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  • Biomaterials Research (2013) 17(1) : 20-25

    20

    Biomaterials

    Research

    C The Korean Society for Biomaterials

    생분해성 고분자 조성에 따른 스텐트 코팅용 필름의 약물 방출 특성 및 평활근

    세포 증식 억제 효율 분석

    Drug Release Behavior and Anti-smooth Muscle Cell Proliferation Property of Stent Coating Film Regulated by Biodegradable Polymer Composition

    민대홍 1 ·박태현

    1 ·이동기

    2 ·나 건

    1 *

    Daehong Min1, Taehyun Park1, Dong Ki Lee2, and Kun Na1*

    1420-743 경기도 부천시 원미구 지봉로 43 가톨릭대학교 생명공학과 2135-720 서울 강남구 언주로 211 연세대학교 의과대학 강남 세브란스병원 내과학교실 1Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, 43 Jibong-ro, Wonmi-gu, Bucheon-si, Gyeonggi-do 420-743, Korea 2Department of internal medicine, Gangnam Severance Hospital, Yonsei University, College of Medicine, 211 Eonjuro, Gangnam-gu, Seoul 135-720, Korea (Received January 20/Acccepted February 12, 2013)

    The drug-eluting stent coating film (PTX-Eluting PTFE film) was investigated by using poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) and poly L-lactic acid (PLLA) via dip coating technique and characterized by thickness, drug eluting test, contact angle, proliferation of smooth muscle cell (SMC). The thickness of the films in ranged from 0.039 µm to 0.045 µm according to the composition of PLGA and PLLA. The sustained release behavior of paclitaxel (PTX) was observed for 65 days at PLGA:PLLA (3:7) film. The surface degradation behavior of the film exposed for 65 days in PBS buffer depends on the ration of PLLA. For monitoring of restenosis, the attachment and proliferation of SMC on the film was observed by fluorescence microscopy. The attachment and proliferation of SMC increase with increasing of PLLA content. It means that the hydrophilic property of the film surface leads to suppress the attachment and proliferation of SMC.

    Key words: drug-eluting stent, PTFE, PLGA, PLLA, restenosis

    서 론

    n-stent restenosis (ISR)1)은 스텐트 시술 후 발생되는 혈관

    신생 내막의 과다 증식(neointimal hyperplasia)2) 및 혈전 형

    성 3,4) 에 의한 혈관 재협착 현상5)으로 일반 환자의 경우 20~

    30%, 당뇨 환자의 경우 30~60% 의 빈도로 나타난다.6) 이

    중 신생 내막의 과다 증식은 스텐트 시술로 인한 혈관의 중막

    혹은 외막에서 기원하는 평활근 세포(smooth muscle cell,

    SMC) 의 형질 변형과 내막 쪽으로의 이동으로부터 유도되는

    것으로 알려져 있다.7)

    현재까지 소수성 항암제인 Paclitaxel (PTX)를 이용한 약물

    방출 스텐트(Drug-Eluting Stent, DES)는 혈관 SMC의 증식을

    억제시키기 위한 효과적 방법으로 알려져 있다.8) PTX는

    Microtuble이 tubulin으로 depolymerization이 되는 것을 차단

    함으로써, 세포 분열주기를 G2-M기에 머물게 하여 세포의 증

    식을 억제하고 최종적으로 세포 사멸(apoptosis)을 일으키는 약

    물이다.9) 그러나 기존에 사용화된 약물 방출 스텐트는 PTX에

    대하여 급격한 초기 방출 및 완전 방출에 한계를 보여왔다. 이

    에 따라 효과적인 약물 방출과 SMC의 과다증식으로 인한 ISR

    을 방지하기 위해 생분해성 고분자를 이용하여 스텐트 표면을

    코팅하는 연구가 활발히 진행 되어왔다.10-12)

    기존의 연구에서는 스텐트 표면 코팅을 위해 사용한 생분해

    성 고분자로 poly-L-lactic acid (PLLA), poly-D,L-lactic acid

    (PDLA), poly-(caprolactones) (PCL)와 polyglycolic acid (PGA),

    poly-DL-lactide-co-glycolide (PLGA) 등의 Polyester가 사용되

    었다.13-15) 이에 관하여 Kytai T. Nguyen 등은 Poly(l-lactic acid)

    (PLLA)로 구성된 스텐트에 약물을 봉입한 결과, 약물 방출 및

    SMC 증식 억제에 효과가 있는 것으로 보고하였다.16) 또한 Y.

    J. Weng 등은 poly-DL-lactide-co-glycolide (PLGA)를 이용하

    였을 때 스텐트 표면이 매끄러운 형태의 표면을 확인하였고,17)

