Testarea ADN in scop de identificare si cercetarea filiatiei biologicesuport de curs pentru studenti Testarea ADNin scop de identificare si cercetarea filiatiei biologice - Note de curs - Autor: Dr. Ligia Barbarii,medic primar legist, Sef Laborator GeneticaINML Mina Minovici, Bucuresti 1.Introducere 2.Pricipiile geneticii clasice care stau la baza testarii ADN inscop de identificare3.Definirea termenului de profil ADN 4.Impactul identificarilor ADN in medicina, justitie si alte domenii ale vietii sociale 5.Structura si funciile ADN.6.Markerii ADN utilizati curent in testarea identitatii umane 7.Etapele unei analize ADN.8.Testele ADN n cercetarea filiaiei biologice9.Interpretarea rezultatelor unei investigatii ADN10.Markerii speciali folositi in genetica judiciara11.Bazele de date ADN12.Standardele de analiza in testarea ADN 1. Introducere. Genetica moleculara remodeleaza in prezent viata omului, fiind una dintre stiintele care contribuiedecisivlaformareaspirituluiomuluimodern.Civilizatiageneidechidenoidomeniidecercetarealtor stiinte, dar tinde totodata sa rastoarne intregul nostru sistem de valori social. Pe masura validarii performantelor si robustetii lor, testele ADN au fost larg imbratisate de comunitatea stiintifica si juridica din intreaga lume, tendinta care s-a accentuat mult in ultimii ani. Lucrurile au evoluat mai repede dectapreciauchiarsicei maioptimitidintrepartizaniiipromotoriiinvestigaiilorgenetice, iarceeace mulinu credeaucuputins-arealizat:testeleADNaudevenituninstrumentfrrivalalinvestigatiilormedico-legalei poliieneti. La toate acestea, a contribuit desigur intr-un mod decisiv si finalizarea in 2001 a proiectului Genomul Uman, care a generat o uimitoare cantitate de informatie stiintifica despre materialul ereditar al speciei noastre. Pe masura ce tehnologiile de analiza genetica se imbunatatesc si sunt utilizate pe scara larga, se ridica foarteacutiintrebariserioasedesprelibertatilecivilesaudreptullaintimitatealuneipersoaneisupusaunei investigatii genetice. De altfel, este binecunoscut faptul ca cercetarea tiinific a strnit controverse si in alte epoci decatceamoderna,insalegitimnrezolvareaacesteiecuatiiaconflictelordeschiseintreoameniidestintasi societate, trebuie s fie asigurarea libertii individului i reprimarea primejdiei de a o submina. 2.PrincipiilegeneticiiclasicecarestaulabazatestariiADNinscopdeidentificare.Identitatea concentreaza in sine toate insusirile unui obiect, fenomen sau fiinta.Sespunecaunsubiectumanpoatefiidentificatatuncicndelpoatefidistinsdintr-ungrupdesubieci avnd caracterstici similare. Caracteristicile identificatoare pot fi reprezentate de: culoarea pielii, ochilor sau parului, grupele de sange, markeri ADN, etc. Caracteristicile identificatoare trebuie sa fie: constante in timp - cu cat stabilitatea lor este mai mare cu atat creste valoarea lor pentru identificare in numar suficient de mare - stabilitrea identitatii, necesita de regula precizarea mai multor caracteristici. Individualitateaumanaestedeci mai intaide toate,o individualitategenetica,desiomul inansambulsau este produsul interactiunii permanente dintre ereditate si mediu.Fiecarefintaumanaianasteresisedezvoltadintr-ocelulaou,cereunesteinproportiiegalezestrea ereditara a celor doi parinti, numiti si genitori. De la stadiul de celula ou pana la completa sa desavarsire biologica, ofiintaumanareprezintaoconfiguratiegeneticanoua,unica,irepetabilasiconstantaintimp. Titlulde unicatal fiecarui univers genetic uman nu este contrazis pna n prezent dect de gemenii monozigoi.Identificareajudiciarareprezintaometodauniversaladestabilireaadevaruluiinprocesulcunoasterii judiciare. Identificarea genetica, la fel ca si cea criminalistica sau medico-legala, este parte integranta a identificarii judiciare, avand valoare probanta. Valoareauneimetodedeidentificarerezidnabilitateaexpertuluideacomparaurmelelsatelalocul fapteicucelegsitepealtematerialesauprobedereferinta.Sepotastfelcompara:ghinturileuneiarmecu amprentele lasate pe un cartus, tipul de drog depistat la traficanti, cu cea consumata de persoanele dependente, urmele descoperite la locul crimei, cu cele ale suspectului si al victimei, etc. De la amprentele digitale la amprentele genetice. Drumul cercetarii individualitatii umane a fost deschis lasfarsitulsecoluluiXIXdeamprenteledigitale,insusirifenotipicecudeterminismmultifactorial,poligenicside mediu,urmateintimp,deantigenelespecificedegrup,sangvinesitisulare,pentruavizainprezentmaterialul genetic al speciei umane - molecula de ADN. TehnologiiledeanalizaADNinscopdeidentificaresuntinprezentacceptatefaraexceptieinmedicinasisistemelejuridicedin aproape intreaga lume. In acest context, genetica moderna si-a definit in cadrul ei o noua disciplina - genetica judiciara axata in principal pe investigarea in scop de identificare a genotipurilor umane, dar si a celor animale sau vegetale. Testarea ADN in scop de identificare si cercetarea filiatiei biologicesuport de curs pentru studenti Incepand cu 1880, amprentele digitale, descrise de antropologul britanic Sir Francis Galton au fost utilizate sistematic in justitiasiarmatatariloranglo-saxone.LainceputdesecolXX,descoperireagrupelordesangeABOdectreLandsteinera deschis o nou er n domeniulidentificrilor. Dupa 1950, laboratoarele de serologie judiciara au testat un numr tot mai mare de grupe sangvine, pentru a culmina in anii 70 cu analiza complexului major de histocompatibilitate (HLA). MuncadepionieratnaplicareatehnicilorADNnjustiieaparinegeneticianuluiAlecJeffreys,incununat pentru descoperirea sa cu premiul Nobel i nobilat cu titlul de Sir pentru serviciile justitiei britanice. In 1985, n timp ce efectua cercetri privind gena mioglobinei umane, echipa de cercettori condus de Jeffreys a remarcat o serie departicularitistructuralealemoleculeiADN.Jeffreysaaprofundatcercetrileprivitoarelaacestetrsturi particulare i a demonstrat c ele sunt unice, irepetabile, proprii fiecrei persoane, exceptnd gemenii monozigoi.Jeffreys a reuit s demonstreze justiiei britanice valoarea descoperirii sale: primele testari ADN au condus larezolvareaunorcazurideimigraie,iarin1986,larezolvareaprimuluicazpenal,respectivaunuicazde omucidere, prin incriminarea lui Collin Pitchfork ca autor al unui dublu asasinat. IntroducereatestarilorADNinsistemuljuridicafostlargdezbatuta.ChiarFBI,ceamaimareageniede investigaiiamerican,arefuzatlanceputspracticeastfeldeteste,primeletesteADNdeidentificarefiind realizate n laboratoare private. n scurt timp insa, agentia americana i-a schimbat radical concepia, constituindu-i propriile sale reele de laboratoare si echipe de experti.InRomania,primullaboratordegeneticajudiciaraaluatfiintaincadrulInsitutuluiNationaldeMedicina Legala Mina Minovici din Bucuresti, in anul 1998.3. Definirea termenului de profil ADN. Testarea ADN in scop de identificare este cunoscuta sub numele de tipare ADN, genotipare ADN, profil ADN sau test de identificare ADN.Profilul ADN se defineste ca fiind totalitatea acelor caracteristici structurale ale materialului genetic care permit identificarea unui individ.Desifoartelargutilizat,termenuldeamprentageneticanudefinestetocmaicorectacesttipdeanaliza. Aceastasintagma,afostcreataoperndu-seoanalogientremultitudineadebenziobtinuteprinanalizade genotipare i multitudinea desenelor liniare ce alctuiesc o amprent digital. Desi sugestiva, analogia este forat intrucat, cei doi termeni, amprenta digital i amprenta genetic nu au n comun dect capacitatea de a reflecta una dintre trsturile fundamentale ale fiinelor vii, i anume unicitatea lor biologic.Amprenta genetica Amprenta digitala vs Termenuldeamprentgenetics-aimpussubaceastformncontiinapublicului,insainprezent,in literatura medical de specialitate i n limbajulul juridic se foloseste aproape exclusiv termenul de profil ADN.1.4. Impactul identificrilor genetice in justiie, medicina si alte domenii ale vietii sociale. AplicabilitateatestuluiADNnsferajustiieiestefoartelarg.PotentialultestelorADNdeaexclude suspectii intr-o ancheta politieneasca, mai ales in cazurile de viol sau omor, este un castig enorm daca il comparam cu cel al testelor conventionale (de grup sangvin). Agresiuni sexuale. Din totalul testelor ADN solicitate pentru diverse infractiuni, ponderea cea mai mare o