El Complejo de la Piruvato Deshidrogenada (PDHc)La mayor parte del ATP utilizado por muchas células para mantener la homeostasis se produce por oxidación del piruvato en el ciclo del ácido tricarboxílico (ATC o ciclo de Krebs). Durante este proceso de oxidación, se generan nicotinamida adenina di nucleótido reducida (NADH) y flavina adenina di nucleótido (FADH2). NADH y FADH2 se utilizan principalmente para dirigir los procesos de fosforilación oxidativa, que son los responsables de convertir el potencial reducido del NADH y FADH2 al fosfato de alta energía ATP.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

El destino del piruvato depende de la carga energía de la célula. En células o tejidos con alta carga de energía el piruvato es dirigido hacia la gluconeogénesis, pero cuando la carga de energía es baja, el piruvato se oxida a CO2 y agua en el ciclo ATC, con la generación de 15 equivalentes de ATP por cada piruvato. Las actividades enzimáticas del ciclo ATC (y la fosforilación oxidativa) se localizan en la mitocondria. Cuando el piruvato es transportado a la mitocondria, este encuentra dos enzimas metabólicas principales: la piruvato carboxilasa (una enzima de la gluconeogénesis) y la piruvato deshidrogenada (PDH), la primera enzima del completo PDH. Con una carga de energía alta en la célula la coenzima A (CoA) esta altamente acilada, principalmente como acetil.CoA, y capaz de activar alostéricamente a la piruvato carboxilasa dirigiendo al piruvato hacia la gluconeogénesis. Cuando la carga de energía es baja la CoA no esta acilada, la piruvato carboxilasa esta inactiva, y el piruvato es metabolizado preferentemente por la vía del PDHc y las enzimas del ciclo del ATC a CO2 y agua. El NADH y FADH2 reducidos que se general durante las reacciones oxidativas

pueden entonces ser utilizados para dirigir la síntesis de ATP por la vía de la fosforilación oxidativa.

El PDHC se compone de múltiples copias de 3 enzimas diferentes: la piruvato deshidrogenasa (PDH, E1: 20-30 ejemplares), dihidrolipoamida S-acetil-transferasa (DLAT, E2: 60 copias) y la deshidrogenasa dihidrolipoamida, (DLD, E3: 6 ejemplares). El complejo también requiere cinco coenzimas diferentes: CoA, NAD+ , FAD+ , lipoico y pirofosfato de tiamina (TPP). Tres de las coenzimas del complejo están estrechamente vinculado a las enzimas del complejo (TPP, ácido lipoico y FAD+ ) y dos son empleados como portadores de los productos de la actividad PDHC (CoA y NAD+ ). La vía de la oxidación de la PDH del piruvato a acetil-CoA es un diagrama a continuación.

Diagrama que ilustra el flujo de la actividad general del PDHc. Durante la oxidación del piruvato a CO2 por la piruvato deshidrogenada los electrones fluyen del piruvato a la estructura de lipoamina de la dihidrolipoil transacetilasa, luego al cofactor FAD de la dihidrolipoil deshidrogenasa y finalmente a la reducción del NAD+ a NADH. El grupo

acetil se une a la coenzima A (CoASH) en una unión tioester de alta energía. Luengo la acetil.CoA entra al ciclo del ATC para su oxidación completa a CO2 y H2O.

La primera enzima de la PDHc es PDH en sí, que por oxidación de piruvato se descarboxila. Durante el curso de la reacción el grupo acetilo que se deriva de la descarboxilación del piruvato se une a la PPT. La siguiente reacción del complejo es la transferencia de los dos carbonos del grupo acetil a partir del acetil-PPT al ácido lipoico, la coenzima unida covalentemente a la dihidrolipoamida transacetilasa. La transferencia del grupo acetil desde la acetil-lipoamida a la CoA da lugar a la formación de dos grupos sulfidrilos (SH) en el lipoato haciéndose necesario la re-oxidación de la forma disulfuro (S-S) para regenerar lipoato como un aceptor competente de grupos acilo. La enzima dihidrolipoamida deshidrogenasa, con FAD+ como co-factor, cataliza esa reacción de oxidación. La actividad final del PDHc es la transferencia de equivalentes reducidos desde el FADH2 de la dihidrolipoil deshidrogenasa al NAD+ . El destino del NADH es la oxidación en la vía de transporte de electrones de la mitocondria, para producir 3 equivalentes de ATP.

