efecto del acido hialuronico en la cicatrizacion de...

Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 34, No. 2, 2003.

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Efecto del acido hialuronico en la cicatrizacion de heridas Recibido: 15 de octubre de 2002 Aceptado: 9 de enero de 2003 Palabras clave: AH, reepitelización, reconstitución dérmica, cicatrización de heridas. Key words: re-epittelization, dermal reconstitutions, HA, wound healing. RESUMEN: Se empleó un crudo de ácido hialurónico (AH) extraído del cordón umbilical de placentas humanas, para evaluar el efecto farmacológico de una jalea cicatrizante. Se realizó un diseño experimental con 20 ratas hembras adultas como modelo biológico. A cada una se les provocó 4 heridas en la región dorsal con un biótomo de 9 mm de diámetro, donde se aplicaron los 4 tratamientos a evaluar: control (C), placebo (P), sulfadiacina de plata (SP) y jalea de AH al 4 % (AH). Se trataron por 7 días y diariamente se observó la clínica de las heridas. Al séptimo día los animales se sacrificaron, tomándose muestras de las heridas para el estudio histopatológico por la técnica clásica de inclusión en parafina con doble tinción de hematoxilina-eosina (H-E) y la tricrómica de Masson y para un estudio de planimetría a través un software de tratamiento de imágenes. El producto evaluado (AH) evidenció una mejor respuesta respecto a los demás tratamientos del ensayo al poseer un 70 % de las muestras con heridas cerradas en la migración epitelial y poseer en la reconstitución dérmica un 50 % en grado II y un 20 % en grado III, lo que demuestra una matriz con fibras colágenas más madura que los demás. En el estudio de planimetría este tratamiento también fue el de mejor evolución con un 89.33 % de área re-epitelizada, un menor perímetro de la herida con l0.32mm y el de mayor crecimiento lineal con 5.5mm y una circularidad menor de 61.33. Se concluye que la Jalea de Acido Hialurónico al 4 % es un fármaco que contribuye a acelerar la cicatrización en el biomodelo ensayado. ABSTRACT: A hyaluronic acid (HA) crude extracted from the umbilical cord of human placentae was pharmacologically assessed as healing jelly. The experimental design used 20 adult female rats as biological model. Four wounds were made to each animal using disposable cutaneous biotomes of 9 mm. Treatments applied were: control (C), placebo (P), silver sulfadiazine (SS) and HA at 4%. Animals were treated for 7 days and there was a daily clinical control of the wounds. The product evaluated (HA) showed a better response regarding the remaining treatments with the healing of 70% of the wounds in the epithelial migration. Also it controlled the dermal renewal by 50% in the II degree and by 20% in the III degree demonstrating a matrix with collagenous fibres more mature than the rest. In the planimetry study this treatment was also of best evolution with 89.33% of re-epithelialized area, a shorter wound perimeter with 10.32 mm

and larger lineal growth with 5.5 mm and a circularity lower than 61.33. It is concluded that the hyaluronic acid jelly at 4% is a medication that contributes to hasten the healing of the biomodel assayed.

INTRODUCCIÓN

La piel constituye una barrera protectora contra el medio externo, y ante cualquier daño o lesión producida en la misma busca alguna solución para ser reparada de forma inmediata. Los eventos de la cicatrización de heridas atraviesan por diferentes pasos, siendo el proceso central la inflamación.1 Este proceso de la cicatrización de heridas es parte de la biología continua entre el estado patológico producido y la regulación de la diferenciación celular y los factores de crecimiento que regulan el desarrollo y formación del tejido nuevo. En el Centro de Histoterapia Placentaria se evalúa un nuevo medicamento: la Jalea Cicatrizante de ácido hialurónico al 4 %. Este producto contiene un crudo de glucosaminoglicanos rico en ácido hialurónico (AH) obtenido del proce-samiento de los cordones umbilicales separados de las placentas humanas recolectadas a término en los hospitales Ginecobstétricos del país según el Programa Nacional de Recogida.2

Loida Oruña Sanchez, Gabriel Coto Valdes, Guillermo Lago Mendoza Y Dayami Dorta Fernández. Centro de Histoterapia Placentaria. Carretera Novia del mediodía y Valle Grande. No. Del FAX 2041757. E-mail: [email protected]


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El AH pertenece al grupo del tipo glucosaminoglicanos, se sintetiza en la membrana del fibroblasto, célula de músculo liso vascular, células epiteliales, células endoteliales, se encuentra distribuido en los espacios extracelulares de todo el cuerpo especialmente formando parte del tejido conectivo. 3,4

