Download - Pràctica transformació

PRÀCTIQUES DE BIOTECNOLOGIA

KIT DE TRANSFORMACIÓ BACTERIANA

INTRODUCCIÓ

La transformació genètica s’esdevé quan un bacteri capta i expressa un fragment nou de DNA procedent del medi on viu.

En aquesta pràctica es transformaran bacteris amb un gen que codifica per la proteïna verda fluorescent (GFP) que, a la natura, es troba en la medusa bioluminiscent Aequorea victoria. Després de la transformació els bacteris expressen el nou gen recent adquirit i produeixen la proteïna fluorescent, per la qual cosa brillen sota una làmpada u.v.

El gen de la GFP, en la pràctica, es troba dins del plasmidi anomenat pGLO, que conté el gen de la GFP i el gen “bla”. Aquest últim confereix als bacteris que el contenen resistència a l’antibiòtic ampicil·lina. Per tant, els bacteris que han sigut transformats es podran aïllar afegint ampicil·lina al medi de cultiu, ja que només podran créixer els bacteris que tinguin el gen “bla”.

Per activar la transcripció del gen de la GFP, i per tant per poder-ne sintetitzar, s’ha d’afegir al medi, a part de l’ampicil·lina, el glúcid arabinosa. Si aquest no és al medi, la proteïna GFP no es sintetitzarà.

Consideracions prèvies a la pràctica

1. Normes de seguretat i higiene al laboratori:En qualsevol tècnica microbiològica és important no introduir bacteris contaminants a l’experiment. Aquests bacteris es troben a les mans, les superfícies de treball... i per tant, cal evitar-ne el contacte amb el material de laboratori. Per això, no s’han de tocar mai amb els dits ni deixar sobre la taula la part circular de les nanses de sembra, les puntes de les pipetes o la superfície de l’agar.A més, hem de treballar sempre prop del bec bunsen (no s’ha de sobrepassar mai un cercle de 20 cm de radi al voltant del bec).

2. Utilització de les pipetes:Abans de començar la pràctica és interessant familiaritzar-se amb les graduacions de les pipetes que s’utilitzaran i que són:


3. Els bacteris utilitzats:Per a la pràctica s’usaran soques d’Escherichia coli no patogèniques; no obstant, convé seguir unes mínimes normes d’higiene com:

a) Rentar-se les mans abans i després de la sessió pràctica.b) Utilitzar, si és possible, guants.c) Netejar bé les superfícies de treball abans i després de la

pràctica.d) No pipetejar mai amb la boca.e) No menjar, beure ni aplicar-se cosmètics en l’àrea de treball.f) Utilitzar ulleres protectores, si és possible.

4. Descontaminació del materialSi no es disposa d’autoclau, les nanses de sembra, les pipetes... que han estat en contacte amb els bacteris s’han de posar en una solució de lleixiu al 10% recent preparada. El material s’hi ha de mantenir com a mínim 1 hora. Després, el líquid sobrant es pot llençar per la pica i les plaques es poden llençar a les escombraries dins de dues bosses.

5. Medi de cultiu:El medi de cultiu líquid i sòlid, anomenats respectivament brou nutritiu LB i agar nutritiu LB (de Luria i Bertani), estan preparats amb un extracte de llevat i subproductes de carn digerits enzimàticament que aporten glúcids, aminoàcids, nucleòtids, sals i vitamines necessaris per al creixement bacterià. L’agar, un derivat de les algues, es fon quan s’escalfa i forma una gelatina sòlida quan es refreda, que és molt útil com a suport sòlid per als cultius bacterians.


1. PREPARACIÓ DE LA PRÀCTICA I (3 a 7 dies abans)

1.1 PREPARACIÓ DE L’AGAR NUTRITIU

Les plaques d’agar han de preparar-se com a mínim 3 dies abans de l’experiment. S’han de deixar a temperatura ambient 2 dies i després cal refrigerar-les fins que s’hagin d’utilitzar. Els 2 dies que les plaques passen a la taula del laboratori a temperatura ambient permeten que l’agar s’assequi el suficient perquè accepti el líquid de la solució transformadora que s’utilitzarà més endavant.