detincazuriledeagresiunesexuala.TestareaADNpermiteidentificareacucertitudineaagresoruluisexualprin analiza genetica a celulelor spermatice de pe un tampon cu secretie vaginala prelevat de la victima. Profilul obtinut din proba este comparat cu profilul de referinta al persoanelor aflate pe lista suspectilor.Omoruri.IncazuriledeomortestareaADNsefaceporninddelaurmelebiologicerecoltatedelalocul faptei:petedesange,salivasausperma,firedepar,microurmedecontact(celuleepitelialedescuamatedepe tegumente la contactul cu diferite suprafete sau obiecte: maner usa, intrerupator lumina, instrumente, bani, etc.).Accidente rutiere. Testele genetice pot servi la identificarea unui vehicul intr-un accident rutier soldat cu victimeumane,maialesatuncicandautorulaccidentuluiparasesteloculfaptei.Inacestecazuri,profileleADN evidentiatedepecaroseriamasiniisuntcomparatecuprofiluldereferintaalvictimei.Dacaprofilelecorespund, atuncisepoatestabili cu maximacertitutdineca vehicululrespectiva fostimplicatintr-unaccident.Totprinteste ADN se pot stabili cu exactitate pozitiile ocupate de sofer si pasageri la momentul producerii unui accident.Identificareacadavrelornecunoscute.Pentruanalizageneticasefolosescatattesuturimoiindiferite stadiidedegradare,catsitesutosos.Dacaidentitateacadavruluiesteprezumata,solutiaidentificariirezulta PolitiabritanicadinregiuneaMidlandsanchetaomoruladouatinereagresatesexuallaintervaldetreiani,existanduneleindiciic autoruleraunlocalniccuvrstacuprinsntre17-34deani.Subpretextulunuistudiupopulationalpentrudepistareauneimaladii,s-a prelevat sange de la toti brbaii din regiune care se ncadrau n aceste limite de vrst. Profilul ADN al unuia dintre donatori, respectiv al lui Collin Pitchfork, s-a dovedit a fi identic cu profilul obinut prin analiza probei de sperm recoltat de pe corpul uneia dintre victime. Criminalul i-a mrturisit ulterior faptele i a fost condamnat. RezultatulprimeloranalizeefectuatedeJeffreysera reprezentat de un set complex de fragmente de ADN, care se asemna codului de barenscris peambalajul produselordin supermarket.Cercettorulbritanicadatnumeleacestor produidereactieamprentegenetice,utiliznduntermen descriptivcarefceaoanalogientremultitudineadebenzi ADNimultitudineadesenelorliniarecealctuiesco amprentdigital.DescoperirealuiAlecJeffreysafostlarg mediatizat n anii 90 sub numele de amprent genetic.Testarea ADN in scop de identificare si cercetarea filiatiei biologicesuport de curs pentru studenti frecventinurmacercetariirelatieideinrudirebiologicaapersoaneiacareiidentitateesteprezumatacudiferiti membri ai familiei.Aplicatiiindomeniulmilitar.RealizandperformantelesiimportantatestelorADNinidentificarilede persoane, armatele SUA si statelor NATO au initiat incepand de la mijlocul anilor 90, programe ample de colectare de probe biologice pentru tipare ADN de la toti angajatii si militarii in termen, dupa modelul programului de colectare a amprentelor digitale initiat cu decenii in urma .Aplicatiiinmedicina.Testarileservesclaidentificareaprobelorbiologiceincazurileincarese suspicioneaza erori accidentale de etichetare a probelor (la momentul recoltarii acestora) sau schimburi accidentale de probe in etapele de analiza de laborator. De asemenea, analizele genetice cu markeri de tip STR reprezinta un instrumentdelucrucurentinapreciereaevolutieipacientilorcareaubeneficiatdetransplantemedulare(analiza chimerismului sangvin).Cercetarea relatiilor de inrudire biologica. Reprezinta un domeniu in expansiune datorita dezvoltarii de tehniciperformantedeanalizagenetica.Inprezent,inStateleUniteaproximativ300000demiidecazuride paternitate sunt rezolvate in fiecare an cu ajutorul testelor ADN. Raportarile cumulate pentru Europa se situeaza cu aproximatietot injurulaceleiasi valori. Insatestelegeneticeefectuate inscopulstabiliriiunuipedigree vizeazain prezentsiomultitudinedealteaspecte(veziintabel-aplicatiiindomeniulcivil).Autoritatiledinstatelevestice rezolva in prezent problemele legate de imigratie sau reintegrire a familiilor imigrantilor tot cu ajutorul testelor ADN.Aplicatii in domeniul penal si militarAplicatii in domeniul civil - identificarea victimelor in omoruri si pruncucideri- cercetarea paternitatii- identificarea criminalilor dupa urmele lasate la locul faptei sau asupra victimelor - cercetarea maternitatii (schimburi accidentale de copii in maternitati, noi-nascuti abandonati sau pierduti, etc.) - identificarea agresorilor sexuali - rezolvarea cazurilor de imigratie (reintregirea familiilor ) - identificarea autorilor talhariilor si furturilor- identificarea adoptiilor ilegale - trierea si excluderea suspectilor in diferite anchete politienesti- identificarea fetilor conceputi prin fertilizare in vitro sau a mamelor surogat - identificarea victimelor in accidente aviatice, catastrofe naturale, acte de terorism, razboaie- cercetarea unor relatii de inrudire biologicaintre: frati buni/vitregi, bunici/unchi-nepoti, veri (pana la grd. IV), etc. - elucidarea cauzelor unor accidente rutiere si aviatice pornind de la urmele biologice - stabilirea unor relatii de descendenta biologica in scopul aflarii adevarului istoric sau din interese politice - probabrea unor rapiri si sechestrari de persoane,a traficului ilegal de persoane si de organe umane - stabilirea unor relatii de inrudire la solicitarea societatilor de asigurare- probarea unor agresiuni fizice- incheierea de asigurari cu clauze de moarte violenta - identificarea speciilor animale sau vegetale- identificarea esantioanelor biologice in cauze de malpraxis 5. Structura si funciile ADN. In lumea vie, celula este unitatea de baza unde se desfasoara procesele ce intretinviata.Celulapoateficomparatacuofabricainminiatura1careprelucreazamateria,produceenergie, sintetizeazaproteinesienzimenecesarecircuitului metabolicsiepureazadeseurilerezultatedinacesteprocese. Un organism uman matur se compune din cateva mii de milioane de celule, care provin din aceeasi celula, celula ou. Prin faptul ca au o origine comuna, celulele unui organism contin acelasi material genetic. Cvasitotalitatea materialului genetic din celula umana se gaseste localizat in nucleul celulei, in molecula de ADNnuclear.Cuexceptiaglobulelorrosii,caresuntcelulelipsitedenucleu,moleculadeADNseregasestein toate celelalte celule. O mica parte din patrimoniului genetic al celulei este localizat si in afara nucleului, respectiv in mitocondrii,undeformeazaasa-numitulADNmitochondrial,diferitcastructurasiorganizaredeADNnuclear. Nucleulestecentruldecomandicontrolalmajoritiiactivitilorcelulare,intimpcemitocondriileconindoar 0,5% din materialul genetic celular si indeplinesc functii limitate. ADNnuclear-suportulmaterialalereditii.MoleculadeADNnuclearseprezintasubformaunui filamentacaruilungimederulataatingeaproximativ1msiconstituiesuportulmaterialalereditatii.Eareprezinta totodatacarteanoastradeidentitatebiologica.MoleculadeADNesteidenticainproportiede99,9%latoti indivizii umani. Din cele 3,5 bilioane de elemente (nucleotide) ce alcatuiesc filementul de ADN, doar 3 milioane sunt diferitedelaunindividlaaltul.Acestemicivariatiistructuraleconferaunicitatebiologicafiecaruiindividuman. Individualitateaumanaestedecioindividualitategenetica,desiomulinansambulsauesteprodusulinteractiunii permanente dintre ereditate si mediu. ADN nuclear ADN mitocondrial 1 Butler J- Forensic DNA Typing (2003) 2ndEdition, Academic Press, San Diego California, 13-24 Testarea ADN in scop de identificare si cercetarea filiatiei biologicesuport de curs pentru studenti Molecula de ADN nuclear are o structura de dublu helix, fiind alcatuita din doua lanturi rulate unul in jurul celuilalt (spirala vietii). Structura ADN poate fi imaginata destul de plastic ca fiind o scara in spirala marginita de douabalustrade.Succesiuneatrepteloracesteiscariinspiralaestedatade4tipurideelementenumite nucleotide: A-adenina, G-guanina, T-timina sau C-citozina.Informatiaestedeterminatadesecventadeliterede-alungullantuluideADN,cualtecuvinteeste codificata. Descifrarea codului informational permite fiecarei celule dintr-un organism sa-si indeplineasca functiile. Codul genetic este format numai din 4 litere, si cu toate acestea extrem de performant, pentru ca permite cuajutorulsauinmagazinareauneicantitatiuriasedeinformatie,oadevarataarhivagenetica,transmisadin generatie in generatie cu o precizie uimitoare. De exemplu: secventa ACGT reprezinta o informatie diferita fata de secventa AGTC in acelasi mod in care cuvantul STOP are un inteles diferit fata de cuvantul POST sau SPOT, chiar daca aceste cuvinte contin aceleasi litere.