El resultado neto de las reacciones del PDHc es:

Piruvato + CoA + NAD+ ——> CO2 + Acetil-CoA + NADH + H+

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Regulación del Complejo PDHLas reacciones de los PDHc sirven para interconexión de las vías metabólicas de la glucólisis, gluconeogénesis y grasos oxidación de los ácidos del ciclo de Krebs. La actividad de la PDHc también es importante en regular el flujo de glucosa a malonil-CoA que se requiere para la de novo síntesis de ácidos grasos. Acetil-CoA, produce en la mitocondria a través de la acción de la PDHc, se transportado hacia el citosol en forma de citrato, cuando la carga de energía de las subidas de la célula. En el citosol el citrato es hidrolizada por la ATP-citrato liasa (siglas en Inglés: ACLY) rendimiento oxalacetato y acetil-CoA. En el citosol de la acetil-CoA puede ser convierte en malonil-CoA a través de la acción de la acetil-CoA carboxilasa (ACC). Este malonil-CoA sirve como precursor para la síntesis de ácidos grasos. La acumulación de malonil-CoA citosólico, como ocurrirá en condiciones ricas en energía, particiones citosólica ácidos grasos lejos de la maquinaria de oxidación de la mitocondrias mediante la inhibición de la carnitina palmitoiltransferasa I (CPT I). Este efecto de malonil-CoA, derivado de la acetil-CoA, las parejas en las tasas de glucosa la oxidación de la inhibición de la oxidación de ácidos grasos. No hay ninguna vía en los mamíferos para la conversión de la acetil-CoA a la glucosa y por lo tanto, la actividad de la PDHc está muy regulada por una variedad de efectores alostéricos y por modificación covalente. La importancia de la PDHc al mantenimiento de la homeostasis es evidente por el hecho de que a pesar de las enfermedades asociadas con deficiencias de la

PDHc se han observado, los individuos afectados a menudo no sobrevivir hasta la madurez. Dado que el metabolismo energético aeróbico de alta tejidos como el cerebro, el músculo esquelético y el corazón depende de la conversión normal de piruvato a acetil-CoA, tejidos aeróbicos son los más sensibles a las deficiencias en los componentes de la PDHc. La mayoría de las enfermedades genéticas asociadas con la deficiencia de PDHc se deben a mutaciones en el PDH. El principal resultado patológico de estas mutaciones es moderada a severa acidosis láctica cerebral y encefalopatías.

Factores que regulan la actividad de la PDHc. Actividad de la PDH está regulado por su ' estado de fosforilación, siendo los más activos en el estado no fosforilado. La fosforilación de la PDH es catalizada por la PDH cuatro quinasas específicas, designados PDK1, PDK2, PDK3 y PDK4. La actividad de la estas quinasas se ve reforzada cuando la carga de energía celular es alto, que se refleja por un aumento en el nivel de ATP, NADH y acetil-CoA. Por el contrario, un aumento de la piruvato quinasa inhibe fuertemente la PDH. negativo adicional efectores de la PDH quinasas son ADP, NAD+ y CoASH, los niveles de lo que

aumenta cuando los niveles de energía caen. La regulación de las fosfatasas PDH (PDP) es menos conocida, pero se sabe que el Mg2+ y Ca2+ activar las enzimas y que son objeto de acción de la insulina. En el tejido adiposo, la insulina aumenta la actividad de la PDH y en músculo cardíaco se incrementa la actividad de PDH por las catecolaminas.

La actividad de la PDH (E1) se está regulada por la fosforilación y desfosforilación eventos que son catalizadas por quinasas PDH (PDKs) y PDH fosfatasas (PDP), respectivamente. Fosforilación de los resultados de la PDH en la inhibición de la actividad, mientras que, desfosforilación aumenta. El PDKs se ha demostrado que estar estrechamente vinculados los dominios de la lipoyl de E2, el anclaje de las quinasas de la PDHc. En promedio, hay de 2 a 3 PDKs unidas entre PDHc.

