Ekspresi Differensial Biogenesis/Faktor Ekspor THOC1 dan ALY

mRNP pada Kanker yang Terjadi pada Manusia

María S Domínguez-Sánchez1, Carmen Sáez2, Miguel A Japón2, Andrés Aguilera1, Rosa

Luna1*

Abstrak

Latar Belakang: Satu langkah kunci dalam ekspresi gen yaitu biogenesis kompleks

ribonukleopartikel mRNA (mRNPs). Pembentukan mRNP memerlukan partisipasi sejumlah

faktor seperti kompleks THO. THO berinteraksi secara fisik dan fungsional dengan Sub2/UAPS6

tergantung RNA. ATPase, dan Yra1/REF1/ALY RNA yang mengikat protein menghubungkan

transkripsi, ekspor mRNA dan integritas genom. Dengan menghubungkan antara instabilitas

genom dan kanker, kami telah melakukan amnalisis komparatif dari pola ekspresi THOC1,

sebuah subunit kompleks THO, dan ALY pada sampel tumor.

Metode: kadar mRNA diukur dengan real-time PCR kuantitatif dan hibridisasi kumpulan cDNA

jaringan tumor; dan kadar protein dan distribusi dengan immunostaining dari kumpulan jaringan

yang disesuaikan yang mengandung sampel yang terfiksasi dengan paraffin dari tumor yang

berbeda dan jaringan normal yang dipantau dengan analisis statistic.

Hasil: kami menunjukkan bahwa ekspresi kedua faktor mRNP, THOC1 dan ALY berubah pada

beberapa jaringan tumor. Kadar protein THOC1 dan mRNA meningkat pada tumor ovarium dan

paru-paru dan menurun pada tumor di testis dan kulit, sedangkan ALY berubah dengan variasi

yang luas pada jaringan tumor. Berbeda halnya dengan THOC1, protein ALY banyak terdeteksi

pada sel proliferative normal, tetapi sedikit pada kanker tahap lanjut.

Kesimpulan: hasil tersebut menunjukkan adanya hubungan antara tumorogenesis dan tingkat

ekspresi THO dan ALY manusia. Penelitian ini memungkinkan untuk mendefinisikan faktor

biogenesis mRNP sebagai faktor putative yang berperan dalam proliferasi sel yang dapat

berkontibusi terhadap perkembangan tumor.

Latar Belakang

Ekspresi gen mencakup berbagai proses dari transkripsi sampai pemrosesan mRNA, ekspor dan

translasi. Selama transkripsi, pre-mRNA awal berhubungan dengan RNA yang berikatan dengan

protein (RNA-binding protein) dan menjalani serial langkah pemrosesan, yang menghasilkan

ekspor kompleks ribonukleoprotein mRNA kompeten ke sitoplasma [1]. Sel eukariotik telah

memiliki mekanisme kontrol kualitas yang mencegah ekspor mRNP suboptimal dan sintesis

protein yang mengalami disfungsi [2]. Ekspresi abnormal dari mRNA-binding proteins

mempengaruhi langkah metabolism mRNA yang berbeda, yang secara signifikan mengubah

ekspresi gen. Relevansi fisiologis kontrol biogenesis mRNP didukung oleh fakta bahwa ekspresi

yang berubah atau disfungsi beberapa RNA binding proteins menyebabkan berbagai penyakit,

seperti kanker, sebagai contoh beberapa faktor 3-end processing dan beberapa protein yang

berperan dalam pernyambungan (splicing) alternative [3,4].

Kompleks THO merupakan kompleks nucleus eukariotik yang berfungsi dalam biogenesis

mRNP [5]. Kompleks ini pertama kali diisolasi pada Saccharomyces cerevisiae sebagai

kompleks empat protein yang terdiri dari sejumlah stoikiometrik Tho2, Hpr1, Mft1, dan Thp2

[6]. THO juga telah dipurifikasi pada Drosophila dan sel manusia dan kompleks mengandung

pasangan subunit Hpr1 dan Tho2 yeast, yang disebut dengan Thoc1 dan Thoc2, begitu juga

dengan komponen tambahan seperti Thoc5-Thoc7 dan hTex1/Thoc3 [7,8]. THO berinteraksi

secara fisik dan fungsi dengan protein dalam ekspor mRNA; Sub2/UAP56 RNA dependen