6. Markerii ADN utilizati curent in genetica judiciara Ansamblulinformatieigeneticespecificeorganismuluiumandefinestegenomuluman.Prinanalogiecu domeniulinformaticii,moleculadeADNestecomparatacuunsoftcomplex,iargenomulumancusetulde instructiuni al acestui soft, care asigura functionarea ordinatorului numit organismuluman.ADN uman este organizat in: gene si secvente inrudite cu genele (material genetic codant) material extragenic sau necodant - alcatuit din secvente repetitive.Dintresecventelerepetitiveseremarcaprininformativitatesecvenelerepetitivescurtegrupaten tandemuri, denumite microsateliti sau secvente STR (short tandem repeats).FunctiaindeplinitadesecventelerepetitivedetipSTRnuesteinprezentelucidata,darcesecunoaste este faptul ca transmiterea acestui material genetic se face cu respectarea legilor ereditatii Mendeliene. Astfel, in cursuldiviziuniicelulare,secventelerepetitivesegregaindependent(secombinala intamplare)siseregasescin succesiunea generatiilor.6. Markerii ADN utilizati curent in testarea identitatii umane StudiulsecvenelordetipSTRfaceobiectulprincipalalinvestigaiilorgeneticeinscopdeidentificarede persoane,deoarecepermitediscriminareaprobelordeADNceprovindelaindivizidiferii.Dintremiilede microsateliti din genomul uman, in genetica judiciara sunt utilizate doar sistemele STR - formate din tetra- si pentarepetii:-(TACG)n-,; -(ACCG)n- -cu localizare unica in genom,-polimorfe prezinta o multitudine de alele -cu numar minim de artefacte genetice (microvariante) -rare fenomene mutationale. MarkeriutilizatiinidentificaresuntlocalizatiexclusivlanivelulADNnecodantastfelincatinformaiile geneticereferitoarelaidentitateauneipersoanesanupoatafipuseinlegaturacueventualemaladiicu determinismgenetic.Dacatestele inscopdeidentificares-arefectualanivelul ADNcodant(lanivelulgenelor), s-arpermite, diagnosticarea neautorizata a indivizilor bolnavi sau purtatori ai unei mutatii genetice cauzatoare de boala, cu toate consecintele nefaste in plan etic si social ce decurg din aceasta.Microsatelitii STR sunt considerati in prezent standardul de aur in materie de identificare. Materialulgeneticdinnucleulcelulei(ADNnuclear)areostructuralineara,insaintimpuldiviziuniicelularesecondenseazasi formeaza mase compacte, denumite cromozomi. Cromozomii pot fi vazuti la microscopul optic numai in timpul diviziunii celulare. Imaginea celor 23 de perechi de cromozomi umani. Numerotarea se face in functie de marime:cromozomul 1 este cel mai mare, in timp ce cromozomul 22 este cel mai mic. Reprezentarea schematica a structurii unui cromozom pornind de la desenul de benzi obtinut prin colorare. O celul somatic uman conine un set de 23 de perechi de cromozomi: 22 de cromozomi autozomi si o pereche de cromozomi caredeterminasexul.Celulelegametice(spermatozoidulsiovulul)facexceptie,deoarececontinnumaiunsingursetdecromozomi. Cromozomii aflati in cei doi gameti parentali se combina in procesul de fecundare si refac setul pereche de cromozomi in viitoarea celula ou. Indiviziide sexmasculin sunt desemnatiXYdeoareceposedaun cromozomX si unulY, in timp indiviziide sex feminin sunt desemnatiXX deoarece poseda doua copii ale cromozomului X. Testele de identificare in genetica judiciara utilizeaza atat markeri ADN localizati pe cromozomii autozomali, cat si markeri specifici cromozomilor sexuali.Testarea ADN in scop de identificare si cercetarea filiatiei biologicesuport de curs pentru studenti

AnalizaunuisingurmarkerSTRnuestesuficientapentruafirmareaapartenenteiuneiprobe.Pentru identificarea cu succes a provenientei unei probe ADN este necesara analizarea a 10 pana la 16 markeri STR. Se eliminaastfelsituatiile incareseraporteazaidentificarileeronate,datorateunorcorespondenteintamplatoareale profilelor ADN. Cu cat numarul markerilor investigati creste cu atat sansa identificarii eronate se reduce.Avantajele genotiparii markerilor de tip STR2 constau in: necesarul redus de material genetic pentru analiza (de ordinul ng sau pg/per proba biologica) ratainaltadesuccesaanalizeidatoratdimensiunilorredusealesecventelorSTRsiposibilitatiide automatizare a proceselor de analiza in laboratorposibilitateainregistrariirezultatelorinformatdigitalsialcatuiriidebazededate-markeriiSTRauo distributiedetipdiscontinuaaordinuluidemarime,lucrucepermiteidentificarealorfidelaprincompararecu etaloane de marime.NomenclaturaarbitraraatribuitasecventelordeADN.Serealizeazaprinsimbolurialfanumerice, conform nomenclaturii standardard adoptate la nivel international, pentru a se facilita schimbul de informatii. Astfel o secventa de ADN uman va fi denumita prin: Tipul acidului nucleic (D - reprezinta initiala de la DNA in terminologia anglo-saxona) Localizarea cromozomiala (1,2,3,........22, X sau Y)Caracteristicile secventei (ex: S - single copy sequence, etc.) Pozitia ocupata de secventa STR la nivelul regiunii cromozomiale respective. Exemplificarea nomenclaturiipentru markerii D1S80 si DYS19: CromozomLocus STRCromozomLocus STR 1F13B, D1S117113D13S308, D13S317 2TPOX, APOB, D2S1242, D2S133814D14S306 3D3S1349, D3S1352, D3S1358, D3S135915FES/FPS, Penta E 4FGA (FIBRA), FABP, GABARB1516D16S539, D16S537 5CSF1PO, D5S373, D5S815, D5S81817D17S976 6F13A1, ACTBP2 (SE33), D6S50218D18S51, D18S535, D18S849 7D7S460, D7S809, D7S820, D7S151719D19S253, D19S433 8LIPOL (LPL), D8S306, D8S320, D8S117920D20S85, D20S470 9D9S5221D21S11, Penta D 10D10S8922- 11TH01 (TC11), APOAI1, D11S554XHPRTB, ARA, STRX1, DXYS156 12VWA, CD4, PLA2A1, D12S391YDYS19, DYS385, DYS389-I, DYS389-II, etc. Markerii ADN genotipai curent n scop de identificare si localizrile lor cromozomiale3 Unii markeri pot imbraca denumiri mai speciale prin imprumutarea denumirii unor gene in vecinatatea carora sunt localizati. Exemplu: markerul TH01 este o secventa repetitiva de tip STR localizata pe cromozomul 11, 2MinisatelitiiaufostprimulsistemdemarkeriADNdescrissiutilizatdeparinteleamprentelorgenetice,SirAlecJeffreys,fiindcategoriadesecventedeADNrepetitivcareadeschiserainvestigatiilordegeneticajudiciara.Datoritamultiplelorinconvenientelegate imposibilitateainscrieiriirezultatelorinbazelededateinformatizate,acestimarkeriaufostinlocuiticumicrosatelitiiSTR.Inprezent, minisatelitiisuntconsideratimarkeriderezerva,fiindutilizatidoarlainvestigareaunorrelatiideinrudirebiologicacomplexegratie potentialuluilordiscriminatoriuridicat.CazulcelamicunoscutestecelalcloneiDolly:autentitcitateacloneinuapututfidoveditanumai prin analiza microsatelitilor, fiind necesara extinderea investigatiilor pe minisatelitii ADN. 3 Preluat dupa baza de date a National Institute of Science and technology www.cstl.nist.gov/div831/strbase DDNA 1localizarea secventei pe cromozomul 1 Ssegment unic80al 80-lea locus descris pe cromozomul 1 DDNA Ylocalizarea secventei pe cromozomul Y Ssegment unic19al 19-lea locus descris pe cromozomul Y Proprietatile secventelor repetitive de tip STR: ocupaingenompozitiifixe,denumiteLOCI(la singular LOCUS) variantele structurale ale unei secvente de tip repetitiv STR sunt desemnate ca fiind ALELEau o informativitate mare, in sensul ca diferentele din structura secventeleor repetitive le confera caracterul deMARKERIairegiunilorgenomiceincareisiau sediulpecromozomiomologi,lanivelulunuilocusdetip repetitiv,seregasescintotdeaunaladescendenti doua alele, din care una este de provenienta materna, iar cealalta de provenienta paterna. Un profil ADN reprezinta o combinatie de genotipuri obtinute in urma investigarii unui set de markeri ADN.Testarea ADN in scop de identificare si cercetarea filiatiei biologicesuport de curs pentru studenti la nivelul genei tyrosine hidroxylase, in portiunea intronului 1 ale genei; markerul TPOX se afla in vecinatatea genei tyroideperoxidase,iarmarkeulCSF1POinvecinatateaproto-oncogeneic-imspentrureceptorulCSF1.Prefixul HUMesteuneoriinclusinnomenclaturapentruamarcaapartenentauneisecventedeADNlagenomuluman. Exemplu: markerii pot fi desemnat si sub forma HUMTH01, HUMTPOX,HUMD1S80, etc.Cuexceptiagemenilormonozigoti,indiviziiumanisuntdiferitidinpunctdevederegenetic,sideci implicitsialinfatisariiexterioaresaufenotipului.Astfel,culoareaochilor,aparului,inaltimeasauformacorpului sunt toate determinate genetic, dar structurile genice ce le determina nu sunt toate identice, ci poseda mici variatii destructurasaudeexpresie.Intelegereanotiuniidevariabilitategeneticaestefacilitatadacasefaceapella grupele de sange ABO, respectiv la genele care le definesc si care se prezinta 3 variante structurale sau alele: A, B si O. Prin combinarea celor 3 alele pot rezulta 6 structuri genice distincete sau genotipuri.ABO abcde AAAABAO aaaabacadae BABBBBO babbbbcbdbc OAOBOOO cacbccccdce dadbddcddde eaebecedeee Daca un locus ADN este definit printr-un numar mare de variante structurale (alele), atunci si numarul genotipurilordefinitelanivelulaceluilocusestemultmaimare.Deexemplu,pentruunlocusdefinitprin5alele (a,b,c,d,e) pot rezulta 15 posibile genotipuri, iar un locus cu 12 alele, un total de 74 de genotipuri, iar unul cu 25 de alele, 325 de genotipuri. Geralizand, pentru un locus cu n alele vor rezulta n +n(n-1)/2 genotipuri. 