INMUNODIAGNOSTICO

DR. CARLOS ESQUERRE AGUIRRE

MEDICO PATOLOGO CLINICO HVLE

INMUNOANALISIS

SON TECNICAS PARA

DETECTAR Y CUANTIFICAR

AG O AC.

UN IE DEBE SER CONFIABLE,

OPORTUNO Y EFICIENTE.

La gran especificidad de Ac, los hace de gran utilidad como reactivos para detectar, cuantificar y purificar Ag

Debido a que puede producirse Ac prácticamente frente a cualquier molécula, se les puede usar para estudiar cualquier tipo de molécula

Inmunoanálisis

Inmunoanálisis

Basado en la presencia de un Ag o Ac, cuya cantidad puede determinarse por medio de una molécula indicadora

Cuando la molécula indicadora es marcada con un radioisótopo, (Yalow y Berson, 1959) se puede cuantificar ultizando instrumentos que detectan la descomposición radioactiva. RIA

Inmunoanálisis

Cuando la molécula indicadora está unida covalentemente a una enzima, puede cuantificarse determinando la capacidad de la enzima de transformar un sustrato transparente en un producto coloreado

A este se le llama enzimoinmunoanálisis

CLASIFICACION DE IE

POR USO DE MARCADORSIN MARCA: PRECIPITACION,

INMUNOELECTROFORESIS, NEFELOMETRIA, INMUNOTURBIDIMETRIA.

CON MARCA: ISOTOPICOS Y NO ISOTOPICOS (ENZIMATICOS Y NO ENZIMATICOS)

CLASIFICACION DE IE

DE ACUERDO AL METODO

DE DETECCION:

COLORIMETRICO

FLUORESCENTE

QUIMIOLUMINISCENTE

CLASIFICACION DE IE

SEGÚN EL DISEÑO DEL SISTEMA DE REACCION:

HOMOGENEO Y HETEROGENEO

COMPETITIVO O NO COMPETITVO

NOMENCLATURA

SE HA RECOMENDADO LLAMAR:INMUNOENSAYO (RADIO, ENZIMO Y

FLUOROINMUNOENSAYO) A AQUELLOS QUE SON DE DISEÑO COMPETITIVO.

ENSAYO INMUNOMETRICO (INMUNORADIOMETRICO, ETC) PARA AQUELLOS NO COMPETITIVOS

EMPLEO DE MARCADORES Y NOMENCLATURA DE LOS IE

EL ANALISIS TIPO I (EXCESO DE

ANTICUERPO) ESTA BASADO EN

MARCAR EL AC REACTIVO.

EL TIPO II (EXCESO DE ANALIZADO),

SE MARCA LA SUSTANCIA

ANALIZADA.

Marcado Enzima

Radioisótopo

Coloidesmetálicos

Látex

Fluoróforo

Hematíes Partículas decolorante

LIMITES DE DETECCION DE MARCADORES DE INMUNOENSAYOS MARCADORFOSFATASA

ALCALINAEUROPIO QUELATOYODO 125ESTER DE

ACRIDINIORUTENIO

CRITERIOS PARA SELECCIONAR UN MARCADOR ENZIMATICO

PUREZASENSIBILIDADFACILIDAD DE VELOCIDAD DE DETECCIONAUSENCIA DE FACTORES QUE

INTERFIERANGRUPOS REACTIVOS POTENCIALESESTABILIDAD IDONEIDAD PARA UN EIA HOMOGENEO

Ventajas EIA frente a RIA

Se evita la exposición a radiacionesReactivos más establesNo se requiere instalaciones ni autorizaciones

especialesMediciones rápidas y fácilmente automatizablesCosto

ELISA

Elemento de captura en la fase sólida.Anticuerpo en el suero del paciente (+) o (-)Reacción con el conjugado Cambio de aspecto del substrato por acción de la Enzima.El cambio de aspecto del substrato es proporcional a la cantidad del elemento “puente” es decir el anticuerpo presente en el suero del paciente positivo.