Este sustancia tiene un amplio espectro terapéutico en la medicina, en ramas como oftalmología, ortopedia, etc. Existen preparaciones que tienen como principio activo el AH cuya finalidad es ejercer una acción cicatrizante, se utiliza en el tratamiento de procesos reparadores tisulares de curso clínicamente tórpido, en la evolución de úlceras varicosas, pustulares, tróficas, diabéticas; en cicatrices quirúrgicas de evolución tórpida y en quema-duras.5 Al ser la piel una barrera de defensa para cualquier daño externo del organismo, la presencia del AH como uno de sus componentes posee un papel fundamental en la reparación de cualquier herida o lesión, ya que debido a las pro-piedades que el mismo posee trata de mantener la integridad del tejido fibroconectivo. Su mecanismo de acción es a nivel celular e interviene en la migración, proliferación y diferen-ciación celular, por lo que, en los bordes del epitelio no dañado de una lesión, se produce una estimulación en la migración epitelial, regulando la relación que debe existir entre el

epitelio, y los bordes de una herida y la interacción con la matriz extra-celular. 6

El presente trabajo tiene como objetivo valorar las propiedades aceleradoras al proceso de cicatri-zación con una sal sódica de AH en forma de Jalea al 4% en heridas abiertas en piel de ratas. MATERIALES Y METODOS Se utilizaron de forma aleatoria 20 ratas hembras adultas Sprague Dawley procedentes del CENPALAP. Las mismas se some-tieron a un periodo de adaptación de 7 días en jaulas individuales con agua y alimentación ad libitum y bajo condiciones controlada de temperatura (24 º C ± 2), de humedad relativa (50 – 65 %), y con un fotoperiodo de 12h/12h ciclo de luz / oscuridad. Procedimiento experimental y tratamientos El peso inicial de las ratas fue de 200 a 250g. Se anestesiaron con pentobarbital sódico 40mg/Kg de peso corporal, depilándose la región dorso-escapular con una crema depilatoria, y se provocaron en con-diciones asépticas cuatro heridas por animal, con un biótomo cutáneo de 9 mm de diámetro,7 eliminándose el tejido celular subcutáneo con una tijera. Inmediatamente después de practicada la herida (P ó ponches) se comenzó la aplicación de los tratamientos empleados, los que fueron:

P1- Jalea al 4 % de AH, P2 - Control de evolución espontánea sin tratamiento, P3 – Placebo (Jalea base sin principio activo que posee carboximetilcelulosa, preservos y agua) y P4 - Sulfadiacina de Plata (como control positivo). Los cuatros tratamientos al cambiar de un animal a otro fueron rotados a favor de las manecillas del reloj. El número total de aplicaciones fue de 7 días, con un intervalo de 24 horas. Posteriormente se sacrificaron los animales por el método de tracción de las vértebras cervicales. Diaria-mente se controló el estado clínico de los animales así como posible infección de las heridas. Procesamiento y evaluación histopatológica A 10 de los animales se les tomó muestra de las heridas para el estudio histopatológico, realizando la fijación de la misma en formol neutro buffer al 10 % por 24 h procesándose por la técnica clásica de inclusión en Parafina, las muestras se cortaron a 5 micras de espesor, coloreándose con hema-toxilina-eosína y la coloración especial tricrómíca de Masson. Las observaciones histopatológicas se realizaron por microscopía óptica a doble ciego, a través de un microscopio Axiophot, donde se evaluó la migración epitelial y la reconstitución dérmica. A continua-ción se reflejan los aspectos con-siderados para la clasificación para ambos indicadores (Tablas 1 y 2).7

Tabla 1. Criterios considerados para la clasificación de la evolución de la migración epitelial en la cicatrización de heridas abiertas en ratas. Grados. Migración epitelial Bordes de la herida. Costra Herida. Grado I M. incompleta Los bordes no han contactado Hay abundante costra H.abierta. Grado II M. intermedia. Los bordes contactaron pero con un

epitelio muy fino. Puede o no haber costra.

H.cerrada

Grado III M. completa. Los bordes contactaron con un epitelio grueso.

No hay costra. H.cerrada.

