Diana Álvarez‐Muñoz, Albert Serra‐Compte, Natàlia Corcoll, Belinda Huerta, Sara Rodríguez‐Mozaz, Sergi Sabater, Damià Barceló.

INTRODUCTION

MATERIAL AND METHODS

• Experimental

• Analytical determination

• Signal processing and multivariate analysis

RESULTS AND DISCUSSION

• Metabolites identification

• Biofilm response to environmental stressors

CONCLUSIONS

ACKNOWLEDGEMENTS

INTRODUCTIONDrought

Pharmaceuticalsmixtures

Landfill Animal waste           Aquaculture             Hospital  waste             Industrial            domestic waste 

Pollution

Chronic exposure

INTRODUCTION

Primary producersBiogeochemical cycle of organic 

and inorganic matterSensitive to river changesHave a rapid interaction with 

dissolved substancesShort life cycleBioaccumulation capacity

Biofilm

BIOMARKERS OF EXPOSUREDISRUPTED METABOLIC PATHWAYS

GOALS

1.To  identify  biofilm  biomarkers  of  drought  stress  and pharmaceutical exposure. 

2.To  elucidate   metabolic  pathways  affected  due  to  a  dry  period and/or pharmaceutical exposure. 

3.To  evaluate  if  the  effects  of  a  dry  period  on  the metabolome  of biofilm  was  influenced  for  the  co‐occurrence  of  pharmaceutical exposure.

Experimental

MATERIAL  AND METHODS

Fluvial mesocosm 2. Pharmaceutical exposure  (P)

Compound Therapeutic familyNominal Concentration (ng/L)

Ibuprofen Anti‐inflammatory 404Diclofenac Anti‐inflammatory 366Carbamazepine Psychiatric drug 124Sulfamethoxazole Antibiotic 699Erithromycin Antibiotic 169Metoprolol β‐Blocker 1845Atenolol β‐Blocker 117Gemfibrozil Lipid regulator 140Hydrochlorothiazide Diuretic 1135

3. Dry exposure (7 days) (D) 

4. Dry and pharmaceutical exposure (D+P)

1. Control (C)

Treatments:

21 d colonization

7 d drought

14 d flow rewetting

Total duration of the experiment 42 d

Analytical determination

MATERIAL  AND METHODS

Samples were collected at the end of the experiment

lyophilized and grounded

Pressurized liquid extraction (ASE 350):

• ACN:citric buffer (1:1)

• Tª 60º C, 1500 psi, 3 static cycles of 5 min each

Samples were dry down  and  re‐dissolve  in  100 ml  of water prior solid phase extraction (SPE) on OASIS HLB cartridges

The  eluates were  evaporated  and  reconstituted  in  1 mL  of methanol, 10 µl ISTDs mix were also added.

HPLC‐HRMS (LC‐LTQ‐Orbitrap Velos)

Equipped with electrospray  ionization operating both  in positiveand negative mode.

Signal processing and multivariate analysis

Mass spectra: 100‐700 m/z, deconvoluted and aligned using Sieve software. The markers were exported to R software for multivariate analysis.

MATERIAL  AND METHODS

Identification of the markers:Accurate  massElemental composition.Biochemical data basesMatch up MS/MS response.Confirmation by STDs.

Fig 1.Principal component analysis (PCA)  of significant metabolites of biofilm exposed to the treatments

Clear separation between the biofilm exposed and not exposed to drought (D)

Slight separation between control (C) group and biofilm exposed only to pharmaceuticals (P)

Not clear separation between D and drought + pharmaceuticals (D+P)

RESULTS AND DISCUSSIONMetabolites identification

Table 1.Tentative identification of markers in biofilm after treatments by using LC‐LTQ‐Orbitrap (ESI+ and ESI‐).