ATPase, dan Yra1/REF1/ALY RNA-binding protein; yang membentuk kompleks yang lebih

besar yang disebut TREX (kompleks transkripsi-ekspor) [8]. THO yeast, mutan sub2 dan mutan

yra1 yang kurang berkembang menunjukkan fenotip yang sama dari kerusakan transkripsi,

gangguan ekspor mRNA, dan transkripsi terkait hiperrekombinasi yang menunjukkan bahwa

protein ini dapat bertindak dalam jalur biogenesis mRNP yang sama [5,9]. THO dan Sub2 dapat

dianggap faktor yang berhubungan paling dekat, mengingat kapasitas Sub2 berlebih untuk

menekan mutasi THO, dan kesamaan dalam kekuatan fenotip diberikan oleh mutasi hpr1, tho2,

dan sub2 [10,11].

Relevansi THO dalam fisiologi sel telah jelas terlihat dari ragi ke manusia. Mutan null THO ragi 

sakit dan tumbuh dengan lambat dan deplesi THO memiliki efek negatif pada laju pertumbuhan

manusia dan sel Drosophila [6,7,12]. Selain itu, THO diperlukan untuk kelangsungan hidup

embrio tikus  dan untuk kelangsungan hidup pasca melahirkan, sebagaimana ditentukan oleh

konock out THOC1 [13]. Hubungan THO dengan perkembangan kanker juga telah diteliti. Pada

manusia, Thoc1 diidentifikasi sebagai  protein matriks nuklear yang mengikat pRB, protein

supresi tumor retinoblastoma [14]. Tingginya kadar hHPR1 / THOC1 telah diamati pada sel

kanker paru-paru dan payudara dan berkaitan dengan ukuran tumor dan agresivitasnya [12,15].

Namun, tidak ada satupun dari pola ekspresi komponen THO THOC1 dan lainnya dan protein

terkait pada tumor yang berbeda dan mekanisme yang mungkin mendasari proses ini diketahui.

Meskipun demikian, data ekspresi gen yang berasal dari microarray dan analisis lokalisasi

protein sistematis tersedia [16,17], sedikit  diketahui tentang ekspresi gen dalam rentang kanker

yang luas dan hubungannya dengan patologi pada pasien. Untuk mendapatkan wawasan lebih

jauh tentang peran faktor biogenesis mRNP pada kanker suatu analisis dilakukan terhadap pola

ekspresi THO dan faktor-faktor fungsional terkait lainnya seperti Aly dan hSpt4 pada berbagai

tumor manusia. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi THOC1 dan Aly berubah pada

beberapa jaringan tumor  yang menunjukkan adanya hubungan  faktor biogenesis mRNP dengan

tumorogenesis. Penelitian pembandingan terhadap pola ekspresi gen ini dengan menggunakan

jaringan tumor mengungkapkan perbedaan antara mereka yang bisa menjadi kompatibel dengan

peran yang berbeda dalam biogenesis mRNP dan relevansi dalam proses biologis lainnya.

Metode

Alat dan Bahan

Probe cDNA diperoleh dari klon cDNA dengan menggunakan PCR yang dibeli konsorsium dari

I.M.A.G.E.. Anti-THOC1 dan anti-Aly monoclonal tikus yang dibeli dari Abcam, dan reagen

sekunder yang dibeli dari Dako untuk analisis imunohistokimia (IHC).

Barisan Sel

Barisan sel kanker payudara (MCF7, SKBr-3 dan T47-D), dan MCF10-A yang dibeli dari

American Type Culture Collection dan disebarkan sesuai dengan kondisi yang

direkomendasikan oleh vendor.

Microarray Jaringan

1 mm inti jaringan diperoleh dari blok paraffin tumor yang direseksi di Rumah Sakit

Universitario Virgen del Rocío, dan kemudian disusun menjadi blok paraffin resipien. Diagnosis

patologis disediakan dalam Lampiran 1. Pengumpulan dan penggunaan bahan dari manusia telah

disetujui oleh komite etik lokal.