Tabla 2. Aspectos considerados para la clasificación de la reconstitución dérmica. Reconstitución dérmica Característica


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Grado I

Predomina el tejido de granulación inmaduro, con incipiente formación de fibras colágenas distribuidas en la base de la herida, sin alinearse ni organizarse en forma de malla, pobre neovascularización. Severo infiltrado inflamatorio a células

rado II Imagen de reconstitución general de la matriz extracelular con tej de granulación sten fibras colágenas depositadas con alguna alineación

orizontal. Presencia de algunos vasos sanguíneos.

mononucleares. G ido

maduro y organizado, exih

Grado III Completa restitución de la matriz extracelular, con fibras colágenas maduras y organizadas horizontalmente en la neodermis. Algunos vasos pueden estar presentes, o pueden encontrarse colapsados por la compresión de las fibras colágenas circundantes.

amiento y evaluaci

A 9 de los animales se les cada herida despu

is de la epidpara un estudio morfométri

lanimetría. Para esto se separó

n

Procesla planimetría

ón de

tomó

se determinó dividiendo el área epitelizada de cada herida entre la media del perímetro del grupo.

heridas cerradas, al considerar la suma de la migración en Grado II y Grado III, de las mismas un 10 % ya

muestra deseparada la derm

és de ermis

co de

Procesamiento estadístico A estos valores se les aplicó un Análisis de Varianza de clasificación simple para un nivel de significación

poseían un epitelio grueso no observándose en los otros trata-mientos, el otro 60 % había contactado los bordes conside-p

dermis de epidermis colocando las muestras en una solución de bromuro de sodio al 5M a 37'C por 24 horas. Se colocó la epidermis en una hoja de papel y cada muestra fue escaneada en un equipo HEWLETT PACKARD SCANJET IIP. Las imágenes escaneada se procesaron usando un sistema de tratamiento de imágenes DIGIPAT elaborado por Eicisoft acoplado a un microscopio Axiophot, por donde, se determinó la circularidad, el perímetro de la herida y el área no epitelizada. Posteriormente fue realizado el siguiente cálculo para determinar el Area re-epitelizada (considerando como área inicial (AI) de herida 63.58 mm²) y el Crecimiento inicial

(P<0,05) y posteriormente el Test de Rango Múltiple según el STARGRAFIC sobre Windows.

Tabla 3. Influencia del ácido hialuróniratas Sprague Dawley.

Tratamiento Migración epitel

RESULTADOS Y DISCUSIÓN En las observaciones clínicas diarias no hubo alteración en el comportamiento de los animales, ni se evidenció complicaciones en las eridas por la presencia de infección h

secundaria teniendo una evoluciótisfactoria el ensayo. sa

Resultados histopatológicos Estos resultados mostraron que el tratamiento correspondiente a la Jalea de AH al 4 % obtuvo la mejor respuesta en el análisis de la migración epitelial con un 70 % de

rándose herida cerrada, pero el epitelio era delgado. El tratamiento que le siguió en orden de respuesta positiva fue el placebo con un 40 % de herida cerrada en Grado II, aunque el epitelio era fino o delgado aún, le sigue el tratamiento control con un 37.5 % con una respuesta practicamente similar, seguido por último de la sulfadiacina de plata con un 25 % todos en Grado II. Como se evidencia el peor comportamiento fue para éste tratamiento de sulfadiacina de plata con un 75 % de herida abierta en Grado I seguido de igual forma por el control con un 62,5 % en Grado I también (Tabla 3).

co en la migración epitelial y reconstitución dérmica en heridas abiertas en

ial Reconstitución dérmica en %

Grado I. H. abierta

G

H. ceEpi. Fino Epi. Grueso

III rado II rrada

Grado III H. cerrada

Grado I Grado II Grado

Control 62.5 37.5 0.0 50.0 50.0 0.0 Placebo 60.0 40.0 0.0 60.0 40.0 0.0 Sulfadiacina 75.0 25.0 0.0 62.5 37.5 12.5

de H

10.0 .0 Jalea al 4 % A

30.0 60.0 30.0 50.0 20

Est esultados se debe eme l AH ron, 8,9,10 basa ismo de acción a nivel celular e interviene en la migraproli y difer ión celu iéndose a una moléculafibronectina, produciendo una estimu de la mig n epitelial, ebord por una , y de est a forma, rela rel x ntre el ep de los bo de una herida

int ión con la matriz extracelular. Es por eso que se considera al AH o uno de los factores que regulan la cicatrización epitelial,8,11,12,13 así

como participa en la diferenciación celul os querat itos durante la reepitelización. 14