Per preparar l’agar cal que facis les operacions següents:

1 Posa 500 mL d’aigua destil·lada en un erlenmeyer d’1 L de capacitat (com a mínim).

2 Afegeix tot el contingut del paquet d’agar nutritiu LB.

3 Fes girar el flascó circularment per a dissoldre l’agar.

4 Posa l’erlenmeyer al microones fins que bulli el seu contingut.

5 Torna a escalfar i remenar l’erlenmeyer unes 3 vegades, fins que tot l’agar s’hagi dissolt i no es vegin grumolls girant. Cal anar en compte de deixar refredar una mica el flascó abans de remenar-lo, per evitar que el medi calent bullint vessi sobre la mà de qui l’està preparant.

6 Quan tot l’agar s’hagi dissolt, deixa’l refredar fins que l’exterior del flascó es pugui agafar bé (aprox. 50ºC).

Mentre l’agar es refreda, etiqueta les plaques i prepara l’arabinosa i l’ampicil·lina (fes els passos 1.2 i 1.3).

Vés amb compte de no deixar refredar massa l’agar perquè pot començar a solidificar-se (a partir dels 27ºC ho fa).

1.2 PREPARACIÓ DE L’ARABINOSA I L’AMPICIL·LINA


L’arabinosa es transporta liofilitzada en un vial petit. Amb una pipeta estèril nova, afegeix 3 mL de solució transformadora directament al vial per rehidratar el sucre. Sacseja bé el vial (si pots, amb l’ajut d’un vòrtex). L’arabinosa triga com a mínim 10 minuts a dissoldre’s.

L’ampicil·lina també es transporta liofilitzada en un vial petit. Amb l’ajut d’una pipeta estèril nova, afegeix 3 mL de solució transformadora directament al vial per a rehidratar l’antibiòtic.

En tots dos casos s’utilitza la solució transformadora per a la rehidratació perquè és una solució estèril. També es podria utilitzar aigua destil·lada estèril.

Aquestes dues substàncies s’hauran de barrejar després amb l’agar. Una calor excessiva (per sobre dels 50ºC) destruiria l’ampicil·lina i l’arabinosa, però l’agar nutritiu es solidifica a 27ºC així que cal controlar bé el refredament de l’agar i després abocar-lo a les plaques des del principi fins al final sense interrupció.

L’excés de bombolles pot ser retirat després d’emplenar totes les plaques flamejant breument la superfície de cada placa amb el bec Bunsen.

Quan totes les plaques estiguin plenes no les toquis fins que l’agar s’hagi solidificat.

L’agar sobrant s’ha de llençar a la BROSSA, no a la pica. Asseca també qualsevol gota d’agar dels costats de les plaques.

1.3 MARCAR LES PLAQUES

Les 40 plaques s’han de marcar amb un retolador permanent a la base, prop de la vora de la manera següent:

escriu “LB” a 16 plaques escriu “LB/AMP” a 16 plaques escriu “LB/AMP/ARA” a 8 plaques


1.4 ABOCA L’AGAR NUTRITIU LB A TOTES LES PLAQUES

1r. Aboca l’agar nutritiu LB a les 16 plaques marcades amb “LB”. Apilona les plaques buides en grups de 4 a 8 i, començant amb la placa del fons, aixeca la tapa i les plaques de sobre amb una mà i aboca l’agar amb l’altra. Omple la placa aproximadament entre 1/3 i ½ (aprox. 12 mL) amb l’agar. Torna-la a tapar i continua omplint les plaques del piló en sentit cap amunt del piló.Deixa refredar les plaques apilonades així.

2n. Afegeix l’ampicil·lina rehidratada a l’agar LB sobrant. Fes girar breument la mescla. Emplena les 16 plaques marcades amb

“LB/AMP” utilitzant la mateixa tècnica.