Analisis Real-Time Reverse Trancription-PCR Kuantitatif

RNA total diisolasi dari barisan sel payudara dengan menggunakan alat Purescript RNA isolation

(Sistem Gentra), cDNA disintesis dengan alat transcriptor first-strand cDNA synthesis (Roche)

dan real-time PCR digunakan dengan SYBR green dye pada sistem 7500 Real Time PCR dari

Biosistem terapan dengan mengikuti instruksi pabriknya. THO-UA P56 dan ALY spesifik primer

dirancang dengan menggunakan Primer Express software (urutan tersedia berdasarkan

permintaan). Gen HPRT1 digunakan sebagai kontrol endogen setelah mengevaluasi gen

housekeeping yang berbeda pada berbagai sel kanker payudara dan mengidentifikasi HPRT

sebagai kontrol internal yang paling stabil.

Immunohistokimia THOC1 dan ALY

Analisis immunohistokimia (IHC) dilakukan pada microarray jaringan dengan potongan empat

micron. Antibody monoclonal terhadap THOC1 dan ALY digunakan. Jaringan di-microwave

pada 1 mM buffer EDTA (untuk ALY) atau dengan menggunakan 4N HCl dan tripsin untuk

THOC1. Inkubasi antibody primer dilakukan selama 1 malam dengan suhu 4oC. reagen sekunder

(Dako) dipakai menurut protocol pabrik. Slides kemudian diwarnai kembali dengan hematoksilin

dan dipasang di DPX. Potongan dimana antibodi primer dihilangkan digunakan sebagai kontrol

negative. Immunostaining kemudian dievaluasi sekurang-kurangnya pada 10 lapangan

mikroskop x200 oleh dua ahli patologi anatomi yang berbeda dan sel unequivocal

immunostained dihitung. Ekspresi immunohistokimia diberikan skor sebagai kuat (>50% sel

karsinoma terwarnai) atau negative (<10%). Foto digital diambil dengan menggunakan

mikroskop Zeiss.

Analisis Statistik

Tes T berpasangan dua arah digunakan untuk menentukan apakah perbedaan antara THOC1,

ALY, dan kadar hSPT4 cDNA pada tumor dibandingkan dengan sampel normal signifikan

secara statistic. Untuk menentukan hubungan antara tingkat ekspresi ALY dengan tumor tingkat

lanjut, digunakan tes chi-square.

Hasil

Deregulasi Ekspresi THOC1 dan ALY mRNA pada Tumor

Pertama kadar mRNA dari THOC1 dan ALY pada jaringan tumor dengan hibridisasi

menggunakan Cancer Profilling Array II (Clontech) dievaluasi. THOC1, diambil sebagai faktor

yang mewakili yang bertindak pada level transkripsi seperti THO-UAP56, dan ALY, sebagai

faktor terkait yang berfungsi sebagai adaptor dalam ekspor mRNA. Kami juga menganalisis

ekpresi hSpt4, subunit faktor elongasi transkripsi manusia DSIF, [18], yang berpartisipasi pada

transkripsi awal dan tidak berkaitan dengan ekspor mRNA. Susunan tersebut mengandung

cDNA tumor yang dinormalisasi dan cocok dengan jaringan normal dari berbagai organ (sampel

154 pasang cDNA yang berasal dari 19 jaringan yang berbeda dan 3 sampai 11 jaringan pasien).

Hasil hibridisasi dan ekspresi relatif pada sampel tumor yang dihitung sebagai rasio sinyal tumor

dibandingkan dengan normal (T/N) ditunjukkan pada Gambar 1A dan Lampiran 2. Kami

mempertimbangkan kasus tersebut dimana nilai rasio T/N cDNA diluar interval 0,5-1,5 (Gambar

1B). THOC1 diekspresikan pada semua jaringan normal (Lampiran 2) dan peningkatkan yang

signifikan ditemukan pada tumor ovarium, lambung, dan paru-paru (ditandai oleh *; untuk lebih

detail lihat Lampiran 3) dengan tingkat tertinggi overekspresi di ovarium (4 kali lebih tinggi

daripada sampel normal)(Gambar 1A). Selain itu, pengurangan signifikan transkrip THOC1

secara statistik diobservasi pada tumor tiroid, testis, dan kulit, meskipun kemudian perbedaan

tersebut lebih rendah (Gambar 1). Kami telah membandingkan hasil yang kami dapatkan dengan

data SAGE (Serial Analyses at The Human Gene Expression) mengenai THOC1 yang tersedia di

human Gene Compendium GeneCard http://www.genecards.org. Data GeneCard menunjukkan

perubahan pada kadar mRNA THOC1 pada jaringan tumor dibandingkan dengan jaringan tumor,

pada semua sampel yang dianalisis; kadar yang lebih tinggi pada nodus limfe, payudara, peru-

paru, kolon, liver, pancreas, prostat, dan kulit, dan lebih rendah pada tiroid, korteks, dan

serebelum. Sebaliknya analisis kami melaporkan perubahan signifikan hanya pada bagian

jaringan yang dianalisis, seperti yang ditunjukkan di atas.

