74 32,62 33,81 - D filtriertes Pils 30,90 33,16 33,65 - Jungbier 30,54 33,44 34,12 - Reinzuchthefe 31,51 33,56 - - SSL-Bouillon 31,30 33,87 - - MRSF Bouillon 30,76 33,32 33,56 -

Die Proben wurden bei den Brauereien dotiert und undotiert mechanisch/thermisch aufgearbeitet (Kap. 2.6.1) und mit der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus untersucht.

Abb. 3.10: Real-Time PCR Nachweis von S. cerevisiae var. diastaticus in Flaschenbier

Flaschenbier wurde bei der Brauerei C mit 104 Zellen/ml (schwarze Linie), 103 Zellen/ml (rote Linie) bzw. 102 Zellen/ml (blaue Linie) dotiert, mechanisch/thermisch aufgearbeitet (Kap. 2.6.1) und mit der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus untersucht. Die Auswertung der Amplifikation erfolgte im Kanal 640/Back 530. Als Negativkontrolle wurde eine undotierte Probe (grüne Linie) mitgeführt.

3 Ergebnisse

53

3.2 Entwicklung einer Real-Time Consensus-PCR für H efen

3.2.1 Auswahl des EF-3 Gens als Zielregion

Das EF-3 Gen wurde bisher teilweise oder vollständig von den Hefen S. cerevisiae, C. albi-

cans, C. maltosa, C. melibiosica, C. zeylanoides, Cr. neoformans, K. lactis, P. pastoris, Sch.

pombe und Y. lipolytica sequenziert (Blakely 2001, Di Domenico et al. 1992, Mita et al. 1997,

Myers et al. 1992, Qin et al. 1990, Sandbaken et al. 1990a,b, Uritani et al. 1999). Aus dem

Reich der Eukaryoten liegen außerdem von dem humanpathogenen Schimmelpilz Aspergil-

lus fumigatus (Acc. No. XM 743850) und der hefeähnlichen Art Pneumocystis carinii Se-

quenzen dieses Gens vor (Ypma-Wong et al. 1992). Der Elongationsfaktor 3 wurde als es-

sentielles Protein der Elongationsphase bei der Translation von mRNA zum Protein be-

schrieben und bisher wurde kein entsprechendes Gegenstück bei Prokaryoten oder anderen

Eukaryoten als bei Hefen und Schimmelpilzen entdeckt (Dasmahapatra und Chakraburtty

1981, Hutchison et al. 1984, Sandbaken et al. 1990a,b, Skogerson und Wakatama 1976).

Bei dem Chlorella Virus CVK2 und E. coli wurden zwar je ein Gen mit teilweiser Sequenz-

homologie zum EF-3 Gen entdeckt, (Belfield et al. 1995, Kiel et al. 1999, Yamada et al.

1993) die ausgewählte Sequenzregion zwischen den beiden Walker Signaturen der zweiten

ATP-Bindekassette wurde jedoch als spezifisch für das EF-3 Gen beschrieben (Abb. 3.11)

(Uritani et al. 1999).

Abb. 3.11: Schematische Darstellung der Aminosäures equenz des Elongationsfaktors 3 von Hefen

Der Elongationsfaktor 3 besitzt zwei ATP-Bindungskassetten mit je einer Walker A und B Signatur (schwarz). Innerhalb der zweiten ATP-Bindungsstelle liegt der für den Elongationsfaktor 3 spezifische Sequenzbereich (grau), der als Target für die Real-Time Condsensus-PCR für Hefen ausgewählt wur-de. Die 5´-Primer (rot) und 3´-Primer (blau), mit denen zur Sequenzierung Abschnitte des EF-3 Gens von unterschiedlichen Hefearten amplifiziert wurden, wurden mit Angaben zu deren Position darge-stellt.

HS14/III-VIII 848-856

Walker B

EF-3 spezifische Sequenz 768-873

NH

1

COOH

1044

HS10 758-764

HS12/IV-IX 758-765

HSwb1 565-575

HS09 874-879

HSabc3 898-908 HS03 435-441

HS04 960-965

Walker B Walker A Walker A

3 Ergebnisse

54

3.2.2 Sequenzierung und Alignment des EF-3 Genbereichs

Aufbauend auf einem Alignment der bereits bekannten EF-3 Gen Sequenzen von C. albi-

cans (Acc. No. AF038153), C. maltosa (Acc. No. AB018532), C. melibiosica (Acc. No.

AB018533), C. zeylanoides (Acc. No. AB018534), Cr. neoformans (Acc. No. AF316889), K.

lactis (Acc. No. AB018535), P. pastoris (Acc. No. AB018536), Sch. pombe (Acc. No.

AB018538) und Y. lipolytica (Acc. No. AB018537) wurden Primer entwickelt, um den EF-3

spezifischen Sequenzbereich einer größeren Anzahl an Hefen zu amplifizieren und an-

schließend zu sequenzieren (Kap. 2.9 und 2.10) (Abb. 3.11). Außerdem wurde ein von Urita-

ni et al. (1999) beschriebenes Primerpaar (HS03/04) verwendet. Die Primer HS10 und HS09

wurden am 5´-Ende um ein Nucleotid mit der Base Adenin verlängert, um die Ligationseffi-

zienz der PCR-Produkte in den Vektor pGEM®-T zu erhöhen.

Mit dem Primerpaar HS10/09 wurde mit der DNA folgender 49 Hefestämme direkt oder über

eine Nested-PCR ein ca. 367 bp großes Fragment amplifiziert und sequenziert. Bei der

Nested-PCR wurde zunächst ein 1,6 kbp großes PCR-Produkt mit dem Primerpaar

HS03/HS04 amplifiziert und anschließend 1:1000-verdünnt eingesetzt.

C. albicans (ATCC 10231) C. glaebosa (CBS 5691) C. intermedia (BCD 685) C. krusei (BCD 689) C. maltosa (BCD 806) C. parapsilosis (ATCC 20384) C. rugosa (BCD 814) C. sake (BCD 1054) C. santamariae (CBS 4261) C. tenuis (BCD 819) C. tropicalis (ATCC 20326) C. vini (DSM 70184) C. zeylanoides (BCD 690) Ci. matritensis (BCD 1062) Cl. lusitaniae (DSM 70102) Deb. etchelsii (ATCC 20126) Deb. hansenii (BCD 3512) Deb. hansenii (BCD 589) Deb. marama (ATCC 11627) En. fibuliger (BCD 3514) G. selenospora (DSM 3431) Hyp. burtonii (BCD 859) Hyp. burtonii (DSM 3505) I. orientalis (CBS 5147) K. marxianus (BCD 2563) K. marxianus (BCD 5186) K. marxianus (BCD 811) K. marxianus (DSM 70106) K. marxianus (DSM 70792) Ka. unispora (BCD 877) L. elongisporus (DSM 70320) La. thermotolerans (CBS 6340) M. pulcherrima (DSM 70321) P. angusta (DSM 70277) P. farinosa (BCD 861) P. fermentans (BCD 711) P. fermentans (DSM 70090) P. guilliermondii (BCD 804) P. ohmeri (BCD 862) S. bayanus (BCD 1256) S. bayanus (BCD 1392) S. cerevisiae (DSM 1333) S. c. var. diastaticus (BCD 1257) S. pastorianus (BCD 728) T. delbrueckii (DSM 70607) Z. bailii (BCD 1424) Z. rouxii (ATCC 48230) Sch. pombe (BCD 773) Tr. cutaneum (DSM 70684)

Mit dem Primerpaar HS10/04 wurde mit der DNA folgender 32 Hefestämme direkt oder in

einer Semi-Nested PCR ein ca. 624 bp großes Fragment amplifiziert und sequenziert. Bei

der Semi-Nested PCR wurde zunächst ein 1,6 kbp großes PCR-Produkt mit dem Primerpaar

HS03/HS04 amplifiziert und anschließend 1:1000-verdünnt eingesetzt.

C. boidinii (DSM 70034) C. catenulata (DSM 70136) C. diddensiae (DSM 70042) C. ernobii (DSM70858) C. glabrata (BCD 8932) C. haemulonii (DSM 70624) C. multigemmis (DSM 70862) C. solani (BCD 818) C. versatilis (DSM 6956) D. bruxellensis (DSM 3429) D. bruxellensis (DSM 70726) D. custersiana (DSM 70736) En. fibuliger (DSM 70554) H. guilliermondii (DSM 70285) H. uvarum (ATCC 9774) H. uvarum (BCD 3526) H. vineae (DSM 70283) P. anomala (BCD 1082) P. anomala (DSM 70783) P. canadensis (CBS 601) P. carsonii (DSM 70392) P. membranaefaciens (DSM S. bayanus (DSM 70412) S. c. var. diastaticus (DSM 70487) 70178) S. exiguus (MUCL 29838) S. pastorianus (DSM 6580) Sch. octosporus (DSM 70573) Y. lipolytica (BCD 2556) Y. lipolytica (BCD 2003) Z. bisporus (DSM 70415) Z. florentinus (DSM 70506) Z. microellipsoides (DSM 6959)

3 Ergebnisse

55

Kein spezifisches PCR-Produkt wurde mit den Primerpaaren HS03/04, HS10/04 oder

HS10/09 mit Ausnahme von Tr. cutaneum von Hefen der Unterabteilung Basidiomycota

amplifiziert. Daher wurde das degenerierte Primerpaar HSwb1/abc3 aufgrund der Sequenz-

informationen, die über die Walker B Sequenzbereiche vorlagen, konstruiert. Ein ca. 1032 bp

großes PCR Produkt wurde von folgenden Hefen amplifiziert und sequenziert:

Bul. dendrophila (DSM 70745) Cr. curvatus (BCD 2578) Cr. laurentii (BCD 824) R. minuta (DSM 70408)

Ein ca. 263 bp langes PCR Fragment wurde von folgenden Hefen mit dem Primermix aus

den 5´-Primern HS12/IV-IX und den 3´-Primern HS14/III-VIII, die aufgrund der Sequenzin-

formationen der zuvor sequenzierten Hefen der Unterabteilung der Basidiomycota konstruiert

wurden, amplifiziert und anschließend sequenziert:

Cr. albidus (DSM 70197) Cr. curvatus (DSM 70022) Cr. flavus (BCD 823) Cr. humicola (DSM 70067) R. glutinis (BCD 3530) Sp. johnsonii (BCD 4982) Sp. johnsonii (BCD 778) Sp. johnsonii (DSM 70847)

Die Abbildung 6.1 im Anhang zeigt das vollständige Alignment (Kap. 2.11) der sequenzierten

Nucleinsäuresequenzen des EF-3 Gen Abschnitts von der Position 2272 bis 2637 (Amino-

säureposition 758 bis 879, S. cerevisiae Sequenz) unter Einbeziehung der bereits bekannten

Sequenzen.

3.2.3 Sequenzvergleich des EF-3 Genbereichs

Die Unterabteilungen der Ascomycota und der Basidiomycota waren aufgrund der Sequenz-

information des EF-3 Genabschnitts deutlich von einander zu unterscheiden. Die Überein-

stimmung der Aminosäuresequenz lag zwischen den Vertretern der beiden Unterabteilungen

unter 35 % (Tab. 6.3). Die prozentuale Übereinstimmung innerhalb der Unterabteilung der

Basidiomycota betrug mindestens 67 % (Tab. 6.3). Hefen aus der Klasse der Hemiascomy-

cetes (Ordnung Saccharomycetales) wiesen untereinander eine Übereinstimmung in der

Aminosäuresequenz von mindestens 68 % auf (Tab. 6.2). Die Gattung Schizosaccharomy-

ces als einziger Vertreter der Klasse der Archiascomycetes sowie die Gattung Dekkera ho-

ben sich als monophyletische Einheiten deutlich von den restlichen Hefen der Klasse der

Hemiascomycetes ab (Abb. 3.12). Weitere monophyletische Gattungen waren in dem Den-

dogramm (Abb. 3.12) nicht zu erkennen. Die Gattung Saccharomyces wies große sequen-

zielle Übereinstimmung mit den Gattungen Kluyveromyces, Zygosaccharomyces und Toru-

laspora auf. Variationen der Aminosäuresequenz waren auch unter Stämmen der gleichen

Art vorhanden, da z. B. die Arten S. pastorianus und S. bayanus keine monophyletischen

Gruppen bildeten. Aufgrund dieser Sequenzvergleiche wurden drei Bereiche der Aminosäu-

resequenz ausgewählt, die als Basis für ein Primer- und Sondendesign dienten.

3 Ergebnisse

56

3 Ergebnisse

57

Abb. 3.12: Dendrographische Auswertung der EF-3 Gensequenzen

Der Baum basiert auf den sequenzierten EF-3 Genabschnitten von Hefen der Unterabteilung der As-comycota (App. 6.1 im Anhang) und wurde unter Verwendung der Neighbour-Joining Methode (Saitou und Nei 1987) konstruiert (Kap. 2.11). Alle nicht in dieser Arbeit generierten Sequenzen sind mit ihren GenBank Zugangsnummern angegeben. Die genauen prozentualen Übereinstimmungen der Amino-säuresequenzen sind in der Tabelle 6.2 im Anhang angegeben. 3.2.4 Anordnung der Primer und Hybridisierungssonde n im EF-3 Gen

Für zwei Real-Time LightCycler® PCR-Systeme, die sich in der Art der Detektion der gebilde-

ten Amplifikate unterschieden, wurden Primer und Hybridisierungssonden von dem Nuclein-

säurealignment des EF-3 Genabschnitts (Abb. 6.1) abgeleitet. Die Detektion der gebildeten

PCR-Fragmente erfolgte bei dem einen System durch den Fluoreszensfarbstoff SYBR®-

Green I, mit dem die doppelsträngige DNA unspezifisch durch Interkalation und die damit

verbundene Fluoreszenserhöhung nachgewiesen wurde. Bei dem anderen System erfolgte

3 Ergebnisse

58

der Nachweis durch spezifische Hybridisierung von zwei Sonden an das gebildete Amplifikat

und die damit verbundene Fluoreszenserhöhung über den „fluorescence resonance energy

transfer“ (FRET). Die genaue Lage aller Primer und Hybridisierungssonden ist in dem Nuc-

leinsäurealignment der EF-3 Genabschnitte (Abb. 6.1) angegeben.

3.2.4.1 Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit SYBR ®-Green I

Aufgrund der Heterogenität der Sequenzen mussten grundlegend unterschiedliche, degene-

rierte Primer für Hefen der Unterabteilung Ascomycota und Hefen der Unterabteilung Basidi-

omycota entworfen werden. Das für die Gattung Schizosaccharomyces spezifische Primer-

paar Ha1f/Ha1r und ein für die weiteren Hefen der Unterabteilung Ascomycota spezifischer

Mix aus den 5´-Primern Ha2f-5f und den 3´-Primern Ha2r-8r wurden für die Amplifikation

eines ca. 315 bp großen DNA-Fragments eingesetzt. Für die Amplifikation eines ca. 213 bp

großen Fragments von Hefen der Unterabteilung der Basidiomycota wurden die 5´-Primer

Hb1f-5f und die 3´-Primer Hb1r-3r ausgewählt.

3.2.4.2 Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit Hybri disierungssonden

Auch für die Real-Time Consensus-PCR mit Hybridisierungssonden mussten wie bei dem

System mit SYBR®-Green I zwei grundlegend unterschiedliche Teilsysteme für die Ascomy-

ceten auf der einen Seite und die Basidiomyceten auf der anderen Seite entwickelt werden.

Das für die Gattung Schizosaccharomyces spezifische Primerpaar Yfs1/HT4r und ein für die

weiteren Hefen der Unterabteilung Ascomycota spezifischer Mix aus den 5´-Primern Yfa1,

Yfa2, HS11/I-IV und den 3´-Primern HT1r-3r wurde für die Amplifikation eines ca. 305 bp

großen DNA-Fragments eingesetzt. Für die Amplifikation eines ca. 246 bp großen Frag-

ments von Hefen der Unterabteilung der Basidiomycota wurden die 5´-Primer Hb6f-7f und

die 3´-Primer HT5r-6r ausgewählt.

Die Hybridisierungssonden mussten wie die Primer aufgrund der hohen Heterogenität der

Zielsequenzen degeneriert werden. Hierbei wurde nicht jede Sequenzvariation, die das Nuc-

leinsäurealignment (Abb. 6.1) vorgab, oder jede durch die Aminosäuresequenz mögliche

Variation berücksichtigt. Die Sonden wurden bis zu 32-fach degeneriert und außerdem bis zu

zwei Basen durch Inosin substituiert. Außerdem wurden die Sonden möglichst lang kon-

struiert, um trotz möglicher Nucleotidfehlpaarungen eine ausreichend hohe Schmelztempera-

tur für die Detektion durch Hybridisierung zu erreichen. Die Abbildung 3.13 verdeutlicht die

Vorgehensweise bei der Konstruktion der Hybridisierungssonden am Beispiel der Sonde

Yff3. Degenerierungen wurden bevorzugt dort vorgenommen, wo aufgrund der Aminosäure-

sequenz die Variation auf zwei Basen reduziert werden konnte. Ikuta et al. (1987) zeigten,

dass die Nucleotidfehlpaarungen G:A, G:T und G:G nur leicht, die Nucleotidfehlpaarungen

3 Ergebnisse

59

A:A, T:T, C:T und C:A dagegen signifikant destabilisierend wirken. Daher wurden Degenerie-

rungen auch vorgenommen, um ungünstige Nucleotidfehlpaarungen zu vermeiden.

H. guilliermondii (DSM 70285)GAATTCAAGAAATTCACGCTAGAAGAAAATTCAAGAAC H. uvarum (BCD 3526) GAATTCAAGAAATTCACGCTAGAAGAAAATTCAAGAAC H. uvarum (ATCC 9774) GAATTCAAGAAATTCACGCTAGAAGAAAATTCAAGAAC S. bayanus (BCD 1392) GAATCCAAGAGATTCACGCCAGAAGAAAGTTCAAGAAC T. delbrueckii (DSM 70607) GAATCCAAGAGATTCACGCCAGAAGAAAGTTCAAGAAC C. glabrata (BCD 8932) GAGTTCAAGAAATCCATGCCAGAAGAAAATTCAAGAAC C. solani (BCD 818) GTATTCATGAAATTCATGCTAGAAGGAAATTCAAGAAC P. anomala (BCD 1082) GTATTCATGAAATTCATGCTAGAAGAAAATTCAAGAAC P. anomala (DSM 70783) GTATTCATGAAATTCATGCTAGAAGAAAATTCAAGAAC

Hybridisierungssonde Yff3 GAGTTCAAGARATTCAYGCIAGAAGRAARTTCAAGAAC

Abb. 3.13: Konstruktion der Hybridisierungssonde Yf f3 für das EF-3 Genfragment

Bei dem Design der Hybridisierungssonden für die Real-Time Consensus-PCR für Hefen wurden Nuc-leinsäurefehlpaarungen (grau) und Degenerierungen (Rahmung) mit einkalkuliert. Dargestellt sind die Sequenz der Hybridisierungssonde Yff3 und die Sequenzen der Targetorganismen in 5´-3´ Orientie-rung. Für Ascomyceten wurden sechs mit Fluorescein am 3´-Ende markierte Donator-Sonden

(Yff1-4, Yff6 und Yff8) und fünf am 5´-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff LightCycler®-Red

640 markierte Akzeptor-Sonden (Yfr1-4 und Yfr8) entwickelt. Die Sonde Yff6 wurde für Hefen

der Gattung Schizosaccharomyces und das Sondenpaar Yff8/Yfr8 für die Art C. magnoliae

designt. Für Basidiomyceten wurden eine mit Fluorescein am 3´-Ende markierte Donator-

Sonde (Yff5) und zwei am 5´-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff LightCycler®-Red 640 mar-

kierte Akzeptor-Sonden (Yfr5 und Yfr7) entwickelt. Alle Hybridisierungssonden wurden im

EF-3 Gen in 5´-3´-Richtung orientiert.

Das PCR-Profil wurde den niedrigen Schmelztemperaturen der Sonden angepasst, indem

eine „Touchdown-PCR“ gewählt wurde, bei der die Annealingtemperatur je PCR-Zyklus kon-

tinuierlich um 0,5 °C von 60 auf 40 °C abnimmt. Dieses Profil ermöglichte eine spezifische

Amplifikation der Targetsequenzen durch die Primer zu Beginn der PCR und die später im

Zyklusprofil erfolgende Detektion mit den Hybridisierungssonden.

3.2.5 Konstruktion der internen Amplifikationskontr olle und der Positiv-

kontrolle

Wie im Kap. 3.1.3 für das S. cerevisiae var. diastaticus Nachweissystem beschrieben, wur-

den auch für die Real-Time Consensus-PCR mit Hybridisierungssonden eine interne Amplifi-

kationskontrolle (IAK) konstruiert. Die Sequenz der IAK entsprach bis auf den Austausch der

Zielregion der LightCycler®-Red 640 markierten Sonde Yfr4 durch Einbau eines Sequenzab-

schnittes, der komplementär zu der Sequenz der LightCycler®-Red 705 markierten Sonde

LMRST1 war, der Sequenz des EF-3 Genabschnitts von S. c. var. diastaticus (DSM 70487).

3 Ergebnisse

60

Konstruiert wurde die interne Amplifikationskontrolle über die PCR-Mutagenese mit den Pri-

mern Yip1f und Yip1r (Kap. 2.9.1.2).

1--------Yfa1----------------------------------------------60 S.dia. GTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAAACGATGCTGAAG IAK GTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAAACGATGCTGAAG 61------------------------------------------Yff1----------120 S.dia. CTATGAACAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACCCCTAGAAGAATTGCCGGTATCCACTCCA IAK CTATGAACAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACCCCTAGAAGAATTGCCGGTATCCACTCCA 121---------------------------Yfr4-----LMRST1-------------180 S.dia. GAAGAAAGTTCAAGAACACTTACGAATATGAATGTTCTTTCTTATTGGGTGAAAACATTG IAK GAAGAAAGTTCAAGAACACATT--A-TCCGA---TACGTTCTTCCAGTGCCA----TTTT 181-------------------------------------------------------240 S.dia. GTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCAATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGATTCCAAGAG IAK GTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCAATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGATTCCAAGAG 241---------------------------------------------HT1r------301 S.dia. GTGAATTGGTTGAATCTCACTCTAAGATGGTTGCTGAAGTTGATATGAAGGAAGCTTTGGC IAK GTGAATTGGTTGAATCTCACTCTAAGATGGTTGCTGAAGTTGATATGAAGGAAGCTTTGGC

Abb. 3.14: Sequenzvergleich der IAK mit dem EF-3 Gen von S. cerevisiae var. diastati-cus

Das Alignment zeigt die Sequenzen der IAK der Real-Time Consensus-PCR für Hefen und die Wildtyp Sequenz des EF-3 Gens von S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487). Die Primer Yfa1 und HT1r sowie die Hybridisierungssonde Yff1 waren für beide Sequenzen spezifisch. Die Hybridisierungssonde Yfr4 war für die Wildtyp Sequenz und die Sonde LMRST1 für die IAK Sequenz spezifisch. Die Markie-rung der Sonden Yfr4 und LMRST1 mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen ermöglichte eine Unterscheidung zwischen IAK und Wildtyp Amplifikaten in der PCR. Nach Ligation der PCR-Produkte in den Vektor pGEM®-T (Kap. 2.9.3), Transformation in E.

coli XL-1 Blue Zellen (Kap. 2.9.4) und Linearisierung der gereinigten Plasmide (Kap. 2.9.5)

mit der Restriktionsendonuclease Sac I (Kap. 2.9.6) wurde der Erfolg der Herstellung durch

Sequenzierung (Kap. 2.10) und Alignment (Kap. 2.11) mit der Sequenz des EF-3 Gen-

abschnitts von S. cerevisiae var. diastaticus bestätigt (Abb. 3.14). In allen folgenden Versu-

chen wurden von der IAK je PCR-Reaktion 0,5 fg eingesetzt.

Bei der Herstellung der PK wurden keine Sequenzveränderungen vorgenommen, sondern

eine klonierte E. coli XL-1 Blue Kultur verwendet, die für die Sequenzierung des EF-3 Se-

quenzabschnitts von C. haemulonii (DSM 70624) hergestellt worden war. Dieses Vorgehen

wurde gewählt, da eine eindeutige Unterscheidung zwischen der PK und positiven Proben

über Schmelzkurven-Analyse aufgrund der Vielzahl an degenerierten Sonden von vornherein

auszuschließen war. Das gereinigte Plasmid (Kap. 2.9.5) wurde mit der Restriktionsendonuc-

lease Sac I linearisiert (Kap. 2.9.6) und 5 fg in der PCR verwendet.

3 Ergebnisse

61

3.2.6 Spezifität und Auswahl des Detektionssystems

3.2.6.1 Spezifität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit SYBR ®-Green I

Von allen Hefen, von denen die Sequenzinformationen vorlagen (Kap. 3.2.2), wurde mit der

Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit SYBR®-Green I das gewünschte PCR-Produkt mit

einer Länge von ca. 313 (Ascomycota) bzw. 213 bp (Basidiomycota) amplifiziert (Abb. 3.15).

Abb. 3.15: Agarosegelelektrophorese nach Real-Time PCR mit SYBR ®-Green I

Die Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit SYBR®-Green I wurde mit je 250 pg RNA-freier DNA (Kap. 2.6.2) getestet. Die Agarosegelelektrophorese wurde mit 5 µl der Reaktionsansätze in einem 2-%igen Gel durchgeführt (Kap. 2.8). PD=Primerdimere. 1: Molekulargewichtsmarker VI 15: Molekulargewichtsmarker VI 2: Schizosaccharomyces octosporus (DSM 70573) 16: Pichia ohmeri (BCD 862) 3: Candida albicans (ATCC 10321) 17: Yarrowia lipolytica (BCD 2556) 4: Candida catenulata (DSM 70136) 18: Candida diddensiae (DSM 70042) 5: Citeromyces matritensis (BCD 1062) 19: Candida versatilis (DSM 6956) 6: Dekkera custersiana (DSM 70736) 20: Dekkera bruxellensis (DSM 3429) 7: Pichia angusta (DSM 70277) 21: Pichia farinosa (BCD 861) 8: Candida boidinii (DSM 70034) 22: Saccharomyces pastorianus (DSM 6850) 9: Debaryomyces hansenii (BCD 3512) 23: Pichia membranaefaciens (DSM 70178) 10: Guilliermondella selenospora (DSM 3431) 24: Candida glaebosa (CBS 5691) 11: Candida haemulonii (DSM 70624) 25: Pichia carsonii (DSM 70392) 12: Candida rugosa (BCD 814) 26: Filobasidium capsuligenum (DSM 70253) 13: Candida zeylanoides (BCD 690) 27: Rhodotorula minuta (DSM 70408) 14: Lachancea thermotolerans (CBS 6340) 28: Cryptococcus curvatus (DSM 70022)

3 Ergebnisse

62

Die Primerkonzentrationen und die PCR-Bedingungen konnten jedoch nicht so eingestellt

werden, dass eine ausreichend hohe Stringenz erreicht wurde, um in jeder Hinsicht eindeuti-

ge, spezifsche Ergebnisse zu liefern. Die Bildung von Primerdimeren, die mit SYBR®-Green I

ebenfalls detektiert wurden, und unspezifische Amplifikate mit Bakterien-DNA ließen eine

eindeutige Abtrennung zwischen negativen und positiven Proben nicht zu. Die spezifischen

Amplifikate hatten Schmelzhöchstwerte zwischen ca. 81 und 91 °C, die sich an ihrer unteren

Grenze mit den Schmelzhöchstwerten der Primerdimere, die in den Negativkontrollen gebil-

det wurden, überlagerten (Abb. 3.16). Die unspezifische Amplifikation von Bakterien-DNA

verhinderte ebenfalls eine Differenzierung zwischen positiven und negativen Proben bei der

Schmelzkurven-Analyse (Abb. 3.17).

Abb. 3.16: Schmelzkurven-Analyse von spezifischen A mplifikaten und Primerdimeren

Die Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit SYBR®-Green I wurde mit je 250 pg RNA-freier DNA (Kap. 2.6.2) (schwarze Linien) von 1: Guilliermondella selenospora (DSM 3431), 2: Pichia carsonii (DSM 70392), 3: Pichia angusta (DSM 70277), 4: Cryptococcus albidus (DSM 70197), 5: Yarrowia lipolytica (BCD 2556) und 6: Rhodotorula glutinis (BCD 3530) durchgeführt. Die Negativkontrolle be-stand aus PCR-H2O (rote Linie). Die Schmelzkurven-Analyse erfolgte im Kanal 530.

3 Ergebnisse

63

Abb. 3.17: Schmelzkurven-Analyse von unspezifisch a mplifizierter Bakterien-DNA

Die Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit SYBR®-Green I wurde mit 250 pg RNA-freier DNA (Kap. 2.6.2) von S. cerevisiae var. diastaticus (schwarze Linie) und Bakterien DNA (blaue Linien) nach me-chanisch/thermischer Extraktion (Kap. 2.6.1) von Lactobacillus hilgardii, (DSM 20051), Lactobacillus kefiri (DSM 20588), Pantoea agglomerans (DSM 3493), Proteus vulgaris (DSM 2140), Salmonella enterica (BCD 14151), Shigella sonnei (BCD 4301), Sporosarcina urea (DSM 2281) durchgeführt. Als Negativkontrolle (rote Linie) wurde PCR-H2O eingesetzt. Die Auswertung der Schmelzkurven-Analyse erfolgte im Kanal 530. 3.2.6.2 Spezifität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit Hybridisierungs-

sonden

Alle 198 in der Tabelle 2.1 aufgeführten Hefestämme und die 54 nicht genauer identifizierten

Fremdhefen von den Brauereien A, B und D konnten mit dem System nachgewiesen wer-

den. Eine Identifizierung über die Schmelzkurven-Analyse war aufgrund der Vielzahl an de-

generierten Sonden, die bei unterschiedlichen Temperaturen abschmolzen, nicht möglich.