7. Etapele unei analize ADN. O analiza ADN este un proces complex in care, indiferent de tehnica de lucru utilizata in laborator, se parcurg in mod obligatoriu cateva etape standard: Prelevarea si conservarea probelor biologice Analiza de laboratorInterpretarea rezultatelor si formularea concluziilor Raportare a profilelor ADN catre baza de date nationala (numai unde legea prevede acest lucru). Prelevarea si conservarea probelor biologice.Eforturile trebuie concentrate in directia prelevarii si conservarii corecte a probelor biologice sau purtatoare de urme biologice, deoarece un ADN cat mai bine conservat reprezintaprimagarantieaunoranalizedecalitate.Neglijentasauignorantainmanipulareaprobelorsaula transportpoateprejudiciaintreagatestare,lucrucriticuneoriinactivitateadeidentificaremedico-legala.Intabel sunt prezentate conditiile de prelevare obligatorii in vederea testarii ADN. Intimpulprelevrilor,darintimpullucruluinlaborator,trebuieevitatcontaminareaaccidentalaa probelorbiologicesaucorpurilordelictecualtADNuman. Sursacontaminariloraccidentaleestereprezentatade personalul care manipuleaza gresit probele.Pentru evitarea contaminarilor accidentale, atat personalul care efectueaza prelevarile cat si personalul dinlaboratoare,auobligatiadeapurtaechipamentedeprotectieconstandin:halatsaucombinezon,boneta, masca, manusi de unica utilizare, ce se schimba la prelevarea fiecarui corp delict sau de cate ori se intra in contact cu obiecte contaminante. Instrumentele folosite sunt de asemenea fie sterile, fie de unica utilizare: pense, foarfeci,bisturiu,seringi,ace,tampoanedebumbac,etc.Neprofesionalismulsauneglijentapotconducelaincriminarea unor inoceni sau la imposibilitatea prinderii criminalului. Este obligatorie, aadar, adoptarea unor msuri draconice de precauie chiar din primele etape ale manipularii probelor la fata locului. Testele genetice pot fi aplicate tuturor probelor ce contin celule nucleate, deci implicit material genetic nuclear. Materialul care urmeaza sa fie analizate poate proveni din uramatoarele surse:-tesuturi(sange,celulebucale,muschi,fecale,urin,firedepar,os,unghii,lichidpleural,lichid peritoneal, lichid amniotic, vilozitati coriale, resturi embrionare, etc.),-pete (de sange, sperma, saliva, etc.) -urme de contact depuse pe obiecte, pe mucuri de igar, in interiorul mtilor sau al mnuilor, gum de mestecat, suprafaa gloanelor, -preparateanatomopatologicearhivate(tesuturiincluseinblocurideparafina)saufrotiuri(tesuturi colorate etalate pe lame) MacromoleculadeADNestefoartestabilaincomparatiecumoleculeleproteice,care facobiectul analizeiinlaboratoareledeserologie.DegradareaADNarelocsubactiuneaunorenzimepropriicelulei,ADN-azele,siesteacceleratadefactoriidinmediuambiental reprezentai de: Deaceeaesteindispensabildeaprelevasiconservacorectprobelebiologicedestinateanalizelor genetice, in conditii de: umiditate caldur excesiv lumin ultraviolet contaminare bacterian Testarea ADN in scop de identificare si cercetarea filiatiei biologicesuport de curs pentru studenti Analiza propriu-zisa de laboratorPentruafianalizat,ADNcontinutintr-oprobabiologicatrebuiemaiintaiizolatsauextras,adica separat de toti ceilalti constituienti ai probei. Obiectivul acestei etape il constituie obtinerea unei cantitati crecute de ADN,avandogreutatemolecularamaresipuritatecrescuta.GreutateamolecularamareamoleculeideADN echivaleazacuintegritatealantuluideADN,iarpuritateamoleculeiestedatadeabsentarezidurilorcelulare (proteice, glucidice, enzimatice) sau de alta natura (coloranti, saruri, etc.). Etapa de extractie se incheie dupa verificarea cantitatii si puritatii ADN obtinut din prelucrarea probei, deoarece de acesti doi factori depind celelalte etape ale analizei de laborator si implicit succesul testarii. Etapa de verificare se realizeaza de rutina spectrofotometric sau prin metode performante de tipul detectiei fluorescente Pico-greensaucuantificariiprinreal-timePCR.Dacadupaaceastaetapa,seconstatacaprobanucontineADNsau materialulgeneticizolatesteincantitatefoartemicasauextremdedegradat,analizanusemaicontinuacu celelate etape. ProbelecarecontincantitaticorespunzatoaredeADNsuntsupusereactieidepolimerizareinlantPCR (PolymeraseChainReaction),reactiecomparatacuunxeroxlanivelmolecular.OamplificarePCRuzuala necesita materialul genetic provenit din 10 pana la 100 de celule. Metoda PCR multiplica secventele de interes din moleculadeADN,intr-unprocescaresederuleazaincicluride reactie. Astfeldupancicluricompletedereactie PCR,seproduc2ncopiidupamatritadeADN.Deexemplu,dupa20decicluridereactie,rezultainmediulde reactie circa 1.000000 de copii ale segmentului tinta de ADN.Testarile ADN in scop de identificare fac apel in mod curent la metoda PCR, si in special la metodele PCR multiplexprin care realizeaza amplificarea simultana a unui numar mai mare de secvente tinta de ADN. Tehnicile PCR multiplex sunt larg utilizate in laboratoarele de genetica moleculara deoarece permit cresterea randamentului de lucru si automatizarea proceselor de analiza. Avantajele metodei PCR Dezavantajele PCR senzitivitatea - capacitatea reactiei deamultiplica cantitati redusede ADN, de ordinul ng (10-6g) sau pg (10-9g);eficientamaximapentrusecventedingenomdemicidimensiunide tipul markerilor STRsrapiditatea analizelei PCR ~ dureaza in medie 3 orerelativausurintacucaresepoateproducecontaminarea probelor de ADN cu material genetic provenit din alte surseerorile reactieiPCR - rataeroriloresteestimatala 0,25% (o lipsa de incorporare de circa 400 de baze in 30 de cicluri). Produsii rezultati in urma reactiei PCR constau intr-un set de fragmente (secvente) de ADN de diferite marimi.PentruaidentificasicaracterizaacestesecventeedeADNestenecesarasepararealor,lucrucese realizeaza cu ajutorul campului electric, deoarece moleculele de ADN sunt purtatoare de ioni: fragmentele de ADN refrigerare uscaciune protejate de radiatii solare, UV sau agenti chimici TehnicileextractieaADNvariazainfunctiedetipul,cantitateasicalitateaprobeideanalizat.Existaomarevarietatedeprocedee,unele destul de laborioase prin care seobtin cantitati mari si foarte pure de ADN,sialtele,denumitemetode quickandeasy, prin care seobtin cantitatiredusedeADN,depuritatescazuta.ExtratiaADNsepoaterealizasiautomatizatcuajutorulrobotilor,metodalargutilizatain centrele unde seorganizeaza bazededateADNmedicale sau judiciare.Majoritatea laboratoarelor de genetica judiciara tind sa foloseasca protocoaledeizolareaADNbazatepekituricomercialedereactivi,lucrucepermiteconfruntareamaiusoaraarezultatelorobtinuteintre diferite laboratoare de profil . Proba biologica Evaluarea calitatii si cantitatii probei si alegerea procedeului de extractie ADN Extractia ADN Verificarea randamentului si calitatii extractiei Analiza PCR Analiza produsilor de reactie in analizorul genetic Interpretarea rezultatelor Raportarea profilului ADNTehnicaPCResteunadincelemaiperformanteuneltedelucrualegeneticiimoleculareprezente,descoperitasidezvoltatala inceputulanilor1980debiochimistulamericanKeryMullis.Pentruaceastadescoperirerealizatalavarstade36deani,Mullisaprimit premiulNobel.Tehnicaarelaoraactualaunimpactmajorinbiomedicina.DatoritatehniciiPCRafostposibiladerulareasifinalizareacu succes a Proiectului Genomul Uman cu 5 ani mai devreme decat era prevazut.Testarea ADN in scop de