Pola ekspresi ALY dianalisis dengan susunan cDNA yang sama. Hibridisasi dengan

probe spesifik ALY mengungkapkan sinyal umum dan kuat terhadap transkrip ALY pada semua

jaringan normal yang di tes, dengan tingkat tertinggi di testis (Lampiran 2), mRNA ALY

meningkat dengan variasi tumor yang luas, sedangkan mRNA ALY tersebut tidak berkurang

secara signifikan pada beberapa jaringan (Gambar 1, Lampiran 3). Analisis SAGE juga

menunjukkan kadar mRNA ALY lebih tinggi pada sejumlah jaringan, kecuali di jaringan tiroid

dan korteks dimana pengurangan yang signifikan dijumpai.

Ekspresi faktor transkripsi hSPT4 pada tumor sama dengan jaringan normal pada hampir

semua organ yang berbeda yang diteliti (kecuali vulva, rectum, dan tiroid).

Dari analisis susunan cDNA kami dapat menyimpulkan bahwa terdapat perbedaan pola

ekspresi THOC1 dan ALY pada jaringan tumor. Bagaimanapun, mengingat jumlah perbandingan

yang dibuat (lihat Lampiran 3), kami tidak bisa mengenyampingkan bahwa pada beberapa kasus

dapat mencapai tingkat signifikansi yang dipilih secara acak. Oleh karena itu, analisis susunan

cDNA menunjukkan bahwa THOC1 diekspresikan secara berbeda pada beberapa tumor, terjadi

upregulasi atau downregulasi, sedangkan ALY diekspresikan secara berlebihan oleh tumor

dalam rentang yang luas dan hanya terjadi sedikit perubahan hSPT4 yang signifikan yang

dijumpai.

Upregulasi THO-UAP56 dan Ekspresi ALY pada sel kanker payudara

Telah dijelaskan bahwa THOC1 diekspresikan secara berlebihan pada kanker payudara [12];

bagaimanapun, kami hanya mendeteksi 3 dari 10 sampel tumor dengan kadar mRNA yang lebih

tinggi dibandingkan dengan sampel normal yang sesuai. Kami memutuskan untuk meneliti lebih

lanjut mengenai ekspresi THO dan faktor mRNAP yang lain pada kanker payudara. Kami

mengevaluasi ekspresi komponen kompleks THO manusia, THOC1, THOC2, THOC3, THOC5,

THOC6 dan THOC7, begitu juga dengan tingkat ekspresi UAP56 dan ALY pada barisan sel

kanker payudara (Gambar 2). Kadar mRNA dianalisis dengan real-time PCR pada barisan sel

tumor malignan payudara MCF7, SKBr3, dan T47-D dan dibandingkan dengan barisan sel

immortal payudara MCF10-A. peningkatan ekspresi semua komponen

Kompleks THO diobservasi pada barisan sel kanker payudara, ekspresi menjadi lebih

kuat pada SKBr3 dan T47D, barisan sel tumor payudara yang paling agresif yang dianalisis

(Gambar 2A). Menariknya, kadar mRNA THOC6 paling tinggi. Meskipun di awal, data ini dapat

menunjukkan bahwa pada beberapa kasus stoikiometri THO berubah dan menunjukkan bahwa

THOC6 dapat memainkan peran tambahan selain dari kompleks THO [19,20]. RT-PCR dari

UAP56 dan ALY menunjukkan bahwa gen ini juga diekspresikan secara berlebihan pada barisan

sel kanker payudara. Penelitian diperpanjang dengan melakukan analisis immunostaining

THOC1 dan ALY pada jaringan tumor payudara dan normal dengan tujuan untuk melihat jika

kadar protein faktor ini juga meningkat. Antibody spesifik digunakan untuk immunostain

susunan 43 sampel kanker payudara dan kontrol payudara normal. sinyal lemah terhadap protein

THOC1 terdeteksi di sitoplasma sel epithelial duktus normal dan sinyal nuclear yang kuat pada