    Xinhua Xu 등은 PLGA의 조성에 따라 약물의 방출 특성이

    달라지는 것을 확인하였다.18)*책임연락저자: kna6997@catholic.ac.kr

    I

  • 생분해성 고분자 조성에 따른 스텐트 코팅용 필름의 약물 방출 특성 및 평활근 세포 증식 억제 효율 분석 21

    Vol. 17, No. 1

    그러나, 이러한 생분해성 고분자의 조성 및 그에 따른 표면

    물성이 약물 방출과 SMC의 증식에 미치는 영향은 잘 알려지

    지 않았다. 이에 본 연구에서는 서방용출형 스텐트 코팅용 필

    름을 제작하여 혈관계 스텐트의 가장 큰 문제점인 재협착 또

    는 혈전 생성을 억제하는 방법을 모색하기 위해 이전의 연구

    에서 ISR 방지와 서방적인 약물 방출 효과를 나타낸 생분해성

    고분자인 PLLA와 PLGA를 혼합하여 그의 조성에 따른 스텐트

    코팅용 필름의 특성 변화를 알아보고자 하였다. PLLA와 PLGA

    의 조성에 따른 스텐트 코팅용 PTFE 필름을 담금법(Dip

    coating technique)19)을 이용하여 제작하고 PTX를 봉입한 후,

    각 PTFE 필름의 코팅 층 두께와 표면의 물리화학적 특성을

    확인하고, 각각의 약물 방출 특성과 필름 표면의 SMC 부착능

    및 증식 억제 정도를 확인하여, 서방적인 약물 방출과 SMC

    증식억제의 효과적인 생분해성 고분자의 비율을 알아보았다.

    재료 및 방법

    Paclitaxel (PTX)은 삼양제넥스㈜ (대전, 대한민국)로부터 구매

    하였으며, Poly (DL-lactide-co-glycolide) (PLA:PGA, 5:5, PLGA,

    RESOMER, RG502H), Poly(L-lactic acid) (PLLA, Mw: 209,000

    g/mol)는 Boehringer Ingeherim Corp. (Ingelheim am Rhein,

    Germany)에서 구매하였다. Tetrahydrofuran (THF)는 Junsei

    Chemical Corp. (Tokyo, Japan)에서 구매하였으며, Polytetra-

    fluoroethylene (PTFE) 필름은 태웅메디칼㈜ (김포, 대한민국)로

    부터 제공받았다.

    PLGA와 PLLA로 코팅된 PTFE 필름의 제조 및 PTX 봉입

    20 mg의 PTX를 5 ml의 THF에 녹인 후 총량 3% (w/v) 의

    PLGA와 PLLA를 각각 7:3, 5:5, 3:7의 비율로 (w/w) THF에

    넣어 고르게 교반하였다. 이 용액에 PTFE 필름을 담금법(dip

    coating technique)을 이용하여 코팅한 후 상온에서 1시간 동

    안 건조하는 과정을 3회 반복 하였다. 필름에 코팅되는 약물

    의 양은 필름에 묻는 용액의 양을 이용하여 환산하였다. 제조

    된 필름의 두께는 마이크로미터기(Micrometer, Mitutoyo Corp.,

    Japan) 를 이용하여 측정하였다.

    고분자 조성에 따른 PTX 방출 특성

    PLGA 와 PLLA 조성에 따른 PTX의 방출 거동을 분석하기

    위해서 0.1% 의 Tween20을 포함하는 2 ml의 0.01 M, pH

    7.4 의 PBS (phosphate buffered saline) 용액에 필름을 넣은

    후 shaking water bath(온도 37oC, 50 rpm) 에서 약물방출

    실험을 진행하였다. 버퍼 용액은 계획된 기간마다 교체하였으며

    방출된 약물은 High performance Liquid Chromatography

    with UV detector (HPLC-UV, Waters Corp., Massachusetts,

    USA) 를 통해 acetonitrile과 H2O를 65:35 비율로 섞은 이동

    상을 이용하여 C18 column을 통해 227 nm 파장에서 UV 흡

    광도를 측정하여 정량하였다.20)

    표면 분해 성질 분석

    PLGA 와 PLLA 조성에 따른 필름 표면 변화는 각각의 0,

    10, 30, 60 일간 약물이 방출된 필름을 각각 12시간 동안 실온

    에서 완전히 건조하여 15 mA의 전류 조건에서 60 초 동안 백

    금(platinum) 코팅하고 주사전자현미경(FE-SEM, S4800, Hitachi,

    Ltd.) 으로 관찰하였으며 무작위적으로 이미지화 하였다.

    PLGA와 PLLA 로 코팅된 PTFE 필름의 물리적 표면성질

    변화

    PLGA 와 PLLA의 조성에 따른 PTX-Eluting PTFE 필름의 물

    리적 표면성질 변화를 확인하기 위하여 각 필름 위에 10 µl의

    증류수를 떨어뜨린 후 접촉각 측정기(Phoenix 300 touch, Sur-

    face Electro Optics) 를 이용하여 수화 접촉각(contact angle,

    θ)을 측정하였다.

    고분자 조성에 따른 평활근 세포의 필름 부착능 및 SMC

    증식억제 여부

    필름 표면 성질에 따른 평활근 세포(smooth muscle cell,

    SMC) (한국 세포주 은행) 의 부착능을 알아보기 위해, 각각의 필

    름을 자외선을 이용하여 clean bench에서 30분 간 멸균 한 후

    10%의 FBS와 0.1%의 antibiotics를 포함한 Dulbecco's mod-

    ified Eagle's medium (DMEM) 배지 조건에서 1 × 105 의 SMC

    를 필름 위에 seeding하고 1일간 incubator (5% CO2, 37.5 oC)

    에서 배양한 후 DPBS를 이용하여 2회 washing 하였다. 최종적

    으로 세포부착여부는 Live & Dead assay kit (Invitrogen,

    Eugene, USA)를 이용하여 세포를 염색하고 형광현미경(Carl

    zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 관찰하였다. 또한, 증식억제

    여부는 SMC를 필름 위에서 7일간 배양한 후 동일한 방법으로

    확인하였으며 배양간 세포의 과증식 방지 및 영양분

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