La fosforilación de la α-subunidad de la PDH (E1α) se presenta en tres diferentes residuos de serina denomina el sitio 1 (Ser-264), el sitio 2 (Ser-271), y el sitio 3 (Ser-203). La fosforilación de cualquiera de estos tres residuos de serina resultados en la inhibición de la PDHc. Sin embargo, los datos muestran que la fosforilación de un sitio se presenta con mayor rapidez y el sitio 3 es el por lo menos rápidamente fosforilados. Teniendo en cuenta estas diferencias en la tasa de fosforilación, un sitio es de primordial importancia para la regulación aguda de la actividad PDHc. Cuatro isoenzimas PDK se han identificado en los humanos: PDK1, PDK2, PDK3 y PDK4. El análisis de los patrones de expresión de la PDKs muestra que PDK2 es el más ampliamente expresada con los más altos niveles de expresión se ve en el corazón, el hígado y los riñones. PDK1 expresión es mayor en el corazón y no se ve en el hígado. PDK4 expresión es alta en el corazón, el hígado, islotes pancreáticos, y el riñón y cada uno de estos tejidos son capaces de altas tasas de oxidación de ácidos grasos y expresar también altos niveles de la factores de transcripción PPARα y PPARδ que se sabe que son reguladores críticos de la expresión de genes que codifican para metabolizar los lípidos enzimas.

La utilización de formas mutantes de la PDH ha sido posible identificar los sitios son fosforilados por el cual PDK. Los cuatro PDKs han demostrado ser capaces de sitios de fosforilación de 1 y 2. Sitio 3 sólo es fosforilada por PDK1. PDK4 tiene un preferencia mucho mayor por la fosforilación de la página 2, en comparación con el actividades de PDK1, PDK2 y PDK3 en este sitio. Los datos de estos tipos de experimentos indican que la actividad de PDK2 es necesario a corto plazo la inhibición de la PDHc través de la fosforilación de la página 1. Por otro lado, PDK1 y PDK4 parecen ser más importantes para permitir que múltiples sitios de fosforilación que a su vez impide la reactivación de la PDHc por PDP.

Regulación de la actividad de los diversos PDKs se manifiesta con la isoforma especificidad. Piruvato, generados a partir de la glucólisis, ejerce inhibición diferencial acciones en el PDKs diferentes. PDK2 es el más sensible a la inhibición por piruvato, mientras que, PDK4 es relativamente insensible. A medida que la relación ATP / ADP cae (es decir, los aumentos en los niveles de ADP) ADP va a ejercer una inhibición alostérica de la actividad de la PDKs. ADP ejerce su inhibición alostérica de PDKs tanto de forma independiente y en sinergia con la inhibición de la piruvato. En contraste con la aguda la inhibición de la PDKs por el piruvato, la activación aguda se produce a través de productos de la PDHc así como por la oxidación de ácidos grasos, es decir, la acetil-CoA y NADH.

PDK2 es el más sensibles a los aumentos en el nivel de la acetil-CoA en comparación con el PDK otros isoformas. La relación de NADH a NAD+ también ejercen isoforma-específicos alostérico regulación de PDKs. PDK4 es muy sensible (activa) a un aumento de NADH / NAD+ , mientras que, PDK2 es mucho menos sensible a esta activación.

Dos genéticamente y bioquímicamente isoformas PDP (PDP1 y PDP2) se han caracterizado. El PDP1 es un Mg2+ -dependiente y Ca2+ estimulada por la proteína fosfatasa serina de la proteína fosfatasa 2C (PP2C) superfamilia. El PDP1 es un heterodímero compuesto de un subunidad catalítica (PDPc) y una subunidad reguladora (PDPr). PDP1 se encuentra ampliamente distribuida y se considera uno de los principales regulador de la actividad PDHc. PDPc está ligado a la interna de la mitocondria membrana. El mecanismo por el cual Ca2+ estimula la actividad PDPC es aumentar su interacción con la PDHc mientras que también disminuye el Km para Mg2+ de PDPc. Iones de calcio también aumenta la asociación de PDPc con la fosforilado Subunidad E1α de la PDH. Por el contrario, PDPr disminuye la sensibilidad de PDPc de Mg2+ . Ambos PDP1 componentes son el blanco de la insulina, lo que aumenta PDPc actividad y disminuye el control negativo PDPr, seguido por una mayor sensibilidad a PDPc Mg2+ y la mejora de general PDP1 eficiencia. PDP2 es menos conocido de las dos pantallas de plasma, pero tiene Se ha demostrado que constan de un catalizador subunidad que no es sensible a Ca2+ y es 10 veces menos sensibles a la Mg2+ de la PDPc de PDP1. Sin embargo, PDP2 también se considera un objetivo de acción de la insulina.