80% sampel tumor yang dianalisis (Gambar 2B). analisis immunohistokimia dengan

menggunakan anti-ALY mengungkapkan eskpresi yang kuat dari protein ini di nucleus kelenjar

epitel pada jaringan payudara normal. Sinyal nuclear diobservasi dengan intensitas yang sama

pada 70% sampel tumor payudara yang dianalisis (Gambar 2B). Meskipun demikian, mengingat

tingkat ekspresi protein ALY yang tinggi, sensitivitas susunan ini untuk mendeteksi peningkatan

ekspresi ALY terbatas. Data ini dalam persetujuan dengan overekspresi hHPR1/THOC1

sebelumnya yang dilaporkan pada barisan sel kanker payudara [12] dan dapat menunjukkan

upregulasi ekspresi ALY pada kanker payudara, setidaknya pada kadar mRNA.

Analisis Komparatif dari protein THOC1 dan ALY dengan menggunakan suatu susunan

jaringan tumor

Kemudian, kami memutuskan untuk memperpanjang analisis komparatif antara THOC1 dan

ALY, dengan analisis menggunakan immunostaining kadar protein dan distribusi faktor ini pada

sampel tumor (Gambar 3 dan Gambar 4). Untuk tujuan ini, susunan jaringan yang disesuaikan

yang mengandung satu set sampel yang terfiksasi dengan paraffin dari tumor yang berbeda dan

jaringan normal dibuat. Susunan tersebut mengandung spesimen tumor yang mewakili dari organ

yang mana, menurut hasil analisis susunan cDNA tumor, THOC1 dan ALY dapat diharapkan

untuk deregulasi. Hal tersebut telah dilakukan dengan total 121 sampel termasuk sekitar 3

kontrol jaringan normal dan rata-rata 9 sampel mencakup tumor derajat rendah dan tinggi untuk

tiap-tiap organ yang dianalisis (untuk lebih jelas lihat Lampiran 1). Seperti yang terlihat pada

Gambar 3, pewarnaan THOC1 membuktikan bahwa gen diekspresikan pada semua jaringan

normal dengan ekspresi tertinggi di kulit dan pancreas. Sinyal yang lebih rendah terdeteksi di

lambung, kandung kemih dan testis, dan pewarnaan paling lemah terlihat pada tumor ovarium,

kolon, dan paru-paru (Gambar 3A dan 3B). Hasil kami menunjukkan bahwa THOC1 dapat

relevan dengan tumor ovarium, yang mana kadar ekspresi THOC1 tinggi pada hampir semua

karsinoma yang dianalisis (Gambar 3A dan Gambar 1). Peningkatan ekspresi protein THOC1

telah dikonfirmasi dengan western blot pada beberapa sampel normal dan tumor ovarium dan

paru-paru (Lampiran 4). Hilangnya pewarnaan protein THOC1 terlihat pada kanker testis dan

kulit, pada lebih dari 75% sampel. Pada tumor ini, sinyal nuclear menghilang dan suatu

immunoreaktivitas yang rendah terdeteksi di sitoplasma (Gambar 3). Umumnya, data protein,

meskipun IHC bukan merupakan metode kuantitaif sebenarnya, sesuai dengan hasil yang didapat

dengan hibridisasi susunan cDNA pada semua jaringan ini, kecuali tumor lambung dan tiroid

yang menunjukkan sinyal protein yang sangat sama dengan sampel normal.

Microarray jaringan menyediakan kemungkinan pewarnaan immunohistokia dalam

jumlah besar dan jaringan kanker dan normal yang bervariasi, seperti kasus protein atlas manusia

[17]. Kami telah membandingkan hasil IHC kami dengan yang didapat dari protein atlas

manusia. Pada kasus THOC1, perbandingan tersebut tidak memberikan hasil yang dapat

dipercaya, karena terdapat analisis IHC dua protein atlas (HPA019687 dan HPA019096) dengan

kesimpulan yang berbeda akibat kadar protein yang berbeda yang terdeteksi pada sampel

jaringan. Sedangkan pada sedikit kasus kanker payudara pertama, limfoma malgna, dan

melanoma dianggap cukup positif, pada kasus kedua, hanya sedikit kasus tumor paru-paru,

lambung, pancreas, dan testis. Di lain pihak, overekspresi THOC1 yang kami laporkan pada

tumor payudara dan paru-paru sesuai dengan data protein atlas dan penelitian lain sebelumnya

[12,15]. Berbeda dengan data IHC atlas, kami mendeteksi adanya overekspresi THOC1 pada

tumor ovarium dan penurunan ekspresi THOC1 pada jaringan tumor testis dan kulit (Gambar 3

dan Gambar 1). Umumnya, hasil ini memperkuat pentingnya penelitian tambahan untuk

membuktikan hubungan yang dapat dipercaya antara tumorogenisitas dan ekspresi THO.