3r. Afegeix l’arabinosa rehidratada a l’agar sobrant que ja conté ampicil·lina. Fes girar breument la mescla i aboca-la a les 8 plaques etiquetades amb “LB/AMP/ARA” utilitzant la tècnica anterior.


1.5 EMMAGATZEMATGE DE LES PLAQUES

Després que les plaques s’hagin assecat aproximadament 2 dies a Tª ambient, es poden utilitzar directament o bé ser apilonades de 20 en 20 i tapades amb una bossa de plàstic com si fos una funda. La pila s’inverteix, es tanca la bossa i les plaques s’emmagatzemen en posició invertida a la nevera fins que són utilitzades.


2. PREPARACIÓ DE LA PRÀCTICA II(24-36 hores abans)

2.1 REHIDRATACIÓ DELS BACTERIS

Utilitzant una pipeta estèril rehidrata l’Escherichia coli liofilitzada, afegint 250 microlitres de solució transformadora directament al vial. Torna a tapar el vial i deixa la suspensió cel·lular a temperatura ambient durant 5 minuts. Després sacseja el vial per barrejar-ho bé abans de ratllar les plaques inicials LB.

Emmagatzema els bacteris rehidratats sobrants de la sembra a la nevera fins a utilitzar-los (temps ideal: 24 hores, com a màxim 3 dies més tard)

2.2 SEMBRA DE LES PLAQUES INICIALS PER A OBTENIR COLÒNIES BACTERIANES INDIVIDUALS A LES PLAQUES D’AGAR

Cada grup de treball de laboratori necessita la seva placa inicial (starter plate) com a font de cèl·lules per a la transformació.

Aquest kit conté material suficient per a 8 equips d’estudiants.

Les plaques han de ser sembrades per a obtenir colònies individuals i incubades a 37ºC entre 24 i 36 hores abans de l’activitat de transformació.

Utilitzant l’Escherichia coli rehidratada que s’ha preparat al darrer pas i 8 de les plaques marcades amb “LB”, cal sembrar per esgotament una placa inicial per a cada equip de treball. Aquest tipus de sembra es realitza ratllant suaument la placa amb una nansa, i l’objectiu és aconseguir generar colònies individuals de d’una suspensió concentrada de bacteris.

Una quantitat diminuta de la suspensió bacteriana pot generar moltes colònies. En condicions favorables, una cèl·lula es multiplica i n’origina milions de genèticament iguals en només 24 hores. Hi ha milions de bacteris individuals en una colònia d’1 mm.

El procediment pas a pas està a continuació:


1r Introdueix la nansa de sembra al cultiu bacterià rehidratat. Fica la nansa directament al vial, sense inclinar-lo. Extreu la nansa i ratlla les plaques segons la il·lustració. La ratllada es fa en 4 quadrants, un rere l’altre. La primera ratllada només serveix per a estendre les cèl·lules una mica. Mou la nansa endavant i endarrere unes 12 vegades a cadascuna de les àrees mostrada. En els quadrants següents les cèl·lules es dilueixen més i més, augmentant la probabilitat de produir colònies individuals.

2n L’objectiu de les següents ratllades és utilitzar el màxim possible de la superfície de la placa. Gira la placa uns 45º (per una major comoditat en la ratllada) i comença la 2ª ratllada. No introdueixis la nansa una altra vegada en la suspensió bacteriana. Passa sobre les ratlles anteriors un parell de vegades i després mou la nansa endavant i endarrere unes 10 vegades.

3r Rota la placa una altra vegada i repeteix la ratllada.


4t Gira la placa per última vegada i fes la ratlla final.

Quan acabis de sembrar la placa, tapa-la ràpidament per evitar que es contamini.

5è Posa les plaques en posició invertida a l’estufa d’incubació una nit a 37ºC (o a temperatura ambient de 2 a 3 dies si no disposes d’estufa). Utilitza-les per a la transformació en 24-36 hores. No les refrigeris abans de l’ús.