Dos productos de la NADH complejo, y acetil-CoA (ambos de los cuales también productos de la oxidación de ácidos grasos), son negativos efectores alostéricos en PDH-a, la no fosforilada, la forma activa de la PDH. Estos efectores reducen la afinidad de la enzima piruvato para, lo que limita el flujo de carbono a través de la PDH complejo. Además, como se indicó anteriormente, el NADH y acetil-CoA son potentes efectores positivos sobre la actividad de PDK2 y PDK4. desde NADH y la acetil-CoA se acumulan cuando la carga de energía de la célula es alta, no es sorprendente que los altos niveles de ATP también hasta de regular la actividad PDK, refuerzo de la baja regulación de la actividad de PDH en células ricas en energía. Tenga en cuenta, sin embargo, que el piruvato es un efector negativo en todas las potentes PDKs, con el resultado que cuando los niveles de piruvato lugar, PDH activa se verá favorecida, incluso con altos niveles de NADH y acetil-CoA.

Las concentraciones de piruvato que mantienen en la PDH forma activa (PDH-a) son lo suficientemente altos para que, en las células ricas en energía, el alostéricamente el regulado, de alta Km forma de PDH es, sin embargo capaz de convertir el piruvato en acetil-CoA. Con grandes cantidades de piruvato en células que tienen la carga de energía de alta y NADH alta, el carbono del piruvato serán dirigidos a las 2 formas de almacenamiento principal de carbono (glucógeno a través de la gluconeogénesis y la grasa producción a través de la síntesis de ácidos grasos), donde la acetil-CoA es el carbono principales de los donantes.

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Reacciones del Ciclo del Ácido Tricarboxílico (ATC)

El ciclo del ATC que indica las enzimas, sustratos y productos. El GTP que se genera en la reacción succinato tiocinasa (succinil-CoA sintetasa) es equivalente a una mol de ATP debido a la presencia de la nucleótido fosfocinasa. Las tres moles de NADH y 1 mole de FADH2 que se generan durante cada vuelta del ciclo alimentan la vía de la fosforilación oxidativa. Cada mole de NADH da lugar a 3 moles de ATP y cada mole de FADH2 da lugar a 2 moles de ATP. Por tanto, por cada mol de piruvato que entra en el ciclo del ATC, se pueden generar 12 moles de ATP. IDH=isocitrato deshidrogenasa. α-KGDH=α-

cetoglutarato deshidrogenasa. MDH=malato deshidrogenasa. Coloque el cursor sobre los intermediarios del ciclo para ver sus estructuras. rxn = reacción

Citrato sintasa (enzima condensadora):

La primera reacción del ciclo es la condensación del carbono metilo de la acetil.CoA con el carbón ceto (C-2) del oxaloacetato (OAA). La energía libre estándar de la reacción, –8.0 kcal/mol, la dirige fuertemente hacia delante. Debido a que la formación del OAA a partir de sus precursores es termodinámicamente no favorable, la naturaleza altamente exergónica de la reacción de la citrato sintasa es de una importancia central para que el ciclo se mantenga funcionando hacia delante, debido a que se dirige la formación de oxaloacetato por principios de acción de masa.

Cuando la carga de energía de la célula se incrementa la tasa de flujo a través del ciclo del ATC disminuirá lo que llevara a un incremento de citrato. El exceso de citrato se utiliza para transportar los carbones de la acetil.CoA desde la mitocondria al citoplasma en donde pueden ser utilizados para la síntesis de ácidos grasos y colesterol. Adicionalmente, los niveles altos de citrato en el citoplasma activan la enzima regulatoria clave de la síntesis de los ácidos grasos, acetil.CoA carboxilasa (ACC) e inhibe la PFK-1. En tejidos no hepáticos el citrato se requiere también para la síntesis de cuerpos cetónicos.