El suero que no aporta el elemento puente (anticuerpo) , no mantiene a la enzima en el sistema y por lo tanto no se producen cambios en el aspecto del substrato y es negativo

ELISA

(+) (-)

Antígeno-Anticuerpo y conjugado antiglobulina - EnzimaCambio de color del substrato

Con

cen

trac

ión

rel

ativ

a

Infección

Meses AñosSemanas

IgMIgM

Respuesta InmunológicaRespuesta Inmunológica

IgGIgG

Seroconversión

AgAg

Días

AntígenoAnticuerpo

Ag - Ac

ELISAReacción antígeno-anticuerpo

ELISAReacción antígeno-anticuerpo

Elisa : Reacción muestra - conjugadoElisa : Reacción muestra - conjugado

H2O2

H2O

O2

Tampón sustrato

TMBCromógeno

Elisa: Reacción del sustratoElisa: Reacción del sustrato

ConjugadoAnticuerpo IgG

Antígenorecubriendoel pocillo

Antígeno

Anticuerpo de captura

Anticuerpo IgM

Bioelisa : LeyendasBioelisa : Leyendas

Detección de IgGDetección de IgG

Fase

Solida

Fase

SolidaMuestraMuestra

ConjugadoConjugado

TMB

Detección de AntígenoDetección de Antígeno

TMBFase

Solida

Fase

Solida

MuestraMuestraConjugadoConjugado

Detección de IgM: InmunocapturaDetección de IgM: Inmunocaptura

TMBFase

Solida

Fase

Solida

MuestraMuestraConjugadoConjugado

Lavado

37°C37°C

Protocolo standard bioelisa:1.- Agregar muestra

Protocolo standard bioelisa:1.- Agregar muestra

Lavado

37°C37°C

Protocolo standard bioelisa:2.- Agregar el Conjugado

Protocolo standard bioelisa:2.- Agregar el Conjugado

TMB Temp. Amb.Temp. Amb.

TMBTMB

TMBTMB

H2O2H2O2

H2O2

H2O2

Protocolo standard bioelisa:3.- Agregar del Sustrato

Protocolo standard bioelisa:3.- Agregar del Sustrato

H2SO4

Protocolo estándar bioelisa:4.- Agregar Solución de parada

Protocolo estándar bioelisa:4.- Agregar Solución de parada

Fuente de luz

Filtro de 450 nm

Fotocélula

LECTURADENSIDADES OPTICAS

Cálculo de resultados

Protocolo estándar bioelisa:4.- Lectura de Absorbancias

Protocolo estándar bioelisa:4.- Lectura de Absorbancias

Lectura a 450 nm

Agregar solución de parada

Incubación

Dispensar Sustrato

Lavado

Incubación

Dispensar Conjugado

Lavado

Incubación

Agregar muestras y controles

Sensibilidad Especificidad

EstabilidadReproducibilidad Facilidad de usoAutomatizable

Guía de erroresGuía de errores

Elisa

Causas de error en el ELISACausas de error en el ELISA

MejorprevenirMejorprevenir

Leer y entender el manual de usuario

Preparar con tiempo el material

Programar el trabajo

Causas comunes de error en el ElisaCausas comunes de error en el Elisa

Errores de dilución durante la preparación de controles y reactivos

Rascado de la fase sólida durante la adición de muestras y/o reactivos

Pipeteo

Utilización de un tamaño de punta incorrecto

Comprobar que la pipeta no esté bloqueada y que dispense correctamente

Evitar contaminación cruzada con muestras y/o reactivos

Utilize puntas nuevas cada vez

Uso de instrumentación en mal estado. Asegurese que los instrumentos funcionen correctamente y estén calibrados.

Uso de los kits todavía frios. Permita que los kits y las muestras adquieran la temperatura ambiente antes de ser utilizados

Mezclar componentes de diversos lotes. Los reactivos están optimizados para cada lote de fabricación.

Contaminación:Salpicaduras de muestras o reactivo durante cualquier paso intermedio de la técnicaUso de puntas recicladasUso de viales sucios o mal secados en la preparación de los reactivos

Causas comunes de error en el ElisaCausas comunes de error en el Elisa

Calidad del agua destilada/desionizada. Parámetros como pH, iones, puede afectar la cinética de los Elisas. La pureza del agua es muy importante.

No utilizar los reactivos del kit pasada su fecha de caducidad

Retornar los kits a la nevera, entre 2-8°C inmediatamente después de usarlos.