Escherichia coli forma colònies blanquinoses de forma uniforme i circular, amb les vores llises. Evita d’utilitzar plaques amb colònies contaminants.

2.3 PREPARACIÓ DEL PLASMIDI pGLO

Utilitzant una pipeta estèril nova, afegeix 250 microlitres de solució transformadora dins del vial del plasmidi pGLO liofilitzat. Fixa’t que la quantitat de DNA és tan petita que el vial pot semblar buit. Si és possible, emmagatzema el DNA rehidratat a la nevera.

Igual que en la rehidratació de l’arabinosa i l’ampicil·lina, podries utilitzar aigua destil·lada estèril en comptes de solució transformadora.


3. PREPARACIÓ DE LA PRÀCTICA III (abans de la transformació)

3.1 PREPARACIÓ DE LES SOLUCIONS EN ALÍQUOTES

Cada equip de treball ha de preparar una alíquota de 1 mL de solució transformadora (CaCl2) i una alíquota de 1 mL de brou de cultiu nutritiu LB en els microtubs de colors de 2 mL que hi ha al kit.

Si es preparen les alíquotes del brou nutritiu LB 1 dia abans d’anar al laboratori, s’han de mantenir refrigerades.

Recorda de retolar els microtubs convenientment.

3.2 PREPARACIÓ DEL MATERIAL DE CADA GRUP PER A LA PRÀCTICA

Cada equip ha de tenir:

1 placa inicial amb Escherichia coli (starter plate) 4 plaques d’agar (1 “LB”, 2 “LB/AMP”, 1 “LB/AMP/ARA”) 1 alíquota de solució transformadora 1 alíquota de brou de cultiu nutritiu LB 1 paquet de 10 nanses de sembra 5 pipetes estèrils 1 gradeta de microtubs de “foam” 1 contenidor amb gel trinxat 1 retolador permanent

El professor s’ha de preparar:

1 vial de plasmidi pGLO Bany maria Estufa a 37ºC Làmpada u.v.


4. TRANSFORMACIÓ BACTERIANA Guia ràpida

1 Etiqueta dos microtubs amb tap amb:

+ pGLO - pGLO

Escriu-hi el nom del grup. Col·loca’ls a la gradeta de “foam”

2 Obre els tubs i, utilitzant una pipeta de transferència estèril, transfereix 250 microlitres de solució transformadora a cada microtub.

3 Posa els microtubs en gel.


4 Utilitza una nansa estèril per agafar una sola colònia de la teva placa inicial (starter plate). Agafa el tub +pGLO i submergeix la nansa en la solució transformadora que hi ha al fons del tub. Fes girar la nansa amb l’ajut dels dits índex i polze fins que tota la colònia s’hagi dispersat en la solució transformadora (que no hi flotin trossos). Torna el tub a la gradeta de gel per tal de mantenir-lo ben fred.Utilitzant una altra pipeta estèril, fes el mateix amb el tub –pGLO.

5 Submergeix una nansa estèril nova dins del tub del plasmidi i retira-la amb l’anella plena de líquid. Hi hauria d’haver una capa (“film”) de plasmidi en l’anella. És semblant a veure una capa de sabó en una anella de fer bombolles. Barreja aquesta capa de plasmidi amb la suspensió de cèl·lules del tub +pGLO. Tanca el microtub i torna’l a la gradeta amb gel. Tanca també el tub –pGLO sense afegir-hi plasmidi.

Per què no li posem?

6 Incuba els tubs en gel uns 10 minuts. Vés amb compte de prémer bé els tubs en la gradeta de manera que el fons dels tubs estigui en contacte directe amb el gel.