Aconitasa:

La isomerización de citrato a isocitrato por la aconitasa es estéreo especifica, con la migración de –OH del carbono central del citrato (anteriormente el carbón ceto del OAA) siendo siempre hacia el carbono adyacente que se deriva del metileno (–CH2–) del OAA. La naturaleza estéreo específica de la isomerización determina que el CO2 perdido, cuando el isocitrato se oxida a succinil-CoA, se derive del oxaloacetato utilizado par la síntesis del citrato.

La aconitasa es una de varias enzimas mitocondriales conocidas como proteínas no-heme-hierro. Estas proteínas contienen hierro inorgánico y azufre, que se conocen como centros de hierro y azufre, en un complejo coordinado con azufres de cisteina de la proteína. Existen dos clases prominentes de complejos no-heme-hierro, aquellos que contienen dos equivalentes cada uno de hierro inorgánico y azufre Fe2S2, y aquellos que contienen 4 equivalentes de cada uno Fe4S4. La aconitasa es miembro de la clase Fe4S4. Sus centros de azufre frecuentemente se designan como Fe4S4Cys4, que indica que 4 átomos de azufre de la cisterna están envueltos es la estructura completa del complejo. En los compuestos sulfuro el hierro esta envuelto en los eventos de oxidación-reducción.

Isocitrato deshidrogenasa:

El isocitrato es descarboxilado oxidativamente a α-cetoglutarato por la isocitrato deshidrogenada, (IDH). Existen dos enzimas IDH diferentes. La IDH del ciclo del ATC usa NAD+ como cofactor, mientras que la otra IDH utiliza NADP+ como cofactor. A diferencia de la enzima que requiere NAD+ , que solamente se encuentra en la matriz mitocondrial, la enzima que requiere NADP+ se encuentra en la mitocondria y en el citoplasma. La IDH

cataliza la reacción limitante así como también la primera reacción que produce NADH del ciclo del ATC. El CO2 que se produce por la reacción de la IDH es el C-1 original del oxaloacetato que se utiliza en la reacción citrato sintasa.

Generalmente se considera que el control del flujo de carbonos del ciclo se regula en la reacción de la IDH por los efectores alostéricos negativos poderosos NADH y ATP y por los efectores positivos poderosos; isocitrato, ADP, y AMP. Por esto último es claro que la carga energética de la célula es un factor clave en la regulación del flujo de carbono en el ciclo del ATC.

El complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa:

El α-cetoglutarato es descarboxilado oxidativamente a succinil-CoA por el complejo α-cetoglutarato deshidrogenada (α-CGDH). Esta reacción genera el segundo equivalente del ciclo del ATC CO2 y NADH. Este complejo multi-enzimático es muy similar al complejo PDH en lo intrincado de sus proteínas y su estructura, cofactores, y su mecanismo de acción. También, como en el complejo de la PDH, las reacciones del complejo de la α-CGDH proceden con una gran carga de energía libre estándar. Aunque el complejo de la α-CGDH no esta sujeto a modificaciones covalentes, la regulación alostérica es muy compleja, con su actividad regulada por la carga de energía, el radio NAD+ /NADH, y la actividad efectora de sustratos y productos.

La succinil-CoA y el α-cetoglutarato son también metabolitos importantes fuera del ciclo del ATC. Así, el α-cetoglutarato, representa un metabolito anapletórico que facilita la entrada y salida de átomos de carbono del ciclo del ATC a vías que involucran el metabolismo de aminoácidos. El α-cetoglutarato es también importante para dirigir el transportador malato-aspartato. La succinil-CoA, junto con la glicina, contribuye con todos los átomos de carbono y nitrógeno que se requieren para la síntesis de heme protoporfirina y para la utilización de cuerpos cetónicos en tejidos no hepáticos.

Succinil-CoA sintetasa, SCS (succinato-CoA ligasa, succinato tiocinasa)