Einzelne, reproduzierbare Schmelzhöchstwerte, die klar einer Art oder einer Gattung zuzu-

ordnen waren, wurden nicht erhalten (Abb. 3.18).

Alle getesteten Bakterien (Tab. 2.2) waren negativ und die Amplifikation der IAK wurde durch

DNA dieser Mikroorganismen nicht beeinträchtigt. Die Abgrenzung zu den Schimmelpilzen

war nicht vollständig möglich. Von den getesteten Schimmelpilzen (Tab. 2.3) wurden positive

Ergebnisse mit DNA von Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus parasiticus,

Cephalosporium aphidicola, Diaporthe citri, Eremascus albulus, Fusarium oxysporum, Fusa-

rium cerealis, Fusarium culmorum, Hyalodendron lignicola, Penicillium funiculosum, Tricho-

derma viride und Wallemia sebi erzielt. Die Amplifikation der IAK wurde durch die DNA von

3 Ergebnisse

64

Schimmelpilzen, die im Kanal 640/Back 530 nicht nachgewiesen wurden, nicht beeinträch-

tigt.

Abb. 3.18: Schmelzkurven-Analyse unterschiedlicher Hefearten

Die Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit Hybridisierungssonden wurde mit je 250 pg RNA-freier DNA (Kap. 2.6.2) von den Hefen Torulaspora delbrueckii (schwarze Linie), Saccharomycopsis fibuli-gera (schwarze Punkte), Clavispora lusitaniae (blaue Linie), Candida haemulonii (blaue Punkte), Zy-gosaccharomyces cidri (rote Linie) und Saccharomyces exiguus (rote Punkte) getestet. Die Schmelz-kurven-Analyse wurde im Kanal 640/Back 530 ausgewertet. 3.2.7 Sensitivität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit Hybridisie-

rungssonden

3.2.7.1 Sensitivitätstestung mit quantifizierter, R NA-freier DNA

Die Sensitivität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen wurde mit quantifizierter, RNA-

freier DNA von 36 unterschiedlichen Hefearten getestet (Tab. 3.10). Mit der Multiplex-PCR

wurden unterschiedliche Sensitivitäten erreicht. Die höchste Nachweisgrenze mit

250 GÄ/Reaktion wurde mit DNA von Issatchenkia orientalis ermittelt. Alle weiteren unter-

suchten Hefearten wurden mit einer Sensitivität zwischen 10 und 100 GÄ/Reaktion nachge-

wiesen (Tab. 3.10). Die Umrechnung auf Genomäquivalente erfolgte mit den von S. cerevisi-

ae (12,1 Mbp), Schizosaccharomyces pombe (13,8 Mbp) und Cryptococcus neoformans

(21,0 Mbp) bekannten Genomgrößen und stellte demnach für einige Arten einen Nähe-

rungswert dar. Die Abbildung 3.19 zeigt die Amplifikationskurven der Sensitivitätstestung mit

DNA von S. exiguus (MUCL 29838).

3 Ergebnisse

65

Tab. 3.10: Sensitivitätstestung mit quantifizierter , RNA-freier DNA

Genomäquivalente/Reaktion Hefestamm 1000 250 100 25 10

Bullera dendrophila (DSM 70745) + + + + - Candida albicans (ATCC 10231) + + + + - Candida parapsilosis (ATCC 20384) + + + + - Candida tropicalis (ATCC 20247) + + + + - Citeromyces matritensis (BCD 1062) + + + + + Clavispora lusitaniae (DSM 70102) + + + + - Cryptococcus flavus (BCD 823) + + + + + Debaryomyces hansenii (BCD 589) + + + + + Dekkera bruxellensis (DSM 70726) + + + + + Dekkera custersiana (DSM 70736) + + + - - Endomyces fibuliger (DSM 70554) + + + + - Filobasidium capsuligenum (DSM 70253) + + + - - Guilliermondella selenospora (DSM 3431) + + + + + Hanseniaspora guilliermondii (DSM 70285) + + + + - Hyphopichia burtonii (BCD 859) + + + + - Issatchenkia orientalis (CBS 5147) + + - - - Kazachstania unispora (BCD 877) + + + + + Kluyveromyces marxianus (DSM 70792) + + + - - Lachancea thermotolerans (CBS 6340) + + + + - Lodderomyces elongisporus (DSM 70320) + + + + + Metschnikowia pulcherrima (DSM 70321) + + + + - Pichia anomala (BCD 1082) + + + + - Pichia membranaefaciens (DSM 70178) + + + + + Rhodotorula minuta (DSM 70408) + + + + - Saccharomyces bayanus (DSM 70412) + + + + - S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487) + + + + + Saccharomyces exiguus (MUCL 29838) + + + + + Saccharomyces pastorianus (DSM 6850) + + + + + Schizosaccharomyces pombe (BCD 773) + + + + + Sporidiobolus johnsonii (DSM 70847) + + + - - Torulaspora delbrueckii (CBS 6339) + + + - - Trichosporon cutaneum (DSM 70684) + + + + - Yarrowia lipolytica (ATCC 20225) + + + + + Zygosaccharomyces bailii (MUCL 28823) + + + + + Zygosaccharomyces lentus (CBS 8516) + + + - - Zygosaccharomyces rouxii (DSM 70835) + + + + + +: Probe positiv - : Probe negativ

Für die Sensitivitätstestung der Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit Hybridisierungssonden wur-de die RNA-freie DNA (Kap. 2.6.2) fluorometrisch quantifiziert (Kap. 2.7.1) und auf Genomäquivalente (GÄ) umgerechnet (Kap. 2.15.1).

3 Ergebnisse

66

Abb. 3.19: Sensitivität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen

Die Real-Time PCR wurde mit 1000 GÄ (schwarze Linie), 250 GÄ (blaue Linie), 100 GÄ (rote Linie), 25 GÄ (schwarze Punkte), 10 GÄ (blaue Punkte) von S. exiguus (MUCL 29838) durchgeführt. Die Auswertung der Amplifikation erfolgte im Kanal 640/Back 530. Als Negativkontrolle (rote Punkte) wur-de PCR-H2O eingesetzt. 3.2.7.2 Sensitivität in Kombination mit der mechani sch/thermischen DNA-

Extraktion

Die Nachweisgrenze in Abhängigkeit von der Hefeart, der Zellzahl pro Aufarbeitung und dem

mechanisch/thermischen DNA-Extraktionsverfahren wurde mit vorangereicherten Getränke-

proben (1:10-verdünnt mit YM-Medium, 48 Stunden, bei 28 °C) getestet. Nach Dotierung der

Anreicherungen mit 103, 104 oder 105 Hefezellen/ml wurden je Dotierungslevel 1 ml im Dupli-

kat mechanisch/thermisch aufgearbeitet.

In den trübstofffreien Getränken Pils, alkoholfreies Bier, Coca-Cola, Eistee, Radler, Apfelsaft

(klar) und Gatorade wurden zwischen 103 und 104 Zellen/ml der Hefearten D. bruxellensis

(DSM 70726), S. cerevisiae (DSM 1333), S. pombe (BCD 773), Z. bailii (MUCL 28823), C.

tropicalis (ATCC 20247) und H. vineae (ATCC 20247) nachgewiesen. Die gleichen Arten

wurden in den teilweise trübstoffreichen Getränken Apfelsaft (naturtrüb), Traubensaft, Rot-

und Weißwein mit einem um eine Zehnerpotenz höheren Nachweislevel zwischen 104 und

3 Ergebnisse

67

105 Zellen/ml detektiert (Tab. 3.11). Alle undotierten, vorangereicherten Getränkeproben wa-

ren negativ in der PCR im Kanal 640/Back 530 und bei der Kultivierung auf YM-Agar.

Tab. 3.11: Eignung der Real-Time Consensus-PCR für Hefen in Kombination mit der

mechanisch/thermischen Aufarbeitung für unterschied liche Probenmatri-ces und Hefearten

Dotierungslevel Cp-Werte im Kanal 640/Back 530 je Probenmatrix

A: [Zellen/ml] [KBE/ml] Apfelsaft (naturtrüb) Rotwein Pils Gatorade YM-

Medium 1,0 x 105 6,9 x 104 31,89/32,2 -/33,25 29,06/29,2 29,45/30,1 27,79 1,0 x 104 6,9 x 103 -/- -/- 31,27/30,9 31,95/31,9 n.b. 1,0 x 103 6,9 x 102 -/- -/- 32,05/32,1 32,68/32,6 n.b. undotiert - -/- -/- -/- -/- -

B: [Zellen/ml] [KBE/ml] Apfelsaft (naturtrüb) Rotwein Pils Gatorade YM-

Medium 1,0 x 105 6,4 x 104 31,21/30,6 31,30/31,3 28,42/28,5 29,02/28,8 27,52 1,0 x 104 6,4 x 103 -/- -/- 30,58/30,4 30,93/31,0 n.b. 1,0 x 103 6,4 x 102 -/- -/- 30,42/- -/- n.b. undotiert - -/- -/- -/- -/- -

C: [Zellen/ml] [KBE/ml] Bier (al-koholfrei) Eistee Trauben-

saft Weißwein YM-Medium

1,0 x 105 3,2 x 105 24,81/25,0 26,63/26,6 30,46/30,4 27,11/27,6 23,14 1,0 x 104 3,2 x 104 28,62/28,3 29,95/29,8 31,67/29,2 30,37/30,3 n.b. 1,0 x 103 3,2 x 103 31,68/31,0 31,36/- -/- -/- n.b. undotiert - -/- -/- -/- -/- -

D: [Zellen/ml] [KBE/ml] Bier (al-koholfrei) Eistee Trauben-

saft Weißwein YM-Medium

1,0 x 105 1,0 x 105 29,66/29,9 39,91/28,7 28,97/30,5 31,05/30,9 28,90 1,0 x 104 1,0 x 104 31,64/31,4 33,85/31,7 -/- -/- n.b. 1,0 x 103 1,0 x 103 -/- -/- -/- -/- n.b. undotiert - -/- -/- -/- -/- -

E: [Zellen/ml] [KBE/ml] Apfelsaft (naturtrüb) Coca-Cola Radler Weißwein YM-

Medium 1,0 x 105 9,4 x 104 30,69/30,6 28,84/28,8 29,02/29,0 30,57/30,4 28,35 1,0 x 104 9,4 x 103 -/- 31,27/31,0 31,49/31,7 31,83/31,7 n.b. 1,0 x 103 9,4 x 102 -/- -/- -/- -/- n.b. undotiert - -/- -/- -/- -/- -

F: [Zellen/ml] [KBE/ml] Apfelsaft (klar) Coca-Cola Radler Weißwein YM-

Medium 1,0 x 105 1,1 x 105 29,72/29,8 28,49/28,5 28,56/28,8 30,23/29,7 28,19 1,0 x 104 1,1 x 104 31,15/31,7 31,03/30,8 30,84/30,9 31,36/31,3 n.b. 1,0 x 103 1,1 x 103 -/- -/- -/- -/- n.b. undotiert - -/- -/- -/- -/- -

Die Probenmatrices wurden vor der mechanisch/thermischen Aufarbeitung (Kap. 2.6.1) mit A: D. bru-xellensis (DSM 70726), B: S. cerevisiae (DSM 1333), C: Sch. pombe (BCD 773), D: Z. bailii (MUCL 28823), E: C. tropicalis (ATCC 20247) oder F: H. vineae (DSM 70283) Zellen dotiert. Die Zellzahlen bzw. KBE wurden mikroskopisch und nach Kultivierung auf YM-Agar bestimmt (Kap. 2.12). n.b.: nicht bestimmt; -: negative Proben.

3 Ergebnisse

68

3.2.7.3 Sensitivität in Kombination mit der erweite rten, mechanisch/thermischen DNA-Extraktion

Für einige Probenmatrices wie trübstoffreiche Getränke und Weine wurde die DNA-

Extraktion erweitert, um die Qualität des in der PCR eingesetzten Probenmaterials und damit

die Sensitivität des Nachweissystems zu erhöhen. Die Erweiterung bestand in einem zusätz-

lichen Proteinase K Verdau und einer Reinigung über Säulenmaterial (Kap. 2.6.3).

Mit dieser Erweiterung wurde die Nachweisgrenze für die Probenmatrices Apfelsaft (natur-

trüb), Rotwein, Eistee und Traubensaft auf 103 bis 104 Zellen/ml S. cerevisiae gesenkt

(Tab. 3.12). Alle undotierten, vorangereicherten Getränkeproben waren negativ in der PCR

im Kanal 640/Back 530 und bei der Kultivierung auf YM-Agar.

Tab. 3.12: Eignung des Real-Time Consensus-PCR für Hefen in Kombination mit der

erweiterten, mechanisch/thermischen Aufarbeitung fü r unterschiedliche Probenmatrices

Dotierungslevel Cp-Werte je Probenmatrix

[Zellen/ml] [KBE/ml] Apfelsaft (naturtrüb)

Rotwein Eistee Traubensaft YM-Medium

1,0 x 105 9,6 x 104 28,85/29,07 27,37/27,26 26,55/26,92 29,99/26,95 24,79

1,0 x 104 9,6 x 103 30,95/30,79 29,71/29,84 29,25/29,28 29,90/29,94 n.b.

1,0 x 103 9,6 x 102 -/- -/- 30,05/30,65 27,73/31,46 n.b.

undotiert - -/- -/- -/- -/- -

Die Probenmatrices wurden vor der erweiterten, mechanisch/thermischen Aufarbeitung (Kap. 2.6.3) mit S. cerevisiae (DSM 1333) Zellen dotiert. Die Zellzahlen bzw. KBE wurden mikroskopisch und nach Kultivierung auf YM-Agar bestimmt (Kap. 2.12). n.b.: nicht bestimmt; -: negative Proben.

3.2.7.4 Detektionszeit für unterschiedliche Hefeart en

Die Detektionszeit eines Nachweissystems wird in diesem Zusammenhang als die Zeit defi-

niert, die für einen Mikroorganismus benötigt wird, damit dieser über Kultivierung eine Kon-

zentration erreicht, die im Nachweisbereich des Systems liegt. Diese Zeit ist abhängig von

der Ausgangskonzentration, der Verdoppelungszeit und der Lag-Phase (Adaptionsphase)

des Mikroorganismus in einem bestimmten Medium. Für einen Organismus oder eine Popu-

lation in einem Medium vergrößert sich die Detektionszeit je geringer die Ausgangskonzent-

ration ist. Um diese Detektionszeit zu ermitteln wurden Getränkeproben mit 1, 10 oder 100

Hefezellen/ml beimpft und in YM-Medium angereichert (1:10-verdünnt, 28 °C, 150 U/min).

Die Anreicherungen wurden im Duplikat angesetzt und je Anreicherung zwei 1 ml Proben

nach 24 und 48 Stunden aufgearbeitet.

Mit den langsam wachsenden Hefearten D. bruxellensis und besonders Sch. pombe (Gene-

rationszeiten von bis zu 4 Stunden) und den schwierigen Probenmatrices Orangensaft bzw.

3 Ergebnisse

69

Apfelsaft (naturtrüb) wurde das Nachweissystem in Kombination mit der erweiterten, mecha-

nisch/thermischen Aufarbeitung getestet (Tab. 3.13).

Tab. 3.13: Detektionszeit für langsam wachsende Hef en

Dotierungslevel nach 24 Stunden nach 48 Stunden

[Zellen/ml] [KBE/ml] Anreicherung 1

Anreicherung 2

Anreicherung 1

Anreicherung 2

A: 1,0 x 102 1,0 x 102 +/+ +/+ +/+ +/+ 1,0 x 101 1,0 x 101 -/- -/- +/+ +/+ 1,0 x 100 1,0 x 100 -/- -/- +/+ +/+ undotiert - -/- -/- -/- -/- B: 1,0 x 102 4,1 x 102 -/- -/- +/+ +/+ 1,0 x 101 4,1 x 101 -/- -/- +/+ +/+ 1,0 x 100 4,1 x 100 -/- -/- +/+ -/- undotiert - -/- -/- -/- -/-

Die Probenmatrices A: Orangensaft bzw. B: Apfelsaft (naturtrüb) wurden vor der Anreicherung mit YM-Medium mit A: D. bruxellensis (DSM 70726) oder B: Sch. pombe (BCD 773) Zellen dotiert. Die Zellzahlen bzw. KBE wurden mikroskopisch und nach Kultivierung auf YM-Agar bestimmt (Kap. 2.12). Nach 24 bzw. 48 Stunden Anreicherung wurden Proben entnommen, die nach Aufarbeitung mit der erweiterten, mechanisch/thermischen Methode mit der Real-Time Consensus-PCR für Hefen getestet wurden (Kap. 2.15.2). -: Probe negativ; +: Probe positiv.

Abb. 3.20: Real-Time PCR Nachweis von D. bruxellensis in Orangensaft

Nach 48 Stunden Anreicherung mit YM-Medium wurde der vor der Anreicherung mit 102 Zellen/ml (schwarze Linie), 101 Zellen/ml (blaue Linie) oder 100 Zellen/ml (rote Linie) D. bruxellensis (DSM 70726) dotierte Orangensaft mit der erweiterten, mechanisch/thermischen DNA-Extraktionsmethode aufgearbeitet. Die Proben wurden anschließend mit der Real-Time Consensus-PCR für Hefen getes-tet. Als Negativkontrolle wurde eine undotierte Anreicherung (grüne Linie) verwendet.

3 Ergebnisse

70

Der unterste Dotierungslevel von einer Zelle/ml Orangensaft wurde bei D. bruxellensis nach

48 Stunden Anreicherung nachgewiesen (Tab. 3.13 und Abb. 3.20). Das Wachstum von Sch.

pombe in einer Anreicherung mit Apfelsaft (naturtrüb) war dagegen bei der geringsten Aus-

gangskontamination von einer Zelle/ml (4,1 KBE/ml) nach 48 Stunden in nur einer Anreiche-

rung nachweisbar (Tab. 3.13). Alle undotierten, vorangereicherten Getränkeproben waren

negativ in der PCR im Kanal 640/Back 530 und bei der Kultivierung auf YM-Agar.

Tab. 3.14: Detektionszeit in Abhängigkeit von der H efeart und der Probenaufarbeitung

Dotierungslevel nach 24 Stunden nach 48 Stunden

[Zellen/ml] [KBE/ml] Anreicherung 1

Anreicherung 2

Anreicherung 1

Anreicherung 2

A: 1,0 x 102 1,1 x 102 +/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)

1,0 x 101 1,1 x 101 +/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)

1,0 x 100 1,1 x 100 -/- (a) -/- (b)

-/- (a) -/- (b)

+/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)

undotiert - -/- (a) -/- (b)

-/- (a) -/- (b)

-/- (a) -/- (b)

-/- (a) -/- (b)

B: 1,0 x 102 6,3 x 101 +/+ (a) -/- (b)

+/+ (a) -/- (b)

+/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)

1,0 x 101 6,3 x 100 -/- (a) -/- (b)

-/- (a) -/- (b)

+/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)

1,0 x 100 6,3 x 10-1 -/- (a) -/- (b)

-/- (a) -/- (b)

+/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)


-/- (a) -/- (b)

-/- (a) -/- (b)

-/- (a) -/- (b)

C: 1,0 x 102 7,5 x 101 +/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)

1,0 x 101 7,5 x 100 +/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)

1,0 x 100 7,5 x 10-1 +/+ (a) -/+ (b)

-/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)


-/- (a) -/- (b)

-/- (a) -/- (b)

-/- (a) -/- (b)

D: 1,0 x 102 4,1 x 101 -/- (a) -/+ (b)

-/+ (a) -/- (b)

+/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)

1,0 x 101 4,1 x 100 -/- (a) -/- (b)

-/- (a) -/- (b)

+/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)

1,0 x 100 4,1 x 10-1 -/- (a) -/- (b)

-/- (a) -/- (b)

+/+ (a) +/+ (b)

+/+ (a) +/+ (b)


-/- (a) -/- (b)

-/- (a) -/- (b)

-/- (a) -/- (b)

Die Probenmatrices Coca-Cola (A und B) bzw. Radler (C und D) wurden vor der Anreicherung mit YM-Medium mit A: P. membranaefaciens (DSM 70178), B: Z. bailii (MUCL 70178), C: C. tropicalis (ATCC 20247) oder D: H. vineae (DSM 70283) Zellen dotiert. Die Zellzahlen bzw. KBE wurden mikro-skopisch und nach Kultivierung auf YM-Agar bestimmt (Kap. 2.12). Nach 24 bzw. 48 Stunden Anrei-cherung wurden Proben entnommen, die nach Aufarbeitung mit der erweiterten, mecha-nisch/thermischen (a) oder (b) der mechanisch/thermischen Methode mit der Real-Time Consensus-PCR für Hefen getestet wurden (Kap. 2.15.2). Jede Anreicherung wurde im Duplikat angesetzt und je Extraktionsmethode im Duplikat getestet. -: Probe negativ; +: Probe positiv.

3 Ergebnisse

71

Die Detektionszeit in Abhängigkeit von den Hefearten P. membranaefaciens (DSM 70178),

Z. bailii (MUCL 70178), C. tropicalis (ATCC 20247) und H. vineae (DSM 70283) wurde mit

Anreicherungen mit Coca-Cola und Radler im direkten Vergleich mit der mecha-

nisch/thermischen und der erweiterten, mechanisch/thermischen Aufarbeitungsmethode ge-

testet (Tab. 3.14).

Unabhängig von der Hefeart, der Probenmatrix und der eingesetzten Probenaufarbeitung

wurde nach 48 Stunden Anreicherung der niedrigste Dotierungslevel mit 1 Zelle/ml detektiert.

3.2.7.5 Sensitivität bei einer hohen Begleitflora

Die Auswirkung einer sehr hohen Begleitflora auf die Nachweisgrenzen und die Aufarbei-

tungsmethoden wurde am Beispiel einer Flüssigkultur (Peptonwasser) mit 1010 KBE/ml E.

coli (DSM 30083) getestet. Die beiden Hefearten S. cerevisiae und Z. bailii wurden mit drei

Verdünnungsstufen (103, 104 und 105 Zellen/ml), sowohl mit als auch ohne Begleitflora und

mit beiden mechanisch/thermischen Probenaufarbeitungsmethoden jeweils im Duplikat ge-

testet.

Die Hefearten S. cerevisiae und Z. bailii wurden auch bei einer hohen Begleitflora eines

Nicht-Zielorganismus ohne Sensitivitätseinbußen nachgewiesen (Tab. 3.15 und Abb. 3.21).

Tab. 3.15: Sensitivität bei einer hohen Begleitflor a

Dotierungslevel Cp-Werte (640/Back530)

[Zellen/ml] [KBE/ml] mit 1010 KBE/ml E. coli ohne E. coli

A: 1,0 x 105 2,9 x 104 25,46/25,44 (a)

27,63/27,64 (b) 26,00/25,90 (a) 28,09/28,26 (b)

1,0 x 104 2,9 x 103 28,15/28,10 (a)

29,76/29,72 (b) 28,97/29,27 (a) 30,25/30,67 (b)

1,0 x 103 2,9 x 102 29,80/30,19 (a)

30,43/30,00 (b) 30,52/30,78 (a) 31,20/32,56 (b)

undotiert - - (a)

- (b) - (a) - (b)

B: 1,0 x 105 1,6 x 104 25,80/25,84 (a)

28,74/28,67 (b) 26,05/26,76 (a) 29,63/29,60 (b)

1,0 x 104 1,6 x 103 28,23/28,45 (a)

30,29/30,48 (b) 28,90/29,15 (a) 31,08/31,52 (b)

1,0 x 103 1,6 x 102 26,14/27,46 (a)

30,01/27,01 (b) 31,03/31,14 (a) 30,11/33,70 (b)

undotiert - - (a)

- (b) - (a) - (b)

Peptonwasser mit oder ohne 1010 KBE/ml E. coli (DSM 30083) wurde mit A: S. cerevisiae (DSM 1333) oder B: Z. bailii (MUCL 28823) Zellen dotiert, und nach Aufarbeitung mit der erweiterten, mecha-nisch/thermischen (a) (Kap. 2.6.3) oder mit der mechanisch/thermischen Extraktionsmethode (b) (Kap. 2.6.1) mit der Real-Time Consensus-PCR für Hefen getestet. Die Zellzahlen bzw. KBE wurden mikro-skopisch und nach Kultivierung auf YM- bzw. Caso-Agar bestimmt (Kap. 2.12). Alle Aufarbeitungen wurden im Duplikat durchgeführt.

3 Ergebnisse

72

Abb. 3.21: Sensitivität bei Anwesenheit einer hohen Begleitflora

Das Real-Time Consensus-PCR für Hefen wurde mit Proben (Peptonwasser) getestet, die mit (durch-gezogene Linien) oder ohne (Punkte) 1010 KBE/ml E. coli und mit 105 Zellen/ml (schwarz), 104 Zel-len/ml (blau) oder 103 Zellen/ml (rot) S. cerevisiae (DSM 1333) dotiert wurden. Die Proben wurden mit der mechanisch/thermischen Methode aufgearbeitet. Als Negativkontrolle wurde eine undotierte Probe verwendet (grüne Linie).

4 Diskussion

73

4 Diskussion

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Real-Time PCR-Systeme zum Nachweis von geträn-

kerelevanten Hefen auf Basis der LightCycler® Technologie mit Hybridisierungssonden ent-

wickelt. Für beide Systeme wurden interne Amplifikationskontrollen und Positivkontrollen

hergestellt und zwei DNA-Extraktionssysteme bereitgestellt.

Ein hoch spezifischer und sensitiver Einzelnachweis für die wichtigste, bierschädliche Sac-

charomyces Fremdhefe, S. cerevisiae var. diastaticus, wurde entwickelt, indem die sequen-

ziellen Unterschiede zwischen den Glucoamylase kodierenden Genen von S. cerevisiae var.

diastaticus (STA1-3) und S. cerevisiae (SGA1) ausgenutzt wurden. Die hohe Nachweisemp-

findlichkeit des PCR-Systems von 5 bis 10 GÄ pro Reaktion ermöglichte in Kombination mit

einer schnellen, mechanisch/thermischen Probenaufarbeitung den Nachweis von 102 bis 103

S. cerevisiae var. diastaticus Zellen/ml bei einer Hintergrundpopulation von 108 Zellen/ml

S. cerevisiae. Die Robustheit des Systems wurde durch Testung von 66 unterschiedlichen

Probenmatrices gezeigt und die Praxistauglichkeit direkt bei vier Brauereien verifiziert.

Die Sequenzierung eines Abschnitts des EF-3 Gens von 93 Hefestämmen lieferte die Grund-

lage für die Entwicklung einer Real-Time Consensus-PCR zum Nachweis von getränkerele-

vanten Hefen. Der Nachweis von allen 252 getesteten Hefestämmen wurde bei dem Assay

durch degenerierte Primer und Hybridisierungssonden ermöglicht, ohne dass mit der DNA

von einer der 71 getesteten Bakterien falsch-positive Ergebnisse auftraten. Der Nachweis

konnte nicht zur Identifizierung der Hefearten oder -gattungen eingesetzt werden und die

Abgrenzung zu den Schimmelpilzen, die ebenfalls das EF-3 Gen enthalten, ließ sich nicht zu

100 % erreichen. Die Sensitivität des Systems lag in Abhängigkeit von der Hefeart zwischen

10 und 250 GÄ pro Reaktion und in Kombination mit einer Erweiterung der mecha-

nisch/thermischen Probenaufarbeitung bei 103 bis 104 Zellen/ml. Bei sehr niedrig kontami-

nierten Getränkeproben mit 1 bis 100 Zellen/ml war ein Nachweis nach zwei bis drei Tagen

Flüssiganreicherung in YM-Medium möglich.