identificare si cercetarea filiatiei biologicesuport de curs pentru studenti incarcate negativ, migreaza catre polul pozitiv, cele de mici dimensiuni mai repede decat cele mari. Se realizeaza astfelseparareafrragmentelordeADNinfunctiedegreutatealormolecularaprinelectroforeza.Fragmentele migrate pot fi vizualizate prin diferite tehnici de colorare: ethidium bromid, saruri de argint, marcaj fluorescent, etc. Metodaelectroforeticaestedealtfellargutilizatainbiomedicina,pentruseparareasiidentificareaprodusilor proteici.Inprezent,pentruaplicatiiledegeneticajudiciara,metoda analitica de electie este reprezentata de electroforeza capilara cuplata cu detectiefluorescentaLASER.Tehnicaserealizeazaautomatizatcu ajutorulunorechipamentededicate,denumitegenericanalizoare genetice. Aceste echipamente au un randament de lucru mare, permitand prelucrarea unui numar de zeci - sute de probe intr-un interval de cateva ore.Analizageneticacuajutorulechipamentelorautomatizatereduce substantialefortulde lucru in laboratorsicresteperformantatestarilor in scopdeidentificare.Avantajeleutilizariitehnicilorautomatesuntcerte, insacutoateacestea,implementareatehnicilordeanalizasefacein laboratoareledelanoidintaracudestuldemultagreutatedatorita costurilor ridicate ale echipamentelor si a consumabilelor. ImagineaprezintaunprofilADNevidentiatcu ajutorulunuianalizorgeneticautomatdetipulcelui dinfigurademaisus.Genotipularezultatprin investigarea unui set complex de 16 markeri ADN. Conformgenotipuluievidentiatelanivelul markeruluidesex(genotipXY)sepoate concluzionacaprofilulADNapartineuneipersoane de sex masculin. 8.TesteleADNncercetareafiliaieibiologice.Determinarearelaiilordedescendenbiologic reprezintosolicitarencreterenpractica medico-legalaultimilor20deani motivataexclusivdedezvoltarea tehnicilor performante de analiz molecular si aplicarea lor pe scar larg. Volumul cel mai mare de testri pentru paternitateraportatlanumaruldelocuitoriseinergistreazaconstantinStateleUnite.nlaboratoareleamericane acreditate numarul de teste de paternitate depaseste anual cifra de jumatate de milion4. Testele reprezint o problem exclusiva a solicitantilor n majoritatea rilor, desi stabilirea unei paterniti esteimplicitsioproblemsocial.Oridecteorimamanuareposibilitateassuportecostuluneiinvestigatii serologice sau genetice n calitate de reclamant, statul este cel ce ordon i suport costul testarilor, lucru care se intampl si la noi in tara. Guvernul federal american, confruntat la sfaritul anilor 1970 cu un numr tot mai mare de copiicustatutilegitimsauabandonai,astabilitmecanismelegislativefoarteeficientepentruidentificareatailor biologici,concomitentcutransferareactreacetiaaobligaiilordentreinere.Aaseexplicnumrulmareal solicitarilor de analize din partea organizaiilor guvernamentale americane.n Europa, tarile scandinave efectueaza in prezent cel mai mare numr de expertize de filiaie din raiuni ce in deopotriva de legislatie i de aspecte sociale. Legiuitorii scandinavi au decis c este mai rentabil s identifice printestareADNtatlbiologicdectsincarcebugetuldestatcucheltuieliledentreinereieducaiealeunui copilpn la vrsta majoratului. Inacesteconditii,costurileunei testari, fieeasitestareADN,suntneglijabile in raport cu cele pe care le presupune intretinerea si educarea unui minor. RezultateletestarilorADNconduclaconfirmareasauinfirmareauneirelatiidedescendenta biologica cu un grad inalt de concludenta. Formulareaconcluziilormedico-legaleininvestigatiileADNdefiliatiesefaceprinstudiul comparativalprofilelorADNapartinandpersoanelortestate,incareseurmarestedacaaufostrespectate legile clasice ale transmiterii caracterilor ereditare.Conform acestor legi, un individ mosteneste in proportii perfect egale material genetic de la genitorii sai. Prinurmare,pentruun locusADN,orice individ poseddoucaracteregenetice(alele):unadeorigine matern (alela materna)i una deorigine patern (alela paterna).Atunci cand intr-o investigatie de paternitate, cu mama 4Annual Report Prepared by the Parentage Testing Standards Program Unit (2004) American Association of Blood Banks; www.aabb.org Testarea ADN in scop de identificare si cercetarea filiatiei biologicesuport de curs pentru studenti copilului prezumata ca fiind certa, profilul ADN al copilului evidentiaza pe langa alelele materne, o serie de alele ce se regasesc in profilul barbatului prezumat tata biologic, se poate vorbi de o confirmare apaternitatii. Probabilitatea de paternitate reprezinta in fapt opinia expertului formulata in termeni statistici cu privire la posibilitatea existentei unei relatii de inrudire biologica intre copil si barbatul investigat. InimagineaalaturatasuntredateprofileleADN evidentiateincazulunuitestdepaternitateunde au fost investigate: mama copilului (profilul notat M)copilul (profilul notat C)prezumtivul tata (profilul notat P).Genotipurileprezentatesuntcele evidentiatelanivelula4markeriADN(markerul desexAmelog,vWA, TPOXsiFGA)dintotalul celor16markeriinvestigatiincontextulexpertizei de paternitate. Pentruceitreimarkerievidentiatisepoate observacaalelele(caracterelegenetice)copiluluiauuncorespondentinprofilulmatern,insanusi inprofilul barbatului testat. Prinurmare, concluzia formulataafostdeexcluderedelapaternitatea barbatului P. Excluderea de la paternitate se formuleaza atunci cand apar neconcordante intre caracterele genetice din profilul ADN al copilului si cele ale barbatului investigat in calitate de prezumtiv tata biologic. Cercetareapaternitatiiesteposibilasiinconditiilein carenusecunoasteprofilulgenetical mamei.In cazul testarii cuplurilor formate din copil - prezumptiv tata este necesara uneori largirea bateriei de markeri ADN investigatipentruaseatingegraduldeconcludentaalcalcululuistatisticcerutdestandardeledeanalizain domeniu.Dacaseobservacapentruuniimarkeri,niciunadintreceledouaalelespecificeevidentiateinprofilul ADNalcopiluluinuseregasesteinprofilulbarbatuluiprezumatafitatalbiologic,atuncirespectivulbarbatse exclude de la paternitatea copilului. Studiileefectuatepecazuridepaternitate5,indicaoratamedieaexcluderilorde28,3-35,6%6.Ratadeexcludereesteingeneralmaimare pentru varste ale partenerilor foarte tinere: maximum inregistrat intre 25-35 ani testarile la cerere comparativ cu cele solicitate prin instanta:40% versus 21% copiii nascuti in cadrul casatoriei comparativ cu cei nascuti in afara casatoriei: 46% versus 32% populatiile defavorizate situatiile cand unul dintre parteneri a suportat integral costul expertizei comparativ cu situatiile cand partenerii au suportat in mod egal costurile:41% versus 14%. Testarea prenatanl a paternitii nu este ilegal n prezent nicieri n lume, dar Organizaia Mondial a Sntii,lainitiativaSocietatiiGermanedeGeneticUmanapropusin1997unmoratorium7carerecomand exercitarea unui auto-control i o triere atent a cazurilor de acest gen pentru a nu se lsa loc abuzurilor.Testarile ADN de paternitate efectuate la limita legalitatii - quo vadis. Legislaiile din ntreaga lume stipuleazcesteninteresulcopiluluisicunoasctatlbiologic.Cutoateacestea,tocmaiacestdrept fundamental al copilului este grav inclcat astzi de accesul nengrdit i extrem de facil la testele ADN, efectuate uneori n condiii de legitimitate incert. Experii n genetic judiciara i pun pe drept cuvnt problema implicaiilor legale ale acestui fenomen. n timp ce pentru investigatiile de filiaie solicitate prin instan, completul de judecat informeazparileasupraconsecinelorjuridicecedecurgdintr-oastfeldetestare,stabiletecustodiacopiluluii verificcalificareaiacreditareaexperilorngeneticjudiciar,pentruinvestigaiileefectuatenlaboratoare private, nu se poate vorbi de nici o responsabilitate. Urmare a costului destul de ridicat al expertizelor oficiale si a modificarilor legislative operate de mai multe ri ale Europei de Vest, menite s faciliteze stabilirea paternitii n afara instanelor de judecat (dar care sunt deosebit restrictive n alte domenii precum: adopiile, mamele "surogat", proteciaembrionului)s-adezvoltato"ariecenuie"ainvestigaiilorgeneticedefiliaie,localizatpredilectn sistemulprivat8.Cupluriletrimit frecventprinpot mostrede fluidamnioticisalivn laboratoareprivatepentru astfel de testri la limita legalitii. 