7 Mentre els tubs estiguin en gel, etiqueta les vostres plaques per la part de sota (no en la tapa) de la següent manera:

una placa “LB/AMP” amb +pGLO una placa “LB/AMP” amb –pGLO una placa “LB/AMP/ARA” amb +pGLO una placa “LB” amb –pGLO

8 Cop de calor

Utilitzant la gradeta de “foam” com a suport, transfereix els dos microtubs (el de +pGLO i el de –pGLO) al bany maria a 42ºC durant un temps de 50 segons exactament. Primer assegura’t de prémer bé els tubs avall de manera que el fons dels tubs estigui en contacte directe amb l’aigua calenta. Quan hagin passat els 50 segons torna els microtubs al gel.Per tal d’obtenir els millors resultats en la transformació, el canvi de 0ºC a 42ºC i el retorn a 0ºC s’ha de fer ràpid.Incuba els tubs en gel durant 2 minuts.

9 Treu la gradeta de gel amb els tubs i poseu-la al taulell del laboratori. Obre un tub i, utilitzant una pipeta estèril nova, afegiu 250 microlitres de brou nutritiu LB al microtub i torna’l a tancar.Repeteix el procés amb l’altre microtub amb una pipeta estèril nova.Incubeu els microtubs durant 10 minuts a temperatura ambient.


10 Posant el dit índex sobre el tap de cada microtub, sacseja’l amb cura. Utilitzant una pipeta estèril nova per a cada microtub, pipeteja 100 microlitres de cada microtub sobre les plaques que has preparat abans de la manera següent:

11 Utilitzant una nansa de sembra estèril diferent per a cada placa, has d’estendre bé les suspensions per la superfície de l’agar, fent lliscar la part plana de la nansa estèril endavant i endarrere per tota la superfície de la placa.

12 Apilona les plaques i enganxa-les juntes amb cinta adhesiva. Posa el nom del grup i la classe a la base de la pila i poseu la pila a l’inrevés a l’estufa de 37ºC fins al proper dia.


QÜESTIONARI PREVI

Qüestió 1: Es pot modificar genèticament un organisme?

a) Per modificar genèticament un organisme sencer s’hauria d’inserir un nou gen a cada cèl·lula de l’organisme. Segons això, en quins organismes és més fàcil fer una transformació, en els unicel·lulars o en els pluricel·lulars? Raona la resposta.

b) A l’hora d’escollir un organisme experimental també és molt important la seguretat. Quines característiques ha de tenir l’organisme per no malmetre la salut del tècnic o l’ambient?

c) Els científics sovint volen saber si els organismes modificats genèticament poden passar les seves noves característiques a la descendència. Per obtenir aquesta informació, quins organismes seran més adequats per l’experiment, uns que creixin i es reprodueixin ràpidament o uns que ho facin més lentament? Per què?

d) Tenint en compte les qüestions anteriors, quina serà l’opció més adient per realitzar una modificació genètica: un bacteri, un cuc, un peix o un ratolí? Raona la teva resposta.

Qüestió 2: Com es pot saber si les cèl·lules s’han transformat? Quins mètodes de selecció de transgènics coneixes?


QÜESTIONARI DE REVISIÓ

Abans de recollir i analitzar les dades, contesta les preguntes que apareixen a continuació:

1. Per què es posa arabinosa en algunes de les plaques que contenen ampicil·lina?

2. Si hi ha bacteris transformats, a quines plaques apareixeran? Raona la teva resposta.

3. Quines plaques s’han de comparar per determinar si s’ha produït la transformació genètica? Per què?

4. Quina és la placa control de l’experiment? Per què? Quina és la seva funció?


5. Si les cèl·lules transformades han adquirit la capacitat de créixer en presència de l’antibiòtic ampicil·lina, què pots deduir sobre els altres gens presents en el plasmidi pGLO?

6. Si l’experiment ha estat un èxit, a quines plaques hi haurà colònies? (Indica, a més, si seran fluorescents o no)

+pGLOLB/amp

+pGLOLB/amp/ara

-pGLOLB/amp


RECOLLIDA DE DADES

Omple la següent taula amb dibuixos i anotacions de la pràctica:

Placa DibuixNo. de

colòniesFluorescència làmpada UV

+pGLO

LB/amp

+pGLO

LB/amp/ara

-pGLO

LB/amp

-pGLO

LB

Download - Pràctica transformació

Top Related