4.1 Beurteilung der STA1-3 und EF-3 Gene als Targetmoleküle

Die Schädlichkeit und Gefährlichkeit der Hefe S. cerevisiae var. diastaticus für die Bierindust-

rie beruht auf der Produktion einer extrazellulären Glucoamylase und der ansonsten physio-

logischen Ähnlichkeit zu den Brauhefen der gleichen Art. Die Glucoamylase (1,4-α-D-

Glucanglucohydrolase, EC 3.2.1.3) befähigt diese Varietät, sowohl als Primärkontamination

im Brauprozess für Geschmacks- und Geruchsveränderungen zu sorgen, als auch als Se-

kundärkontamination im fertigen Bier die Restnährstoffe aus Stärke und Dextrinen zu Gluco-

se abzubauen und eine Übervergärung mit den negativen Folgen der Nachtrübung, Ge-

4 Diskussion

74

schmacks-/Geruchsveränderung und Bodensatzbildung hervorzurufen. Ihre physiologische

Ähnlichkeit zu den Brauhefen erschwert zudem die einfache und schnelle Detektion mit kon-

ventionellen, kultivierungsabhängigen Methoden besonders innerhalb des Brauprozesses,

bei Anwesenheit der Brauhefe. Die Glucoamylase kodierenden Gene STA1-3 sind demnach

die idealen Targets für die Entwicklung einer molekularbiologischen Schnellmethode, um

S. cerevisiae var. diastaticus nachzuweisen und von S. cerevisiae unterscheiden zu können.

Seit der Entdeckung der Glucoamylase Genfamilie STA1-3 durch Tamaki et al. (1978) und

Erratt und Stewart (1978) in S. cerevisiae var. diastaticus ist diese Gegenstand umfangrei-

cher Untersuchungen gewesen, nicht nur wegen ihres bierschädlichen Potentials sondern

auch aus Interesse an einer biotechnologischen Nutzung zur Gewinnung von Ethanol aus

Stärke und der ungewöhnlichen Länge und Komplexität des Promotors (Erratt und Nasim

1986, Laluce und Mattoon 1984, Laluce et al. 1988, Lambrechts et al. 1991, 1994, Vivier et

al. 1999). Molekulare Charakterisierungen der Gene zeigten, dass sie auf den Chromoso-

men II (STA2), IV (STA1) und XIV (STA3) lokalisiert sind und nahezu identische Sequenzen

haben (Bignell und Evans 1990, Lambrechts et al. 1991, Pretorius und Marmur 1988, Yama-

shita et al. 1985a,b). Außerdem zeigte sich, dass die Gene zwar nur bei S. c. var. diastaticus

Stämmen vorhanden sind, die einzelnen funktionalen Bereiche der Gene jedoch bei allen

untersuchten S. cerevisiae Stämmen als Bestandteil der Gene MUC1 (FLO11) und SGA1

vorkommen. Der 5´-Bereich der STA Gene wird durch die zwei Sequenzabschnitte S1 und

S2 gebildet, die beide auch im Gen MUC1 (FLO11) vorliegen, das ein membrangebundenes,

mucin-ähnliches Protein kodiert (Lambrechts et al. 1996, Pretorius et al. 1986, Yamashita et

al. 1987). Die S2 Sequenz bildet in den STA Genen den Promotor und kodiert die ersten

96 Nucleotide des anschließenden offenen Leserasters, wohingegen die folgende S1 Se-

quenz einen Serin/Threonin-reichen Bereich kodiert (Yamashita et al. 1985b). Die Sequen-

zen in der Mitte und dem 3´-Ende der STA Gene kodieren die katalytische Domäne der Pro-

teine, die identisch ist mit einem Bereich im Gen SGA1, das auf dem Chromosom IX lokali-

siert ist und eine sporulationsabhängige, intrazelluläre Glucoamylase kodiert (Pretorius und

Marmur 1988, Vivier et al. 1997, Yamashita und Fukui 1985, Yamashita et al. 1987). Die

Gene STA1-3 sind sehr wahrscheinlich aufgrund ihrer Homologie zu den Genen MUC1

(FLO11) und SGA1 aus einer Rekombination derselben mit anschließender Sequenzverviel-

fältigung hervorgegangen (Yamashita et al. 1987). Unterstützt wird diese These nicht nur

durch die Sequenzübereinstimmungen sondern auch durch drei weitere Argumente. Erstens

sind die STA Gene im Bereich der Telomere positioniert, wohingegen die Gene MUC1

(FLO11) und SGA1 eine zentrale Position im Chromosom IX einnehmen. Zweitens sind die

STA Gene in nur einigen S. cerevisiae Stämmen vorhanden, die Gene MUC1 (FLO11) und

SGA1 liegen jedoch in allen S. cerevisiae Stämmen vor. Drittens existieren übereinstimmen-

4 Diskussion

75

de, sich wiederholende Sequenzen an beiden Seiten der propagierten Junktionen (Lam-

brechts et al. 1995, Yamashita et al. 1985b, 1987).

Diese nur in S. c. var. diastaticus vorkommende Anordnung der Sequenzabschnitte in den

STA Genen in der Reihenfolge S2-S1-SGA (Abb. 3.1) wurde erfolgreich für die Entwicklung

des spezifischen PCR Nachweises ausgenutzt. Ein ähnliches Primerdesign mit einem

5´-Primer aufbauend auf der S1 Sequenz und einem 3´-Primers aufbauend auf der SGA Se-

quenz wurde bereits von Yamauchi et al. (1998) erfolgreich zur Entwicklung eines spezifi-

schen PCR-Systems zum Nachweis von S. c. var. diastaticus verwendet. Die Detektion ei-

nes spezifischen 868 bp langen PCR-Produkts erfolgte hierbei nach Amplifikation mit einem

konventionellen Thermocycler über Agarosegelelektrophorese.

Für die Entwicklung einer Consensus-PCR zum Nachweis aller getränkerelevanten Hefen

wurde ein Target gesucht, das in allen Hefen vorkommt, eine grundlegende Funktion erfüllt

und konservierte, spezifische Sequenzabschnitte aufweist. Da die Möglichkeit einer Differen-

zierung zwischen lebenden und toten Zellen über RT-PCR nicht ausgeschlossen werden

sollte, wurde außerdem nach einem mRNA kodierenden Gen gesucht.

Der Translationsprozess ist bei Hefen ein komplexes Zusammenspiel aus Initiation, Elonga-

tion und Termination, das durch eine Vielzahl an Proteinen gesteuert wird (Merrick 1992).

Bei der Elongation benötigen Hefen und Schimmelpilze den Elongationsfaktor 3 (EF-3), der

bisher nur bei diesen Eukaryoten nachgewiesen wurde, essentiell für das vegetative Wachs-

tum ist und für den bei Prokaryoten kein funktionsgleiches Gegenstück existiert (Dasmaha-

patra und Chakraburtty 1981, Hutchison et al. 1984, Sandbaken et al. 1990a,b, Skogerson

und Wakatama 1976).

Diese überraschende Einzigartigkeit des Elongationsfaktors 3 bei Hefen und Schimmelpilzen

innerhalb eines ansonsten hoch konservierten, biochemischen Prozesses scheint jedoch

nicht uneingeschränkt gültig zu sein. Bei dem Chlorella Virus CVK2 konnte ein mutmaßlich

EF-3 kodierendes Gen isoliert werden, dem jedoch eine funktionale Domäne fehlt (Belfield et

al. 1995, Yamada et al. 1993). Eine ribosomale ATPase (RbbA) konnte außerdem bei E. coli

identifiziert werden, die in der C-terminalen Hälfte der Aminosäuresequenz 40 % Ähnlichkeit

mit dem EF-3 Protein von S. cerevisiae aufweist (Kiel et al. 1999). Das 1044 Aminosäuren

lange Protein EF-3 wird durch ein „single-copy“ Gen (EF-3) kodiert (Chromosom XII bei S.

cerevisiae) und enthält strukturelle Motive, die aufgrund ihrer Homologie zu Proteinen mit

bekannten Funktionen auf eine Interaktion des Proteins mit tRNA, rRNA und ATP hinweisen

(Qin et al. 1990). Ein 200 Aminosäure langes Motiv am N-terminalen Ende weist 30 % Ho-

mologie zu dem ribosomalen Protein S5 von E. coli auf und interagiert mit der 18 S rRNA

und den 80 S Ribosomen (Gontarek et al. 1998, Kovalchuke und Chakraburtty 1995). Das

4 Diskussion

76

Vorhandensein von zwei ATP-Bindekassetten (oder Walker Boxen), von der die Erste eine

intrinsische und die Zweite eine ribosomen-abhängige ATPase Aktivität aufweist, ist ein wei-

teres Merkmal des Elongationsfaktors 3 (Qin et al. 1990). Außerdem existiert zwischen den

beiden Walker Signaturen der zweiten ATP-Bindekassette, die mit 188 Aminosäuren unge-

wöhnlich weit auseinander liegen, eine hoch konservierte Sequenz (ELVES), die in tRNA-

bindenden Proteinen zu finden ist (Belfield und Tuite 1993, Belfield et al. 1995, Colthurst et

al. 1991a). Diese strukturellen Motive korrelieren mit der etablierten Funktion von EF-3, die in

der ATP-abhängigen Stimulation der Bindung des ternären Komplexes aus EF-1α, GTP und

Aminoacyl-tRNA an die ribosomale A-Stelle durch Entfernen der deacylierten tRNA von der

E-Stelle besteht (Kamath und Chakraburtty 1989, Triana-Alonso et al. 1995, Uritani und Miy-

azaki 1988).

Als Target für die Entwicklung einer Consensus-PCR wurde der 106 Aminosäuren (bzw. 107

Aminosäuren bei Sch. pombe) lange Bereich zwischen den beiden Walker Signaturen der

zweiten ATP-Bindekassette ausgewählt, der nicht in anderen Proteinen mit ATP-

Bindekassetten vorkommt und große sequenzielle Übereinstimmung unter den von Hefen

bekannten Sequenzen aufweist (Belfield et al. 1995). Bisher waren Sequenzen dieses Be-

reichs von 9 Ascomyceten (S. cerevisiae, C. albicans, C. maltosa, C. melibiosica, C. zeyla-

noides, K. lactis, P. pastoris, S. pombe und Y. lipolytica) und von einer Hefe der Unterabtei-

lung der Basidiomycota (C. neoformans) bekannt (Blakely 2001, Di Domenico et al. 1992,

Mita et al. 1997, Myers et al. 1992, Qin et al. 1990, Sandbaken et al. 1990a,b, Uritani et al.

1999). Die Übereinstimmung der Aminosäuresequenz des Teilstücks liegt innerhalb dieser

Ascomyceten bei mindestens 74 % und ein deutlicher Sequenzunterschied besteht zwischen

den Ascomyceten und der Sequenz von C. neoformans (33 % Sequenzähnlichkeit zu S. ce-

revisiae). Die Sequenzierungen dieses Bereiches von 93 Hefestämmen, von denen zum

größten Teil bisher noch keine Informationen vorlagen, und die phylogenetische Untersu-

chung bestätigten die starke Sequenzhomologie unter den Ascomyceten und gleichzeitig die

Distanz zu den Basidiomyceten. Im Gegensatz hierzu ist die Sequenzhomologie zwischen

den beiden Unterabteilungen bei dem Elongationsfaktor 1α, der in allen Eukaryoten vor-

kommt, viel größer, da z. B. S. cerevisiae und C. neoformans eine Sequenzidentität von

84,7 % aufweisen (Thornewell et al. 1997). Die Ergebnisse bestätigen die vermutete, größe-

re evolutionäre Drift des Elongationsfaktors 3 innerhalb des Reichs der Pilze. Außerdem

zeigten die neu hinzugekommenen Sequenzen von weiteren Hefen der Unterabteilung der

Basidiomyceten, dass die Sequenzübereinstimmung innerhalb dieser Unterabteilung (min-

destens 67 %) ähnlich hoch ist wie bei den Ascomyceten (mindestens 68 %).

Die phylogenetische Distanz zwischen den Unterabteilungen der Ascomycota und Basidio-

mycota aufgrund der EF-3 Sequenzen korreliert mit der phylogenetischen Ordnung der He-

4 Diskussion

77

fen, die auf Sequenzen der 26 S ribosomalen RNA basiert (Fell et al. 2000, Kurtzman 1994,

Kurtzman und Robnett 1998). Weitere Parallelen können zwischen den phylogenetischen

Stammbäumen, die mit den EF-3 oder den 18 S rDNA Sequenzen erstellt wurden, in Bezug

auf die Gattung Saccharomyces gezogen werden (James et al. 1997). Die Gattung musste

aufgrund beider Analysen als polyphyletisch eingestuft werden, da sie mit Arten der Gattun-

gen Zygosaccharomyces, Kluyveromyces und Torulaspora vermischt ist (Abb. 3.12). Viele

der zurzeit akzeptierten Hefegattungen wurden nach einem umfangreichen Vergleich der

D1/D2 Domäne der 26 S rDNA von Kurtzman und Robnett (1998) als nicht monophyletisch

eingestuft. Monophyletische Gruppen bildeten, wie bei dem über die D1/D2 Sequenzen der

26 S rDNA ermittelten Stammbaum, nur die Gattungen Dekkera und Schizosaccharomyces,

wobei die Letztere auch zu einer anderen Klasse (Archiascomycetes) als die sonstigen un-

tersuchten Ascomyceten (Hemiascomycetes) gehörte (Kurtzman und Robnett 1998). Der

sequenzierte Bereich des EF-3 Gens ist jedoch zu klein, um detaillierte Aussagen über die

phylogenetische Verwandtschaft der einzelnen Gattungen und Arten machen zu können.

Das EF-3 Gen wurde jedoch von einigen Autoren als möglicher taxonomischer Marker für

das Phylum Fungi genannt und für die Identifizierung von Sauerteighefen über RFLP-PCR

eingesetzt (Belfield und Tuite 1993, Colthurst et al. 1991b, Mäntynen et al. 1999). Diese

RFLP-PCR Analyse von Mäntynen et al. (1999) konnte nicht auf die Hefearten Candida geo-

chares, Cryptococcus laurentii, Rhodosporidium toruloides und Schizosaccharomyces pom-

be angewendet werden, da keine PCR-Produkte mit den Primern, die über die Sequenzin-

formationen von S. cerevisiae und C. albicans entwickelt wurden, generiert werden konnten.

Der Mikrosatelliten-DNA Polymorphismus in der Promotor Region des EF-3 Gens wurde au-

ßerdem als Target zur Typisierung von C. albicans verwendet. (Bretagne et al. 1997, Dalle et

al. 2000).

Aber auch wenn das EF-3 Gen in seiner Gesamtheit für phylogenetische Analysen geeignet

ist, sollte immer davon ausgegangen werden, dass phylogenetische Stammbäume aufbau-

end auf unterschiedlichen Genen zur Lösung von taxonomischen Problemen auch unter-

schiedliche Topologien aufweisen können (McCarroll et al. 1983, Seifert et al. 1995). Po-

lyphasische Untersuchungen mit unterschiedlichen, unabhängigen Genen und weitere

Merkmale wie z. B. die Morphologie sollten daher zur Bestätigung der Stammbäume heran-

gezogen werden (Valente et al. 1999).

Der Elongationsfaktor 1α (EF-1 α) wurde bereits als Target für den Nachweis einiger Hefe-

(S. cerevisiae, C. albicans) und Schimmelpilzarten (Mucor racemosus, Aureobasidium pullu-

lans) über RT-PCR in Milch, Bier und Joghurt verwendet (Vaitilingom et al. 1998). Versuche,

das Consensus-PCR System für Hefen ebenfalls zu einer RT-PCR weiterzuentwickeln, wa-

ren nicht erfolgreich, da das Gesamtsystem aufgrund der großen Anzahl an Primern und

4 Diskussion

78

Sonden zu komplex war. Durch diese große Anzahl an Primern und Sonden setzte sehr

wahrscheinlich schon während der RT-Reaktion eine zu starke Primerdimerbildung ein, die

die nachfolgende PCR unmöglich machte. Mit einer reduzierten Anzahl an Primern und nur

einem Hybridisierungssondenpaar konnte jedoch die mRNA des EF-3 Gens von S. cerevisi-

ae var. diastaticus in einer Real-Time RT-PCR spezifisch detektiert werden. Die Daten zu

diesem Experiment werden im Kapitel 6.3 im Anhang präsentiert.

Für die Entwicklung der Real-Time Consensus-PCR für Hefen lieferten die Sequenzergeb-

nisse zwei Notwendigkeiten, zum einen mussten degenerierte Oligonucleotide verwendet

werden und zum anderen mussten drei unabhängige PCR-Assays für die Hemiascomyceten,

die Gattung Schizosaccharomyces und die Basidiomyceten zu einer Multiplex-PCR kombi-

niert werden. Diese Kombination machte eine Identifizierung von Arten oder Gattungen mit

diesem System unmöglich.

4.2 Spezifität und Sensitivität der Real-Time PCR-A ssays

Die Spezifität von Real-Time PCR-Assays mit Hybridisierungssonden beruht zum einen wie

bei herkömmlichen PCR-Systemen auf den Primern, aber zum anderen auch auf der gleich-

zeitigen, spezifischen Hybridisierung von zwei fluoreszenzmarkierten Sonden, um die Ampli-

fikate zu detektieren. Bei dem Nachweissystem für S. cerevisiae var. diastaticus konnte

durch die Anordnung der vier Oligonucleotide sowohl die PCR als auch die Detektion der

PCR-Amplifikate 100-%ig spezifisch gestaltet werden. Dieses Ergebnis stimmt mit Ergebnis-

sen von Yamauchi et al. (1998) überein, die mit einer konventionellen PCR ebenfalls eine

100-%ige Spezifität erreichten.

Dagegen konnte das Nachweissystem für alle Hefen durch die Verwendung von degenerier-

ten und vielen unterschiedlichen Primern auf der Ebene der PCR nicht 100-%ig spezifisch

gestaltet werden. Die Spezifität wurde jedoch durch die Verwendung von Hybridisierungs-

sonden so weit erhöht, dass keine falsch-positiven Ergebnisse durch bakterielle DNA verur-

sacht wurden. Alle getesteten Hefen waren positiv, aber auch 13 Schimmelpilzarten wurden

positiv getestet. Dieses Ergebnis war aufgrund der Heterogenität der EF-3 Zielsequenzen zu

erwarten, da die degenerierten Oligonucleotide auch aufgrund der mit berücksichtigten Re-

dundanz des genetischen Codes eine große Sequenzvariabilität abdeckten. Die Unspezifität

in Bezug auf einige Schimmelpilze kann jedoch auch als ein Vorteil angesehen werden. Die

gemeinsame Erfassung von Hefen und Schimmelpilzen kann von Nutzen sein, da Schim-

melpilze ebenfalls zum Verderb von Getränken führen und durch die Bildung von Mycotoxi-

nen gefährlich für die menschliche Gesundheit sein können. Die Ergebnisse zeigten an, dass

durch die Sequenzierung des EF-3 Genabschnitts von getränkerelevanten Schimmelpilzen

der Assay zu einem Gesamtnachweis für Hefen und Schimmelpilzen erweitert werden könn-

4 Diskussion

79

te, wie zurzeit durch die kultivierungsabhängigen Standardmethoden vorgegeben (Anony-

mus 1987). Auch wenn die ascosporogenen Hefen mit Ausnahme der Gattung Schizosac-

charomyces aufgrund der rDNA eine monophyletische Gruppe (Hemiascomycetes) bilden,

die sich von filamentösen Arten der Euascomycetes unterscheidet, könnte demnach ein

Consensus-System für Hefen und Schimmelpilze möglich sein (Kurtzman 1994).

Die Unterschiede in der Komplexität der beiden Assays zeigten sich auch in den Sensitivi-

tätstestungen mit Protein- und RNA-freier, quantifizierter DNA. Die Real-Time PCR für S. c.

var. diastaticus ist mit einer Nachweisgrenze zwischen 5 und 10 GÄ pro Probenvolumen von

5 µl sehr sensitiv. Teilweise wurde auch 1 GÄ pro Reaktion nachgewiesen, was einer einge-

setzten DNA-Menge von 13,3 fg entspricht. Die theoretisch erreichbare Empfindlichkeit des

PCR-Systems konnte demnach auch praktisch realisiert werden, wenn von maximal drei

STA Gensequenzen pro Chromosomensatz auszugehen ist und zudem eine Konkurrenz zu

der Amplifikation der internen Amplifikationskontrolle besteht. Die Sequenzen der Gene

STA1 und STA2 sind bekannt und bis auf eine Base identisch, außerdem besitzen alle STA

Gene die gleiche Restriktionskarte, so dass höchstwahrscheinlich auch das noch nicht se-

quenzierte STA3 Gen ein Target für die PCR darstellt (Lambrechts et al. 1991, Pardo et al.

1986 und Yamashita et al. 1985a,b).

Die Real-Time Consensus-PCR für Hefen konnte dagegen nicht so weit optimiert werden,

dass die theoretisch mögliche Nachweisgrenze erreicht wurde. Die Empfindlichkeit lag zwi-

schen 10 und 250 GÄ pro Reaktion und war abhängig von der jeweiligen Hefeart. Diese

verminderte Sensitivität lässt sich mit der Komplexität der Multiplex-PCR und den notwendi-

gen Degenerierungen der Oligonucleotide erklären. Die Optimierung der Multiplex-PCR wur-

de besonders durch die sehr unterschiedlichen GC-Gehalte im Target Bereich erschwert, die

sich zum einen auf das Design der Primer und zum anderen auf die Annealingtemperatur

auswirkten. Beim Einsatz von degenerierten Primern ist es nicht zu vermeiden, dass sehr

viele unterschiedliche Primer mit unterschiedlichen Schmelztemperaturen im Reaktionsan-

satz vorliegen. Die Bildung von Primerdimeren und unspezifischen Amplifikaten mit bakteriel-

ler DNA, die den Einsatz von SYBR®-Green I zur Detektion der Amplifikate unmöglich mach-

te, könnte durch den Einsatz dieser degenerierten Primer verstärkt worden sein. Das Pri-

merdesign, für das einige Computerprogramme entwickelt wurden, wird als wichtiger Punkt

zur Vermeidung von Primerdimeren angesehen (Abd-Elsalam 2003). Diese Programme und

Regeln für das Primerdesign wie z. B. die Vermeidung von Sequenzen, die zu einem Annea-

ling der Primer untereinander oder innerhalb der eigenen Sequenz führen können, sind bei

degenerierten Primern schwer anzuwenden. Eine weitere Strategie zur Vermeidung von

Primerdimeren, die bei den entwickelten PCR-Systemen zum Einsatz kam, ist die Anwen-

4 Diskussion

80

dung einer so genannten „Hot Start“ DNA-Polymerase. Diese Polymerasen können reversi-

bel chemisch wie in der vorliegenden Arbeit, mit Aptameren oder enzymatisch modifiziert

sein, sodass sie erst durch den einleitenden Denaturierungschritt bei 95 °C aktiviert werden

(Dang und Jayasena 1996, Sharkey et al. 1994). Beim Ansetzen der PCR-Reagenzien be-

steht daher nicht die Gefahr, dass die Polymerase schon bei niedrigen Temperaturen gering-

fügig aktiv ist und dadurch unspezifische Amplifikate und Primerdimere bildet.

Die unterschiedlichen Sensitivitäten der Real-Time Consensus-PCR für Hefen können zum

einen durch die unterschiedliche Effizienz der Primerpaare, aber zum anderen auch durch

die unterschiedlichen Effizienzen bei der Synthese der degenerierten Primer entstehen. Bei

der normalen Synthese von degenerierten Primern wird nicht jedes Nucleotid mit gleicher

Effizienz eingebaut, daher bestehen degenerierte Primer in der Regel nicht zu gleichen Tei-

len aus allen möglichen Primervarianten, sodass die Primer in sehr unterschiedlichen Kon-

zentrationen vorliegen können. Ein weiterer Punkt, der die PCR-Effizienz herabgesetzt ha-

ben könnte, war die notwendige Verringerung der Annealingtemperatur während der Touch-

down-PCR auf einen mit 40 °C sehr niedrigen Wert, der für die PCR ungünstig war und nor-

malerweise nur bei der RAPD-PCR eingesetzt wird. Der Einbau von LNA®- („locked nucleic

acid“) Nucleotiden in die Sonden, die deren Schelztemperatur erhöhen würden, könnte hier

eine Verbesserung darstellen. LNA®-Nucleotide stellen eine neuen, bizyklischen Typ an

DNA/RNA-Analoga dar, die eine Methylierung zwischen dem 2´-Sauerstoffatom und dem 4´-

Kohlenstoffatom der Ribose enthalten und dadurch einem LNA/DNA-Duplex eine höhere

Stabilität geben (Koshkin et al. 1998). Die Sonden könnten mit dieser Modifikation kürzer und

mit einer höheren Schmelztemperatur konstruiert werden, wodurch die PCR unter stringente-

ren Bedingungen mit höheren Annealingtemperaturen durchgeführt werden könnte.

Das EF-3 Gen kommt einzeln im Genom von S. cerevisiae vor und ist auf dem Chromosom

XII lokalisiert (Qin et al. 1990). Im vollständig sequenzierten Genom von S. cerevisiae konnte

jedoch eine zu EF-3 homologe Sequenz im Chromosom XIV nachgewiesen werden, die

75 % DNA-Übereinstimmung und 84 % Aminosäure-Übereinstimmung im kodierenden Be-

reich aufweist. Da dieser Bereich aufgrund fehlender Promotorsequenzen nicht exprimiert

werden kann, scheint er nicht essentiell für das vegetative Wachstum zu sein (Sarthy et al.

1998). Für die Sensitivität bedeutet dies, dass maximal zwei Targetsequenzen je haploider

Zelle vorliegen.

Real-Time PCR Techniken bieten gegenüber konventionellen PCR Methoden nicht nur einen

Vorteil in Bezug auf Zeit- und Arbeitsaufwand, sondern auch in Bezug auf die erreichbare

Sensitivität. Casey und Dobson (2004) konnten in einem direkten Vergleich zeigen, dass

eine Real-Time PCR zum Nachweis des Citratsynthase Gens (cs 1) von C. krusei um zwei

4 Diskussion

81

Zehnerpotenzen sensitiver ist als eine konventionelle PCR. Die Sensitivität dieses Systems,

das mit SYBR®-Green I zur Detektion der Amplifikate arbeitete, war mit 10 Kopien aufgerei-

nigter Amplifikate oder 120 pg genomischer DNA je Reaktion jedoch nicht im optimalen Be-

reich.

Vergleichbare Systeme für den Nachweis von Hefen über Real-Time PCR beruhen zum

größten Teil auf Sequenzen der ribosomalen DNA und deren ITS-Regionen als Target und

sind für klinisch relevante Hefen (Candida sp. und Cryptococcus neoformans) entwickelt

worden (Bialek et al. 2002, Bu et al. 2005, Hsu et al. 2003, Loeffler et al. 2000, Maaroufi et

al. 2003, White et al. 2003). Die Nutzung von rDNA als Target bietet Sensitivitätsvorteile, da

je Genom 100 bis 200 Kopien des rDNA Gen-Clusters vorliegen (Kurtzman 1994).

4.3 Anwendbarkeit der Real-Time PCR in Kombination mit der Pro-

benaufarbeitung

Ein PCR-basierendes Nachweissystem kann nur Teil eines Qualitätskontrollkonzeptes sein,

wenn einige, grundlegende Voraussetzungen erfüllt sind. Hierzu zählen nicht nur die Spezifi-

tät und Sensitivität des PCR-Systems, sondern auch eine leichte und sichere Handhabung,

die unter anderem eine leichte Interpretation der Ergebnisse beinhaltet, und ein hohes Maß

an Robustheit in Bezug auf das eingesetzte Probenmaterial bietet. Das Gesamtkonzept

muss außerdem durch eine geeignete Probenvorbehandlung (z. B. Voranreicherung, Memb-

ranfiltration) und eine DNA-Extraktionsmethode ergänzt werden. Gegenüber den herkömmli-

chen Methoden sollten sich möglichst Vorteile zeigen wie z. B. geringerer Zeit- und Ar-

beitsaufwand. Außerdem sollte die Methode genau und zuverlässig sein, indem das Auftre-

ten von falsch-positiven und falsch-negativen Resultaten möglichst vermieden wird.

Mit der optischen Vorrichtung des LightCycler® Gerätes können Fluoreszenzen mit unter-

schiedlichen Wellenlängen simultan in einer Probe gemessen werden. Dies erlaubt es in

jeder Probe eine interne Amplifikationskontrolle (IAK) mitzuführen, deren Amplifikation über

eine andere Wellenlänge als bei den positiven Proben und der Positivkontrolle gemessen

wird. Für beide Real-Time PCR-Assays wurde eine interne Amplifikationskontrolle durch

PCR-Mutagenese entwickelt, die mit der LightCycler®-Red 705 markierten Sonde LMRST1

statt mit den LightCycler®-Red 640 markierten Sonden, die die Wildtypen detektieren, nach-

gewiesen wurde. Eine IAK sollte idealerweise, um äquivalente Amplifikationseigenschaften

aufzuweisen, so wenig Unterschiede zu der eigentlichen Zielsequenz aufweisen wie möglich.

Bei den hergestellten internen Amplifikationskontrollen wurde daher nur der Bereich einer

Sonde ausgetauscht, die restliche Sequenz entsprach dem Wildtyp. Zu beachten ist jedoch,

dass bei der Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit vielen, unterschiedlichen Zielsequen-

zen und den entsprechenden, unterschiedlichen Primern und Sonden die Ähnlichkeit zu der

4 Diskussion

82

IAK nicht einheitlich hoch sein konnte. Das Mitführen der internen Amplifikationskontrolle

(IAK) bei jeder Reaktion ist für die Anwendung des Systems in der Praxis essentiell, da die

PCR durch eine Vielzahl an Substanzen inhibiert werden kann und ohne Kontrolle falsch-

negative Ergebnisse liefern kann (Rosenstraus et al. 1998). Die IAK wurde bei den beiden

Systemen in Form von Plasmid-DNA in einer Konzentration zugegeben, die dem unteren

Detektionslimit entspricht, um auch geringe Inhibitionen und Störungen zu detektieren. Ein

positives Signal für die Amplifikation der IAK validierte somit negative Ergebnisse bei der

Amplifikation des primeren Targets und zeigte, dass auch sehr geringe DNA Mengen in den

Proben amplifiziert werden können.

Technische Probleme, fehlerhafte Reagenzien oder Fehler beim Handling können durch Mit-

führen einer Positivkontrolle erkannt werden. Wenn diese Probe negativ ist muss das ge-

samte Experiment wiederholt werden und mögliche Fehler behoben werden (Burkardt 2000).

Für die beiden Systeme wurde je eine Positivkontrolle hergestellt, die sich bei der Real-Time

PCR für S. cerevisiae var. diastaticus durch Einfügen einer Punktmutation im Sondenbereich

auch von positiven Proben über Schmelzkurvenanalyse unterscheiden ließ, um falsch-

positive Ergebnisse durch Kontaminationen ausschließen zu können. Für das Consensus-

System konnte diese zusätzliche Möglichkeit aufgrund der Verwendung von degenerierten

Sonden nicht angewendet werden.

Falsch-positive Ergebnisse durch Verschleppungen von Amplifikaten in neue Reaktionsan-

sätze können mit der LightCycler® Technologie zum einen vermieden werden, da ein Öffnen

der Glaskapillaren für weitere Untersuchungen der Amplifikate nicht notwendig ist, und zum

anderen durch den Einsatz eines weiteren Enzyms, der Uracil-N-Glycosylase, gänzlich aus-

geschlossen werden (Longo et al. 1990). Die Basis für den Einsatz dieses Enzyms ist eine

während der PCR durchgeführte Markierung der generierten Amplifikate, sodass sie sich von

der Target-DNA unterscheiden. Dieser Unterschied wird durch die vollständige oder teilweise

Substitution der Pyrimidin Base Thymin durch Uracil während der PCR bewerkstelligt. Wenn

solche Amplifikate in eine folgende PCR-Reaktion gelangen, werden sie von dem Enzym

UNG durch Spaltung der N-glycosidischen Bindung zwischen Uracil und der Desoxyribose

abgebaut und können nicht als Vorlage für die PCR dienen. Für die Real-Time PCR für S. c.

var. diastaticus wurde der Abbau von zugegebenen Amplifikaten durch die UNG während

der einleitenden Inkubation bei 37 °C und die anschließende Inaktivierung des Enzyms durch

die folgende Inkubation bei 95 °C erfolgreich getestet.