Muy importante: Conserve las tiras no utilizadas junto con la bolsita desecante, en la bolsa de plástico con cierre que se incluye en cada kit

Causas comunes de error en el ElisaCausas comunes de error en el Elisa

Errores en el ELISAEsquema de investigaciónErrores en el ELISAEsquema de investigación

Nº Acción OK?

1 Revisar el procedimiento y determinar si ha habidoalgún error u omisión

2 Comprobar fecha de caducidad de los componentes

3Parámetros físicos: Tiempo

Temperatura incubaciónTemperatura ambiente

4 Equipo de laboratorio: Pipetas, lavador, lector5 Calidad del agua desionizada / destilada6 Preparación y conservación de los reactivos7 Los controles han funcionado según lo esperado ?8 Estaban los reactivos a temperatura ambiente?

Espacios libres cubiertos por la Albúmina bovina

¿Por qué falsos positivos?¿Por qué falsos positivos?

Antígeno HIV soluble fijado en la placa

IgG específica contra HIV

HIV Positivo verdadero

IgG contra Albúmina bovina

Falso positivo

¿Por qué falsos positivos?¿Por qué falsos positivos?

HIV Positivo verdadero HIV Falso positivo

RADIOINMUNOANALISIS

Así como en el sistema ELISA usamos una enzima y valoramos los cambios en el aspecto del substrato , en el RIA nos valemos de un ISOTOPO RADIOACTIVO unido a sistemas de anticuerpos .

Las lecturas se hacen por una valoración de la cantidad de radiación emitida , la que es proporcional a la concentración del analito estudiado .

RADIOINMUNOANALISIS

VALIDACION: CONSISTE EN COMPARAR SU RENDIMIENTO CON OTRO DE REFERENCIA

TRANSFERIBILIDAD:TIEMPO DE REALIZACION:SUSTANCIA PROBLEMA MARCADA.

RADIOINMUNOANALISIS

LOS METODOS RIA OFRECEN UN CONSIDERABLE ATRACTIVO POR SU EXTREMA SENSIBILIDAD, SU RELATIVA FACILIDAD DE CREACION Y SU COSTO RELATIVAMENTE BAJO.

COMPONENTES DEL SISTEMA RIA

SUSTANCIA: AG NO MARCADO.AG MARCADO.AC.MEDIO DONDE OCURRE LA

REACCION. ISOTOPOS COMO TRAZADORES: 3H Y

125I .

QUIMIOLUMINISCENCIA

El principio de la prueba es similar al de ELISA es decir una reacción de antígeno y anticuerpo .

Esta reacción se objetiva por la producción de luz a partir de una molécula de alta energía que es descompuesta por actividad enzimática.

La cantidad de luz producida es proporcional al analito investigado.

VENTAJAS DE LA QUIMIOLUMINISCENCIA

PRESENTAN UN GRAN INTERVALO LINEAL. BAJO LIMITE DE DETECCION. ELEVADA ESPECIFICIDAD Y RAPIDEZ. LA MAYORIA SON PROCEDIMIENTOS DE UN

PASO. NO ES NECESARIO LARGAS INCUBACIONES. ESTABILIDAD DE COMPUESTOS

LUMINISCENTES

FACTORES QUE AFECTAN LAS MEDICIONES QLC

EL PH ES UNA VARIABLE IMPORTANTE.LAS REACCIONES SON DEPENDIENTES

DE LA TEMPERATURA.LOS COMPONENTES SERICOS COMO

ADENINA Y NUCLEOTIDOS DE PIRIDINA. (LAVADOS).

LA LUZ AMBIENTAL

ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA

UTILIZACION DE MARCADORES NO ISOTOPICOS MUY ESTABLES.

LA ELEVADA DETECTABILIDAD.

EL AMPLIO INTERVALO DE MEDIDA

LA FACIL SEPARACION DE LA FASE LIGADA DE LA LIBRE.

NECESIDADES EMERGENTES EN LOS ANALISIS

MENORES LIMITES DE DETECCION.DETECCION DE ANALITOS DE BAJO

PM.MAYOR ESPECIFICIDAD.VELOCIDAD DE PROCESAMIENTO DE

GRAN NUMERO DE MUESTRAS.DIAGNOSTICOS RAPIDOS.