D el p de vista histo gico se a, como el tratam la Jal 4 % de AH, fue el de menor porcentaje en Grado I de reconstitución dérmica con un 30

os r n posibl nte a que e como señala su mecan ción, feración enciac lar un de

lación ració n los es del epitelio no dación que debe eeracc

añadoistir e

lesiónitelio

a mismrdes

gula , y

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%, y solamente poseía una incipiente formación de fibras colágenas sin organizarse, predominando el tejido de granulación. Sin embargo en este grado se encontraban el de mayor porcentaje de la respuesta correspondiente a los otros tratamientos siendo para la sulfadiacina un 62.5 %, placebo con un 60 % y el control con un 50 %. En el grado II de reconstitución dérmica se comportó con 50 % el con-trol y la jalea al 4 % de AH con la presencia de una imagen general de reconstitución de toda la matriz extracelular conteniendo fibras colágenas depositadas con alguna alineación, y presencia de tejido de granulación. La jalea de AH obtuvo un 20 % en grado III de reconstitución dérmica

fibras colágenas maduras y organiza-das horizontalmente, no hay presencia de anejos etc ( Fig. 1 ). En esta figura se observa como contactaron los bordes de la herida y hubo una reepitelización completa, el epitelio es grueso, así como existe un

ente.

bos

% de AH en

pidermis cerrando la herida,

Tabla 4. Efecto del Acido Hialurónico en la cicatrización de heridas abiertas. tratada de ratas.

lo que demuestra que fue el tratamiento con mejor comportamiento en cuanto a la madurez de la matriz extracelular por encontrarse la misma con una completa restitución, mostrando una dermis bien formada con

completa restitución de la matriz extracelular, con fibras colágenas organizadas horizontalm El control (Fig. 2) y el placebo se comportaron de manera similar. A pesar de que el tratamiento de la sulfadiacina de plata posee un 12,5 % de respuesta en Grado III como valoración general, fue el que peor comportamiento reflejó para amindicadores evaluados. En esta figura se puede apreciar como los bordes epiteliales no han contactado, por lo tanto la herida esta abierta, hay presencia tejido de granu-lación. La respuesta alcanzada en el trata-miento de Jalea al 4 cuanto a la maduración de la matriz extracelular se debe a que en el pro-ceso de cicatrización de heridas, lo que primero contacta son los bordes de la eocurriendo así la reepitelización como respuesta para restaurar las propieda-des de barrera de la piel, pero el proceso de madurez de la dermis es más lento y puede demorar hasta incluso un año en restablecer las características histológicas definitiva de ser una masa de colágeno acelular, pálida, sin resistencia mecánica. 1,15,16,17,18 También al ser el AH un componente mayoritario de la matriz extracelular y posee la capacidad de absorber grandes cantidades de agua en el espacio intercelular logra mantener las células unidas en una matriz gelatinosa, 11,19 Por otro lado, por ser un elemento producido por los fibroblastos, al aplicarse exógenamen-te, acelera o potencializa el proceso de formación de matriz extracelular, y del proceso de formación de las fibras elásticas, donde juega un importante papel, contribuyendo así a la síntesis del colágeno. El papel que juega el AH en la angiogénesis, morfogénesis, remodelación del tejido y el mantenimiento de la arquitectura del mismo lo han reportado diferentes autores. 1, 13, 20, 21

Resultados de la Planimetría en la piel

Figura 1. Influencia del AH en la migración epitelial y de regeneración dérmica con Grado III en heridas abiertas en la piel de ratas. (250x. Tinción tricrómica de Masson.).

Fig. 2. Evolución espontánea (control) con Grado I de la migración epitelial y de reconstitución dérmica en heridas abiertas en la piel de ratas.. (40x. Tinción tricrómica de Masson.).

ARE ± E.S Tratamientos P±E.S Mm2 % CL± E.S C± E.S Control 21.07± 2.06 a 42.91± 2.60 a 67.48 a 2.03 0.14 a 78.11± 4.67 a ±


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Placebo 18.26± 2.06 a 43.02± 2.60 a 67.66 a 2.34± 0.14 a 76.33± 6.36 a Sulfadiacina 22.78± 2.19 a 37.70± 2.75 a 59.29 a 1.65± 0.15 ab 75.87± 6.08 a Jalea 4 %AH 10.32± 2.06* b 56.80± 2.60 *b 89.33 *b 5.5± 0.14 *c 61.33±23.7 b