Die Anwendbarkeit und die Robustheit der PCR-Assays wurden mit unterschiedlichen Pro-

benmatrices in Kombination mit der schnellen, mechanisch/thermischen DNA-

4 Diskussion

83

Extraktionsmethode getestet. Diese Testung war wichtig, da ein Nachteil von PCR-Methoden

in der Inhibition der DNA-Polymerase durch Substanzen liegen kann, die in der Probe vor-

handen sind (Rossen et al. 1992). Der Real-Time PCR-Assay zum Nachweis von S. cerevi-

siae var. diastaticus stellte sich dabei als ein sehr robustes System dar, da sich nur eine

Probenmatrix („Laugetank“) von 66 untersuchten Proben als gänzlich ungeeignet heraus-

stellte und auch nach Verdünnung die Amplifikation der IAK inhibierte. Die Probenmatrix

„Laugetank“ inhibiert sehr wahrscheinlich die DNA-Polymerase durch die Erhöhung des pH-

Wertes im Reaktionsansatz.

Das in den PCR-Ansätzen als Blocking-Reagenz enthaltene BSA und das während der

DNA-Extraktion verwendete Chelex® 100 sind bekannt für ihre positive Eigenschaft, PCR-

Inhibitionen zu vermindern, und könnten zu der hohen Stabilität des Systems beigetragen

haben (Al-Soud und Radström 2000, de Lamballerie et al. 1992, Kreader 1996, Mättö et al.

1998, Walsh et al. 1991).

Auch eine sehr hohe Hintergrundkonzentration von 108 Zellen/ml S. cerevisiae, die allein

aufgrund der großen DNA-Menge oder den auch bei S. cerevisiae vorhandenen Zielsequen-

zen von Primern und Sonden zur Inhibition der IAK hätten führen können, bereitete keine

Probleme. Die Stabilität des PCR-Systems könnte möglicherweise den gänzlichen Verzicht

auf eine DNA-Extraktion für einige Proben ermöglichen. Ibeas et al. (1996) konnten z. B. auf

eine DNA-Extraktion verzichten, da der Denaturierungsschritt zu Beginn der PCR bei 95 °C

ausreichte, um die Zellen zu lysieren und die DNA freizusetzen.

Die Real-Time Consensus- PCR für Hefen ist ebenfalls als ein robustes System anzusehen,

jedoch führten trübstoffhaltige Säfte und besonders Rotwein zu einer verminderten Sensitivi-

tät des Systems, sodass teilweise keine Detektion bei Zellzahlen von weniger als

105 Zellen/ml möglich war. Die Anwendung einer Flüssiganreicherung könnte in diesem Zu-

sammenhang zur Erhöhung der Zellzahlen führen und gleichzeitig auch zur Verdünnung der

inhibierenden Substanzen dienen (Hofstra 1994, Swaminathan und Feng 1994). Besonders

Rotwein ist bekannt für die inhibierende Wirkung einiger Inhaltsstoffe wie z. B. Polysacchari-

de, Tannin und Polyphenole (Wilson 1997). Die Inhaltsstoffe des Rotweins könnten mögli-

cherweise als organische Liganden Komplexe mit den Magnesiumionen, die essentiell für die

Aktivität der DNA-Polymerase sind, bilden und die PCR dadurch inhibieren. Vergleichbare

Verschlechterungen der Sensitivität durch die Probenmatrix Wein konnten bei PCR-

Systemen beobachtet werden, die für Dekkera/Brettanomyces sp. entwickelt wurden. Ibeas

et al. (1996) konnten mit einer konventionellen Nested-PCR ein Detektionslimit von

10 Zellen/Reaktion erreichen, wenn steriles Wasser als Probenmatrix verwendet wurde und

die Proben direkt ohne Extraktion in die PCR eingesetzt wurden. Sherrywein inhibierte dage-

gen die PCR, sodass nur 104 Zellen/ml nachweisbar waren. Eine Zentrifugation der Proben

4 Diskussion

84

und die anschließende Aufnahme der sedimentierten Zellen in sterilem Wasser eliminierte

die Inhibition. Eine Nested-PCR ist jedoch für die Anwendung in der Praxis nicht nur eine zu

umständliche und arbeitsaufwendige Methode, sondern auch aufgrund ihrer hohen Anfällig-

keit für falsch-positive Ergebnisse durch Kontaminationen ungeeignet (Burkardt 2000). Jedes

erneute Öffnen von Reaktionsgefäßen oder Pipettieren von hohen Amplifikatmengen stellt

bei der sehr empfindlichen PCR-Diagnostik ein zu vermeidendes Kontaminationsrisiko dar.

Von Cocolin et al. 2004 wurde ebenfalls ein PCR-System zum Nachweis von Dekke-

ra/Brettanomyces bruxellensis und Dekkera/Brettanomyces anomalus entwickelt, das die

D1/D2 Domäne der 26S rDNA als Target nutzte. Das System hatte trotz der Verwendung

eines „multicopy“ Gens ein hohes Detektionslimit von 104 bis 105 Zellen/ml, wenn DNA oder

RNA direkt aus Wein isoliert wurde. Bei einer Konzentration von 105 KBE/ml oder höher

macht sich die für Brettanomyces sp. typische und unerwünschte Geschmacksveränderung

im Wein bereits bemerkbar (Chatonnet et al. 1992).

Quantitative Real-Time PCR-Systeme für Dekkera/Brettanomyces bruxellensis konnten von

Delaherche et al. (2004) und Phister und Mills (2003) mit SYBR®-Green I entwickelt werden.

Bei Delaherche et al. (2004) wurde ein Detektionslimit von 104 KBE/ml in Wein ermittelt, das

gut mit den Ergebnissen der konventionellen Methoden korrelierte. Phister und Mills (2003)

konnten dagegen ein für die schwierige Probenmatrix Wein und die Detektion mit SYBR®-

Green I sehr sensitives System entwickeln, das nach einer 1:10-Verdünnung der Proben ein

Detektionslimit von 10 KBE/ml hatte. Diese beiden Einzelnachweise, die nur ein Primerpaar

enthielten, sind jedoch nicht direkt mit der entwickelten Real-Time PCR für Hefen zu verglei-

chen. Die für diese beiden PCR-Systeme verwendeten, kommerziellen DNA-

Extraktionsmethoden entsprechen eher der erweiterten, mechanisch/thermischen Methode,

mit der wie bei Delaherche et al. (2004) 104 Zellen/ml S. cerevisiae in Rotwein detektiert

wurden. Die hohe Sensitivität des Nachweises von Phister und Mills (2003) ist sicher auch

auf die Verwendung eines „multi-copy“ Gens (26 S rRNA Gen) zurückzuführen.

Die Erweiterung der mechanisch/thermischen Extraktionsmethode um einen enzymatischen

Schritt mit Proteinase K und einen Aufreinigungsschritt mit Säulen führte zu einer Verbesse-

rung der Sensitivität. Magnetische Separationstechniken, die zur Trennung von Nucleinsäu-

ren von der Probenmatrix angewendet werden, wie z. B. das MagNA Pure System, das bei

einer der Brauereien mit dem S. c. var. diastaticus System erfolgreich getestet wurde, könn-

ten ebenfalls zur Minderung von Inhibitionen bei problematischen Probenmatrices angewen-

det werden (Loeffler et al. 2002, Safarík et al. 1995). Die Real-Time Consensus-PCR für He-

fen unterscheidet sich außerdem von dem Einzelnachweis für S. cerevisiae var. diastaticus

in der auf 750 ng/µl verminderten BSA-Konzentration. Diese Reduktion war durch den Ein-

4 Diskussion

85

satz einer höheren MgCl2-Konzentration (4,0 mM) bei diesem System notwendig. BSA wird

während der PCR durch die wiederholten 95 °C Schritte denaturiert und bildet dann beson-

ders in Gegenwart von bivalenten Ionen wie Mg2+ unlösliche Niederschläge (Teo et al. 2002).

Die von Teo et al. (2002) als thermostabile Alternative zu BSA vorgeschlagene Verwendung

von RNase A wurde getestet und die Anwendung war für dieses System möglich, jedoch

konnten die inhibitionsmindernden Eigenschaften des BSA durch dieses Enzym bei mecha-

nisch/thermisch aufgearbeiteten Proben nicht erreicht werden. (Die Daten hierzu wurden in

dieser Arbeit nicht vorgestellt.)

Neben Inhibitionen ist die Effizienz des Zellaufschlusses durch die mechanisch/thermischen

DNA-Extraktionsmethoden ein weiterer wichtiger Aspekt, der die Sensitivität der Nachweise

beeinflusst. Der mechanische Zellaufschluss von Hefen und Schimmelpilzen unter Einbezie-

hung von Glaskügelchen und einem geeignetem Gerät wurde oft als effiziente, schnelle und

günstige Methode beschrieben (Haugland et al. 1999, Müller et al. 1998, van Burik et al.

1998). Eine ähnlich aufgebaute schnelle Extraktionsmethode wie in der vorliegenden Arbeit,

die aus der Kombination eines thermischen Schritts mit einem Lysis-Puffer und einem me-

chanischen Schritt mit Glaskügelchen bestand, wurde von Kuske et al. (1998) zur Extraktion

von DNA aus sehr unterschiedlichen Zelltypen (vegetative Bakterien, bakterielle Endosporen

und Konidien) und Bodenproben erfolgreich verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde

eine 5-%ige Chelex 100 Lösung als Lysis-Puffer verwendet, die durch die Chelatierung von

polyvalenten Metallionen und ihre hohe Alkalinität in Kombination mit hohen Temperaturen

zur Destabilisierung und Zerstörung der Zellemembranen führt und vermutlich gleichzeitig

eine stabilisierende Wirkung auf die DNA hat (de Lamballerie et al. 1992, Walsh et al. 1991).

Die Ergebnisse der Sensitivitätstestung des Einzelnachweises für S. c. var. diastaticus zeig-

ten, dass die mechanisch/thermische DNA-Extraktionsmethode sehr effizient war. Eine Aus-

gangskontamination zwischen 102 und 103 Zellen/ml war nachweisbar, was theoretisch 2,5

bis 25 GÄ pro PCR-Reaktion entspricht. Mit der Real-Time Consensus-PCR für Hefen konn-

ten in Kombination mit der mechanisch/thermischen DNA Extraktionsmethode in trübstoff-

freien Getränken zwischen 103 und 104 Zellen/ml nachgewiesen werden. Bei der Handhab-

barkeit der DNA-Extraktionsmethode wurde außerdem auf die Vermeidung von gesundheits-

gefährdenden Stoffen wie Chloroform oder Phenol geachtet.

Bei Kontaminationsleveln, die unterhalb des ermittelten Detektionslimits lagen, zeigte sich

ein Nachteil von PCR-basierten Methoden, der von van der Vossen und Hofstra (1996) an-

gesprochen wurde und in dem geringen einsetzbaren Probenvolumen von maximal 10 µl bei

einem Reaktionsvolumen von 20 µl liegt. Die Sensitivität ist daher auch bei dem sehr emp-

findlichen PCR-Assay für S. c. var. diastaticus mit einem optimalen Probenvolumen von 5 µl

4 Diskussion

86

durch die Probenaufarbeitung limitiert. Die Sensitivität der Nachweise könnte bei filtrierbaren

Proben über eine geeignete Membranfiltration erhöht werden, die jedoch auch einen wesent-

lich höheren Arbeitsaufwand darstellt. Größere Volumina könnten auch nach Zentrifugation

und anschließender Aufnahme der sedimentierten Zellen im Lysispuffer aufkonzentriert wer-

den. Anreicherungen stellen wie mit dem Gesamtnachweis für Hefen gezeigt ebenfalls eine

Möglichkeit dar, um auch Spurenkontaminationen von weinigen Zellen/ml zu erfassen.

Ein Vorteil der Flüssiganreicherung liegt in der Ermittlung signifikant höherer Zellzahlen als

bei der direkten Anwendung von Oberflächen- oder Plattenguss-Verfahren, da gestresste

Zellen besser wiederbelebt werden (Deák, 1991). Die Kombination aus unspezifischer Flüs-

siganreicherung mit YM-Medium und anschließender Consensus-PCR stellt einen unselekti-

ven Nachweis für Hefen dar, der Aussagen über die An- und Abwesenheit von Hefen liefert.

Ein solcher Nachweis kann z. B. in Brauereien als Indikator für die allgemeine Betriebshy-

giene und als Endkontrolle dienen. Ein unselektives Medium wurde hierbei zu Gunsten einer

hohen Wachstumsgeschwindigkeit ausgewählt, da jedes selektive Reagenz oder jede selek-

tive Bedingung auch Einfluss auf die nachzuweisenden Organismen hat. Die Inhibition einer

Begleitflora wie z. B. der Kulturhefe und das Wachstum von Fremdhefen wird unter selekti-

ven Bedingungen von den physiologischen Voraussetzungen der Hefen, der Zellkonzentrati-

on und den Inkubationsbedingungen beeinflusst (Fernández et al. 1989). Makdesi und Beu-

chat (1996) zeigten, dass gegen Benzoat resistente Zygosaccharomyces bailii Stämme nach

einem Hitzestress mit pH-neutralem YM-Agar besser als mit saurem YM-Agar (pH 3,8)

nachzuweisen waren. Diese Ergebnisse sind besonders interessant im Bereich der nicht

karbonathaltigen Getränke, die heiß abgefüllt oder vor dem Abfüllen pasteurisiert werden.

Ein weiterer positiver Aspekt des unselektiven YM-Mediums ist die mit 10 g/l niedrige Gluco-

sekonzentration, da hitzegestresste Hefezellen eine erhöhte Sensitivität gegenüber hohen

Zuckerkonzentrationen aufweisen können (Golden und Beuchat 1990, Stecchini und Beu-

chat 1985). Das YM-Medium, das nach den Bestandteilen im Bereich der Brauereien auch

MYGP-Medium genannt wird, wurde außerdem ausgewählt, da es als Grundmedium für ei-

nige selektive Medien zum Nachweis von Fremdhefen in Brauereien angewandt wird

(Jespersen und Jakobsen 1996). Bei einem Vergleichstest unterschiedlicher Medien für den

Nachweis von Fremdhefen von van der Aa Kühle und Jespersen (1998) konnten die besten

Ergebnisse mit YM-Agar mit dem Zusatz von CuSO4 erzielt werden. Die Anwendung des

MYGP-Mediums mit 200 ppm CuSO4 wird außerdem von der American Society of Brewing

Chemists empfohlen (Anonymus 1992).

4 Diskussion

87

Wie in Brauereien kann es auch in anderen Bereichen der Getränkeindustrie sinnvoll sein

nur die relevanten, obligaten Verderbniserreger (z. B. Zygosaccharomyces sp., Dekkera sp.

oder Saccharomyces sp.) oder einzelne Gruppen von Hefen (z. B. gärfähige Hefen) nachzu-

weisen. Eine solche Selektion kann über die Bedingungen der Flüssiganreicherung und die

dabei verwendeten Medien erfolgen. Das SSL-Verfahren verbessert z. B. den Nachweis von

osmophilen und gärfähigen Hefen in Rohstoffen und Konzentraten, indem zunächst eine

Flüssiganreicherung mit SSL-Bouillon für 36 bis 48 Stunden vorgenommen wird, die zur Ver-

kürzung der Lag-Phase führt (Back 1999). Danach werden zwischen 2 und 5 ml der Flüssig-

kultur im Plattengussverfahren mit Orangenfruchtsaftagar ausgewertet. Das gesamte Verfah-

ren dauert 4 bis 5 Tage und kann sehr geringe Keimzahlen nachweisen. Eine Verkürzung

der Detektionszeit um 2 bis 3 Tage, die zur Kultivierung im Orangenfruchtsaftagar nötig sind,

könnte durch die Verwendung der wesentlich schnelleren PCR erreicht werden.

Quantitative Aussagen über die Grundbelastung können nach einer Flüssiganreicherung

nicht gemacht werden. Da es sich hierbei um einen Spurennachweis handelt, ist jedoch die

Kenntnis der genauen Keimzahl zweitrangig. Der Nachweis solcher Spurenkontaminationen

kann je nach Probe und beteiligtem Mikroorganismus sehr relevant sein. In fruchtfleischhalti-

gen Säften kann z. B. schon eine Hefezelle pro 10 ml problematisch sein, bei klaren Säften

wird dagegen teilweise eine Hefezelle/ml toleriert (Weidenbörner 1998). Für einige Organis-

men wie z. B. Zygosaccharomyces sp. muss das Qualitätskontrollsystem so ausgelegt wer-

den, dass im Endprodukt keine Zelle vorhanden ist, da auch ein sehr geringer Kontaminati-

onslevel zu Problemen führt (van der Vossen und Hofstra 1996). Die entwickelte Real-Time

Consensus-PCR für Hefen in Kombination mit einer Flüssiganreicherung könnte für solche

Proben eine Aussage über die An- oder Abwesenheit dieser obligaten Schädlinge in 2 bis 3

Tagen liefern.

Die Experimente zur Ermittlung der Detektionszeit zeigten, dass die Anreicherungszeit für

langsam wachsende Hefen wie z. B. Brettanomyces sp. oder Schizosaccharomyces pombe

entsprechend verlängert werden muss. Falls diese Arten relevant für das Untersuchungsma-

terial sind und deren Auftreten zu erwarten ist, muss dies entsprechend berücksichtigt wer-

den. Außerdem sollte auch für geschädigte Zellen, die durch Methoden der Produktstabilisie-

rung nicht vollständig abgetötet wurden, eine verlängerte Anreicherungszeit berücksichtigt

werden. Versuche, bei denen vor einer Anreicherung mit Hefezellen dotiert wurde, wurden

auch von García et al. (2004) durchgeführt. Die konventionelle PCR mit Nachweis der Ampli-

fikate über Gelelektrophorese hatte ein Detektionslimit für K. marxianus in Milch von

105 KBE/ml. Dieses Detektionslimit konnte bei einer initialen Kontamination von 10 KBE/ml

nach 16 Stunden Anreicherung ohne zusätzliches Nährmedium erreicht werden.

4 Diskussion

88

Der Nachweis von Hefen über eine Flüssiganreicherung und anschließende Detektion über

PCR ist vergleichbar mit der direkten oder indirekten Messung der Leitfähigkeit. Der Detekti-

onsgrenzwert liegt bei der indirekten Messung der Leitfähigkeit zwischen 104 und

105 Zellen/ml (Deák 1995). Wie bei der Messung der Leitfähigkeit könnte auch die Real-Time

Consensus-PCR für Hefen in Kombination mit einer Flüssiganreicherung über die Detekti-

onszeit, die von Beginn der Inkubation verstreicht bis eine messbare Veränderung auftritt,

gegen eine konventionelle Zellzahlbestimmung kalibriert werden, um Aussagen über die

Ausgangspopulation machen zu können. Größere Ausgangspopulationen würden dement-

sprechend kürzere Detektionszeiten ergeben, die jedoch nicht unabhängig von den unter-

schiedlichen Wachstumsgeschwindigkeiten der Hefearten sind.

Im Gegensatz zu dem Gesamtnachweis für Hefen konnten bei dem Einzelnachweis für S. c.

var. diastaticus die gesamten Vorteile der Real-Time PCR ausgenutzt werden, da das Sys-

tem zur sensitiven Detektion und spezifischen Identifikation genutzt werden kann. Ein Vorteil

der Real-Time PCR gegenüber anderen PCR-basierten, molekularbiologischen Methoden

liegt in der Bündelung der PCR und der Amplifikatdetektion in einem Schritt und der einfa-

chen und objektiven Auswertung der Ergebnisse z. B. mit der LightCycler® Software 4. Be-

sonders wenn sehr geringe Amplifikatmengen detektiert werden müssen, bietet ein numeri-

scher Wert oder eine klare positive oder negative Aussage weniger Interpretationsmöglich-

keiten als eine schwache Bande in einem Agarosegel. Damit wird diese Technik nicht nur zu

einer schnellen, sondern auch zu einer leicht handhabbaren Methode, wie durch die Testung

des S. c. var. diastaticus Nachweises bei vier Brauereien gezeigt wurde. Eine RFLP-PCR

von Yamagishi et al. (1999), mit der S. c. var. diastaticus von Brauhefen unterschieden wur-

de, bestand im Gegensatz dazu aus der PCR mit 5 S rDNA und 26 S rDNA spezifischen

Primern, einem anschließendem Restriktionsverdau und einer abschließenden Auftrennung

im Agarosegel. Neben dem Nachteil des höheren Arbeitsaufwandes besteht ein weiterer

Unterschied dahingehend, dass diese Methode nur zu Identifizierung von Reinkulturen ver-

wendet werden kann. Die gleichen Nachteile und Einschränkungen gelten für einen RAPD-

PCR-Assay von Tompkins et al. (1996), der ebenfalls zur Unterscheidung von S. cerevisiae

var. diastaticus von Brauhefen geeignet war und auch zur Identifizierung von bierschädlichen

Bakterien diente. Gegenüber immunologischen Tests besitzt ein Nachweissystem über Nuc-

leinsäuren den Vorteil, dass nicht erst eine phänotypische Expression der Zielantigene statt-

finden muss. Sie sind demnach auch weniger abhängig von Wachstumsbedingungen und

äußeren Einflüssen.

4 Diskussion

89

Der wichtigste Maßstab für die Anwendbarkeit einer auf der Real-Time PCR-basierten Me-

thode besteht jedoch im Vergleich mit den klassischen, mikrobiologischen Methoden. Die

Detektion von Fremdhefen wie S. c. var. diastaticus bereitet besonders durch ihre biochemi-

sche und physiologische Ähnlichkeit zu den Brauhefen Probleme (Jespersen und Jakobsen

1996), daher ist der Real-Time PCR-Nachweis über das entscheidende, genetische Identifi-

kationsmerkmal von S. c. var. cerevisiae für die Anwendung sehr sinnvoll. Ein weiterer Vor-

teil des Real-Time LightCycler® Systems zum Nachweis von S. cerevisiae var. diastaticus

liegt in der Möglichkeit, geringe Zellzahlen bei einer großen Hintergrundpopulation an S. ce-

revisiae nachzuweisen. Mit dem System können zwischen 102 und 103 Zellen/ml S. c. var.

diastaticus bei einem Hintergrund von 108 Zellen/ml S. cerevisiae identifiziert werden, obwohl

die Zielsequenzen in anderer Konstellation auch in der Brauhefe S. cerevisiae vorliegen.

Diese Sensitivität entspricht der von Detektionssystemen im Bereich der Brauereien gefor-

derten Nachweisempfindlichkeit von einem verderbniserregenden Organismus in 106 Kultur-

hefen (Jespersen und Jakobsen 1996). Das System ist demnach geeignet, um S. c. var. di-

astaticus in schwierigen Proben wie der Anstellhefe und anderen hefehaltigen Proben aus

dem gesamten Produktionsbereich nachzuweisen.

Der klassische Nachweis von S. c. var. diastaticus und anderen Saccharomyces Fremdhefen

kann über Kultivierung mit einer Reihe von unterschiedlichen Medien erfolgen, wobei die

Auswahl von der verwendeten Kulturhefe abhängt (Jespersen und Jakobsen 1996). Powell

und Smart (2003) verglichen drei unterschiedliche Medien (MYGP mit CuSO4, Lysin und

CLEN) mit zwei konventionellen PCR-Methoden (spezifische PCR und RAPD-PCR). Die

Ergebnisse zeigten, dass eine Kombination der drei Medien für den Nachweis von

103 Zellen/ml Fremdhefen in Kulturhefen geeignet war und die PCR-basierten Methoden

dagegen zur Identifizierung von Hefen geeignet waren. Bei der Verwendung von selektiven

Medien besteht jedoch immer die Gefahr, dass auch mögliche Fremdhefen, die sich in einem

physiologisch schlechten Zustand bedingt durch z. B. Hitzebehandlung befinden, ebenfalls

inhibiert werden und somit unentdeckt bleiben (Jespersen und Jakobsen 1996). Kultivie-

rungsmethoden haben den Nachteil, dass aktive Prozesskontrollen und zeitnahe Qualitäts-

kontrollen der Produkte schwierig sind, da Tage oder sogar Wochen vergehen bis mögliche

Kontaminationen erkannt werden. Die Anwendung einer schnellen Methode wie der Real-

Time PCR zum Nachweis von S. c. var. diastaticus kann hier dazu beitragen, dass Endpro-

dukte schneller ausgeliefert werden können, da die Ergebnisse der Qualitätskontrolle schnell

vorliegen. Je schneller eine Methode zum Nachweis von verderbniserregenden Mikroorga-

nismen ist, desto weniger Lagerzeit ist notwendig und somit reduziert sich auch die benötigte

Lagerfläche. Die Gesamtzeit, die für die DNA-Extraktion von 30 Proben mit der mecha-

4 Diskussion

90

nisch/thermischen Methode und die Durchführung der Real-Time PCR benötigt wird, beträgt

für den Einzelnachweis von S. c. var. diastaticus nur 2,5 Stunden.

Probleme bei der Anwendung von PCR-Methoden können durch falsch-positive Ergebnisse

entstehen, die durch Amplifikation von freier DNA oder DNA von toten Mikroorganismen,

deren Zellmembranen noch intakt sind, verursacht werden (van der Vossen und Hofstra

1996). Im Bereich der Getränkeindustrie ist nur der Nachweis von lebenden und damit poten-

tiell schädlichen Mikroorganismen relevant. Für pathogene Bakterien wurde von einigen Au-

toren gezeigt, dass die DNA von abgetöteten Zellen noch viele Tage als Vorlage für die PCR

dienen konnte (Allmann et al. 1995, Josephson et al. 1993, Masters et al. 1994). Bleve et al.

(2003) konnte für S. cerevisiae zeigen, dass nach einer Abtötung der Zellen bei 60 °C für

20 min die DNA auch 24 Stunden später nach einer Inkubation bei 25 °C noch amplifiziert

werden konnte. In der vorliegenden Arbeit wurde keine undotierte Probe mit oder ohne An-

reicherung falsch-positiv getestet. Die bei dem Consensus-System angewandte Voranreiche-

rung könnte bei Untersuchungen von z. B. Säften, bei denen durchaus auch „non-viable“

Targetorganismen zu erwarten wären, die zwar nicht lebensfähig sind, deren DNA aber in-

takt ist, zur Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen genutzt werden. Rückstell-

proben, die kühl gelagert wurden, müssten dann bei positiven Ergebnissen ebenfalls getestet

werden, um das Ergebnis aufgrund von lebensfähigen Hefen als positiv zu verifizieren. Der

Nachweis von Organismen über mRNA als Target kann unter der Voraussetzung, dass die

ausgewählte RNA nach dem Tod der Zelle schnell abgebaut wird und eine essentielle Funk-

tion für den Organismus hat, zur Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen einge-

setzt werden. Die Anwendbarkeit dieser Methode für Hefen in Lebensmitteln wurde von eini-

gen Autoren für unterschiedliche Targets wie z. B. EF-1α und Actin mRNA gezeigt (Bleve et

al. 2003, Vaitilingom et al. 1998). Die Komplexität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen

verhinderte deren Umstellung zu einer RT-PCR, obwohl Versuche mit einem reduzierten

System die Nutzbarkeit der mRNA des EF-3 Proteins anzeigten. Die Daten zu diesem Expe-

riment werden im Anhang im Kapitel 6.3 präsentiert.

Für die Anwendbarkeit in der Praxis stellen sich jedoch Fragen, die die Komplexität und da-

mit die Handhabbarkeit der Methode betreffen. Ein zusätzlicher DNase-Verdau mit entspre-

chenden Kontrollen und möglicherweise einer getrennten Reversen Transkription könnten zu

einem erhöhten Arbeitsaufwand führen. Die Inaktivierung der DNase vor der RT-PCR und

die Vermeidung von Ribonucleasen sind ebenfalls kritische Punkte, die eine Anwendung als

Routineuntersuchung erschweren. Eine Behandlung von Proben, die für eine PCR verwen-

det werden sollen, mit DNase vor einer DNA-Extraktion könnte auch zur Eliminierung von

freier DNA und DNA von toten Zellen verwendet werden (Lyon 2001, Nogva et al. 2000).

4 Diskussion

91

Bleve et al. (2003) stellten außerdem nach der Hitzeinaktivierung von S. cerevisiae Zellen

ausgehend von einer hohen Zellzahl von 108 Zellen fest, dass die mRNA auch noch nach

24 Stunden Inkubation über RT-PCR nachzuweisen war, da ein Teil der Zellen in ein VBNC-

Stadium übergegangen war.

Hefen können wie Bakterien ein so genanntes VBNC-Stadium (viable but nonculturable sta-

te) einnehmen, in dem die Zellen zwar metabolisch aktiv sind, aber keine Zellteilung zum

Wachstum in flüssigem oder festem Nährmedium durchführen (Oliver 1993). Ausgelöst wird

der Übergang in dieses Stadium durch Stressfaktoren wie z. B. Nährstoffmangel oder un-

günstige Temperaturen, die neben der Veränderung der Zellmembranen zu einer Verkleine-

rung der Zellgröße führen (McDougald et al. 1998, Oliver et al. 1995). Divol und Lonvaud-

Funel (2005) konnten den Übergang in ein VBNC-Stadium bei S. cerevisiae, C. stellata und

Z. bailii in durch Botrytis cinerea beeinflusstem Wein nach der Zugabe von SO2 beobachten,

während dessen keine Kultivierung auf festem Nährmedium möglich war. Nach Verdünnung

des Weins und der damit verbundenen Herabsetzung der Stressfaktoren SO2-Konzentration

und osmotischer Druck gelangten die Hefen wieder in ein kultivierbares Stadium. Die Detek-

tion von Organismen, die sich in dem VBNC-Stadium befinden, kann besonders dann sinn-

voll sein, wenn ein Produkt wie z. B. Wein zur Reifung lange gelagert wird. Das Phänomen

einer erneuten Fermentation von in Fässern reifendem oder abgefülltem Wein, in dem zum

Zeitpunkt der Einlagerung oder Abfüllung über Kultivierung keine Mikroorganismen nachzu-

weisen waren, könnte durch z. B Brettanomyces sp. im VBNC-Stadium verursacht werden.