Analisis immunohistokimia dilakukan dengan antibody spesifik anti ALY, (Gambar 4),

sinyal nuclear yang kuat terhadap protein ALY yang terdeteksi pada hampir seluruh jaringan

normal, berbeda dengan differensial jaringan immunostaining THOC1.

Menariknya, sinyal ALY ditunjukkan memiliki intensitas yang sama pada sebagian

sampel tumor seperti pada jaringan normal (pada 46 dari 94 tumor) (Gambar 4A dan Tabel 1).

Intensitas immunostaining dengan anti-ALY berkurang pada sampel tumor kolon, lambung,

tiroid, testis, dan pancreas dengan sitoplasma dan sinyal yang rendah dibandingkan dengan

sampel tumor pada hampir 50% tumor yang dianalisis (Gambar 4B).

Ketika kami membandingkan susunan IHC ALY kami dengan data IHC protein atlas

(melaporkan CAB016281 dan HPA019799, yang menunjukkan koinsidensi mendekati 90%),

menjadi bukti bahwa meskipun Protein Atlas menunjukkan bahwa ALY diekspresikan secara

tinggi pada jaringan normal dan dalam rentang tumor yang luas, pada penelitian kami sebagian

tumor menunjukkan sinyal keseluruhan yang lebih rendah dan distribusi sitoplasmik tambahan

(Gambar 4A dan Tabel 1).

Protein ALY kurang terdeteksi pada tumor derajat tinggi, tetapi paling terdeteksi pada sel

proliferative normal

Penurunan protein ALY berbeda dengan upregulasi mRNA ALY yang dijumpai setelah

hibridisasi susunan cDNA (Gambar 1). Bagaimanapun, ketika sinyal protein ALY dianalisis

pada tumor yang berbeda, jelas bahwa penurunan signifikan kadar protein ALY terjadi hanya

pada tumor derajat tinggi (pewarnaan lemah atau negative pada 35% tumor derajat rendah-20

dari 58-versus 72%-26 dari 36- pada tumor derajat tinggi)(Gambar 4A dan Tabel 1). Datum ini

menunjukkan bahwa kadar protein ALY mengalami downregulasi pada kebanyakan fase

dedifferensiasi tumor. Data IHC protein atlas ALY menunjukkan bahwa hanya sebagian kecil

sampel tumor (!3-23%) memiliki sinyal yang lebih rendah dibandingkan dengan jaringan normal

dan tidak tersedia data yang cukup untuk membuat kesimpulan tentang hubungan antara ekspresi

ALY dan derajat tumor.

Untuk mendapatkan informasi lebih lanjut tentang relevansi fisiologis penurunan ini,

ekspresi ALY dianalisis pada jaringan normal yang berbeda dengan tingkat proliferasi sel yang

tinggi atau sel yang berdifferensiasi menjadi tipe sel yang bervariasi. Seperti yang ditunjukkan

pada Gambar 5, sinyal nuclear yang kuat yang sesuai dengan protein ALY terdeteksi pada sel

trofoblas plasenta normal, pada epitel basalis dan folikel limfoid pada tonsil normal dan sel

germinal testis. Sinyal positif dijumpai pada sel yang membelah konsisten dengan ekspresi yang

tinggi yang dijumpai pada susunan cDNA.