La conversión de succinil-CoA a succinato por succinil-CoA sintetasa (implica el uso del tioéster de alta energía de succinil-CoA para dirigir la síntesis de un nucleótido fosfato de alta energía, por una proceso conocido como fosforilación a nivel de sustrato. En este proceso una alta energía enzima-fosfato intermedia se forma, con el fosfato posteriormente se transfieren a GDP. GTP mitocondrial se utiliza en una reacción de trans-fosforilación catalizada por la enzima mitocondrial diphosphokinase nucleósido para fosforilar ADP, la producción de ATP y la regeneración del GDP para el funcionamiento continuo de succinil-CoA sintetasa. Succinil-CoA sintetasa es una enzima heterodimérica compuesta de una subunidad alfa y beta. La α-subunidad es invariante en todas las formas de SCS y es codificada por el gen SUCLA1. La β-subunidad de SCS determina la especificidad de nucleótidos del complejo enzimático. Hay dos subunidades β-genes que codifican la A-beta y G-beta subunidades. Como se indica por las designaciones, la subunidad A-beta determina la especificidad para el ATP y la G-beta por GTP. La subunidad A-beta está codificada por el gen SUCLA2 mientras la subunidad G-beta está codificada por el gen SUCLG2.

Succinato deshidrogenasa (SDH)

La SDH cataliza la oxidación del succinato a fumarato con la reducción secuencial de FAD unido a la enzima y del hierro no hemínico. En las células de mamíferos el aceptor final de electrones es la coenzima Q10 (CoQ10), un transportador móvil de equivalentes reducidos que por su naturaleza lipofílica esta restringido a la fase lipídica de la membrana mitocondrial.

Fumarasa (fumarato hidratasa):

La fumarasa cataliza reacciones especificas para la forma trans del fumarato. El resultado es que la hidratación del fumarato procede de forma estero específica con la producción de L-malato.

Malato deshidrogenasa (MDH):

El L-malato es el sustrato específico para la MDH, la última enzima del ciclo del ATC. La reacción hacia delante del ciclo, la oxidación del malato produce oxaloacetato (OAA). En la reacción hacia delante la reacción tiene una energía libre estándar de aproximadamente +7kcal/mol, lo que indica la naturaleza no favorable de la dirección de la reacción hacia delante. Como se indico anteriormente, la reacción de la citrato sintasa que condensa el OAA con la Acetil.CoA tiene una energía libre estándar de aproximadamente –8kcal/mol y es responsable de tirar la reacción de la MDH hacia delante. El promedio de cambio en la energía libre estándar es de aproximadamente –1kcal/mol para la conversión de malato a OAA y a succinato.

La estequiometría promedio del ciclo del ATC es:

acetil-CoA + 3NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2H2O ——> 2CO2 + 3NADH + FADH2 + GTP + 2H+ + HSCoA

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Regulación del Ciclo del Ácido tricarboxílico (ATC)La regulación del ciclo del ATC, como el de la glucólisis, se hace a la entrada de los sustratos al ciclo así como también en reacciones claves del mismo. La energía entra al ciclo del ATC principalmente como acetil.CoA. La generación de acetil.CoA a partir de los carbohidratos es, por tanto, un punto de control importante del ciclo. Esta es la reacción catalizada por el complejo PDH.

En forma de revisión, el complejo PDH se inhibe por la acetil.CoA y el NADH y se activa por la CoA no acetilada (CoASH) y el NAD+ . Las actividades de la piruvato deshidrogenasa del complejo PDH se regulan por su estado de fosforilación. Esta modificación se lleva a cabo por las quinasas específicas (PDK1–PDK4) y los fosfatos son eliminados por una fosfatasa específica (PDH fosfatasa, PDP). La fosforilación de la PDH inhibe su actividad, y por tanto, lleva a una disminución en la oxidación del piruvato. PDKs son activados por NADH y por la acetil.CoA y se inhibe por el piruvato, ADP, CoASH, Ca2+ , y Mg2+ . La PDP, por el contrario, se activa por el Mg2+ , y el Ca2+ .

Debido a que tres reacciones del ciclo del ATC así como también de la PDH utilizan NAD+

como cofactor no es difícil entender por que el ratio de NAD+ /NADH de la célula tiene un gran impacto en el flujo de carbonos en el ciclo del ATC.

La disponibilidad de sustrato puede también regular el flujo del ciclo del ATC. Esto ocurre en la reacción de la sintasa de citrato como un resultado de la disminución en la disponibilidad de oxaloacetato. La inhibición por producto de la reacción también ocurre en el ciclo del ATC, por ejemplo, el citrato inhibe la sintasa de citrato, la α-CGDH se inhibe por el NADH y la succinil-CoA. Las enzimas clave del ciclo del ATC también son reguladas alostéricamente por el Ca2+ , ATP, y ADP.