Nur direkte Techniken, die keine Kultivierung benötigen, können zur Detektion von Hefen in

diesem Stadium angewandt werden. Neben Methoden wie der Durchflusszytometrie und der

DEF-Technik (direct epifluorescent filter technique) bietet auch die Real-Time PCR die Mög-

lichkeit, diese Organismen nachzuweisen (Divol und Lonvaud-Funel 2005, Lowder et al.

2000).

4 Diskussion

92

4.4 Ausblick

Die entwickelten Real-Time PCR-Assays sind in ihrer jetzigen Form zusammen mit den Pro-

benaufarbeitungsmethoden für den Einsatz in der Getränkeindustrie geeignet. Bei beiden

Systemen besteht das Potential, sie durch Einbeziehung weiterer Targetorganismen zu er-

weitern. Der Einzelnachweis für S. cerevisiae var. diastaticus könnte durch den gleichzeiti-

gen Nachweis von weiteren obligat bierschädlichen Hefen wie z. B. S. bayanus, S. pastoria-

nus und D. bruxellensis ergänzt werden. Der Gesamtnachweis für Hefen könnte nach Gene-

rierung von weiteren Sequenzen zu einem Nachweis für Hefen und Schimmelpilze ausge-

weitet werden.

Der Erweiterung der Komplexität von Real-Time PCR-Assays sind jedoch durch die Anzahl

der einsetzbaren Fluoreszenzfarbstoffe Grenzen gesetzt, wenn eine größere Anzahl unter-

schiedlicher Arten oder Stämme gleichzeitig detektiert und identifiziert werden soll. Die An-

wendung der Multiplex-PCR mit anschließender Detektion über Microarrays, die ein hohes

Potential zur Differenzierung bieten, wird in Zukunft sicher bei geeigneter Automatisierung für

solche Fragestellungen zum Einsatz kommen, um ausgehend von einem einzelnen Assay

sehr viele unterschiedliche Targets zu identifizieren. Die Menge an produzierten Daten wird

durch die Anwendung solcher immer umfangreicheren Identifizierungsmethoden ansteigen

und die Ansprüche an die Auswertungssysteme erhöhen. Jedoch wird auf Einzelnachweise

im Real-Time PCR Maßstab für sehr relevante Mikroorganismen, deren An- bzw. Abwesen-

heit in einer Probe getestet werden muss, nicht verzichtet werden, da die Sensitivität von

Multiplex-PCR-Systemen durch Konkurrenzreaktionen herabgesetzt wird.

Mit zunehmender Vollautomatisierung im Bereich der Probenaufarbeitung und der anschlie-

ßenden Detektion wird auch die Möglichkeit der Online-Datenübertragung zwischen unter-

schiedlichen Produktionsstandorten und der Datenbündelung zur zentralen Auswertung

möglich.

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6 Anhang

110

6 Anhang

6.1 Getestete Mikroorganismen

Tab. 6.1: Stämme für die Spezifitätstestung der Rea l-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus

Spezies Stamm/Herkunft Spezies Stamm/Herkunft Candida boidinii DSM 70024 S. cerevisiae ATCC 44075 Candida magnoliae DSM 70638 S. cerevisiae CBS 6503 Candida sake CBS 2920 S. cerevisiae ATCC 12341 Candida tropicalis ATCC 20247 S. cerevisiae ATCC 18790 Cryptococcus albidus DSM 70197 S. cerevisiae ATCC 28383 Debaryomyces hansenii BCD 3512 S. cerevisiae DSM 70452 Dekkera anomala DSM 70727 S. cerevisiae DSM 1333 Dekkera anomala DSM 70732 S. cerevisiae DSM 70416 Dekkera bruxellensis DSM 3429 S. cerevisiae Brauerei E Dekkera bruxellensis DSM 70726 S. cerevisiae Brauerei D Dekkera custersiana DSM 70736 S. cerevisiae var. diastaticus BCD 1257 E. coli DSM 30083 S. cerevisiae var. diastaticus BCD 1432 E. coli Serovar O157:H7 BCD 5579 S. cerevisiae var. diastaticus BCD 1433 Hanseniaspora uvarum ATCC 9774 S. cerevisiae var. diastaticus BCD 1499 Issatchenkia orientalis CBS 5147 S. cerevisiae var. diastaticus BCD 1501 Kazachstania unispora BCD 877 S. cerevisiae var. diastaticus BCD 13974 Kluyveromyces marxianus DSM 70106 S. cerevisiae var. diastaticus BCD 13980 Kluyveromyces marxianus BCD 5186 S. cerevisiae var. diastaticus DSM 70487 Lactobacillus brevis DSM 20054 S. cerevisiae var. diastaticus VTT C-68059 Lactobacillus casei DSM 20011 S. cerevisiae var. diastaticus VTT C-70060 Lactobacillus collinoides DSM 20515 S. cerevisiae var. diastaticus VTT C-82101 Lactobacillus coryniformis DSM 20001 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei A Lactobacillus lindneri DSM 20690 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei A Lactobacillus parabuchneri DSM 5707 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei A Lactobacillus plantarum DSM 20174 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei A Lactobacillus perolens DSM 12744 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei A Megasphaera cerevisiae DSM 20462 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei A Pectinatus cerevisiiphilus DSM 20467 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei B Pectinatus frisingensis DSM 6306 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei B Pediococcus damnosus DSM 20331 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei C Pediococcus inopinatus DSM 20285 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei C Pediococcus parvulus DSM 20332 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei D Pediococcus claussenii DSM 14800 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei D Pediococcus pentosaceus DSM 20336 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei D Pichia anomala BCD 1082 S. cerevisiae var. diastaticus Brauerei E Pichia anomala DSM 70783 S. exiguus BCD 1491 Pichia membranaefaciens DSM 70178 S. exiguus BCD 1493 Rhodotorula sp. ATCC 20254 S. exiguus MUCL 29838 Rhodotorula glutinis BCD 3530 S. kluyveri DSM 70517 Rhodotorula rubra BCD 4081 Saccharomycopsis fibuligera ATCC 9947 S. bayanus BCD 1256 Schizosaccharomyces pombe BCD 773 S. bayanus BCD 1392 Torulaspora delbrueckii CBS 5636 S. bayanus DSM 70412 Z. bailii MUCL 28823 S. carlsbergensis (=S. past.) BCD 2573 Z. bisporus DSM 70415 S. carlsbergensis (=S. past.) BCD 2574 Z. cidri MUCL 31280 S. carlsbergensis (=S. past.) BCD 2581 Z. fermentati MUCL 27824 S. carlsbergensis (=S. past.) ATCC 9080 Z. lentus CBS 8516 S. carlsbergensis (=S. past.) BCD 728 Z. rouxii DSM 70835 S. pastorianus NCYC 73 Z. rouxii ATCC 48230 S. pastorianus DSM 6580

6 Anhang

111

6.2 Sequenzauswertung

Abb. 6.1: Alignment der Nucleinsäuresequenzen des EF-3 Sequenzabschnitts (Posi-tion 2272-2637) mit Angabe der Primerpositionen.

1 10 20 30 40 50 60 70 75 |--------|---------|---------|---------|---------|---------|---------|----|- HS10 |-------------------| HS11/I-IV |--------------------| Ha1f-5f |-----------------------| Yfa1-2,Yfs1 |-------------------| Ca AF038153 TGGAGATTCCAAACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGATAGAGCCTCTAGACAAATCAATGAAGAAGATGAACAAA Ca ATCC 10231 TGGAGGTTCCAGTCTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGATAGAGCTTCTAGACAAATCAATGAAGAAGATGAACAAA Cb DSM 70034 TGGCGGTACCAGACTGGTGAAGATCGTGAAACTATGGGTAGGGCTTCTAGACAAATTAACGAAAATGATGAAGAAG Cc DSM 70136 TGGAGGTTCCAGACTGGTGAGGACAGAGAAACCATGGACCGTGCTTCCAGACAGGTTACCGAGGAAGACGAGAACA Cd DSM 70042 TGGAGGTACCAAACTGGTGAAGATCGAGAGACTATGGATCGAGCCAATCGACAGATCGATGAAAATGATGAGGAAG Ce DSM70858 --------------------AGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCAAGACAAATCAATGAAAATGATGAAGAAA Cg BCD 8932 TGGAGGTACCAAACCGGTGAAGATAGAGAAACTATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAGATGATGAAGCTG Cglae CBS 5691 TGGCGGTACCAGACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCCAACAGACAAGTTACTGAAAAGGATGAAGAAA Ch DSM 70624 TGGCGGTACCACACTGGTGAGGACAGAGAGACCATGGACAGAGCCAACAGACAGATCAACGAAGCTGATGAGAACG Cim BCD 1062 TGGCGGTACCAGACCGGTGAGGATCGTGAAACCATGGACCGTGCCTCTCGTCAAATCAACGAGGACGATGAAACCT Cint BCD 685 TGGAGGTTCCATACCGGTGAGGACAGAGAGACCATGGACAGAGCCAACAGACAGATTAACGAGGACGATGAGAACG Ck BCD 689 TGGAGGTACCAGACCGGTGAGGACAGAGAGACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATCAACGAGAGCGATGAGAACG Cll DSM 70102 TGGCGGTTCCAGACCGGTGAGGACAGAGAGACCATGGACAGAGCCAACAGACAAATCAACGAGGATGACGAGAACG Cm DSM 70638 --------------------GATATGAGAGACCATGGACCGTGCTAGCCGCCAGATCGACGAGAACGACGAGCAGG Cmal AB018532 TGGAGATTCCAAACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATCAACGAAGAAGATGAACAAA Cmal BCD 806 TGGCGGTTCCAATCTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGAGTTATCAACGAAAACGATGCTGAAG Cmel AB018533 TGGAGATTCCACACTGGTGAAGACAGAGAGACCATGGACAGAGCCTCTAGACAAATCAACGAGAGTGATGAGAACG Cmu DSM 70862 TGGCGGTACCAGACCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGATAGAGCTTCAAGACAAATTAACGAACAAGATGAACAAT Cp ATCC 20384 TGGAGGTTCCAGTCCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATTAACGAAGAAGATGAACAAA Cr BCD 814 TGGCGGTACCAGTCTGGTGAGGACCGTGAGACCATGGACCGTGCCAACCGTCAGATCGATGAGAACGATGAGGCTG Cs BCD 1054 TGGCGGTACCAGTCCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATCAACGAAAACGATGAAAACG Csan CBS 4261 TGGAGGTTCCACACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATTAACGAAAACGATGAAAACG Cso BCD 818 TGGAGGTACCAATTCGGTGAAGATAGAGAAACTATGGTTCGTGCTTCAAGACAAATTAATGAAAATGATGAAGAAG Ct BCD 819 TGGCGGTTCCACACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCTAGACAGATCAACGAAGATGATGAAAAGG Ctr ATCC 20326 TGGAGGTTCCACACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATCAACGAAGAAGATGAACAAA Cv DSM 6956 TGGCGGTTCCAGTCTGGTGAGGACCGTGAGACTATGGACCGTGCCAACCGTCAAATCGATGAGAATGACGAGAAGG Cvi DSM 70184 TGGCGATACCAAACCGGTGAAGATAGAGAAACTATGGATAGAGCTTCTAGACAAATTAACGAAAATGATGAACAGG Cz AB018534 TGGAGATTCCACACTGGTGAAGACAGAGAGACCATGGACAGAGCCTCTAGACAAATCAACGAGAGTGACGAGAACG Cz BCD 690 TGGAGGTTCCACACTGGTGAAGACAGAGAGACAATGGACAGAGCCTCTAGACAAATCAACGAGAGTGACGAGAACG De ATCC 20126 TGGAGGTACCAGACCGGTGAAGATAGAGAAACTATGGATAGAGCATCTAGACAAATCAACGAAGATGATGAGAATG Dekb DSM 3429 TGGAGGTACCAATCCGGTGAAGATCGTGAGACTATGGACCGTGCTAACAGGAAGATTAACGAAGAGGACAAGCAGG Dekb DSM 70726 TGGCGGTACCAGACTGGTGAAGATCGTGAGACTATGGACCGTGCTAACAGGAAGATTAACGAAGAGGACAAGCAGG Dekc DSM 70736 TGGCGGTACCAGACTGGTGAAGATCGTGAAACCATGGACCGTGCCAACAGAAAGATCAATGAATCTGATAAGCAGG Dh BCD 3512 TGGAGGTACCAATCTGGTGAAGATAGAGAAACTATGGACAGAGCCTCCAGACAAATCAACGAAGATGATGAAACTT Dh BCD 589 TGGAGGTACCAAACCGGTGAAGATAGAGAAACTATGGACAGAGCCTCCAGACAAATCAACGAAGATGATGAAACTT Dm ATCC 11627 TGGAGGTTCCAAACTGGTGAAGATAGAGAAACTATGGACAGAGCTTCTAGACAAATCAACGAAGATGATGAAACTT Ef BCD 3514 TGGAGGTTCCAGACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGATAGAGCTTCTAGACAAGTTAACGAACAAGATGAAAACT Ef DSM 70554 TGGAGGTACCAGTCTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATCAATGAAAGTGATGAAGAAG Gs DSM 3431 TGGAGGTTCCAAACCGGTGAAGATAGAGAAACTATGGACAGAGCTTCCAGACAAATCAACGAAAATGATGAACAAG Hb BCD 859 TGGCGGTACCAGTCTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCCAGACAAGTTAACGAACAAGATGAAAACT Hb DSM 3505 TGGCGGTACCAATCTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGATAGAGCTTCTAGACAAGTTAACGAACAAGATGAAAACT Hg DSM 70285 TGGCGGTTCCATTCTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAGATGATGAAGCTG Hu ATCC 9774 TGGAGGTTCCAAACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAGATGATGAAGCTG Hu BCD 3526 -GAAGGTTCCATTCCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAGATGATGAAGCTG Hv DSM 70283 TGGAGGTTCCACACCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCCAACAGACAAATCAACGAAGATGATGCTCAAG Io CBS 5147 TGGAGGTTCCAGACCGGTGAAGATAGAGAAACTATGGATAGAGCTTCCAGACAAATCAACGAAAACGATGAACAAG Kl AB018535 TGGAGATTCCAAACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGAGTTATCAACGAAGATGATGCTGAAG Km BCD 2563 TGGCGGTTCCAGACCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGAGTTATCAACGAAAACGATGCTGAAG Km BCD 5186 TGGAGGTACCAGACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGGGCTAACAGAGTTATCAACGAAAACGATGCTGAAG Km BCD 811 TGGAGGTTCCAGACCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGAGTTATCAACGAAAACGATGCTGAAG Km DSM 70106 TGGCGGTTCCATACCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGAGTTATCAACGAAAACGATGCTGAAG Km DSM 70792 TGGAGGTACCAGTCTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGAGTTATCAACGAAAACGATGCTGAAG Ku BCD 877 TGGAGGTTCCAGACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGATAGAGCTAACAGACAAATTAATGAAAATGATGCTGAAG Le DSM 70320 TGGCGGTTCCAGTCCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCAAGACAAATCAACGAGGCTGATGAGCAAA Lt CBS 6340 TGGAGGTTCCAGTCTGGTGAAGACAGAGAGACCATGGACAGAGCCAACAGAGTCATCAACGAGGAGGATGCTGAGT Mp DSM 70321 TGGCGGTTCCAGTCTGGTGAGGACAGAGAGACCATGGACAGAGCTAACAGAGTCATCAACGAGGGCGATGAGAATG Pa DSM 70277 TGGAGGTACCAAACCGGTGAAGACAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATCAACGAGAACGATGAGCAGG Pan BCD 1082 TGGAGGTTCCAAACTGGTGAAGATAGAGAAACTATGGATCGTGCTTCAAGACAAATTAATGAAAATGATGAAGAAG Pan DSM 70783 TGGCGGTTCCACACTGGTGAAGATAGAGAAACTATGGATCGTGCTTCAAGACAAATTAATGAAAATGATGAAGAAG Pc CBS 601 TGGAGGTTCCAAACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGATCGTGCTTCCAGACAAATCAATGAAAATGATGAACAAG Pcar DSM 70392 TGGAGGTTCCAGACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGATAGAGCATCTAGACAAATCAACGAAGATGATCAAAAAG Pf BCD 861 TGGCGGTTCCAGACTGGTGAAGATAGAGAGACTATGGATAGAGCTTCTAGACAAATCAACGAGGAGGACGAGAGTG Pfe BCD 711 TGGAGGTTCCAAACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATCAACGAAAACGATGAAGAAG Pfe DSM 70090 TGGAGGTTCCAATCCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCCAGACAAATTAACGAAAACGATGAACAAG Pg BCD 804 TGGAGGTACCAGACTGGTGAGGACAGAGAGACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATCAACGAGAGCGATGAGAACG Pm DSM 70178 TGGAGGTTCCACTCTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCCAGACAAATCAACGAAAATGATGAAGAAG

6 Anhang

112

Po BCD 862 TGGAGGTTCCAGACTGGTGAGGACAGAGGGACCATGGACAGAGCTTCCAGACAGGTCACCGAGGAGGACGAGCAGA Pp AB018536 TGGAGATTCCAAACCGGTGAGGACCGTGAGACCATGGACCGTGCATCTAGACAAATCAACGAGAACGATGAGGAGG Sb BCD 1256 TGGAGGTTCCAAACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATTAACGAAGACGATGCTCAAG Sb BCD 1392 TGGCGGTTCCATACCGGTGAAGACAGAAAAACCATGGACAGAGCTAACAGAGTTATCAACGAAGATGATGCTGAAG Sb DSM 70412 TGGCGGTACCAGACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATTAACGAAGACGATGCTCAAG Sc AB018539 TGGAGATTCCAAACCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAAACGATGCTGAAG Sc DSM 1333 TGGAGGTTCCAGTCCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAAATGATGCTGAAG Sd BCD 1257 TGGCGGTACCAGTCCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAAACGATGCTGAAG Sd DSM 70487 TGGAGGTTCCAGACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAAACGATGCTGAAG Se MUCL 29838 TGGAGGTTCCAGTCCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAAACGATGCTGAAG Sp DSM 6580 TGGAGGTTCCAGACCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGATAGAGCTAATAGGCAAATAAATGAAAATGATGCGGAAG Sp BCD 728 TGGAGGTACCAGTCTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATTAATGAAGACGATGCTCAAG Td DSM 70607 TGGAGGTACCAGACCGGTGAAGACAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGAGTTATCAACGAAGATGATGCTGAAG Yl AB018537 TGGCGATTCCAGACCGGTGAGGATCGAGAGACCATGGACCGAGCCAACCGACAGATCACCGACTCCGATGAGGCTG Yl BCD 2003 TGGCGGTACCAGACTGGTGAAGATCGAGAGACTATGGATCGAGCCAATCGACAGATCGATGAAAATGATGAGGAAG Yl BCD 2556 TGGCGGTACCAGACCGGTGAGGATCGAGAGACCATGGACCGAGCCAACCGACAGATCACCGACTCCGATGAGGCTG Zb BCD 1424 TGGCGGTACCAGACCGGTGAGGACAGAGAGACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAGAGTGATGAGCGGG Zbi DSM 70415 TGGAGGTTCCAGACCGGTGAAGACAGAGAAACCATGGATAGAGCTAACAGACAGATTAATGAGAGTGACGAACAGG Zf DSM 70506 TGGCGGTTCCAGTCTGGTGAAGACAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAAACGATGCTGAAG Zm DSM 6959 TGGAGGTTCCATACTGGTGAAGATAGAGAAACTATGGACAGAGCCAACAGACAAATCAACGAAGATGATGCTCAAG Zr ATCC 48230 TGGAGGTTCCAGACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATTAACGAAGATGATGCTCAAG Scho DSM 70573 TGGCGGTTCCACTCTGGTGAAGATTTGGAAGCTATGGACAAGGCCTCTCGTGTCATTAACGAAGCTGATGAGGAAG Schp AB018538 TGGCGTTTCCAATCTGGTGAAGATTTGGAGGCTATGGATAAGGCTTCTCGTGTCATCAGCGAGGCTGATGAGGAGG Schp BCD 773 TGGCGGTACCACACTGGTGAAGATTTGGAGGCTATGGATAAGGCTTCTCGTGTCATCAGCGAGGCTGATGAGGAGG HS12/IV-IX |--------------------| Hb1f-5f |-------------------- Hb6f |----------------------| Hb7f |------------------| Bd DSM 70745 TGGCGATACCAAACCGGTGAAGATTTGGAAGAAATGAACAAAGCTACCCGAGTCATGACCGAAGAAGAGAAACAAA Cra DSM 70197 TGGCGATACCAGACCGGTGAGGATTTGGAGGAACTGCAAAAGGCGAACCGACAGTTGACCGAGGAAGAGATGCAAA Crc BCD 2578 TGGCGGTTCCATACCGGTGAGGACATTGAGGAGCTCTCCAAGGCCAACCGTGTCCTCTCCGAGGAGGAGAAGAAGA Crc DSM 70022 TGGCGATACCAGACGGGTGAGGACCTCGAGGAGCTCAACAAGGCCAACCGTGTCATGTCCGAGGAGGAGAAGAAGA Crf BCD 823 TGGCGATACCAGACCGGTGAGGATCTCGAGGAGATGCACAAGGCCAACCGAGTCATGACCGAGGAGGAGAAGAAGA Crh DSM 70067 TGGCGATACCAGACCGGTGAGGACCTCGAGGAGGTGAACAAGGCCACCCGTGTCATGACCGAGGAGGAGAAGAAGA Crl BCD 824 TGGCGATACCAGACTGGTGAGGATCTTGAGGAACTACACAAGGCCAACCGAACCATGTCTGCCGAGGAAGAGGCCA Fn AF316889 TGGCGATACCAGACCGGTGAGGACTTGGAGGAAATGCACAAGGCTAACCGGGTCATGACCGAGGCCGAGCTTGCCA Rg BCD 3530 TGGAGGTTCCAGACCGGTGAGGACATTGAGGAGCTCGCCAAGGCCAACCGCAAGCTCAGCGAGGAGGAGGAGAAGA Rm DSM 70408 TGGAGATACCAGACCGGTGAGGATCTCGAGGAGCTCAACAAGGAAGGCCGACAGATCACCGATGCCGAAAAGGAGA Spj BCD 4982 TGGCGATAC-AGACTGGTGAGGACCTCGAAGAGCTCGCGAAGGCCAACCGCACCCTCTCTGAGGAGGAGGAGAAGA Spj BCD 778 TGGAGGTTCCAGACCGGTGAGGACATTGAGGAGCTCCACAAGGCCAACCGTGTCCTGTCCGAGGAGGAGGAGAAGA Spj DSM 70847 TGGAGGTTCCAGACCGGTGAGGACATTGAGGAGCTCCACAAGGCCAACCGTGTCCTGTCCGAGGAGGAGGAGAAGA Trc DSM 70684 TGGAGGTTCCAGACCGGTGAGGACCTCGAGGAGCTGAACAAGGCTACTCGTGTCCTTACCGAGGAGGAGAAGAAGA 77 80 90 100 110 120 130 140 150 | | | | | | | | | Yff1-4,6,8 |------------------------------ Ca AF038153 ACATGAA------CAAGATTTTCAAAATTGAAGGTACACCAAGAAGAATTGCTGGTATTCACGCCAGAAGAAAGTT Ca ATCC 10231 ACATGAA------CAAGATTTTCAAAATTGAAGGTACACCAAGAAGAATTGCTGGTATTCACGCCAGAAGAAAGTT Cb DSM 70034 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACTCCAAGAAGAATTGCCGGTATTCACTCCAGAAGAAAGTT Cc DSM 70136 ACATGAA------CAAGATCTTCAAGGTTGAGGGTTCCGAGCGTAGAATTGCCGGTACCCACGCCAGAAGAAAGTT Cd DSM 70042 CCATGAA------CAAGATATATAAGATTGAAGGCACTCAGCGACGTGTGGCCGGTGTTCATGCTCGAAGGAAGTT Ce DSM70858 ACATGAA------GAAAATCTTCAAAGTTGAAGGTACACCAAGAAGAATTAAAGACATTATTGCCCGAAGAAAATT Cg BCD 8932 GTATGAA------GAAGATTTTCGAAATTGAAAACACTCCAAGAAGAGTTCAAGAAATCCATGCCAGAAGAAAATT Cglae CBS 5691 ACATGAA------CAAGGTTTTCAAGATCGAAGGTACTCCAAGAAGAGTCCAAGGTATCCACGCCAGAAGAAAGTT Ch DSM 70624 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGGTCGAGGGTACCCCAAGAAGAGTTGCTGGTGTCCACTCTAGAAGAAAGTT Cim BCD 1062 CCATGAA------CAAAATCTTCAAGATTGAGGGTACCCCAAGAAGAATTCAAGGTATCCACGCCAGAAGAAAGTT Cint BCD 685 CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAGGGTACCCCAAGAAGAATTGCTGGTATTCACGCTAGAAGAAAGTT Ck BCD 689 CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACCCCAAGAAGAGTTGCTGGTATTCACGCTAGAAGAAAGTT Cll DSM 70102 CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAGGGTACCCCAAGAAGAATTGCTGGTATTCACGGTAGAAGAAAGTT Cm DSM 70638 CCAAGAA------CAAGGTCTACAAGGTCGAGGGCACCTACCGCCGTGTGAACGAGGTTCTGTCCCGCCGTAAGTT Cmal AB018532 ACATGAA------CAAAATCTTCAAAGTTGAAGGTACTCCAAGAAGAGTTGCTGGTATCCACGCCAGAAGAAAGTT Cmal BCD 806 CTGTGAA------CAAGATCTTCAAGATCGATGGTACCCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAAGTT Cmel AB018533 CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAGGGTACTCCCAGAAGAATCCAAGGTATTCACGCCAGAAGAAAGTT Cmu DSM 70862 CTATGAA------CAAGATCTTCTCAGTTGAAGGATCACCAAGAAAGATTGCTGGTATTCACTCTAGAAGAAAATT Cp ATCC 20384 ATATGAA------CAAGATTTTCAAGATTGAAGGTACCCCAAGAAGAGTTGTTGGTATCCATTCTAGAAGAAAGTT Cr BCD 814 CCATGAA------CAAGATCTACAAGATTGAGGGAACTCCCCGCTGTGTTGCCGGTGTTCATGCTCGTCGTAAGTT Cs BCD1054 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGGTTGAAGGTACCCCAAGAAGAGTCCAAGGTATTCACGCTAGAAGAAAGTT Csan CBS 4261 CTATGAA------CAAGATTTTCAAGGTTGAAGGTACTCCAAGAAGAATCCAAGGTATCCATGCTAGAAGAAAGTT Cso BCD 818 GTATGAA------GAAAATCTTCAAAATTGAAGGTACTCCAAGACGTATTCATGAAATTCATGCTAGAAGGAAATT Ct BCD 819 GAATGGA------AAAGATCTTCAAGATTGAAGGTTCTCCAAGAAGAGTTGCTGGCATTCACGCTAGAAGAAAATT Ctr ATCC 20326 ACATGAA------CAAGATCTTCAAAGTTGAAGGTACACCAAGAAGAGTTGCTGGTATCCACGCCAGAAGAAAGTT Cv DSM 6956 CTATGAA------CAAGATCTACAAGATCGAAGGTACTGAGCGTCGTGTGCAAGGTGTTCACTCTCGCCGGAAGTT Cvi DSM 70184 CTATGAA------CAAAATTTTCAAGATTGAAGGCACTCCAAGAAGAATTCAAGGTATTCATTCTAGAAGAAAGTT Cz AB018534 CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAGGGTACTCCCAGAAGAATCCAAGGTATTCACGCCAGAAGAAAGTT Cz BCD 690 CCATGAA------CAAGATTTTCAAGATCGAGGGTACTCCCAGAAGAATTCAAGGTATTCACGCCAGAAGAAAGTT De ATCC 20126 CTATGAA------CAAAATCTTCAAGATTGAGGGTACCCCAAGAAGAGTCGCTGGTATCCATGCCAGAAGAAAGTT Dekb DSM 3429 GTATGAA------CAAGATTTTCCACATTGAAGGTACCTCAAGGAGAATTGCCGGTATCCACTCTAGAAGAAAGTT