Diskusi

Hasil kami menunjukkan bahwa ekspresi THOC1 dan ALY yang terganggu berhubungan dengan

tumorogenesis. Overekspresi THOC1 telah dikorelasikan sebelumnya dengan derajat invasive

tumor payudara, dan juga hubungan antara kadar protein pada non-small lung cancers telah

disarankan [12,15]. Penelitian ini menunjukkan bahwa tidak hanya ekspresi THOC1, tetapi juga

kompleks THO/TREX mengalami upregulasi pada sel kanker payudara. Selain itu, hubungan

baru antara ekspresi THOC1 dan tumor yang berbeda telah ditemukan. mRNA THOC1 dan

kadar protein mengalami upregulasi pada tumor ovarium dan paru-paru dan mengalami

downregulasi pada testis dan kulit. Menariknya, kami menunjukkan bahwa ALY, faktor

biogenesis mRNP yang lain sangat terdeteksi pada sel proliferative dan overekspresi dalam

rentang luas pada tumor. Pola yang berbeda dari ekspresi THOC1 dan ALY pada tumor dapat

menunjukkan relevansi yang berbeda dari tiap-tiap faktor tumorogenesis. Meskipun demikian,

karena banyak gen diekspresikan secara berbeda pada jaringan kanker dan populasi sel kanker

sangat heterogen, beberapa maksud profil ekspresi yang berhubungan dengan tumorogenesis

memerlukan penelitian lebih lanjut dan konfirmasi dengan bank tumor tambahan [16].

Data kami menunjukkan overekspresi THOC1 dan ALY secara spesifik berhubungan

dengan tumor, dan bukan konsekuensi dari metabolism dan proliferasi yang tinggi dari sel tumor,

karena perubahan pola ekspresi faktor transkripsi, seperti hSpt4 pada susunan cDNA tumor,

tidak ditemukan. Pada waktu yang sama, pola ekspresi yang berbeda dari THOC1, yang

mewakili THO, dan ALY pada jaringan normal dan tumor, menunjukkan relevansi yang berbeda

dari faktor ini dalam proses tumorogenesis. Faktanya, ekspresi yang berubah atau disfungsi RNA

yang terikat dengan protein termasuk dalam langkah metabolic pre-mRNA seperti splicing, 3’-

end formation terlibat dalam berbagai penyakit termasuk kanker, mendukung relevansi fisiologis

kontrol biogenesis mRNAP [3]. Kadar yang tinggi dari protein THOC1 dijumpai pada nucleus

tumor ovarium, dan kanker paru-paru dibandingkan dengan jaringan normal. karena penurunan

THOC1 juga berhubungan dengan beberapa kanker seperti kanker kulit dan testis, hasil ini

membantah ide bahwa ekspresi THOC1 diperlukan untuk proliferasi dan ketahanan dari

oncogene-transformed cells [21]. Karena THO memiliki peran dalam biogenesis mRNP,

mungkin umum di antara eukariotik, merupakan hal yang mungkin jika perubahan ekspresi

THOC1 dapat mempengaruhi pembentukan mRNP seperti yang dilaporkan pada ragi

sebelumnya [9,22]. Bagaimanapun, kita tidak dapat mengenyampingkan bahwa pola ekspresi

THOC1 pada beberapa tumor dapat juga berhubungan dengan peran fisiologis spesifik THO

dalam jaringan yang berbeda. Belum jelas juga apakah relevansi fisiologis sama pada jaringan

yang berbeda dan pada tahap yang perkembangan dan differensiasi yang berbeda. Dalam

pengertian ini, telah ditunjukkan bahwa THOC1 conditonal konock out mice mempengaruhi

perkembangan testis [23], dan bahwa fungsi THOC5 penting di sumsum tulang dan

hematopoiesis [24]. Oleh karena itu, tingkat ekspresi THOC1 secara potensial dapat digunakan

sebagai indicator prognostic pada tumor spesifik, tetapi bukan sebagai biomarker umum.

Kami memberikan bukti tingkat ekspresi yang tinggi dari ALY berhubungan dengan

jaringan proliferative normal dan dengan variasi yang luas dari tumor. Hal ini sesuai dengan

peran yang diusulkan mengenai ALY pada perkembangan proliferasi siklus sel [25]; telah

diusulkan bahwa ALY dapat menjadi target fisiologis dari nuclear PI3K signaling, yang

mengatur keberadaan subnukleus ALY di speckles, begitu juga dengan proliferasi sel dan

aktivitas ekspor mRNA melalui fosforilasi Akt nucleus dan hubungan fosfoinositol [25].

Meskipun hubungan antara fungsi ekspor mRNA dan proliferasi, aktivitas lain ALY dapat

berkontribusi pada tumorogenesis. Lalu, ALY juga telah diusulkan sebagai koaktivator

transkripsional penting untuk ekspresi c-myc pada leukemia yang diinduksi oleh virus dan

limfoma [26], dan homolog ragi Yral telah ditunjukkan diperlukan dalam S phase entry [27].