5WalkerR,CoffeyM,KodaliR-Associationofindividualsociodemograficfactorswithpaternitytestsresults(1994)AdvancesinForensic Haemogenetics no.5, Springer Verlag, Berlin, 23-25 6 Annual Report Prepared for the Parentage Testing Standards Program Unit (1998) - American Association of Blood Bankswww.aabb.org 7 World Health Organisation - Proposed international guidelines on ethiccal issues in medical genetics (1997) Geneva8 Rittner C, Rittner G, Schneider PM - DNA ADN Legal Rights in Paternity Testing in Germany(2000) Progress in Forensic Genetics 8 , Elsevier, Amsterdam 365-367 RezultatulfinalaluneitestariADNcarevalideazapaternitateaseexprimaintotdeaunaintermenide probabilitate, respectiv prin indicele de paternitate si probabilitatea de paternitate.Expertul care se pronunta pentru o excludere de la paternitate, are insa obligatia de a prezenta criteriile care au stat la baza formularii concluzilor sale specificand numarul si tipul de neconcordantelor evidentiate.Testarea ADN in scop de identificare si cercetarea filiatiei biologicesuport de curs pentru studenti Germania,taracuceamaindelungattradiiedinlumenceprivetetestriledepaternitate,atrage astfelatentiacomunitiitiinificeintrenaionaleasupratestarilorADNilegalecuimplicaiijuridiceevidente.In Statele Unite, American Association of Blood Banks a luat de asemenea atitudine impotriva proliferarii testarilor la limitalegalitatii.Documentulreferitorla"StandardelepentruLaboratoareledeTestareaPaternitii"din1998 reglementeaza strict conditiile de efectuare a unui test de paternitate, conditionandu-se orice testare deobtinerea unuiconsimmntscrisdinparteafiecareipersoanetestate.Documentulmaiprecizeazcprincipiul confidenialitiirezultatelortrebuierespectatcustricteedectreexpert,deoareceinformaiicuprivirela paternitatesaualtetipuridenrudiripotfispeculatederudeideanturajpentrurevendicareaunordrepturi materiale, etc. n prezent, tehnicile de investigaie genetic permit stabilirea celor mai diverse relaii de nrudire biologic pornind de la cele mai diverse tipuri de probe biologice.9. Interpretarea rezultatelor unei investigatii ADN. Scopul principal al unei imvestigatii ADN este de a testa ipoteza prin care un anume individ este sursa unei probe biologice judiciare prelevata de catre investigatorii criminalisti de la locul unei fapte. Expertul genetician cerceteaza in laborator daca exista o asociere intre respectiva probabiologica judiciarasiprobadereferintaapartinandindividuluicatalogatdecatreinvestigatordreptsuspect. Trei concluzii posibile pot fi formulate in urma efectuarii unei investigatii ADN: 1.Profilelegeneticesuntdiferite,inconsecintaprovindinsursebiologicediferite.Inacestcazse formuleazaoconcluziedeexcludere. Acesttipdeconcluziesespunecaareuncaracterabsolut prin urmare nu necesita analize sau discutii suplimentare2.Profilelegeneticepotprovenidinaceesisursabiologicaintrucatprezintasimilaritatisau concordantesaupotrivirilanivelultuturormarkerilorinvestigati(termenulanglosaxonutilizatfrecvent esteceldematch).Inacestcazseformuleazaoconcluziedeprobabilitate.Concluziade probabilitatenuareuncaracterabsolutsideaceeapentru formulareaeiestenecesareaprelucrarea biostatisticaarezultateloranalizelorADN,respectivcalculareaindiceluideincriminare,denumitsi raport de probabilitate conditionat de ipoteze sau indice de probabilitate.Doua profilele ADN pot prezenta similaritati in urmatoarele circumstante: Similaritatea este reala - probele biologice investigate provin din aceeasi sursa, respectiv de la acelasi individSimilaritateaesteocoincidenta-probajudiciaraprovinedelaoaltasursadecatceareala,insaintamplator,celedouasurse, prezinta aceleasi caracteristici genetice la nivelul markerilorADN investigati. Drept consecinta, rezulta o incriminare eronata a unui inocentSimilaritateaesteaccidentala (eronata) - probajudiciara provine in mod realde laoalta sursa decat cea considerata suspecta, insa datoritaunorerorideprelevare/testare/etc.seevidentiazacaracteristicigeneticesimilareintreprobajudiciarasisuspect.Consecintao reprezinta o incriminare eronata a suspectului .3.Profilelegeneticeobtinuteinurmaanalizelornupotservilaformulareaunorconcluzii.Prin umare analiza este catalogata ca fiind neconcludenta. (ex: profilele ADN incomplete obtinute in urma analizariiunorprobedegradate,profileADNcarerelevamixturicomplexedematerialebiologice datoritacontaminariloraciidentale,etc.).Rezultateleneconcludentenecesitarepetareainvestigatiei genetice pe aceleasi probe biologice ori pe alte probe, schimband protocoalele si tehnicile de lucru, in incercarea de a obtine rezultate concludente. Valoarea unui rezultat neconcludent in instanta este nula, darpentruinvestigatoriicriminalisti,elpoatefurnizauneorioseriedeindiciivaloroaseinsensul orientarii investigatiei penale.Analiza si interpretarea probelor ce contin un amestec de ADN (mixturi) este mai complicata decat atunci cand proba provine de la o sursa biologica unicat. Iar aceasta situatie se intalnesc constant, atat in cazurile de agresiuni sexuale cat si in crime, situatii in care se evidentiaza pe corpurile delicte sau pe urmele prelevate de la locul faptei, amestecuri de ADN provenite de la victima si faptuitor/faptuitori. Saluaminconsiderareuncazdeviol,undepechilotulvictimeiseregasesteunamestecdematerial biologic, compus din secretia vaginala a victimei si sperma agresorului. In mixtura de ADN identificata pe chilot se Consimtamantul pentru testarea ADN se da in scris, direct sau indirect, printr-un nscris oficial sau prinintermediulprinteluisaututoreluilegalncustodiacruiaseaflaunminorsauopersoancu discernmntulabolit.Dacpriniiauncomuncustodiaunuiminor,atunciambiiparintisuntobligatis consimtnscrislatestareagenetica.ncazcontrar,testareapoateficonsideratilegaliaductoarede prejudiciu persoanei n cauz, in speta minorului.Valorile numerice ale IP pot fi exprimate si prin conventii verbale: IPProbabilitatea de incriminare 1- 1000 1.000-10.000 10.000-100.000 100.000- 1.000.000 >1.000.000 nesemnificativa destul de semnificativa semnificativa foarte semnificativa extrem de semnificativa Testarea ADN in scop de identificare si cercetarea filiatiei biologicesuport de curs pentru studenti vorpuneinevidentamaimultde2caracteregenetice(alele),respectivdinalelelevictimeisialeleleagresorului (vezi figura de mai jos). 10. Markerii speciali folositi in genetica judiciara.Testulamelogeninei.TestarileADNutilizateinidentificriledepersoanerealizeazderutina diagnosticul molecular al sexului unei persoane prin asa-numitul test al amelogeninei.Testul urmareste punerea in evidenta a unor secvene localizate n regiuniomologepecromozomiiXsiY,nimediatavecintateagenei amelogeninei-deundeidenumireagenericdetestalamelogeninei. Secventa specifica cromozomului X este de dimensiuni mai mici decat cea a cromozomului Y, motiv pentru identificarea sexului se face fara dificultati:-pentrusubiectiidesexfeminintestulevidentiazaunsemnal, corespunzatorr secventelor specifice perechii de cromozomi X -pentrusubiectiidesexmasculinseevidentiazadouasemnale,unul corespunzatorsecventeidepecromozomulXsiunulcorepunzator secventei de pe cromozomul Y). ADN feminin ADN masculin XXY MarkeriispecificicromozomuluiY.Reprezintaunputernicinstrumentdelucrupentruinvestigaiile criminaleidefiliatie.Inntreagalume,autoriivasteimajoritatiaactelorcriminalesuntbrbai,dupastatisticile oficiale acetia comit 99% din agresiunile sexuale i 93% din omucideri. Orice urm, lsat la locul unei fapte de catre un infractor de sex masculin, devine astfel deosebit de informativ, dac n contextul investigaiei ADN aa-zise clasice, se are in vedere i analiza markerilor ADN specifici cromozomului Y.n timp ce toti cromozomii se gasesc perechi n genomul uman, cromosomul Y este unic - nepereche si nu participa la aceste procesele de schimb de material genetic. Consecina acestui tip de comportament din cursul diiviziuniicelulareestecY-ulsetransmiteintegraldelatatlafiu,nsuccesiuneageneraiilor.Aceast modalitatedetransmitereacromozomulYarcorespundensocietatetrasmiteriinumeluide familiedelatatla descendenii si de sex masculin.UnprofilADNspecificcromozomuluiY,definitprintr-unsetde9-11markeridetipSTR-Y,poate discriminapeste95%dinindiviziidesexmasculindintr-opopulaie.Putereadiscriminatorieamarkerilor cromozomialiYscadenizolatelepopulaionale.Discriminareaintreindiviziicareauofiliaiecomunpelinie masculin(tata-fiu,nepot-bunicpatern,frai,veriprimaricubunicpaterncomun,nepot-unchipatern,etc.)nuse