6 Anhang

113

Dekb DSM 70726 GTATGAA------CAAGATTTTCCACATTGAAGGTACTTCAAGGAGAATTGCCGGTATCCACTCTAGAAGAAAGTT Dekc DSM 70736 GTATGAA------TAAGATTTTCCATATTGAAGGTACTCCAAGAAGGATTGCTTCTATCAACTCCAGAAGAAAGTT Dh BCD 3512 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACTCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACGCCAGAAGAAAGTT Dh BCD 589 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACTCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACGCCAGAAGAAAGTT Dm ATCC 11627 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACTCCAAGAAGAATTGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAAGTT Ef BCD 3514 CTATGAA------AAAGATTTTCAATGTTGAAGGTACCCCAAGAAGAATTGCCGGTATTCACTCCAGAAGAAAGTT Ef DSM 70554 GTATGAA------GAAACTTTTCAAGGTTGAAGGTACCGCTAGAAGAATTAAGGAAATCTTGGCTAGAAGAAAGTT Gs DSM 3431 GTATGAA------GAAGATCTTCAAGGTTGATTCTACTACCAGAAGAGTTAAAGAAATTTAGCCCAGAAGAAAATT Hb BCD 859 CTATGAA------GAAGATTTTCACTGTTGAAGGTACCCCAAGAAGAATTGCTGGTATTCACTCCAGAAGAAAGTT Hb DSM 3505 CTATGAA------AAAGATTTTCAATGTTGAAGGTACCCCAAGAAGAATTGCCGGTATTCACTCCAGAAGAAAGTT Hg DSM 70285 GTATGAA------GAAGATCTTCGAAATTGAAAACACTCCAAGAAGAATTCAAGAAATTCACGCTAGAAGAAAATT Hu ATCC 9774 GTATGAA------GAAGATCTTTGAAATTGAAAACACTCCAAGAAGAATTCAAGAAATTCACGCTAGAAGAAAATT Hu BCD 3526 GTATGAA------GAAGATCTTCGAAATTGAAAACACTCCAAGAAGAATTCAAGAAATTCACGCTAGAAGAAAATT Hv DSM 70283 GTATGCA------AAAAATTTTCAAGATTGAAGGTACTCCAAGAAGAATCAACGAAATTTTGGCCAGAAGAAAATT Io CBS 5147 CTATGAA------CAAGATTTTCAAGATTGAAGGTACTCCAAGAAGAATTGCAGGTATTCACTCCAGAAGAAAGTT Kl AB018535 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGACGGTACTCCAAGAAGAATTGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAAGTT Km BCD 2563 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGATGGTACCCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAAGTT Km BCD 5186 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGATGGTACCCCAAGAAGAGTCGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAAGTT Km BCD 811 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAAGGTACCCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAAGTT Km DSM 70106 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGATGGTACCCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAGGTT Km DSM 70792 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGATGGTACCCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAAGTT Ku BCD 877 TTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACTCCAAGAAGAATTCAAGAAATTTTAGCTAGAAGAAAGTT Le DSM 70320 ACATGAA------CAAGATCTTCAAGGTTGAAGGTACCCCAAGAAGAATTGCTGGTATTCACGCAAGAAGAAAGTT Lt CBS 6340 CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAGGGTACCCCAAGAAGAATTCAGGGCATCCACGCCAGAAGAAAGTT Mp DSM 70321 CTATGAA------CAAAATTTTCAAGATCGAGGGCACTCCAAGAAGAATTGCTGGTATCCACTCTAGAAGAAAGTT Pa DSM 70277 CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGATGGTACCCCAAGAAGAATTCAAGGTATTCACGCTAGACGGAAGTT Pan BCD 1082 GTATGAA------GAAAATCTTCAAAATTGAAGGTACTCCAAGACGTATTCATGAAATTCATGCTAGAAGAAAATT Pan DSM 70783 GTATGAA------GAAAATCTTCAAAATTGAAGGTACTCCAAGACGTATTCATGAAATTCATGCTAGAAGAAAATT Pc CBS 601 CTATGAA------CAAAATTTTCAAGATTGAAGGTACCCCAAGACGTATTGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAAATT Pcar DSM 70392 ATATGAA------TAAGATTTTCAAGGTTGAGGGTACCGAAAGAAGAATTGCCGGAATTCATGCCAGAAGAAAGTT Pf BCD 861 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACTCCAAGAAGAATCGCTGGTATTCACGCTAGAAGAAAGTT Pfe BCD 711 CTATGAA------CAAGATCTATAAGATCGAAGGTACTCCAAGAAGAATTGCAGGTATTCACGCTAGACGGAAGTT Pfe DSM 70090 CTATGAA------CAAGATCTTCAGGATTGAAGGTTCTCCAAGAAGAATTGCTGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT Pg BCD 804 CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACCCCAAGAAGAGTTGCTGGTATTCACGCTAGAAGAAAGTT Pm DSM 70178 CTATGAA------CAAGATCTATAAGATCGAAGGTACCCCAAGAAGAATTAATGGTATTCACGCTAGACGGAAGTT Po BCD 862 ACATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAGGGTACCCCAAGAAGAGTTGTTGGTATCCACGCCAGAAGAAAGTT Pp AB018536 CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGATGGTACTCCAAGAAGAATCGCTGAGATTCACTCCAGAAGAAAGTT Sb BCD 1256 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAAGGTACCCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT Sb BCD 1392 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAAGGTACTCCAAGAAGAATCCAAGAGATTCACGCCAGAAGAAAGTT Sb DSM 70412 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAAGGTACCCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT Sc AB018539 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACCCCTAGAAGAATTGCCGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT Sc DSM 1333 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACCCCTAGAAGAATTGCCGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT Sd BCD 1257 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACCCCTAGAAGAATTGCCGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT Sd DSM 70487 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACCCCTAGAAGAATTGCCGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT Se MUCL 29838 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACCCCTAGAAGAATTGCCGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT Sp DSM 6580 CCATGAA------CAAAATCTTCAAAATCGAAGGAACTCCACGAAGGATTGCAGGAGTTCACTCAAGAAGAAAATT Sp BCD 728 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAAGGTACTCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT Td DSM 70607 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGGAGGTACTCCAAGAAGAATCCAAGAGATTCACGCCAGAAGAAAGTT Yl AB018537 CCATGAA------CAAGATCTACAAGATCGAGGGCACTCCCCGACGAGTTGCTGAGGTCCACGCCCGACGAAAGTT Yl BCD 2003 CCATGAA------CAAGATATATAAGATTGGAGGCACTCAGCGACGTGTGGCCGGTGTTCATGCTCGAAGGAAGTT Yl BCD 2556 CCATGAA------CAAGATCTGCAAGATCGAGGGCGCCCCCCGACGAGTTGCTGGTGTTCACGCCCGACGAAAGTT Zb BCD 1424 CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGATGGTACTCCAAGAAGAATTGCTGGTATTCACTCCAGAAGAAAGTT Zbi DSM 70415 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGACGGTACTCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACTCTAGAAGAAAGTT Zf DSM 70506 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGACGGTACCCCAAGAAGAATTGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAAGTT Zm DSM 6959 CTATGAA------CAAAATCTTCAAGATTGAAGGTACTCCAAGAAGAATTGCTGGTATTCACTCTAGAAGAAAGTT Zr ATCC 48230 CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGATGGTACCCCAAGAAGAATTGCTGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT Scho DSM 70573 CCATGAAGAA---CAAGATCTTCAAGATTGAGGGTACTCCTCGTAAGATTTTGGGTATTCACAGCCGTAGAAAGCT Schp AB018538 CTATGAAGAA---CAAGATCTTCAAGATTGAGGGAACTCAACGTAAGATTTTGGGTATCCACAGCCGTCGTAAGCT Schp BCD 773 CTATGAAGAA---CAAGATCTTCAAGATTGAGGGAACTCAACGTAAGATTTTGGGTATCCACAGCCGTCGTAAGCT Hb1f-5f ----| Yff5 |------------------------- Bd DSM70745 AGATGAAGGAAGGTGCCGTCGTTGTCAAAGAAGGTGTCAAACGATTGATAGACGAACTTGTTGCCAGAAAGAAATT Cra DSM70197 AGATGAAGGAAGGAGGCAACGTCATCATTGAAGGTGCCAAGCGAGTCATTGACGAACTTGTCGCCCGAAAGAAGCT Crc BCD 2578 AGATGGCCGAGGGTGCCACCGTCGTCGTTGAGGGTGTGAAGCGCATCATTGACGAGCTCGTTGCCCGTAAGAAGCT Crc DSM 70022 AGATGGCCGAGGGAGCAAACGTCATCAAGGACGGCGTGAAGCGTATCATTGACGAGCTTGTCGCACGTAAGAAGCT Crf BCD 823 AGATGGCCGAGGGTGCCACCTTCATGAAGGAGGGTGTCAAGCGAATCATCGACGAGATTGTTGCCCGAAAGAAGCT Crh DSM 70067 AGATGGCCGAGGGTGCCACCTTTGTCAAGGAGGGCGTCAAGCGCATCATTGACGAGCTTGTCGGCCGTAAGAAGCT Crl BCD 824 AGATGAAGGAAGGAGCCAACGTTATCAAGGAAGGTGTCAAGCGAATCATTGATGAGCTTATCGCCCGAAAGAAGCT Fn AF316889 AGATGAAGGAGGGTGCCACCGTTATCAAGGACGGTGTCAAGCGAATCATCGATGAGCTTGTTGCTAGAAAGAAGCT Rg BCD 3530 GGATGAAGGACGGCGCCAACGTCGTCGTCGAGGGCGTCAAGCGCACCATCGACGACATTGTCGCCCGCAAGAAGCT Rm DSM 70408 AGATGAAGCAGGGTGAAGTCGTCCTCGTTGAAGGTGTCAAGCGCATCATCGATGAGATCGTTGGACGAAAGAAGCT Spj BCD 4982 AGATGAAGGAGGATTCGACCGTCGTCGTTGAGGGCGTCAAGCGCACCATCGACGAGGTTATCAACCGCAAGAAGCT Spj BCD 778 AGATGAAAGAGGGTGCGACCGTTGTCGTTGAGGGTGTCAAGCGCACCATTGACGAGATCATCAGCCGCAAGAAGCT Spj DSM 70847 AGATGAAAGAGGGTGCGACCGTTGTCGTCGAGGGTGTCAAGCGCACCATTGACGAGATCATCAACCGTAAGAAGCT Trc DSM 70684 AGATGGCCGAGGGTGCTATCGTCGTCAAGGAGGGCGTCAAGCGCACCATTGACGAGCTCGTTGCCCGTAAGAAGCT

6 Anhang

114

153 160 170 180 190 200 210 220 228 |------|---------|---------|---------|---------|---------|---------|-------| Yff1-4,6,8 ------| Yfr1-4,8 |------------------------------------| Ca AF038153 CAAGAACTCTTATGAATATGAAATTTCTTGGATGTTGGGTGAAAACATTGGTATGAAGAATGAAAGATGGGTACCA Ca ATCC 10231 CAAGAACTCTTATGAATATGAAATTTCTTGGATGTTGGGTGAAAACATTGGTATGAAGAATGAAAGATGGGTACCA Cb DSM 70034 CAAGAACACCTACGAATATGAATGTTCTTTTACTTTAGGTGAAAACATTGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTCCCA Cc DSM 70136 CAAGAACTCTTACGAGTACGAGATCTCCTGGATGTTGGGTGAGAACGTCGGCATGAAGTCCGAGAGATGGGTCCCC Cd DSM 70042 CAAGAACTCTTATGAATACGAATGTTCATTCTTGCTTGGTGAAAACCTTGGCATGAAATCTGAGCGATGGATTCAA Ce DSM70858 CAAGAATTCTTATGAATATGAAATTGAATGGTCTTTAGGTGAAAACATTGGTATGAAGAATGAAAGATGGATTAAC Cg BCD 8932 CAAGAACTCTTATGAATATGAATGTTCTTTCTTATTAGGTGAAAACATTGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCA Cglae CBS 5691 CAAGAACTCTTACGAATATGAAATTTCTTGGATATCGGGAGACAATGTTGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTACCA Ch DSM 70624 CAAGAACACTTACGAGTACGAGGTTTCTTGGAACCTTGGTGAGAACATTGGCATGAAGAACGAGAGATGGGTTCCA Cim BCD 1062 CAAGAACACCTACGAGTACGAGTGTTCTTTCATGCTTGGAGAGAACATCGGTATGAAGAACGAGAGATGGGTTCCT Cint BCD 685 CAAGAACTCTTACGAGTACGAGTGTTCTTTCACCTTGGGTGAGAACATTGGTATGAAGAACGAGAGATGGGTTCCA Ck BCD 689 CAAGAACTCTTACGAGTACGAATGTTCTTGGCTCTTGGGTGAGAACATTGGCATGAAGAACGAGAGATGGGTTCCT Cll DSM 70102 CAAGAACACTTACGAGTACGAGTGTTCTTTCTTGTTGGGAGAGAACATCGGCATGAAGAACGAGAGATGGGTTCCA Cm DSM 70638 CAAGAACTCTTACGAGTACGAGGTCTCGTACCTGCTCGGAGACAACATTGGTCTCAAGAGCGAGCGCTGGGTCCCC Cmal AB018532 CAAGAACTCTTACGAGTATGAAATTTCTTGGTTGTTGGGTGAAAACATTGGTATGAAGAACGAAAGATGGGTCCCA Cmal BCD 806 CAAGAACACCTACGAGTACGAATGTTCCTTCCTGTTGGGTGAAAACATCGGTATGAAGTCTGAAAGATGGGTTCCA Cmel AB018533 CAAGAACTCTTACGAGTACGAATGTTCTTGGATGTTGGGTGAGAACATTGGCATGAAGAATGAGAGATGGGTTCCT Cmu DSM 70862 CAAAAATTCTTATGAATATGAAATTTCATGGATGTTGGGTGACAACATTGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTTGCT Cp ATCC 20384 TAAGAACTCTTATGAGTATGAAGTTTCATGGTCTTTGGGTGAAAACGTTGGTATGAAGAATGAAAGATGGGTCCCA Cr BCD 814 CAAGAACTCCTACGAGTACGAGTGTTCTTTCCTGCTCGGTGAGAACATTGGTCTCAAGTCTGAGCGCTGGATTCCC Cs BCD1054 CAAGAACTCTTACGAATACGAATGTTCTTGGATGTTGGGTGAAAACATTGGTATGAAGAACGAAAGATGGGTCCCA Csan CBS 4261 CAAGAACTCTTACGAATACGAATGTTCTTGGATGTTAGGTGAAAACATTGGTATGAAGAACGAAAGATGGGTTGCT Cso BCD 818 CAAGAACTCTTATGAATATGAATGTTCTTCCTTATTAGGTGAAAATGTTGGTATGAGGAATGAAAGATGGGTTCCA Ct BCD 819 CAAGAACTCTTACGAGTATGAATGTTCTTGGACTTTGGGTGAAAACTTGGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCA Ctr ATCC 20326 CAAGAACTCTTACGAGTATGAAATTCCTTGGTTGTTGGGTGAAAACATTGGTATGAAGAACGAAAGATGGGTCCCA Cv DSM 6956 CAAGAACTCTTATGAGTACGAGTGCTCATTCTATCTAGGTGAGAACGTTGGTCTGAAGAGCGAGCGCTGGACGCCC Cvi DSM 70184 TAAAAACACTTATGAATATGAATGTTCTTTCACATTAGGTGAAAACATCGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCA Cz AB018534 CAAGAACTCTTACGAGTACGAATGTTCTTGGATGTTGGGTGAGAACATTGGCATGAAGAATGAGAGATGGGTTCCT Cz BCD 690 CAAGAACTCTTACGAGTACGAATGTTCTTGGATGTTGGGTGAGAACATTGGCATGAAGAACGAGAGATGGGTTCCT De ATCC 20126 TAAGAACACCTACGAGTACGAATGTTCTTGGTTATTAGGTGAAAACATTGGAATGAAGAATGAAAGATGGGTTCCA Dekb DSM 3429 CAAGAACACGTACGAGTACGAGTGTTCGTTCTTGCTTGGTGAGAACGTTGGTATGAAGAGTGAGAGATGGACTCCA Dekb DSM 70726 CAAGAACACGTATGAGTACGAGTGTTCGTTCTTGCTTGGTGAGAACGTTGGTATGAAGAGTGAGAGATGGACTCCA Dekc DSM 70736 CAAGAACACTTACGAATACGAGTGTTCGTTCTTGCTTGGTGAAAATGTTGGTATGAAGAAGGAGAAGTGGACTCCA Dh BCD 3512 CAAGAACTCTTACGAGTATGAATGTTCTTGGATGTTGGGTGAAAACATCGGTATGAAGAACGAAAGATGGGTCCCA Dh BCD 589 CAAGAACTCTTACGAGTATGAATGTTCTTGGATGTTGGGTGAAAACATCGGTATGAAGAACGAAAGATGGGTCCCA Dm ATCC 11627 CAAGAACTCTTACGAATATGAATGTTCTTGGTTCTTAGGTGAAAACATCGGTATGAAAAACGAAAGATGGGTTCCA Ef BCD 3514 CAAAAACTCTTATGAATATGAAATTTCTTGGTTATTAGGTGATAACGTTGGTATGAAGAACGAAAGATGGGTTCCA Ef DSM 70554 CAAGAACTCTTACGAATATGAAATCAGTTGGTACTTGGTTGACAACCCAGGTATGAAGAACGAAAGACAAGTTCCA Gs DSM 3431 CAAGAACTCTTATGAATATGAAATTAGTTGGTATTTAGTTGAAAACCCAGGTATGAAGAATGAAAGAGAAGTTCCA Hb BCD 859 CAAAAACTCTTACGAATATGAAATTTCTTGGATGTTGGGCGACAATGTCGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTCCCA Hb DSM 3505 CAAAAACTCTTATGAATATGAAATTTCTTGGTTATTAGGTGATAACGTTGGTATGAAGAACGAAAGATGGGTTCCA Hg DSM 70285 CAAGAACTCTTACGAATACGAATGTTCTTTCTTATTAGGTGAAAACATCGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTCCCA Hu ATCC 9774 CAAGAACTCTTACGAATACGAATGTTCTTTCTTATTAGGTGAAAACATCGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTCCCA Hu BCD 3526 CAAGAACTCTTACGAATACGAATGTTCTTTCTTATTAGGTGAAAACATCGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTCCCA Hv DSM 70283 CAAAAACTCTTACGAATATGAATGTTCCTTCTTCTTGGGTGAAAACATCGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCA Io CBS 5147 CAAGAACACTTACGAATATGAATGTTCTTTCTTATTAGGTGAAAACATTGGTATGAAGTCTGAAAGATGGGTTCCA Kl AB018535 CAAGAACACCTACGAATACGAATGTTCCTTCTTGTTAGGTGAAAACATCGGTATGAAGTCTGAAAGATGGGTTCCA Km BCD 2563 CAAGAACACCTACGAGTACGAATGTTCCTTCTTGTTGGGTGAAAACATCGGTATGAAGTCTGAAAGATGGGTTCCA Km BCD 5186 CAAGAACATCTACGAGTACGAATGTTCCTTCTTGTTGGGTGAAAACATCGGTATGAAGTCTGAAAGATGGGTTCCA Km BCD 811 CAAGAACACCTACGAGTACGAATGTTCCTTCTTGTTGGGTGAAAACATCGGTATGAAGTCTGAAAGATGGGTTCCA Km DSM 70106 CAAGAACACCTACGAGTACGAATGTTCCTTCTTGTTGGGTGAAAACATCGGTATGAAGTCTGAAAGATGGGTTCCA Km DSM 70792 CAAGAACACCTACGAGTACGAATGTTCCTTCTTGTTGGGTGAAAACATCGGTATGAAGTCTGAAAGATGGGTTCCA Ku BCD 877 TAAGAATACTTATGAATATGAATGTTCTTTCTACTTAGGTGAAAACATTGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCA Le DSM 70320 TAAGAACTCTTATGAGTATGAGATTTCATGGACTTTGGGTGAAAACGTTGGTATGAAGAATGAGAGATGGGTTCCA Lt CBS 6340 CAAGAACTCTTACGAGTACGAGTGTTCTTTCTTGTTGGGTGAGAACATTGGTATGAAGTCTGAGAGATGGGTTCCA Mp DSM 70321 CAAGAACTCTTATGAGTACGAGTGTTCTTTCACCTTGGGTGAGAACATTGGCATGAAGAATGGGAGATGGGTCCAG Pa DSM 70277 CAAGAACACTTATGAGTATGAGTGTTCTTTCCTGTTGGGTGAGAACGTTGGTATGAAATCCGAGAGATGGGTTCCA Pan BCD 1082 CAAGAACTCTTATGAATATGAATGTTCTTTCTTATTAGGTGAAAATGTTGGTATGAAGAATGAAAGATGGGTTCCA Pan DSM 70783 CAAGAACTCTTATGAATATGAATGTTCTTTCTTATTAGGTGAAAATGTTGGTATGAAGAATGAAAGATGGGTTCCA Pc CBS 601 CAAAAACACTTACGAATATGAATGTTCTTTCACTTTAGGTGAAAACATTGGTATGAAGAATGGAAGATGGGTTCCA Pcar DSM 70392 TAAAAACTCTTACGAATATGAAATCTCCTGGATGTTGGGAGAAAACATTGGTATGAAGAATGAAAGATGGGTTGCA Pf BCD 861 CAAGAACTCTTACGAGTACGAATGTTCTTGGTTATTGGGTGAGAACATCGACATGAAGAACGAGAGATGGGTTCCA Pfe BCD 711 CAAGAACACATACGAATATGAATGTTCCTTCTTGTTGGGTGAAAACATTGGTATGAAGTCTGAAAGATGGGTTCCA Pfe DSM 70090 CAAGAACACCTACGAATATGGATGTTCTTTCCTTTTGGGTGACAACATCGGTATGAAGTCTGAAAGATGGGTTCCT Pg BCD 804 CAAGAACTCTTACGAGTACGAATGTTCTTGGCTCTTGGGTGAGAACATTGGCATGAAGAACGAGAGATGGGTTCCT Pm DSM 70178 CAAGAACACTTACGAGTATGAATGTTCTTTCTTCTTAGGTGAAAACATTGGTATGAAGTCTGAAAGATGGGTTCCA Po BCD 862 CAAGAACTCTTACGAGTACGAAGTCTCCTGGGCTTTGGGTGAGAACATCGGCATGAAGAACGAGAGATGGGTTAAC Pp AB018536 CAAGAACTCTTACGAGTACGAGTGTTCGTTCTTGCTGGGTGAGAACATTGGTATGAAGTCTGAGAGATGGGTTCCA Sb BCD 1256 CAAGAACACTTACGAATATGAATGTTCTTTCATGTTGGGTGAAAACATTGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCA Sb BCD 1392 CAAGAACACCTACGAATACGAATGTTCTTTCCTATTGGGTGAAAACATCGGTATGAAATCCGAGAGATGGGTTCCA Sb DSM 70412 CAAGAACACTTACGAATATGAATGTTCTTTCATGTTGGGTGAAAACATTGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCA Sc AB018539 CAAGAACACTTACGAATATGAATGTTCTTTCTTATTGGGTGAAAACATTGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCA Sc DSM 1333 CAAGAACACTTACGAATATGAATGTTCTTTCTTATTGGGTGAAAACATTGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCA Sd BCD 1257 CAAGAACACTTACGAATATGAATGTTCTTTCTTATTGGGTGAAAACATTGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCA

6 Anhang

115

Sd DSM 70487 CAAGAACACTTACGAATATGAATGTTCTTTCTTATTGGGTGAAAACATTGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCA Se MUCL 29838 CAAGAACACTTACGAATATGAATGTTCTTTCTTATTGGGTGAAAACATTGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCA Sp DSM 6580 CAAGAACACATACGAATACGAGTGCTCTTTCTTCTTAGGCGAAAACATTGGCATGAAGTCCGAGAGATGGGTCCCG Sp BCD 728 CAAGAACACTTACGAATATGAATGTTCTTTCATGTTGGGTGAAAACATTGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCA Td DSM 70607 CAAGAACACCTACGAATACGAATGTTCTTTCCTATTGGGTGAAAACATTGGTATGAAATCCGAGAGATGGGTTCCA Yl AB018537 CAAGAACTCTTACGAGTACGAGTGTTCTTTCCTGCTCGGAGAGAACCTGGGCATGAAGTCCGAGAAGTGGATCCCC Yl BCD 2003 CAAGAACTCTTATGAATACGAATGTTCATTCTTGCTTGGTGAAAACCTTGGCATGAAATCTGAGCGATGGATTCAA Yl BCD 2556 CAAGAACTCTTACGAGTACGAGTGTTCTTTCCTGCTCGGTGAGAACCCTGGCATGAAGTCCGAGAAGTGGATCCCC Zb BCD 1424 CAAGAACACTTACGAATACGAATGTTCTTTCTTGCTAGGTGAGAACATTGGTATGAAATCCGAGAGATGGGTGCCT Zbi DSM 70415 CAAGAACACTTACGAGTACGAATGTTCCTTCTTGCTAGGTGAGAACATCGGTATGAAATCCGAGAGATGGGTTCCA Zf DSM 70506 CAAGAACACTTACGAATATGAATGTTCTTTCTTATTAGGTGAAAACATCGGCATGAAATCAGAAAGATGGGTTCCA Zm DSM 6959 CAAGAACACTTACGAATATGAATGTTCCTTTTTATTAGGTGAAAACATCGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCA Zr ATCC 48230 CAAGAACTCTTACGAGTACGAATGTTCTTTCTTGTTGGGTGAAAACATCGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCA Scho DSM 70573 TAAGAACTCTTACGAGTATGAATGTTCTTTCACTGTTGGTGAGAACATTGGTATGAAGAGTGAACGCTGGGTTCCC Schp AB018538 CAAGAACTCTTATGAGTATGAGTGCTCTTTCCTCGTCGGTGAGAACATTGGCATGAAGAGTGAGCGCTGGGTTCCT Schp BCD 773 CAAGAACTCTTATGAGTATGAGTGCTCTTTCCTCGTCGGTGAGAACATTGGCATGAAGAGTGAGCGCTGGGTTCCT Yff5 --------| Yfr5,7 |-------------------- -- ---- Bd DSM70745 GAAGCAATCGTACGAGTACGAAGTTTCATTC------------------------------AA-----AGGT---- Cra DSM70197 CAAGCAGTCGTACGAGTACGAAATCTCGTTC------------------------------AA-----GGGC---- Crc BCD 2578 CAAGCAGTCTTACGAGTACGAGGTCTCGTTC------------------------------AA-----GGGC---- Crc DSM 70022 CAAGCAGTCGTACGAGTACGAGGTGTCCTTC------------------------------AA-----GGGC---- Crf BCD 823 GAAGCAATCTTACGAGTACGAGGTTTCGTTC------------------------------AA-----GGGA---- Crh DSM 70067 GAAGCAGTCTTACGAGTACGAGGTCTCGTTC------------------------------AA-----GGGC---- Crl BCD 824 CAAGCAGTCTTACGAATACGAAATCTCTTTC------------------------------AA-----GGGT---- Fn AF316889 CAAGCAGTCCTACGAGTACGAGGTATCCTTC------------------------------AA-----GGGT---- Rg BCD 3530 CAAGCAGTCGTTCGAGTACGAGGTCACCTTC------------------------------AA-----GGGC---- Rm DSM 70408 GAAGCAATCTTACGAGTACGAGCTATCCTTC------------------------------AA-----GGCT---- Spj BCD 4982 CAAGCAGTCGTTCGAGTACGAGGTCTCGTTC------------------------------AA-----GGGT---- Spj BCD 778 CAAGCAGTCGTTCGAGTACGAGACTACCTTC------------------------------AA-----GGGT---- Spj DSM 70847 CAAGCAGTCGTTCGAGTACGAGACTACCTTC------------------------------AA-----GGGT---- Trc DSM 70684 CAAGCAGTCTTACGAGTACGAGGTTTCGTTC------------------------------AA-----GGGC---- 229 240 250 260 270 280 290 300 304 |----------|---------|---------|---------|---------|---------|---------|---| Ca AF038153 ATGATGTCTGTTGACAACACTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATGGAAACTCACGCC---AAGTTGGTTGCTGAAG Ca ATCC 10231 ATGATGTCTGTTGACAACACTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATGGAAACTCACGCC---AAGTTGGTTGCTGAAG Cb DSM 70034 ATGATGTCTGTTGATAACGCTTGGTTACCAAGAGGTGAATTAGTTGAATCACATTCC---AAGATGGTTGCTGAAG Cc DSM 70136 ATGATGTCTGTTGACAACACCTGGTTGCCCAGAGGTGAGTTGATGGAGACTCACGCC---AAGTTGGTCGCCGAGG Cd DSM 70042 ATGTCCTCTGTTGACAATGCATGGATTTCGCGATCTGAGTTGGTTGAATCTCACGCC---AAGTTGGTTGCTGAGG Ce DSM70858 ATGATGTCTGCTGATAACACATGGTTACCAAGAGGTGAATTAGTTGAAACTCACTCC---AAGATGGTTAGTGAAG Cg BCD 8932 ATGTCTTCTGTTGACAATGCTTGGATTCCAAGAAGTGAATTAGTTGAATCTCATGCT---AAGTTGGTTGCTGAAG Cglae CBS 5691 ATGATGTCTGTCGACAACACTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATGGAAACCCACGCC---AAGATGGTTGCTGAAG Ch DSM 70624 ATGATGTCTGTTGACAACACCTGGTTGCCAAGAGGTGAGTTGATCGAGACTCACTCC---AAGTTGGTCGCTGAGG Cim BCD 1062 ATGATGTCTGTCGACAACGCTTGGTTGCCACGTGGTGAAATCACTGAATCTCACGGT---AAGATGGTTGCTGAGG Cint BCD 685 ATGATGTCCGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAGTTGATCGAGACTCACTCC---AAGTTGGTTGCTGAGG Ck BCD 689 ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATGGAGACCCACTCC---AAGATGGTTGCTGAGG Cll DSM 70102 ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAGTTGGTTGAGACTCACTCC---AAGATGGTTGCTGAAG Cm DSM 70638 ATGTCGTCTGTCGACAACGGCTGGATCCCGCGTAACGAGCTTATGGAGTCGCACGCC---AAGGACATTGCTGAGG Cmal AB018532 ATGATGTCTGTTGACAACACTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATGGAAACTCACGCC---AAATTGGTTGCTGAAG Cmal BCD 806 ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGGTCGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG Cmel AB018533 ATGATGTCCGTCGACAACACTTGGTTGCCAAGAAGTGAGTTGATGGAGACCCACTCC---AAGTTGGTTGCTGAGG Cmu DSM 70862 ATGATGTCAGTTGACAACACTTGGTTACCAAGAGGTGAATTAATGGAAACTCACTCC---AAGATGGTTGCTGAAG Cp ATCC 20384 ATGATGTCTGTTGATAACACCTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATGGAAACTCATGCT---AAATTGGTTGCTGAAG Cr BCD 814 ATGTCCTCTGTCGACAACGCATGGATTCCTCGTTCTGAGCTTGTTGAGTCTCATGCC---AAGCTGGTTGCTGTGG Cs BCD1054 ATGATGTCTGTTGACAACACTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTAATGGAAACCCACTCT---AAGTTGGTTGCTGAAG Csan CBS 4261 ATGATGTCTGTTGATAACACTTGGTTACCAAGAGGTGAATTAATGGAAACTCACTCT---AAGTTAGTCGCTGAAG Cso BCD 818 ATGATGTCTGTTGATAACGCTTGGTTACCAAGAGGTGAATTGGTTGAAACTCATTCC---AAATTGGTTGCTGAAG Ct BCD 819 ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTAATGGAAACTCACTCC---AAGATGGTTGCCTAAG Ctr ATCC 20326 ATGATGTCTGTTGACAACACTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATGGAAACTCACGCC---AAATTGGTTGCTGAAG Cv DSM 6956 ATGTCTTCGGTTGACAATGCTTGGATCCCTCGTAGCGAGCTTATGGAATCGCACGCT---AAGCTTGTCTCAGAGG Cvi DSM 70184 ATGCTTTCTGTTGATAACGCTTGGTTACCAAGAGGTGAATTGGTTGAATCTCATTCC---AAGATGGTTGCCGAAG Cz AB018534 ATGATGTCCGTCGACAACACTTGGTTGCCAAGAGGTGAGTTGATGGAGACCCACTCC---AAGTTGGTTGCTGAGG Cz BCD 690 ATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAGTTGATGGAGACCCACTCC---AAGTTGGTTGCCGAGG De ATCC 20126 ATGATGTCCGTTGATAACACTTGGTTACCAAGAGGTGAGCTCATGGAAACACACTCC---AAGATGGTTGCTGAAG Dekb DSM 3429 ATGTCTTCGGTCGACAACGCATGGATTCCAAGAGGTGAATTGGTTGAGAGTCACTCC---AAGATGGTTGCTGAAG Dekb DSM 70726 ATGTCTTCGGTCGACAACGCATGGATTCCAAGAGGTGAATTGGTTGAGAGTCACTCC---AAGATGGTTGCTGAAG Dekc DSM 70736 ATGTCTTCTGTTGACAATGCTTGGATTCCAAGAGGTGACTTGATTGAGACTCACGGT---AAGATGGTCGCTGAGG Dh BCD 3512 ATGATGTCTGTTGATAACGCTTGGTTACCAAGAGGTGAAATCATGGAAACTCACTCC---AAGTTAGTCGCCGAAG Dh BCD 589 ATGATGTCTGTTGATAACGCTTGGTTACCAAGAGGTGAAATCATGGAAACTCACTCC---AAGTTAGTCGCCGAAG Dm ATCC 11627 ATGATGTCTGTTGATAACGCTTGGTTACCAAGAGGTGAAATTATGGAATCTCACTCC---AAGTTGGTTGCTGAAG Ef BCD 3514 ATGATGTCTGTTGATGACACTTGGTTACCAAGAGGTGAATTAATGGAAACTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG Ef DSM 70554 ATGATGTCCGTCGACAACACCTGGTTACCAAGAGGTGAATTGGTTGAAACTCACTCC---AAGATGGTTGCTGAAG Gs DSM 3431 ATGATGTCTGTTGATAACACTTGGTTACCAAGAGGTGAATTAGTTGAAACTCACTCT---AAATTAGTCGCCGAAG Hb BCD 859 ATGATGTCTGTTGACAACACTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTAATGGAAACTCACTCC---AAGATGGTTGCTGAAG Hb DSM 3505 ATGATGTCTGTTGATAACACTTGGTTACCAAGAGGTGAATTAATGGAAGCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG Hg DSM 70285 ATGTCCTCTGTTGACAATGCTTGGATTCCAAGAAGTGAATTAGTTGACTCCCACTCT---AAGTTAGTTGCTGAAG