Merupakan hal yang menarik jika kadar mRNA ALY ditemukan pada jaringan tumor

(lihat hasil susunan cDNA), sedangkan kadar protein ALY yang rendah berhubungan dengan

tumor derajat tinggi. Mungkin jika regulasi post-transkripsi dari protein ALY terjadi pada tahap

lebih lanjut tumorogenesis. Memang, ALY diatur oleh AKT kinase, dan inhibisi fosforilasi ALY

secara substansial mengurangi proliferasi sel dan ekspor mRNA [25]. Menariknya, protein lain

yang termasuk dalam ekspor mRNA, seperti THOC1 ortolog Hpr1 ragi, dibuktikan menjadi

target ubiquitinasi [28] dan fosforilasi [29].

Menariknya, profil ekspresi ALY tampaknya sama dengan faktor ekspor mRNP terkait

lainnya, seperti UAP56/Sub2 dan NCF1/Mex67, yang secara fisik dan fungsional berinteraksi

dengan THO. Human protein atlas IHCs untuk faktor ini (CA B034012 dan CAB016327)

menunjukkan jaringan normal memperlihatkan sinyal nuclear yang kuat dan sel tumor

menampilkan immunoreaktivitas nuclear sedang sampai kuat. Malahan, sekitar 40% dan 65%

sampel tumor menunjukkan pewarnaan yang rendah dibandingkan dengan jaringan normal pada

UAP56 dan NXF1 dalam laporan IHC. Hubungan signifikan antara ekspresi ALY yang berubah

dan tumor membuka peluang ALY dapat dipertimbangkan sebagai penanda prognostic tumor

yang memungkinkan.

Kami dapat menyimpulkan bahwa perubahan ekspresi THOC1 dan ALY berhubungan

dengan tumorogenesis. Mengingat jumlah sampel yang kecil, mungkin jika untuk beberapa tes

sizeable true effect dapat tidak terdeteksi dalam penelitian ini, yang dapat menjelaskan beberapa

inkonsistensi yang jelas dengan penelitian lain. Bagaimanapun, perbedaan pola ekspresi protein

pada tumor dapat menunjukkan relevansi yang berbeda dati tiap-tiap faktor dalam

tumorogenesis. Yang penting, pola ekspresinya konsisten dengan peran fungsional protein ini

dalam biogenesis dan ekspor mRNA. Meskipun interaksi fisik dan fungsional antara faktor-

faktor ini, THO merupakan inti structural yang stabil pada sel eukariotik [5]. Faktaya,

Sub2/UAP56 dan Yra1/ALY tidak ditemukan atau hanya terdeteksi dalam sejumlah

substoikiometri dalam purifikasi kromatografi kompleks THO pada kondisi garam yang tinggi

dari ekstrak ragi, Drosophilla dan sel manusia [6,7,12]. ALY tidak stabil terkait dengan THO,

dan interaksi dimediasi oleh UAP56 dan THOC5 [30,19]. Selain itu, meskipun perekrutan

ALY/Yra1 untuk kromatin pertama kali menunjukkan tergantung kepada faktor THO dan

UAP56/Sub2 pada ragi [31], faktor lainnya seperti cap-binding protein CBP80 dan faktor

elongasi transkripsi Spt6 juga berkontribusi kepada cotranscriptional loading dari protein ALY

[32,33].

Tampaknya, Yra/ALY dapat berfungsi sebagai jembatanantara RNA binding-proteins

selama biogenesis mRNP, bertindak upstream selama transkripsi dan downstream selama ekspor

mRNA. Pola ekspresi THO dan ALY yang berbeda pada tumor konsisten dengan peran yang

dibedakan dari kedua faktor dalam ekspresi gen, untuk proliferasi sel secara tepat dan perubahan

perkembangan yang terjadi pada tumor.

Kesimpulan

Hasil ini menunjukkan hubungan differensial antara tumorogenesis dan tingkat ekspresi faktor

THO dan biogenesis mRNP ALY manusia. Penelitian kami membuka kemungkinan untuk

mendefinisikan faktor biogenesis mRNP sebagai pemeran putative dalam proliferasi dan

differensiasi del yang berkontribusi terhadap perkembangan tumor.