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  • Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und

    auf zellbiologische Aktivitäten in mesenchymalen Zellen

    Der Naturwissenschaftlichen Fakultät

    der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

    zur

    Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.

    vorgelegt von

    Gudrun Volkert

    aus Hünfeld

  • Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät

    der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

    Tag der mündlichen Prüfung: 23.11.2011 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Rainer Fink Erstberichterstatter: Prof. Dr. Robert Slany Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Karl Hilgers

  • Meinen Eltern

  • Was wir wissen, ist ein Tropfen,

    was wir nicht wissen, ein Ozean

    ISAAK NEWTON (1643-1727)

  • Inhaltsverzeichnis

    I

    Inhaltsverzeichnis

    Inhaltsverzeichnis.............................................................................................I 

    Zusammenfassung.........................................................................................VI 

    Summary ...................................................................................................... VII 

    1 Einleitung ...................................................................................................... 1 

    1.1 Aufbau und Funktion der Niere................................................................................. 1 

    1.2 Pathologische Veränderungen im Glomerulus .......................................................... 2 

    1.3 Aufbau und Funktion arterieller Gefäße.................................................................... 3 

    1.4 Pathologische Veränderungen der Gefäßwand.......................................................... 4 

    1.5 Mesenchymale Zellen in Niere und Gefäßen ............................................................ 5 

    1.5.1 Mesangiumzellen (MZ) .......................................................................................... 5 

    1.5.2 Vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMZ).................................................................. 6 

    1.6 Integrine und ihre Funktionen ................................................................................... 6 

    1.6.1 Struktur und Aufbau der Integrine......................................................................... 7 

    1.6.2 Ligandenbindung und Aktivierung der Integrine................................................... 8 

    1.6.3 Integrine und fokale Kontakte.............................................................................. 10 

    1.6.4 Integrine und das Zytoskelett ............................................................................... 11 

    1.6.5 Integrine und Matrix-Metalloproteinasen (MMP) .............................................. 13 

    1.6.6 Integrine und Connective tissue growth factor (CTGF)...................................... 13 

    1.7 Integrine der mesenchymalen Zellen....................................................................... 14 

    1.8 α8β1-Integrin ........................................................................................................... 15 

    1.9 Zielsetzung............................................................................................................... 18 

    2 Ergebnisse ................................................................................................... 19 

    2.1 Isolation und Charakterisierung von Maus-Mesangiumzellen (MMZ)................... 19 

    2.1.1 Generierung der Primärkulturen......................................................................... 19 

    2.1.2 Charakterisierung der Zellen............................................................................... 20 

  • Inhaltsverzeichnis

    II

    2.2 Etablierung eines siRNA-vermittelten transienten „knockdown“ von α8-Integrin in Ratten-Mesangiumzellen (RMZ)......................................................................... 22 

    2.3 Charakterisierung der isolierten vaskulären glatten Muskelzellen (VSMZ) aus Aorten von WT- und α8-/--Mäusen.......................................................................... 23 

    2.4 Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett........................................................... 25 

    2.4.1 Vergleichende Darstellung der F-Aktine............................................................. 25 

    2.4.2 Vergleichende immunzytochemische Darstellung der Stressfasern .................... 27 

    2.4.3 Nachweis der α-SMA Expression in mesenchymalen Zellen ............................... 29 

    2.5 Einfluss von α8-Integrin auf die Bildung fokaler Kontakte .................................... 30 

    2.6 Vergleich mesenchymaler und epithelialer Marker................................................. 33 

    2.6.1 Expression mesenchymaler und epithelialer Marker .......................................... 33 

    2.6.2 Immunzytochemische Desmin-Färbung von siRNA transfizierten RMZ ............. 34 

    2.7 Zellbiologische Untersuchungen zur Funktion von α8-Integrin.............................. 35 

    2.7.1 Einfluss von α8-Integrin auf Adhäsion und Ausbreitung..................................... 35 

    2.7.2 Einfluss von α8-Integrin auf Migration ............................................................... 36 

    2.7.2.1 Migration im Wundheilungstest (Scratch Assay) ......................................... 37 

    2.7.2.2 Migration im Barriere-Assay........................................................................ 38 

    2.7.2.3 Migration in der Boydenkammer (Boyden Chamber Assay)........................ 39 

    2.7.3 Einfluss von α8-Integrin auf das Zellüberleben................................................... 40 

    2.7.3.1 Apoptose im Caspase-3 Assay ...................................................................... 41 

    2.7.3.2 Hoechst-Apoptoseassay ................................................................................ 42 

    2.7.4 Einfluss von α8-Integrin auf das Wachstumsverhalten von Zellen...................... 44 

    2.8 Untersuchungen zur Interaktion von α8-Integrin mit seinem potentiellen Liganden Fibrillin .................................................................................................... 46 

    2.8.1 Adhäsions- und Ausbreitungsassays.................................................................... 46 

    2.8.2 Adhäsionsassay mit cRGD-Peptiden ................................................................... 48 

    2.9 Expression potentiell kompensatorischer Integrine................................................. 50 

    2.9.1 Bestimmung der RNA-Expression potentiell kompensatorischer Integrine ........ 50 

  • Inhaltsverzeichnis

    III

    2.9.2 Untersuchung zur Funktion von α2- und α6-Integrin beim Zellüberleben.......... 51 

    2.10 Einfluss von α8-Integrin auf die Matrix-Metalloproteinasen (MMP) ..................... 53 

    2.11 CTGF Expression in mesenchymalen Zellen .......................................................... 54 

    2.12 Untersuchungen des RhoA/Rho-Kinase (ROCK)-Signalwegs ............................... 55 

    3 Diskussion ................................................................................................... 58 

    3.1 Einfluss von α8-Integrin auf Zellmorphologie, Zytoskelett und fokale Kontakte .... 58 

    3.2 Die Bedeutung von α8-Integrin für zellbiologische Aktivitäten ............................. 60 

    3.2.1 Einfluss von α8-Integrin auf Adhäsion und Ausbreitung..................................... 60 

    3.2.2 Einfluss von α8-Integrin auf Zellüberleben, Proliferation und Migration .......... 61 

    3.3 Mögliche Kompensatorische Mechanismen............................................................ 63 

    3.3.1 α2- und α6-Integrin.............................................................................................. 63 

    3.3.2 Funktion von α2- und α6-Integrin beim Zellüberleben in α8-/--MMZ ................. 65 

    3.4 α8β1-Integrin und mesenchymale Marker............................................................... 66 

    3.4.1 Vermehrte Bildung von Vimentin in α8-/--MMZ .................................................. 67 

    3.5 Einfluss von α8-Integrin auf Matrix-Metalloproteinasen (MMP) ........................... 68 

    3.6 Welche Rolle spielt der Rho/ROCK–Signalweg? ................................................... 69 

    3.7 Die Interaktion von Fibrillin-1 und α8β1-Integrin .................................................. 71 

    4 Material und Methoden............................................................................. 72 

    4.1 Material.................................................................................................................... 72 

    4.1.1 Chemikalien ......................................................................................................... 72 

    4.1.2 Kits ....................................................................................................................... 74 

    4.1.3 Verbrauchsmaterialien ........................................................................................ 75 

    4.1.4 Geräte und Zubehör............................................