6 Anhang

116

Hu ATCC 9774 ATGTCTTCTGTTGACAATGCTTGGATTCCAAGAAGTGAATTAGTTGACTCCCACTCT---AAGTTAGTTGCTGAAG Hu BCD 3526 ATGTCCTCTGTTGACAATGCTTGGATTCCAAGAAGTGAATTAGTTGACTCCCACTCT---AAGTTAGTTGCTGAAG Hv DSM 70283 ATGTCCTCTGTTGACAACGCCTGGATTCCAAGAGGTGAATTGGTTGAAACTCACTCC---AAACTGGTTGCTGAAG Io CBS 5147 ATGTTATCTGTTGATAACGCTTGGTTACCAAGAGGTGAATTAGTTGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG Kl AB018535 ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAGTTGGTCGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG Km BCD 2563 ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATCGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG Km BCD 5186 ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGGTCGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG Km BCD 811 ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGGTCGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG Km DSM 70106 ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATCGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG Km DSM 70792 ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATCGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG Ku BCD 877 ATGATGTCTGTTGACAATGCTTGGATTCCAAGAGGTGAATTAGTTGAATCTCATTCT---AAGATGGTTGCTGAAG Le DSM 70320 ATGATGTCCGTTGACAACACTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATGGAGACTCATGCC---AAGATGGTTGCTGAAG Lt CBS 6340 ATGATGTCCGTTGACAACGCCTGGATTCCAAGAGGTGAGTTGGTCGAGTCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAGG Mp DSM 70321 ATGATGTCCGTTGACAACGCCTGGTTGCCAAGAGGTGAGTTGATCGAGTCTCACGGT---AAGATGGTCGCCGAGG Pa DSM 70277 ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAGCTCATTGAATCCCACGCT---AAGATGGTTGCTGAGG Pan BCD 1082 ATGATGTCTGTTGATAACGCTTGGTTACCAAGAGGTGAATTGGTTGAAACTCATTCC---AAATTGGTTGCTGAAG Pan DSM 70783 ATGATGTCTGTTGATAACGCTTGGTTACCAAGAGGTGAATTGGTTGAAACTCATTCC---AAATTGGTTGCTGAAG Pc CBS 601 ATGATGTCTGTTGACAGTGCTTGGTTACCAAGAGGTGAATTGGTTGAATCTCATTCT---AAATTGGTTGCTGAAG Pcar DSM 70392 ATGATGTCTGTTGATAACACTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATGGAAACCCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG Pf BCD 861 ATGATGTCCGTTGACAACGCCTGGTTGCCAAGAGGTGAGCTTATGGCAAGTCACGCC---AAGATGGTCTCTGAAG Pfe BCD 711 ATGTTGTCTGTCGATAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATTGAATCCCACTCC---AAGATGGTTGCTGAAG Pfe DSM 70090 ATGTTATCCGTCGACAATGCTTGGTTACCAAGAGGTGAATTGGTTGAATCTCACTCC---AAGATGGTTGCTGAAG Pg BCD 804 ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATGGAGACCCACTCC---AAGATGGTTGCTGAGG Pm DSM 70178 ATGTTGTCTGTTGATAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAAGTGATTGAATCCCACTCC---AAGATGGTTGCTGAAG Po BCD 862 ATGATGTCTGTTGACAACACCTGGTTGCCAAGAGGTGAGTTGATGGAGACCCACGCC---AAGATGGTTGCCGAGA Pp AB018536 ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGAGAGTTGGTAGAGTCCCACTCC---AAGATGGTTGCTGAGG Sb BCD 1256 ATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGGTCGAATCCCACTCC---AAGATGGTCGCTGAAG Sb BCD 1392 ATGATGTCTGTCGACAACGCTTGGATTCCAAGAGGTGAATTGGTTGAGTCTCACGCC---AAGATGGTCGCTGAAG Sb DSM 70412 ATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGGTCGAATCCCACTCC---AAGATGGTCGCTGAAG Sc AB018539 ATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGATTCCAAGAGGTGAATTGGTTGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG Sc DSM 1333 ATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGATTCCAAGAGGTGAATTGGTTGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG Sd BCD 1257 ATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGATTCCAAGAGGTGAATTGGTTGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG Sd DSM 70487 ATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGATTCCAAGAGGTGAATTGGTTGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG Se MUCL 29838 ATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGATTCCAAGAGGTGAATTGGTTGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG Sp DSM 6580 ATGATGTCTGTTGATAACGCTTGGCTACCAAGAGGCGAACTAATTGAATCGCACACT---AAACTCGTTGCAGAAG Sp BCD 728 ATGATGTCCGTCAACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGGTCGAATCTCACTCC---AAGATGGTCGCTGAAG Td DSM 70607 ATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGATTCCAAGAGGTGAATTGGTTGAATCTCACGCC---AAGATGGTCGCTGAAG Yl AB018537 ATGGGCTCCGTCGACAACGCCTGGATCCCCCGATCCGAGCTCATGGAGTCTCACTCC---AAGCAGGTTGCCGAGG Yl BCD 2003 ATGTCCTCTGTTGACAATGCATGGATTTCGCGATCTGAGTTGGTTGAATCTCACGCC---AAGTTGGTTGCTGAGG Yl BCD 2556 ATGGGTTCCGTCGACAACGCCTGGATCCCCCGATCCGAGCTCATGGAGTCCCACTCC---AAGCTGGTTGCTGAGG Zb BCD 1424 ATGATGTCTGTGGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGGCCGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCCGAGG Zbi DSM 70415 ATGATGTCGGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAGTTGGCCGAGTCCCACTCT---AAGATGGTCGCCGAAG Zf DSM 70506 ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTACCAAGAGGTGAATTGGTCGAATCTCACTCC---AAATTGGTGGCTGAAG Zm DSM 6959 ATGATGTCTGTTGACAATGCTTGGTTACCAAGAGGTGAATTAGTCGAATCTCACGCT---AAAATGGTCGCTGAAG Zr ATCC 48230 ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAAGTTATTGAATCTCACGGT---AAGATGGTTGCTGAAG Scho DSM 70573 ATGATGTCTTCCGACAACGCTTGGTTGCCTCGTGGTGAGCTTATGGAAAGCCACGCC---AAGATGGTTGCTGAAG Schp AB018538 ATGATGTCTTCCGACAATGCTTGGTTACCTCGTGGTGAACTTATGGAGACTCACGCT---AAGATGGTTGCTGAAG Schp BCD 773 ATGATGTCTTCCGACAATGCTTGGTTACCTCGTGGTGAACTTATGGAGACTCACGCT---AAGATGGTTGCTGAAG HS14/III-VIII |-----------------------| Hb1r-3r |-------------------------- HT5r-6r |------------------| Yfr5,7 ----------| Bd DSM70745 CTTTCATCCGCTGAAAACATGTGGTTATCAAGAGATGAATTGGTTGCCAGAGGTTTCGAAAAGAAAGTCATGGAAC Cra DSM70197 ATGTCCTCGACCGAGAACATCTGGATGTCCCGAGACGAGTTGATCAGCCGAGGTTTCGAAAAGAAGGTTCTTG--- Crc BCD 2578 CAGTCTTCCGCCGACAACATCTGGATGTCGCGTGACGAGCTCGTCACCCGTGGTTTCGAGAAGAAGATTCTCGAGC Crc DSM 70022 CAGTCCTCTGCCGAGAACATCTGGATGTCCCGTGACGAGCTCATCACCCGTGGGTTCGAGAAGAAGGTCCTCG--- Crf BCD 823 ATGTCCTCCGCCGAGAACGTCTGGATCTCCCGAGACGAGCCCATCACCCGTGGGTTCGAGAAGAAGGTCCTCG--- Crh DSM 70067 ATGTCGTCTGCCGAGAACGTCTGGCTCTCGCGTGACGAGCTCATTGCCCGTGGTTTCGAGAAGAAGGTCCTCG--- Crl BCD 824 CTATCTTCTGCCGAAAACATGTGGATGTCCCGAGACGAGCTCATTACTCGAGGTTTCGAAAAGAAGGTTCTTGAAC Fn AF316889 ATGTCCTCTGCCGAAAACATCTGGATTTCTCGAGACGAACTTGTTGCCCGTGGTTTCGAGAAGAAGGTTATGGAGC Rg BCD 3530 CTCTCGTCGTCCGAGAACATGTGGCTCCCGCGTGACGAGCTCGTCCGCCGTGGTTTCGAGAAGAAGGTCCTCG--- Rm DSM 70408 CTCTCATCATCTGAAAACATCTGGATGTCTCGAGATGAGCTCATCTCACGTGGTTTCGAGAAGAAGGTCCTCGAGG Spj BCD 4982 CTTTCTTCGTCGGAGAACCTCTGGATTCCGCGTGACGAGCTCATCCGTCGTGGTTTCGAGAAGAAGGTCCTCG--- Spj BCD 778 CTCTCGTCGTCTGAGAACATGTGGCTCCCGCGTGACGAGCTCATCCGTCGTGGGTTCGAGAAGAAGGTCCTCG--- Spj DSM 70847 CTCTCGTCGTCTGAGAACATGTGGCTCCCGCGTGACGAGCTCATCCGTCGTGGTTTCGAGAAGAAGGTCCTCG--- Trc DSM 70684 CAGTCGTCGGCCGAGAACATCTGGATGTCGCGTGACGAGCTTATCTCGCGTGGCTTCGAGAAGAAGGTCCTCGAGC

6 Anhang

117

305 310 320 330 340 350 360 370 376 |----|---------|---------|---------|---------|---------|---------|----| HS09 |---------------| Ha1r-8r |--------------------------| HT1r-4r |---------------------| Ca AF038153 TTGATATGAAAGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAAGAAATTGAAGAACATTG Ca ATCC 10231 TTGATATGAAAGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAAGAAATTGAAGAACATTG Cb DSM 70034 TTGATATGAAAGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAGGAAATTGAAGCTCATTG Cc DSM 70136 TCGACATGAAGGAGGCTCTTGCTTCCGGTCAGTTCCGTGCCCTTACCAGAAAGGAGATTGAGGAGCACTG Cd DSM 70042 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCATCTGGACAGTTCCGACCTTTGACCAGAAAGGAAATTGAAGCCCACTG Ce DSM70858 TTGATATGAAAGAAGCCTTAGCTTCAGGTCAATTCAGACCTTTAGTTAGAAAGGAAATTGAAGCTCATTG Cg BCD 8932 TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCAGAGCTTTAACCAGAAAGGAAATTGAATCTCATTG Cglae CBS 5691 TTGATATGAAAGAAGCTTTAGCCTCCGGTCAATTCAGACCATTGACTAGAAAAGAAATCGAACAACACTG Ch DSM 70624 TTGATATGAAGGAGGCTTTGGCTTCCGGTCAGTTCAGACCATTGACCAGAAAGGAGATCGAGGACCACTG Cim BCD 1062 TTGATATGAAGGAGGCTCTTGCATCCGGTCAATTCCGTCCTCTTACCCGTAAGGAGATCGAGAAGCACTG Cint BCD 685 TTGACATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAGTTCAGACCATTGACCAGAAAGGAGATCGAGAAACACTG Ck BCD 689 TTGATATGAAGGAGGCTTTGGCTTCTGGACAATTCAGACCTTTGACCAGAAAGGAGATTGAGCAGCACTG Cll DSM 70102 TCGACATGAAGGAGGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCATTGACCAGAAAGGAGATCGAACAACACTG Cm DSM 70638 TTGACATGAAGGAAGCTCTCGCCTCACC------------------------------------------ Cmal AB018532 TTGATATGAAAGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAAGAAATCGAAGAACATTG Cmal BCD 806 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCTTTGACCAGAAAGGAAATCGAACAACACTG Cmel AB018533 TTGACATGAAGGAGGCCTTGGCTTCTGGTCAATTTAGACCTTTGACCAGAAAGGAGATTGAGGAGCATTG Cmu DSM 70862 TTGATATGAAAGAAGCTTTAGCATCTGGTCAATTCAGACCTTTAACTAGAAAAGAAATTGAAGAACATTG Cp ATCC 20384 TTGATATGAAAGAAGCTTTGGCTTCAGGTCAATTCAGACCATTGACTAGAAAGGAAATCGAGAAACACTG Cr BCD 814 TCGATATGAAGGAGGCTCTTGCTTCTGGTCAGTTCCGTCCTCTTACCCGTAAGGAGATAGAACAACACTG Cs BCD1054 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCAGACCATTAACTAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG Csan CBS 4261 TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAGGAAATTGAAGAACACTG Cso BCD 818 TTGATATGAAAGAAGCTTTAGCCTCAGGTCAATTCCGTGCTTTAACCAGAAAAGAAATTGAATCTCACTG Ct BCD 819 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCAGACCTTTAACCAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG Ctr ATCC 20326 TTGATATGAAAGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAGAGAAATCGAACAACACTG Cv DSM 6956 TTGATATGAAGGAAGCATTGGCTTCTGGTCAGTTCCGCCCTCTTACCAGAAAGGAGATTGAGCAACACTG Cvi DSM 70184 TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTTAGACCATTAACCAGAAAAGAAATCGAAGAACACTG Cz AB018534 TTGACATGAAGGAGGCCTTGGCTTCTGGTCAATTTAGACCTTTGACCAGAAAGGAGATTGAGGAGCATTG Cz BCD 690 TTGACATGAAGGAGGCCTTGGCTTCTGGTCAATTTAGACCTTTGACCAGAAAGGAGATAGAGAAACACTG De ATCC 20126 TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCATCTGGTCAATTCAGACCATTAACTAGAAAGGAGATCGAGAAGCACTG Dekb DSM 3429 TTGATATGAAGGAAGCTCTTGCCAACGGTCAGTATAGAGCTTTGACCAGAAAGGAGATCGAGGCGCACTG Dekb DSM 70726 TTGATATGAAGGAAGCTCTTGCCAACGGTCAGTATAGAGCTTTGACCAGAAAGGAGATCGAGGCCCATTG Dekc DSM 70736 TCGATATGAAGGAAGCTCTTGCCAACGGTCAGTACAGACCATTGACTAGAAAGAACATCGAAGAGCACTG Dh BCD 3512 TCGATATGAAGGAAGCTTTAGCCTCTGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAAGAGATCGAACAACACTG Dh BCD 589 TCGATATGAAGGAAGCTTTAGCCTCTGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAAGAAATCGAAAAACACTG Dm ATCC 11627 TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCCTCTGGTCAATTTAGACCATTAACCAGAAAGGAAATCGAAGAACACTG Ef BCD 3514 TTGATATGAAAGAAGCTTTAGCTTCCGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAAGAAATCGAAAAACACTG Ef DSM 70554 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCAGACCATTGACCAGAAAAGAAATCGAAGATCATTG Gs DSM 3431 TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCAGAGCTTTAACCAGAAAGGAAATAGAAAAGCACTG Hb BCD 859 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAACTCAGACCTTTAACCAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG Hb DSM 3505 TTGATATGAAAGAAGCTTTAGCTTCCGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAAGAAATCGAAAAACACTG Hg DSM 70285 TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCAGAGCTTTAACCAGAAAGGAAATTGAATCCCACTG Hu ATCC 9774 TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCAGAGCTTTAACCAGAAAGGAAATTGAATCCCACTG Hu BCD 3526 TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCAGAGCTTTAACCAGAAAGGAAATTGAATCCCACTG Hv DSM 70283 TTGATATGAAAGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCAGAGCTTTGACCAGAAAAGAAATTGAATCTCACTG Io CBS 5147 TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCAGACCATTGACTAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG Kl AB018535 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCAGACCTTTGACTAGAAAGGAAATCGAAGAGCACTG Km BCD 2563 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCTTTGACCAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG Km BCD 5186 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCTTTGACCAGAAAGGAGATCGAACAACACTG Km BCD 811 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCTTTGACCAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG Km DSM 70106 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCTTCGACCAGAAAGGAAATCGAACAGCACTG Km DSM 70792 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCTTTGACCAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG Ku BCD 877 TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCAGACCATTAACTAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG Le DSM 70320 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCAGGTCAATTCAGACCATTGACCAGAAAGGAAATCGAGCAACACTG Lt CBS 6340 TTGACATGAAGGAGGCTTTGGCTTCCGGTCAGTTCCGTCCTTTGACCAGAAAGGAGATCGAGGAGCACTG Mp DSM 70321 TTGACATGAAGGAGGCTTTGGCTTCCGGTCAGTTCAGACCATTGACCAGGAAGGAGATCGAAAAGCACTG Pa DSM 70277 TTGACATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCTTTGACTAGAAAGGAGATCGAGCAGCACTG Pan BCD 1082 TTGATATGAAAGAAGCTTTAGCTTCAGGTCAATTCCGTGCTTTAACCAGAAAAGAAATTGAATCTCACTG Pan DSM 70783 TTGATATGAAAGAAGCTTTAGCTTCAGGTCAATTCCGTGCTTTAACCAGAAAAGAAATTGAATCTCACTG Pc CBS 601 TTGATATGAAAGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCCGTCCATTAACCAGAAAAGAAATTGAACAACATTG Pcar DSM 70392 TGGATATGAAAGAAGCCTTAGCATCTGGTCAATTTAGACCATTAACTAGAAAGGAAATTGAAGAACATTG Pf BCD 861 TCGATATGAAGGAGGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCAGACCTTTGACTAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG Pfe BCD 711 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG Pfe DSM 70090 TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCATCTGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAGGAGATCGAAAAGCACTG Pg BCD 804 TTGATATGAAGGAGGCTTTGGCTTCTGGACAATTCAGACCTTTGACCAGAAAGGAGATCGAAAAGCATTG Pm DSM 70178 TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCATCTGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAGGAAATCGAAGACCATTG Po BCD 862 TCGACATGAAGGAGGCTCTTGCCTCTGGTCAGTTTAGACCATTGACCAGAAAGGAGATCGAACAACACTG Pp AB018536 TCGATATGAAGGAGGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCCGTCCTTTGACCAGAAAAGAAATCGAGGAGCACTG Sb BCD 1256 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCCGTCCATTAACTAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG Sb BCD 1392 TCGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCCGTCCATTGACCAGAAAGGAAATAGAAAAGCACTG Sb DSM 70412 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCCGTCCATTAACCAGAAAGGAAATTGAAGAACATTG Sc AB018539 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCCGTCCATTAACCAGAAAAGAAATTGAAGAACATTG Sc DSM 1333 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCCGTCCATTAACCAGAAAAGAGATCGAAAAACACTG

6 Anhang

118

Sd BCD 1257 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCCGTCCATTAACCAGAAAAGAAATCGAAAAACACTG Sd DSM 70487 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCCGTCCATTAACCGGAAAAGAAATTGAAGAACATTG Se MUCL 29838 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAACTCCGTCCATTAACCAGAAAAGAAATTGAAGAACATTG Sp DSM 6580 TTGATATGAGGGAAGCACTTGCCTCCGGTCAATTTAGAGCCTTAACTAGAAAAGAGATTGAGTCTCATTG Sp BCD 728 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCCGTCCATTAACCAGAAAGGAGATCGAAAAAC---- Td DSM 70607 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCCGTCCATTGACCAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG Yl AB018537 TTGATATGAAGGAGGCTCTTGCTTCCGGACAGTTCCGACCTCTTACCAAGAAGGAGATTGAGCAGCATTG Yl BCD 2003 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCATCTGGACAGTTCCGACCTTTGACCAGAAAGGAAATTGAAGCCCACTG Yl BCD 2556 TTGATATGAAGGAGGCCCTTGCTTCCGGACAGTTCCGACCTCTTACCAAGAAGGAGATTGAGGCCCACTG Zb BCD 1424 TTGACATGAAGGAGGCCTTGGCTTCCGGTCAGTTCCGTGCGTTGACCAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG Zbi DSM 70415 TCGACATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAGTTCCGTGCGTTGACTAGAAAGGAGATTGAAGAGCACTG Zf DSM 70506 TTGATATGAAGGAGGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCCGTCCATTAACCAGAAAGGAAATCGAAGAACACTG Zm DSM 6959 TTGATATGAAAGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCCGTCCTCTAACCAGAAAGGAAATCGAAGAACACTG Zr ATCC 48230 TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCCGTCCATTGACCAGAAAGGAAATAGAAGAGCACTG Scho DSM 70573 TTGACCGTGCTGAAGCTTTGAAGAGTGGTCAATTCCGTCCCTTGGTCCGTAAGGAAATTGAAGAACACTG Schp AB018538 TTGACCGTGCTGAGGCCTTGAAGAGTGGTCAATTCCGTCCCTTGGTCCGTAAGGAGATTGAGGAGCACTG Schp BCD 773 TTGACCGTGCTGAGGCCTTGAAGAGTGGTCAATTCCGTCCCTTGGTCCGTAAGGAGATCGAAAAGCACTG Hb1r-3r --| Bd DSM70745 TTGATACCCGAGAAGCTCAACGATTAGGTTTAATGAGACCTTTAGTCCGAAGAGAAATCGAAAAACATTT Cra DSM70197 ---------------------------------------------------------------------- Crc BCD 2578 TCGACACCCGTGAGGCCCAGCGTCTTGGTCTCATGCGCCCCCTTGTCCGTCGCGAGATCGAAAAACACTG Crc DSM 70022 ---------------------------------------------------------------------- Crf BCD 823 ---------------------------------------------------------------------- Crh DSM 70067 ---------------------------------------------------------------------- Crl BCD 824 TCGACACCAAGGAGGCTCAGCGATTGGGTCTCATGCGACCTTTGGTTCGACGAGAAATCGAAAAGCACTT Fn AF316889 TCGACACCAGGGAGGCTCAGCGATTGGGTCTCATGAGGCCCTTGGTCAGGAGGGAAATCGAAAAGCACTT Rg BCD 3530 ---------------------------------------------------------------------- Rm DSM 70408 TTGATACTCGTGAAGCTCAACGTCTTGGTTTAATGAGACCTCTAGTCCGAAAGGAAATCGAGAAGCACAT Spj BCD 4982 ---------------------------------------------------------------------- Spj BCD 778 ---------------------------------------------------------------------- Spj DSM 70847 ---------------------------------------------------------------------- Trc DSM 70684 TCGACACCCGTGAGGCTCAGCGTCTTGGTCTCATGCGCCCCCTCGTCCGTCGCGAGATCGAAAAGCACTG

Bd : Bullera dendrophila; Ca: Candida albicans; Cb: Candida boidinii; Cc: Candida catenulata; Cd: Candida diddensiae; Ce: Candida ernobii; Cg: Candida glabrata; Cglae : Candida glaebosa; Ch: Can-dida haemulonii; Cim : Citeromyces matritensis; Cint : Candida intermedia; Ck: Candida krusei; Cll : Clavispora lusitaniae; Cm: Candida magnoliae; Cmal : Candida maltosa; Cmel : Candida melibiosica; Cmu : Candida multigemmis; Cp: Candida parapsilosis; Cr: Candida rugosa; Cra: Cryptococcus albi-dus; Crc : Cryptococcus curvatus; Crf : Cryptococcus flavus; Crh : Cryptococcus humicola; Crl : Crypto-coccus laurentii; Cs: Candida sake; Csan : Candida santamariae; Cso : Candida solani; Ct: Candida tenuis; Ctr : Candida tropicalis; Cv: Candida versatilis; Cvi : Candida vini; Cz: Candida zeylanoides; De: Debaryomyces etchelsii; Dekb : Dekkera bruxellensis; Dekc : Dekkera custersiana; Dh: Debaryo-myces hansenii; Dm: Debaryomyces marama; Ef: Endomyces fibuliger; Fn: Filobasidiella neoformans; Gs: Guilliermondella selenospora; Hb: Hyphopichia burtonii; Hg: Hanseniaspora guilliermondii; Hu: Hanseniaspora uvarum; Hv: Hanseniaspora vineae; Io: Issatchenkia orientalis; Kl : Kluyveromyces lactis; Km : Kluyveromyces marxianus; Ku : Kazachstania unispora; Le: Lodderomyces elongisporus; Lt : Lachancea thermotolerans; Mp: Metschnikowia pulcherrima; Pa: Pichia angusta; Pan: Pichia ano-mala; Pc: Pichia canadensis; Pcar : Pichia carsonii; Pf: Pichia farinosa; Pfe: Pichia fermentans; Pg: Pichia guilliermondii; Pm: Pichia membranaefaciens; Po: Pichia ohmeri; Pp: Pichia pastoris; Rg: Rho-dotorula glutinis; Rm: Rhodotorula minuta; Sb: Saccharomyces bayanus; Sc: Saccharomyces cerevi-siae; Scho : Schizosaccharomyces octosporus; Schp : Schizosaccharomyces pombe; Sd: Saccharo-myces cerevisiae var. diastaticus; Se: Saccharomyces exiguus; Sp: Saccharomyces pastorianus; Spj : Sporidiobolus johnsonii; Td: Torulaspora delbrueckii; Trc : Trichosporon cutaneum; Yl: Yarrowia lipoly-tica; Zb: Zygosaccharomyces bailii; Zbi : Zygosaccharomyces bisporus; Zf: Zygosaccharomyces flo-rentinus; Zm: Zygosaccharomyces microellipsoides; Zr: Zygosaccharomyces rouxii

6 Anhang

119

Tab. 6.2: Distanz-Matrix: Prozentuale Übereinstimmu ng der EF-3 Aminosäurese-quenzen innerhalb der Unterabteilung der Ascomycota