poate realiza utilizand markerii specifici cromozomului Y. Cromozomul Y uman servete n domeniul medicina legala la identificarea agresorilor sexuali brbai - servesteinspecialcatestdetriereasuspeciloridentificareacelulelorepitelialemasculinenejaculatele indivizilorvasectomizai;investigareaagresiunilorhomosexualecercetareapaternitiipentrucazurilecu descendenidesexmasculinstudiidegenealogieiantropologie.Pentrucazuriledeagresiunisexualecu agresori multipli, analiza markerilor cromozomiali Y permite determinarea cu precizie a numarului minim de agresori sexuali brbai dup numarul de profile Y identificate.InimagineaalaturatasuntredateprofileleADN rezultateincazuluneiagresiunisexuale,incareau fostinvestigatevictima(V)suspectul(S)si chilotul-corp delict.Genotipulevidentiatpechilotprezintao mixtura de ADN la nivelul markerului de sex (XY) si a markeruluiD8S1179(12,13,14,15).Alelelevictimei (XX, respectiv13,14) se regasescinmixturaalturide cele ale agresorului (XY, respectiv 12,15). Sepoateobservacaaleleleprovenitedela agresorulsexual(12,15)suntidenticecucelealesuspectului (12,15).Prinurmare,sepoateincriminasuspectulS ca fiind autorul agresiunii sexuale. InterpretarearezultatelorncazulcorespondeneiadouaprofilecromozomialeY.Atuncicandunbarbatsuspect prezintunprofilcromozomialYidenticcucelalcriminalului,primeleconsideratiivizeazamoduldetransmiterealcromozomuluiY: profileY identice cua criminalului se regasesc si la fraii, tatl, fii suspectului,launchii inepotii paternali,laverii paternali,etc.Apoi, trebuie cercetata frecvena cu care se regsete respectivul profil Y ntr-o anumit populaie. De aici i problema care apare mereu: ce populaietrebuiesfieanalizatpentrucafrecvenasfieestimatcuacuratee?nanumitepopulaii,indiviziidesexmasculinpot aparine unui singur haplogrup Y in proportie de pana la 80-90%. n aceste cazuri, analiza cromozomului Y are desigur o informativitate scazut pentru identificare. Diversitatea scazut a profilelor cromozomiale Y este de regula rezultatul practicilor maritale poligame. Testarea ADN in scop de identificare si cercetarea filiatiei biologicesuport de curs pentru studenti Ceamaicuprinzatoarebazdedate internationalacuprofilecromozomialeYeste organizat de cercettorii de la Universitatea Humbold dinBerlin(www.yhrd.org)siconinesutedemiide profileAND-Y,fiindoreferinimportantaatatpentru interpretarearezultatelortestarilorefectuatederutina inlaboratoareledegenticajudiciara.Geneticienii apreciazcntr-unviitornufoartendeprtat,un profilcromozomialYdetaliatvaputeaindica anchetatorilorpopulaiadeorigineipoatechiari numeledefamiliealinfractoruluicarealasatourm biologic la locul unei fapte. Profile cromozomiale Y servind la identificare ADNmitocondrial(ADNmt)siereditateaextranucleara.Mitocondriaesteunorganitcelularesential pentru viata celulei, pentru ca aici se produce energia celulei si procesele respiratorii de baza. Fiecare mitocondrie arepanala10moleculedeADNmt,iarfiecarecelulaumanacontineintre5000-10000demitocondrii.Prin urmare, ADNmt se regaseste in de sute sau mii de copii intr-o singura celula, comparativ cu ADN nuclear care este unic. Daca probele biologice contin ADN nuclear in cantitati extrem de mici sau extrem de degradat, sansele de a recupera ADNmt sunt destul de mari, ceea ce prezinta un real avantaj in identificarile medico-legale. ExistamaridiferenteintreADNmtaldiferitelorspeciideanimale,ceeacefaceacestmaterialereditar idealpentrudiferentiereaspeciilor.Pentruidentificariledepersoanesuntanalizateprintehnicidesecventiere anumite regiuni din mitocondrie. Transmiterea materialului genetic mitocondrial se face preferential pe linie materna- erediatate de tip matern.Cercetarilearatacaintimpulfecundarii,dupapatrundereainovul,mitocondriilespermatozoiduluise dezintegreaza,ramanandincelulaounumaimitocondriileovulului.DatoritafaptuluicaADNmtaluneipersoane este mostenit integral de la genitorul matern, se poate verifica descendenta biologica pe linie feminina a membrilor ADN nuclearADN mitocondrial Localizat in nucleul celulelor Structura de helix dublucatenarUnicat in celula Mostenit de la ambii parinti, in proportii perfect egaleMarkeriADNncsecventelerepetitiveinformativitate mare,utilizaticurentinidentificariledepersoanesipentru cercetarea relatiilor de inrudire pe linie paterna sau materna Localizat in mitocondrieStructura circulara dublucatenara Cateva sute-mii de molecule ADNmt per celulaMostenit exclusiv pe linie maternaMarkeriADNmtinformativitateredusa,utilizatide regula in cazurile unde analiza ADNnc esueazaIncautareaadevaratilorparinti.Otragediedeproportiis-aprodusinArgentinaintre1975-1983intimpulregimuluimilitar, conducandlaraportareadisparitieiacirca15.000depersoane.Aproximativ200decopiiaufostnascutiinconditiidecaptivitate.Cei maimultidintreparintiiacestorcopiiaumuritininchisori,iarcopiiiaufostadoptatisicrescutiinfamilliidemilitari.Inunelecazuris-a doveditcauniimilitariaufostimplicatiinucidereaparintilorbiologiciaicopiilorpecareulteriori-auluatiningrijire.Investigatiile intreprinsedupa caderea regimului militar de catre Comitetul International pentru Persoane Disparuteau scos la iveala in multe cazuri, existenta unor certificate de nastere false emise pentru copii unor familii de militari, desi respectivii negau implicarea lor si se pretindeau afiparintiibiologiciaiacestorcopii.Infamiliiledemilitariundes-asesizatcafiindsuspectaprovenientaunuicopil,autoritatileau intreprinseforturi pentruobtinerea de probebiologicedela copii, familiaadoptiva si delapresupusele rudeale copiilor, in specialde la bunici. Proiectula fost sustinut de American Association for the Advancementof Science careaefectuat testele deADN genomic si mitocondrial.S-a studiat transmiterea caracterelor geneticepe parcursula2 generatii siapoi s-a calculatprobabilitatea unor gradede rudenieintrepersoanelevizate.NumaiputereadediscriminaremareatestelorADN,siinspecialatestelorefectuatepeADN mitochondrial, a facut ca 51 de copii sa fie identificati si redati familiilor lor biologice.Primul sex-scandal prezidential din istoria Statelor Unite. Thomas Jeffreson (1743-1826), cel de-al treilea presedinte american, a fost incriminatin 1802, intr-un jurnal din Richmond, caavando relatieextraconjugala cu sclava sa Sally Hemings, relatie din carear fi rezultatmai multi copii ilegitimi. Intr-un proces intentat in 1804 deun tribunal din Massachusetts, Jeffresona negat toateacuzatiile cei s-auadus,caredefapteraumaimultdeordincircumstantial,faraosustinerecuprobeobiective.Scandalulafostdeclansatin perioadaalegerilorelectoraleinsanuaavutefectulscontat,popularitatealuiJeffresonnefiindafectatasicastigandalegerile prezidentiale. Controversele legate de aceasta poveste au alimentat o intreaga literaura pana in ziua de azi.Pentru un grup de geneticieni, solutia a fost sa compare cromozomii Y ai unor descedenti pe linie masculina apartinand celor douafamiliiJeffresonsiHemings.EiauanalizatmarkeiADNapatinandcromozomuluiYsiaupublicatrezultateleinrevista Nature/nr.27/1998 . Haplotipul lui Jeffreson nu a prezentat nici un punct comun cu cel al lui Tom Woodson (n.1790), primul fiu al sclavei SallyHemings,concluziageneticienilorfiindcapresedintelenuafosttatalbiologicaacestuicopil.Inschimbeiaugasito corespondentaperfecta intre Y-ul lui Jeffreson si cel al lui Eston Hemings (n.1808), cel de-al cincilea fiu al lui Sally, probabilitatea ca acestaportiviresaaparaintr-opopulatiefiindmaimicade1%.Interesantestecanuacestcopilafostobiectulscandaluluidepresa declansatin1802,ciprimulnascutalluiSallyHemings.Dinpunctdevederepolitic,verdictulgeneticienilorincazulluiThomas Jeffresonafostspeculatdemediainnoiembrie1998intimpulaudierilorpresedinteluiClintonpentruamotivaintr-unfelrelatiasa extraconjugala. Dupa cum se stie, si inacest caz, testul ADNa servit ca probaobiectivain sustinereaacuzatiilor procurorilor. Cazurile luiJeffresonsauClinton,auamintitlumiicapresedintiinusuntdumnezeisausfinti,cioamenicatotioameniicutoateslabiciunilesi imperfectiunile care caracterizeaza o fiinta umana. Testarea ADN in scop de identificare si cercetarea filiatiei biologicesuport de curs pentru studenti unei familii. Acest lucru este extrem de util in identificarile de persoane, mai ales acolo unde una din verigile dintre generatiilipseste:deexemplu,incazulincareambiiparintiisuntdecedati,studiulsecventelordeADNmtal nepotilorsibuniciimaternepermitestabilireafiliatieilorbiologice.ModuldetransmiterealADNmtaresi dezavantajelegatedeimposibilitateadistingeriiintredescendentiipeliniematernaaleaceleasifamilii.Analiza ADNmt nu isi gaseste utilitatea pentru testele de paternitate. 