* p< 0.05 , a / b/ c p< 0.05 R de la de l S alo

rminaron n cada ponche. Perímetro (P en m), Area Re-epitelizada (A.RE en

2

gni

de en nu s. 2

La istent epr in dcrecimiento epidérmico o EGF), y el AH, se expone en un modelo experimental in vivo mostrando que el EGF, estimula la síntesis de

26

é l obje-rtici eso de del una oduc consi-

derable comienzan a disminuir estas concentraciones plasmáticas. Por lo que se demostró que este proceso se

002 E., Karakiu-

usalakis G.,

esultados s evaluacionesa planimetríae muestran v res de medias

da uno de con el error estándar de calos parámetros que se deteemmm ) ,Crecimiento Lineal (C.L en mm) y Circularidad (C en unidades arbitrarias). a,b,c difieren si fica-tivamente para (p<0.05) Test de Rangos Múltiples. La jalea al 4 % de AH mostró el mejor valor del crecimiento lineal el que fue de 5.5 mm lo que refleja una mejor linealidad de los bordes del epitelio de la herida y un menor perímetro con 10.32 mm y menor circularidad con 61.33 respecto a los demás tratamientos existiendo dife-rencias estadísticas a favor de la Jalea al 4 % de AH, lo que evidencia que todos los indicadores evolu-cionaron favorablemente hacia la reparación de la herida, demos-trándose al obtener un área re-epitelizada de 56.80 mm2 para un 89.33 %. El resto de los tratamientos no tuvieron diferencias significativas entre ellos, no obstante al valorar los resultados del tratamiento de la sulfadiacina de plata, se observa una menor área re-epitelizada y un menor crecimiento lineal respecto a los demás tratamientos, a pesar de no mostrar diferencias significativas estadísticas, con el resto de los valores correspondientes al control y placebo. Estos resultados de la planimetría coinciden con los de las evalua-ciones histopatológicas, manifes-tando una correspondencia propor-cional para ambos estudios en el tratamiento de la Jalea de AH al 4%, al observar una respuesta repa-radora, en el proceso de cica-trización de heridas abiertas por ponches superior al resto de los tratamientos, coincidiendo con los resultados informados en otros ensayos realizados por este diseño

hialurónico en los queratinocitos dela rata, observándose una elongación y migración de estas células, y un incremento del AH en las vesículas perinucleales de las mismas. Resultados similares se encontraron en estudios in vitro de cicatrización de herida.23 Los resultados obtenidos experi-mentalmente en este estudio coinciden con las consideraciones hechas por la literatura24, donde se presentan resultados de cicatrización completa de heridas, empleando como uno de sus tratamientos membranas que contenían AH esterificado estéril. A su vez se refiere por la literatura que la participación activa del AH en la cicatrización de heridas, se debe a que existen receptores potenciales en la epidermis para el mismo24,25,26 por otro lado, se

experimento estro paí 2 quemaduras t relación ex e entre l tivo de paoducto Heberm (Factor e reparación

que se pr

ha reportado, que al emplearlo en forma de Gel, (forma farmacéutica similar al evaluado en este trabajo), en heridas bilaterales de la mucosa del oído medio, ob-tuvieron una cicatrización completa con una recuperación auditiva, muy superior a otros tratamientos usados sin AH. De acuerdo con estos resultados logrados en este trabajo, y los infor-mados por la literatura, se considera que el AH posee propiedades aceleradoras al proceso de cicatri-zación, coincidiendo con lo citado por la literatura27 quienes en post-operaciones obtuvieron una signifi-cativa aceleración del tejido de granulación, así como su sustitución por fibras colágenas bien alineadas en los inicios y una angiogénesis acelerada, Todo el efecto expuesto se demostró al aumentar los niveles plasmáticos de AH después de

rmicas,28 con epar en el proc daño tisular, ye una mejoría

acelera si el AH es suministrado exógenamente ya que se describe que la aplicación tópica de este producto modula exógenamente los niveles en piel de AH.29 Es por eso que hay autores que consideran al AH como un biopolínero de muy disímil uso terapéutico, debido a su versatilidad y ubicuidad, lo que hace que no intervenga en un solo evento en el proceso de la cicatrización, sino que interviene en numerosos eventos, en que está involucrada la cascada de la cicatrización epidérmica o tisular. 30,31 CONCLUSIONES Se demuestra que la Jalea al 4 % tiene propiedades aceleradoras al proceso de cicatrización. Se comprueba que la sulfadiacina de plata brinda una protección anti-microbiana pero no ejerce acción cicatrizante. BIBLIOGRAFIA 1. Davidson J. and Benm S.

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