Ca

AF

0381

53

Ca

AT

CC

102

31

Cb

DS

M 7

0034

Cc

DS

M 7

0136

Cd

DS

M 7

0042

Ce

DS

M 7

0858

Cg

BC

D 8

932

Cgl

ae C

BS

569

1

Ch

DS

M 7

0624

Cim

BC

D 1

062

Cin

t BC

D 6

85

Ck

BC

D 6

89

Cll

DS

M 7

0102

Cm

DS

M 7

0638

Cm

al A

B01

8532

Cm

al B

CD

806

Cm

el A

B01

8533

Cm

u D

SM

708

62

Cp

AT

CC

203

84

Cr

BC

D 8

14

Cs

BC

D 1

054

Csa

n C

BS

426

1

Ca AF038153 100 100 86 91 79 84 81 87 88 88 91 92 88 65 97 84 94 89 94 80 93 93 Ca ATCC 10231 100 86 91 79 84 81 87 88 88 91 92 88 65 97 84 94 89 94 80 93 93 Cb DSM 70034 100 80 83 81 82 81 86 90 91 90 93 65 84 93 87 84 84 83 87 87 Cc DSM 70136 100 76 78 76 86 84 80 84 84 81 64 90 77 86 85 87 75 87 87 Cd DSM 70042 100 73 84 77 79 78 83 82 82 69 80 83 80 73 78 93 80 79 Ce DSM 70858 100 74 78 80 79 81 83 81 59 84 78 83 81 82 72 84 85 Cg BCD 8932 100 78 78 83 84 83 84 66 82 82 83 74 80 86 82 80 Cglae CBS 5691 100 82 81 83 85 82 64 87 80 84 83 87 76 85 84 Ch DSM 70624 100 84 91 90 90 66 90 84 89 84 89 80 92 90 Cim BCD 1062 100 90 89 91 62 85 87 89 83 84 79 88 88 Cint BCD 685 100 94 95 63 89 89 93 84 87 84 92 92 Ck BCD 689 100 94 66 93 88 94 86 90 83 94 93 Cll DSM 70102 100 63 87 92 90 84 85 83 89 89 Cm DSM 70638 100 68 63 64 64 67 71 67 65 Cmal AB018532 100 83 91 88 94 81 94 92 Cmal BCD 806 100 84 80 80 83 84 84 Cmel AB018533 100 86 90 81 96 96 Cmu DSM 70862 100 85 74 87 89 Cp ATCC 20384 100 78 91 89 Cr BCD 814 100 81 79 Cs BCD 1054 100 98 Csan CBS 4261 100

Cso

BC

D 8

18

Ct B

CD

819

Ctr

AT

CC

203

26

Cv

DS

M 6

956

Cvi

DS

M 7

0184

Cz

AB

0185

34

Cz

BC

D 6

90

De

AT

CC

201

26

Dek

b D

SM

342

9

Dek

b D

SM

707

26

Dek

c D

SM

707

36

Dh

BC

D 3

512

Dh

BC

D 5

89

Dm

AT

CC

116

27

Ef B

CD

351

4

Ef D

SM

705

54

Gs

DS

M 3

431

Hb

BC

D 8

59

Hb

DS

M 3

505

Hg

DS

M 7

0285

Hu

AT

CC

977

4

Hu

BC

D 3

526

Hv

DS

M 7

0283

Ca AF038153 85 87 95 78 86 94 94 92 78 78 76 94 94 92 87 84 83 87 87 80 80 80 84 Ca ATCC 10231 85 87 95 78 86 94 94 92 78 78 76 94 94 92 87 84 83 87 87 80 80 80 84 Cb DSM 70034 86 87 83 81 96 88 89 90 84 84 79 88 88 89 83 80 77 84 84 83 83 83 84 Cc DSM 70136 81 84 88 77 79 87 86 84 75 75 70 85 85 84 85 79 79 87 85 75 75 75 78 Cd DSM 70042 78 79 78 89 82 79 80 80 79 79 74 79 79 80 72 71 71 72 73 82 82 82 80 Ce DSM 70858 82 79 84 70 80 84 83 83 70 70 69 82 82 81 82 84 81 81 82 74 74 74 77 Cg BCD 8932 84 82 80 83 84 82 83 82 82 82 76 82 82 83 75 75 78 75 76 97 97 97 89 Cglae CBS 5691 79 84 85 78 81 85 84 85 74 74 72 83 83 82 84 81 75 85 84 75 75 75 77 Ch DSM 70624 81 84 88 79 85 90 89 92 77 77 76 87 87 86 85 80 81 84 85 77 77 77 80 Cim BCD 1062 84 85 84 78 91 90 91 90 80 80 78 94 94 94 82 79 75 82 83 83 83 83 83 Cint BCD 685 87 89 87 81 90 94 94 93 81 81 80 94 94 93 84 81 79 84 84 85 85 85 88 Ck BCD 689 87 92 91 80 89 95 96 97 80 80 79 94 94 93 88 84 81 86 88 82 82 82 84 Cll DSM 70102 86 87 85 79 92 91 92 94 84 84 82 91 91 90 85 81 78 84 85 84 84 84 86 Cm DSM 70638 62 62 67 72 67 64 64 65 62 62 58 63 63 64 63 63 62 64 64 64 64 64 66 Cmal AB018532 84 87 98 78 84 92 91 93 77 77 75 91 91 90 88 84 84 86 88 79 79 79 82 Cmal BCD 806 84 84 81 78 91 85 86 88 84 84 79 85 85 86 79 77 75 79 80 83 83 83 84 Cmel AB018533 86 87 89 81 88 99 98 94 76 76 75 94 94 92 86 84 81 86 86 84 84 84 84 Cmu DSM 70862 78 85 86 73 84 87 86 86 76 76 74 87 87 85 90 82 78 92 90 75 75 75 78 Cp ATCC 20384 84 86 93 81 85 91 90 90 78 78 76 89 89 88 86 81 83 85 86 77 77 77 81 Cr BCD 814 77 79 79 90 83 80 81 81 78 78 74 80 80 81 72 69 70 72 73 84 84 84 81 Cs BCD 1054 86 88 92 81 88 97 96 94 75 75 74 93 93 91 87 84 84 87 87 81 81 81 83 Csan CBS 4261 86 86 90 79 88 97 96 93 75 75 74 93 93 91 87 84 83 87 87 81 81 81 83

Die verwendeten Abkürzungen entsprechen den Abkürzungen in der Abbildung 6.1.

6 Anhang

120


Io C

BS

514

7

Kl A

B01

8535

Km

BC

D 2

563

Km

BC

D 5

186

Km

BC

D 8

11

Km

DS

M 7

0106

Km

DS

M 7

0792

Ku

BC

D 8

77

Le D

SM

703

20

Lt C

BS

634

0

Mp

DS

M 7

0321

Pa

DS

M 7

0277

Pan

BC

D 1

082

Pan

DS

M 7

0783

Pc

CB

S 6

01

Pc

DS

M 7

0392

Pf B

CD

861

Pfe

BC

D 7

11

Pfe

DS

M 7

0090

Pg

BC

D 8

04

Pm

DS

M 7

0178

Po

BC

D 8

62

Pp

AB

0185

36

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Sb

BC

D 1

256

Sb

BC

D 1

392

Sb

DS

M 7

0412

Sc

AB

0185

39

Sp

BC

D 7

28

Sc

DS

M 1

333

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o D

SM

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73

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p A

B01

8538

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p B

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Sd

BC

D 1

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Sd

DS

M 7

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MU

CL

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8

Sp

DS

M 6

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DS

M 7

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B01

8537

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CD

200

3

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CD

255

6

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BC

D 1

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DS

M 7

0415

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SM

705

06

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DS

M 6

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CC

482

30

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6 Anhang

121


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BC

D 8

18

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CD

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AT

CC

203

26

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DS

M 6

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0185

34

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D 6

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AT

CC

201

26

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b D

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c D

SM

707

36

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D 3

512

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D 5

89

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D 8

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Pfe

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36

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6 Anhang

122


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BC

D 1

256

Sb

BC

D 1

392

Sb

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M 7

0412

Sc

AB

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39

Sp

BC

D 7

28

Sc

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M 1

333

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o D

SM

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73

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p A

B01

8538

Sch

p B

CD

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Sd

BC

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Sd

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M 7

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MU

CL

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Sp

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M 6

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200

3

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CD

255

6

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Zbi

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M 7

0415

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705

06

Zm

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Zr

AT

CC

482

30

Cso BCD 818 83 83 83 84 82 84 74 74 74 84 84 84 83 83 76 77 75 84 84 86 83 81 Ct BCD 819 86 82 86 84 85 84 76 74 74 84 84 84 81 82 80 78 80 84 84 84 85 84 Ctr ATCC 20326 83 80 83 82 82 82 73 73 73 82 81 81 80 80 76 77 77 82 83 84 84 83 Cv DSM 6956 81 80 81 83 80 83 71 70 70 83 82 82 82 80 84 88 84 80 80 81 82 80 Cvi DSM 70184 94 89 94 94 94 94 81 77 77 94 93 93 89 89 80 81 80 92 93 92 94 90 Cz AB018534 88 84 88 86 87 86 77 76 76 86 85 85 84 84 80 78 81 87 87 88 86 85 Cz BCD 690 89 85 89 87 88 87 78 77 77 87 86 86 85 85 81 79 82 88 88 89 87 86 De ATCC 20126 90 86 90 89 89 89 76 76 76 89 88 88 84 86 81 79 81 89 89 89 90 87 Dekb DSM 3429 87 84 87 88 86 88 70 69 69 88 87 88 83 84 76 78 76 86 87 84 87 84 Dekb DSM 70726 87 84 87 88 86 88 70 69 69 88 87 88 83 84 76 78 76 86 87 84 87 84 Dekc DSM 70736 82 80 82 83 81 83 66 66 66 83 82 83 78 80 75 73 74 81 82 79 83 82 Dh BCD 3512 89 84 89 86 88 86 76 75 75 86 85 85 84 84 79 78 80 86 86 88 87 87 Dh BCD 589 89 84 89 86 88 86 76 75 75 86 85 85 84 84 79 78 80 86 86 88 87 87 Dm ATCC 11627 89 84 89 87 88 87 77 74 74 87 86 86 86 84 80 79 81 87 87 89 88 88 Ef BCD 3514 82 76 82 82 81 82 73 73 73 82 81 81 77 76 73 71 73 82 82 80 82 81 Ef DSM 70554 78 77 78 78 77 78 69 69 69 78 77 77 74 77 71 70 70 77 77 78 77 75 Gs DSM 3431 76 73 76 75 75 75 65 65 65 75 74 74 74 74 69 71 69 77 78 78 75 75 Hb BCD 859 84 76 84 82 83 82 74 73 73 82 81 83 78 76 73 71 73 82 82 80 82 81 Hb DSM 3505 83 77 83 83 82 83 74 73 73 83 82 82 78 77 74 72 74 83 83 81 83 82 Hg DSM 70285 84 86 84 85 84 85 72 70 70 85 84 84 82 86 82 81 81 84 84 85 84 83 Hu ATCC 9774 84 86 84 85 84 85 72 70 70 85 84 84 82 86 82 81 81 84 84 85 84 83 Hu BCD 3526 84 86 84 85 84 85 72 70 70 85 84 84 82 86 82 81 81 84 84 85 84 83 Hv DSM 70283 88 87 88 87 87 87 72 71 71 87 86 86 85 87 79 79 78 84 85 87 87 85

Io C

BS

514

7

Kl A

B01

8535

Km

BC

D 2

563

Km

BC

D 5

186

Km

BC

D 8

11

Km

DS

M 7

0106

Km

DS

M 7

0792

Ku

BC

D 8

77

Le D

SM

703

20

Lt C

BS

634

0

Mp

DS

M 7

0321

Pa

DS

M 7

0277

Pan

BC

D 1

082

Pan

DS

M 7

0783

Pc

CB

S 6

01

Pc

DS

M 7

0392

Pf B

CD

861

Pfe

BC

D 7

11

Pfe

DS

M 7

0090

Pg

BC

D 8

04

Pm

DS

M 7

0178

Po

BC

D 8

62

Pp

AB

0185

36

Io CBS 5147 100 93 93 92 94 91 93 90 86 90 89 94 88 88 94 84 89 96 96 91 94 82 95 Kl AB018535 100 98 97 98 96 98 92 84 94 89 92 86 86 90 84 87 93 89 89 90 79 94 Km BCD 2563 100 97 98 98 100 92 84 94 90 94 86 86 90 84 87 94 89 89 92 79 94 Km BCD 5186 100 97 95 97 91 83 94 88 91 86 86 89 83 86 92 88 90 89 80 94 Km BCD 811 100 96 98 94 84 95 90 92 88 88 92 84 88 94 91 90 92 80 94 Km DSM 70106 100 98 90 82 92 88 92 84 84 88 82 85 93 87 87 90 77 92 Km DSM 70792 100 92 84 94 90 94 86 86 90 84 87 94 89 89 92 79 94 Ku BCD 877 100 82 94 84 89 87 87 88 82 84 90 86 85 89 78 91 Le DSM 70320 100 84 85 88 86 86 87 92 89 85 83 91 84 89 85 Lt CBS 6340 100 88 89 87 87 87 84 87 90 86 88 88 81 91 Mp DSM 70321 100 87 84 84 90 84 87 88 85 89 86 81 89 Pa DSM 70277 100 88 88 91 83 89 94 90 89 92 83 93 Pan BCD 1082 100 100 89 84 85 88 84 89 86 81 91 Pan DSM 70783 100 89 84 85 88 84 89 86 81 91 Pc CBS 601 100 84 88 92 90 90 90 82 91 Pc DSM 70392 100 86 84 81 90 83 85 84 Pf BCD 861 100 89 85 93 86 85 89 Pfe BCD 711 100 93 91 97 81 94 Pfe DSM 70090 100 87 90 78 92 Pg BCD 804 100 88 88 91 Pm DSM 70178 100 80 91 Po BCD 862 100 81 Pp AB018536 100


6 Anhang

123


Sb

BC

D 1

256

Sb

BC

D 1

392

Sb

DS

M 7

0412

Sc

AB

0185

39

Sp

BC

D 7

28

Sc

DS

M 1

333

Sch

o D

SM

705

73

Sch

p A

B01

8538

Sch

p B

CD

773

Sd

BC

D 1

257

Sd

DS

M 7

0487

Se

MU

CL

2983

8

Sp

DS

M 6

580

Td

DS

M 7

0607

Yl A

B01

8537

Yl B

CD

200

3

Yl B

CD

255

6

Zb

BC

D 1

424

Zbi

DS

M 7

0415

Zf D

SM

705

06

Zm

DS

M 6

959

Zr

AT

CC

482

30

Io CBS 5147 95 89 95 95 94 95 80 78 78 95 94 94 90 89 82 83 82 94 94 94 95 92 Kl AB018535 95 94 95 95 94 95 79 77 77 95 94 94 90 95 81 83 81 94 94 97 95 94 Km BCD 2563 94 93 94 95 93 95 79 77 77 95 94 94 92 94 81 83 81 94 94 97 94 94 Km BCD 5186 93 92 93 94 92 94 78 76 76 94 94 94 89 93 82 84 82 92 92 96 93 92 Km BCD 811 95 94 95 97 94 97 80 78 78 97 96 96 92 94 82 84 82 93 93 97 95 92 Km DSM 70106 92 91 92 94 91 94 77 75 75 94 93 93 90 92 79 81 79 92 92 95 92 92 Km DSM 70792 94 93 94 95 93 95 79 77 77 95 94 94 92 94 81 83 81 94 94 97 94 94 Ku BCD 877 92 94 92 94 91 94 75 73 73 94 94 94 88 94 81 81 79 88 88 93 91 87 Le DSM 70320 85 82 85 84 84 84 77 75 75 84 83 83 81 82 76 76 76 84 84 84 86 84 Lt CBS 6340 92 94 92 94 91 94 79 77 77 94 94 94 87 94 82 83 82 89 89 93 92 90 Mp DSM 70321 90 86 90 89 89 89 80 76 76 89 88 88 87 86 78 80 78 89 89 87 90 91 Pa DSM 70277 91 90 91 91 90 91 79 77 77 91 90 90 88 91 80 83 80 92 93 93 93 92 Pan BCD 1082 85 85 85 87 84 87 76 76 76 87 86 86 85 85 79 80 78 86 86 89 85 84 Pan DSM 70783 85 85 85 87 84 87 76 76 76 87 86 86 85 85 79 80 78 86 86 89 85 84 Pc CBS 601 92 86 92 91 91 91 77 74 74 91 90 90 88 86 79 81 80 89 90 93 91 87 Pc DSM 70392 86 81 86 84 85 84 73 73 73 84 83 83 80 81 74 74 74 83 83 84 84 84 Pf BCD 861 87 85 87 87 86 87 78 76 76 87 86 86 84 85 79 79 79 87 87 87 89 87 Pfe BCD 711 92 89 92 94 91 94 79 77 77 94 93 93 90 89 84 84 83 92 92 94 92 90 Pfe DSM 70090 92 85 92 92 91 92 76 74 74 92 91 91 86 85 78 79 79 90 91 90 92 88 Pg BCD 804 89 85 89 89 88 89 78 78 78 89 88 88 84 85 84 81 84 90 90 89 89 88 Pm DSM 70178 90 87 90 91 89 91 78 75 75 91 90 90 89 87 81 82 80 89 89 91 89 89 Po BCD 862 81 79 81 79 80 79 72 72 72 79 78 78 76 78 74 74 74 79 80 79 82 80 Pp AB018536 93 90 93 94 92 94 81 79 79 94 94 94 89 91 83 84 81 94 94 94 93 93

Sb

BC

D 1

256

Sb

BC

D 1

392

Sb

DS

M 7

0412

Sc

AB

0185

39

Sp

BC

D 7

28

Sc

DS

M 1

333

Sch

o D

SM

705

73

Sch

p A

B01

8538

Sch

p B

CD

773

Sd

BC

D 1

257

Sd

DS

M 7

0487

Se

MU

CL

2983

8

Sp

DS

M 6

580

Td

DS

M 7

0607

Yl A

B01

8537

Yl B

CD

200

3

Yl B

CD

255

6

Zb

BC

D 1

424

Zbi

DS

M 7

0415

Zf D

SM

705

06

Zm

DS

M 6

959

Zr

AT

CC

482

30

Sb BCD 1256 100 92 100 96 99 96 79 76 76 96 95 95 92 92 81 81 81 94 94 94 98 94 Sb BCD 1392 100 92 94 91 94 78 76 76 94 93 93 87 98 81 82 79 88 88 92 94 89 Sb DSM 70412 100 96 99 96 79 76 76 96 95 95 92 92 81 81 81 94 94 94 98 94 Sc AB018539 100 95 100 79 77 77 100 99 99 93 94 83 84 83 94 94 96 96 93 Sp BCD 728 100 95 78 75 75 95 94 94 91 91 80 80 80 93 94 94 97 94 Sc DSM 1333 100 79 77 77 100 99 99 93 94 83 84 83 94 94 96 96 93 Scho DSM 70573 100 96 96 79 78 78 77 78 68 69 68 78 78 77 80 78 Schp AB018538 100 100 77 76 76 74 76 67 70 67 76 76 75 78 76 Schp BCD 773 100 77 76 76 74 76 67 70 67 76 76 75 78 76 Sd BCD 1257 100 99 99 93 94 83 84 83 94 94 96 96 93 Sd DSM 70487 100 98 92 93 83 84 83 93 93 95 95 92 Se MUCL 29838 100 92 93 82 84 82 93 93 95 95 92 Sp DSM 6580 100 87 79 82 80 91 91 93 92 90 Td DSM 70607 100 81 84 79 89 89 93 94 90 Yl AB018537 100 86 95 82 82 82 81 80 Yl BCD 2003 100 85 81 81 85 83 81 Yl BCD 2556 100 82 82 83 81 80 Zb BCD 1424 100 99 94 94 93 Zbi DSM 70415 100 94 94 94 Zf DSM 70506 100 94 93 Zm DSM 6959 100 95 Zr ATCC 48230 100


6 Anhang

124

Tab. 6.3: Distanz-Matrix: Prozentuale Übereinstimmu ng der EF-3 Aminosäurese-quenzen innerhalb der Unterabteilung der Basidiomyc ota

Bd

DS

M 7

0745

Cra

DS

M 7

0197

Crc

BC

D 2

578

Crc

DS

M 7

0022

Crf

BC

D 8

23

Crh

DS

M 7

0067

Crl

BC

D 8

24

Fn

AF

3168

89

Rg

BC

D 3

530

Rm

DS

M 7

0408

Spj

BC

D 4

982

Spj

BC

D 7

78

Spj

DS

M 7

0847

Trc

DS

M 7

0684

Sc

AB

0185

39

Bd DSM 70745 100 77 81 83 82 88 81 86 75 74 73 75 75 87 31 Cra DSM 70197 100 77 81 75 75 81 78 70 75 73 71 71 82 33 Crc BCD 2578 100 89 82 82 80 81 77 71 76 78 78 88 32 Crc DSM 70022 100 86 86 87 86 73 74 74 74 74 90 28 Crf BCD 823 100 89 80 86 69 70 73 74 74 83 34 Crh DSM 70067 100 77 83 69 73 73 74 74 88 31 Crl BCD 824 100 82 74 73 77 78 78 80 28 Fn AF316889 100 69 71 71 71 71 81 33 Rg BCD 3530 100 67 82 88 88 74 31 Rm DSM 70408 100 69 69 69 76 31 Spj BCD 4982 100 87 88 76 31 Spj BCD 778 100 99 76 31 Spj DSM 70847 100 76 30 Trc DSM 70684 100 30 Sc AB018539 100

Die verwendeten Abkürzungen entsprechen den Abkürzungen in der Abbildung 6.1. 6.3 Real-Time RT-PCR

6.3.1 RNA-Extraktion

RNA wurde wie im Kap. 2.6.1 beschrieben extrahiert und die Eluate anschließend mit DNa-se I [Sigma-Aldrich] behandelt. Hierzu wurden 35 µl des Eluats mit 4 µl 10 x Reaktionspuffer [Sigma-Aldrich] und 1 µl Amplification Grade DNase I [Sigma-Aldrich] versetzt und 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Deaktivierung der DNase I erfolgte durch Zugabe von 4 µl Stop Solution [Sigma-Aldrich] und Inkubation bei 70 °C für 20 min. Die Proben wurden direkt in der RT-PCR eingesetzt oder bei -20 °C gelagert. 6.3.2 Real-Time One-Step RT-PCR

Alle Real-Time One-Step RT-PCR Versuche wurden mit einem LightCycler® 2.0 Instrument in 20 µl LightCycler® Kapillaren durchgeführt und mit der LightCycler® Software 4.0 ausge-wertet [Roche Diagnostics]. Die spezifische Amplifikation der Target-cDNA wurde bei dem Einsatz von Hybridisierungssonden im Fluoreszenzkanal 640/Back 530 analysiert. Real-Time PCR-Reaktionen zur Kontrolle des DNase-Verdaus wurden mit SYBR®-Green I [Molecular Probes] durchgeführt und im Fluoreszenzkanal 530 ausgewertet. Die Real-Time RT-PCR Versuche wurden mit dem LightCycler® RNA Master HybProbe Kit [Roche Diagnostics] durchgeführt. Die Real-Time PCR-Reaktionen zur Kontrolle des DNase-Verdaus wurden mit den gleichen Reagenzien, wie im Kap. 2.13 beschrieben, durchgeführt.

6 Anhang

125

6.3.3 Real-Time One-Step RT-PCR-Programm

Das One-Step RT-PCR-Programm mit Hybridisierungssonden bestand aus folgenden fünf Teilprogrammen:

Teilprogramm Anzahl Zyklen Analysis Mode RT Reaktion 1 None Denaturierung der cDNA 1 None Amplifikation 45 Quantification Schmelzkurven-Analyse 1 Melting Curves Kühlen 1 None


RT Reaktion Target [°C]

Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode

61 00:20:00 20 0 0 0 None Denaturierung der cDNA Target [°C]

Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode

95 00:00:30 20 0 0 0 None Amplifikation Target [°C]

Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode

95 00:00:01 20 0 0 0 None 55 00:00:30 20 45 0.5 10 Single 72 00:00:15 20 0 0 0 None


Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode



Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode

40 00:00:30 20 0 0 0 None Das PCR-Programm mit SYBR®-Green I [Molecular Probes] zur Kontrolle des DNase-Verdaus bestand aus den folgenden vier Teilprogrammen: Teilprogramm Anzahl Zyklen Analysis Mode Initiale Denaturierung 1 None Amplifikation 45 Quantification Schmelzkurven-Analyse 1 Melting Curves Kühlen 1 None

6 Anhang

126


Initiale Denaturierung der cDNA Target [°C]

Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode

95 00:15:00 20 0 0 0 None Amplifikation Target [°C]

Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode

95 00:00:01 20 0 0 0 None 55 00:00:30 20 45 0.5 10 None 72 00:00:15 20 0 0 0 Single


Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode



Hold [hh:mm:ss]

Ramp Rate [°C/s]

Sec. Target [°C]

Step Size [°C]

Step Delay [cycles]

Acquisition Mode

40 00:00:30 20 0 0 0 None 6.3.4 Real-Time One-Step RT-PCR-Ansätze

Die One-Step RT-PCR wurde mit den Hybridisierungssonden und Primern für den Hefege-samtnachweis durchgeführt. Die Versuche wurden mit allen Sonden und Primern oder nur mit den in der folgenden Tabelle aufgeführten Sonden und Primern durchgeführt. Komponente Volumen Endkonzentration LightCycler RNA Master HybProbe (2,7-fach) 7,5 µl 1 x Mn(OAc)2 (50 mM) 1,3 µl 3,25 mM 3´-Primer-Mix HS11/I-IV (je 10 µM) 0,4 µl 0,2 µM (je Primer) 5´-Primer-Mix HT1r-3r (10 µM) 0,8 µl 0,4 µM (je Primer) LC-Fluorecein Sonde Yff1 (10 µM) 0,1 µl 0,05 µM LC-Red-640 Sonde Yfr4 (10 µM) 0,4 µl 0,2 µM Probe 5,0 µl H2O ad. 20 µl

Der Kontrollansatz mit SYBR®-Green I setzte sich wie folgt zusammen:

Komponente Volumen Endkonzentration 10 x PCR-Puffer 2,0 µl 1 x MgCl2 (100 mM) 0,6 µl 3,0 mM dNTP-Mix (je 10 mM) 0,4 µl 0,2 mM (je Nucleotid) BSA (30 µg/µl) 1,0 µl 1,5 µg/µl 3´-Primer-Mix HS11/I-IV (je 10 µM) 0,4 µl 0,2 µM (je Primer) 5´-Primer-Mix HT1r-3r (10 µM) 0,8 µl 0,4 µM (je Primer) SYBR®-Green I (100-fach) 0,1 µl 0,5-fach Taq DNA Polymerase (5 U/µl) 0,4 µl 2,0 U/Reaktion Probe 5,0 µl H2O ad. 20 µl

6 Anhang

127

6.3.5 Ergebnisse der Real-Time One-Step RT-PCR

Die Eignung der Primer und Hybridisierungssonden des Real-Time PCR Hefegesamtnach-

weissystems in der Real-Time One-Step RT-PCR wurde mit aufgearbeitetem YM-Medium

(Kap. 6.3.1), das mit S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487) dotiert wurde getestet. Bei

diesen Experimenten zeigte sich, dass beim Einsatz aller Komponenten (Primer und Son-

den) keine One-Step RT-PCR möglich war. In den Reaktionsansätzen wurden ausschließlich

Primerdimere gebildet.

Nach Reduktion der verwendeten Primer- und Sondenanzahl (siehe Kap. 6.3.4) konnten bis

zu 102 Zellen/ml S. cerevisiae var. diastaticus mit der Real-Time One-Step RT-PCR nachge-

wiesen werden (Abb. 6.2). Nach Agarosegelelektrophorese wurden Amplifikate der ge-

wünschten Länge detektiert (Abb. 6.3). Die Real-Time PCR mit SYBR®-Green zur Kontrolle

der DNase Behandlung zeigte, dass keine DNA in den Proben vorhanden war (Abb. 6.4). Die

mRNA des EF-3 Gens war demnach mit einem reduzierten System über Real-Time One-

Step RT-PCR nachweisbar.

Abb. 6.2: Real-Time One-Step RT-PCR

Die Real-Time One-Step RT-PCR mit dem reduzierten Hefegesamtnachweissystem wurde mit aufge-arbeitetem YM-Medium (Kap. 6.3.1) durchgeführt, das mit 106 Zellen/ml (grüne Linie), 105 Zellen/ml (rote Linie), 104 Zellen/ml (schwarze Linie), 103 Zellen/ml (blaue Linie) oder 102 Zellen/ml (rote Punkte) S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487) dotiert war. Als Negativkontrolle (blaue Punkte) wurde undotiertes YM-Medium verwendet.

6 Anhang

128

Abb. 6.3: Agarosegelelektrophorese nach Real-Time O ne-Step RT-PCR

Die Real-Time One-Step RT-PCR mit dem reduzierten Hefegesamtnachweissystem wurde mit aufge-arbeitetem YM-Medium (Kap. 6.3.1) durchgeführt, das mit S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487) dotiert war. Die Agarosegelelektrophorese wurde anschließend mit 5 µl der Reaktionsansätze in ei-nem 2-%igen Gel durchgeführt (Kap. 2.8). 1: Molekulargewichtsmarker VI 5: 104 Zellen/ml S. c. var. diastaticus 2: undotiertes YM-Medium 6: 103 Zellen/ml S. c. var. diastaticus 3: 106 Zellen/ml S. c. var. diastaticus 7: 102 Zellen/ml S. c. var. diastaticus 4: 105 Zellen/ml S. c. var. diastaticus

Abb. 6.4: Schmelzkurven-Analyse zur Kontrolle des D NA Abbaus

Der vollständige Abbau der DNA in den Proben für die Real-Time One-Step RT-PCR mit dem redu-zierten Hefegesamtnachweissystem wurde mit einer Real-Time PCR mit SYBR®-Geen I überprüft. Mit S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487) dotierte Proben: 106 Zellen/ml (grüne Linie), 105 Zellen/ml (rote Linie), 104 Zellen/ml (schwarze Linie), 103 Zellen/ml (blaue Linie) oder 102 Zellen/ml (rote Punk-te); Negativkontrolle: undotierte Probe (blaue Punkte); Positivkontrolle: 250 pg S. cerevisiae var. di-astaticus (DSM 70487) DNA (schwarze Punkte).

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