METABOLIC PATHWAYS

M/z value ofmarker ion

RT(min)

ESIPutative experimental

molecular formula of ionTheoretical

massError(ppm)

Putative Identity

251.2003 5.29 +C16H27O2[M+H]+ 251.2011 3.2 LPA (16:3)

279.2319 5.58 +C18H31O2[M+H]+ 279.2324 1.8 alfa linolenic acid

297.2424 5.85 +C18H33O3[M+H]+ 297.2429 1.7 A vernolate

191.0193 0.71 ‐C6H7O7[M‐H]‐ 191.0192 ‐0.5 Citrate

187.0975 3.73 ‐C9H15O4[M‐H]‐ 187.0970 ‐2.7 Azelaic acid

269.2119 5.15 ‐C16H29O3[M‐H]‐ 269.2117 ‐0.7 16‐Oxohexadecanoic acid

275.2012 5.76 ‐C18H27O2[M‐H]‐ 275.2011 ‐0.3 Stearidonic acid

255.2323 6.12 ‐C16H31O2[M‐H]‐ 255.2324 0.4 Palmitic acid

339.3264 6.75 ‐C22H43O2[M‐H]‐ 339.3263 ‐0.3 Behenic acid

367.3575 6.94 ‐C24H47O2[M‐H]‐ 367.3576 0.3 Lignoceric acid

409.2353 9.62 ‐C19H38O7P[M‐H]‐ 409.2355 0.4 LPA(0:0/16:0)

253.2170 5.93 ‐C16H29O2[M‐H]‐ 253.2168 ‐0.8 Palmitoleic acid

RESULTS AND DISCUSSIONMetabolites identification

Fragmentation pattern of Lysophosphatidic acid (LPA 

(0:0/16:0). 

Fig.2. A) Total ion chromatogram  from biofilm sample exposed to  pharmaceuticals, B) Mass spectrum of this compound at 30 v CID.

Biofilm response to environmental stressors

RESULTS AND DISCUSSION

Table 2. Significant variation of markers levels (p<0.05) in biofilm after each treatment compared to the control group. It is represented as an increase (↑) or decrease (↓). 

Biofilm response to environmental stressors: Drought

RESULTS AND DISCUSSION

Table 3. metabolite type and response to  a dry period

Lipids were the most affected metabolites. Both saturated and unsaturated fatty acids increased after a dry period: changes in membrane 

fluidity, increase of energy reservoirs and a growth phase of microorganisms after drought. The increase in carboxilic acids: signaling functions.Oxohexadecanoic acid it is involved in unsaturated fatty acids biosynthesis.

Biofilm response to environmental stressors: pharmaceuticals

RESULTS AND DISCUSSION

Table 3. metabolite type and response to  a pharmaceutical exposure

Lipids were the most affected metabolites. Saturated fatty acids decreased after pharmaceutical exposure: higher demand and consume 

of energy. The increase of unsaturated fatty acids: conversion of saturated into unsaturated by the 

organism.Glycerophospholipid: baseline toxicity of pharmaceutical and alteration of the membrane 

structure.

CONCLUSSIONS 

LPA (0:0/16:0) and palmitic acid have been proposed as specific biomarkers of pharmaceutical exposure in biofilm. In the case of drought: palmitoleic, LPA (16:3), alpha‐linoleic, stearidonic, 16‐Oxohexadecanoic, azelaic acids and citrate have been pointed out. Behenic and lignoceric acids have been also proposed but as common biomarkers with different observed effect.

The biosynthesis of fatty acids is the main endogenous metabolic pathway disrupted by both stressors but other biological functions can also be altered: membrane fluidity, signaling, energy reservoirs.    

When biofilm was simultaneously exposed to drought and pharmaceuticals the stressor that produced a higher alteration on the biofilm metabolome was the drought, although a slight alteration due to the co‐ocurrence of pharmaceuticals can not be discarded.

Acknowledgements 

Thanks to all the co‐authors specially to Albert Serra and Natalia Corcoll.

This project was supported by the Scarce Consolider‐Ingenio 2010 (CSD2009‐00065) “Assessing and Predicting Effects On Water Quantity and Quality In Iberian Rivers Caused By Global Change (2009‐2014)” and the Spanish ministry of economy and competitiveness.

To all of you for your attention.

Thank  you !