11. Bazele de date ADN. Analiza ADN este un mijloc de identificare comparativa extrem de eficient, iar odata analizata o proba biologica, rezultatul poate fi pastrat intr-o banca de date. O banca de date poate identifica infractoriicareopereazaintr-unteritoriunationalsauchiarinternational.Premisadelacaresepronestein alcatuireauneibazededateestecaanumitetipurideinfractorirecidiveaza,comitandaceleasitipurideacte infractionale.Prima baza de date ADN a fost lansata in aprilie 1995 in Marea Britanie, pentru ca in 2003 aceastasa cuprindadejapeste2.000.000profileADN.Bazadedatebritanicaaservitlaidentificareaapeste200.000de corespondente.Siinmomentuldefata,aceastabazadedateesteceamaicuprinzatoaredinlume.Urmand initiativabritanicilor,sialtestateeuropenesi-aucreatbazededatenationale:1997-Olanda,1998-Austriasi Germania, 1999 Danemarca si Finlanda, 2000 2001: Belgia, Franta, Norvegia, Suedia, Elvetia. Concomitent cu alcatuireabazelordedate,statelerespectiveauadoptatsilegislatiacorespunzatoare.InRomania,functioneaza din 2008 Sistemului National de Date Genetice Judiciare9. Din 2009, toate bazele de date ADN ale tarilor membre ale Uniunii Europene sunt interconectate, permitand schimbul de informatii cu mare rapiditate. In Statele Unite, toate cele 50 de state ale SUA au baze de date ale celor condamnati dupa 1992-1994, ajutand la rezolvea cazurilor dificile de omor, talharii, identificarea persoanelor disparute. Sistemul de inregistrare in US National DNA Databank cuprinde un set de 13-16 markeri STR - denumit CODIS.Pentru fiecare tara exista legislatii care precizeaza tipurile de infractori ce pot fi inclusi in bazele nationale de date ADN, cate probe poate cuprinde o baza de date, metodologia de identificarea prin cautare in baza de date si in ce mod informatiile furnizate de o astfel de baza de date pot constitui probe in fata instantei de judecata. Cele mairestrictivesistemelegislativeindomeniuprevadincludereainbazelenationalededatenumaiaprofilelor infractorilorcondamnatipentrudelictesexualesicrimedeosebitdegrave.Altesistemelegislative,permit alimentareabazelordedatecurezultateleobtinutelatoatecazurilejudiciare,sichiarcurezultateletestarilordin banciledesange,dincentreledetestareamaladiilorgenetice,rezultateletestelordepaternitate,etc.Motivul invocat pentru o astfel de politici este cel al necesitatii efectuarii unor estimari probabilistice corecte avand ca reper esantioane populationale cat mai reprezentative numeric.Existainprezentunconsensgeneral,sianumecabazelededateADNajutanemijlocitlaaccelerarea investigatiilorcriminalesisolutionareacrimelorgrave siimplicit laeliminareasupectilor inocenti.Creareabancilor dedatesuscitainsainca viidiscutiicuprivire ladrepturilepersoaneloracarorADNestepastratinacestebaze, deoarece o analiza genetica poate in orice moment releva si alte date decat cele legate de identificare - date legate de codul genetic - atentand astfel grav la intimitatea biologica a unui individ uman.PolitiabritanicadinMareaBritanierecunoastecabazadedateservesteinprezentsiunorstudii stiintifice.InserviciulADNal ForensicSciencesetesteazadecativaanioseriedemarkeripentrudeterminarea culorii pielii, ochilor, parului si rasei unui individ. Identificarea rasei sepoate deja realiza cu o marja de eroare de numai7-8%.GeneticieniilegistisuntdeparerecatesteleADNvorserviinviitorlareconstituireaunuiadevarat portret fizic al criminalului pornind de la o pata de sange descoperita la locul unei crime. Probabil ca nu va mai trece mult timp pana ce acest scenariu de film va fi pus integral in practica. 12.StandardeledeanalizaintestareaADN.LaboratoarelecareefectueazatesteADNinscopde identificare sau de paternitate trebuie sa indeplineasca o serie de criterii prevazute in regulamente speciale interne sau internationale: criterii de calitate, competente profesionale, etc. Acreditarile pentru efectuarea testelor sunt date deagentiinationalesauinternationale.Persoaneleinscrisepelistelespecialealeexpertilorjudiciariprimescla randul lor acreditari dupa criterii profesionale prestabilite. Standardeleinmateriedeanalizegeneticemedico-legaleUniuniiEuropenevizeazainprincipudoua aspecte:tehnicsiprocedural.Standardeletehnicefacreferirelasistemelegenetice:tipulacestora, nomenclatura markerilor, nomenclatura alelelor, metodologia de lucru, rata mutatiilor, etc. metodele biostatistice pentru evaluarea rezultatelor metodele de arhivare a probelorsi rezultatelor. Standardele de procedura vizeaza probleme precum: autorizarea si competenta laboratorului autorizarea si competenta personalului randamentul testarilormodalitatiledecomunicareadatelor,etc.BazelededateADNsuntunaltaspectincareintervine standardizareadinperspectivacomparariirezultatelorsiaschimbuluideinformatii,inconditiileincarepolitica sociala europeana favorizeaza mobilitatea cetatenilor ei.Numarul total al laboratoarelor Uniunii Europene in care care efectueaza teste ADN medico-legale este estimat la circa 150, avand peste 1000 de experti in domeniu. 9CustodeleSistemuluiesteInspectoratulGeneralalPolitieRomane:detaliidespreorganizaresiprevederilelegislativepe http://www.politiaromana.ro/Criminalistic/sndgj.htm Testarea ADN in scop de identificare si cercetarea filiatiei biologicesuport de curs pentru studenti Invremececazurilejudiciaresuntinvestigatederegulainlaboratoareoficialeapartinandmedicinei legale si politiei, constelatia laboratoarelor care efectueaza teste de paternitate este mult mai mare si include de la caz la caz: laboratoare apartinand Ministerelor Jusitiei, servicii universitare de genetica, antropologie, laboratoare de imunologie sau imunogenetica, servicii de hematologie, laboratoare de analiza private, etc. In tarile din nordul si vestul Europei exista o tendinta generala de a concentra testarile ADN in cateva laboratoare principale, de regula oficiale,spredeosebiredecentrulsisudulEuropei,undetendintaestedeadispersainvestigatiilespre laboaratoare mici. Pentru armonizarea metodologiei de lucru si facilitarea schimbului de rezultate transfrontalier, in perioada 1989-1999 Comisia ADN a Societatii Internationale de Genetica Judiciara(ISFG) a elaborat o serie de recomandariprivindstandardeledelucruindomeniultestarilorADN.Acesterecomandariaufostadoptatein interval de numai cativa ani, de o maniera aproape unanima, de catre toate statele europene si de pe continentul american, iar progresul rezultat a fost semnificativ de la un an la altul. De ce este atat de important sa existe standarde de analiza in genetica judiciara?. Deoarece in functie deunanumestandard,sepotdezvoltaprogramedeasiguraresicontrolalcalitatiiindomeniu.Standardelede analiza odata adoptate de catre un laborator garanteaza justitiei si publicului interesat ca testele efectuate in acel laboratorsuntdemnedeincredere.Experientaunuilaboratorsiaexpertilorstiintificisuntdeasemeneafactori decisivi in derularea cu succes a unei investigatii genetice judiciare.Contraexpertiza reprezinta un principiu de baza in medicina legala si un drept recunoscut in majoritatea legislatiiloreuropene.Inanumitetarieuropeneadevenitobligatoriudejaprinlege,catoatesistemelegenetice testate pentru un caz, sa poata fi efectuate in cel putin doua laboratoare distincte din tara respectiva, astfel incat sa existe posibilitatea obtinerii a doua opinii stiintifice independente IN LOC DE CONCLUZII. Testele ADN si-au castigat renumele de regina a probelor sau proba perfecta in domeniul justitiei. Justitia moderna este revolutionata si in acelasi timp bulversata de aceste aplicatii ale geneticii moleculare. Inainte de 1990-1992, analizele serologice ofereau magistratilor anumite indicatii asupra provenientei unei probe biologice. Testele ADN permit in prezent excluderea cu certitudine a unor suspecti, precum si indicarea cu o rata foarte inalta a probabilitatii celui culpabil.Pe masura ce tehnologiile de identificare se imbunatatesc si sunt utilizate pe scara tot mai larga, se ridica foarte acut i intrebari serioase despre libertatile civile si dreptul la intimitate ale persoanelor testate genetic.