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Introdução ao Acoplamento Cromatografia Líquida – Espectrometria de Massas

XVII MET – Encontro Nacional sobre Metodologia e Gestão de Laboratórios da Embrapa

©2012 Waters Corporation 1

Pirassununga, 24-25 de Outubro de 2012.

Amadeu Hoshi IglesiasEspecialista de Aplicações em Espectrometria de Massas

[email protected]

AgendaAgenda

� Conceitos e Fundamentos de Espectrometria de Massas

� Instrumentação

� Espectrometria de Massas Sequencial


� Acoplamento LC – MSMS

� Desenvolvimento de Métodos Quantitativos por LC – MS e LC -

MSMS

� Screening com Tof

Conceitos e Fundamentos de


Conceitos e Fundamentos de Espectrometria de Massas

EspectrometriaEspectrometria de de MassasMassas

Técnica analítica para:

identificação de compostos desconhecidos

quantificação de compostos conhecidos.

Sensibilidade: Substâncias podem ser detectadas com quantidadesmínimas de amostra (10-12 g, 10-15 mol pra um composto de massa1000 Daltons.


1000 Daltons.

Seletividade: Substâncias podem ser identificadas e quantificadas emconcentrações muito baixas (uma parte em 1012) em misturascomplexas.

DefiniçãoDefinição IUPACIUPAC

Espectrometria de Massas:

Estudo de sistemas pela formação de íons em fase gasosa, com ou sem fragmentação, que são caracterizados por suas relações massa carga e

abundâncias relativas.


UnidadesUnidades emem um um espectroespectro de de massasmassas

� m/z = relação massa/carga

� Daltons (Da) = u = unidade de massa atômica

� Thomson (Th) = m/z 100


� m/z = Da/z = Th

m/z

Ion abundance (%)

60

40

80

20

EspectroEspectro de de massasmassas

Pico base (ion 100%)Pico base (ion 100%)

100

Pico do íon molecularPico do íon molecular(Precursor)(Precursor)

Íons fragmentoÍons fragmento


Ion abundance (%)

m/z

60

40

80

20

IsótoposIsótopos

IsótoposIsótopos

100243.09

Flurbiprofen (M+H)

100292.02

Thiomethoxam (M+H)


m/z243 244 245

%

0

244.09

m/z292 293 294 295 296 297

%

0

294.02

293.03

295.02

C15 H13 O2 F C8 H10 N5 O3 S Cl

RazãoRazão de de IsótoposIsótopos

Elemento Isotopo Abundância Relativa

+1 Isotopo Abundância Relativa

+2 Isotopo

Abundância Relativa

Carbono 12C 100 13C 1.11

Hidrogênio 1H 100 2H 0.016

Nitrogênio 14N 100 15N 0.38

Oxigenio 16O 100 17O 0.04 18O 0.20

Enxofre 32S 100 33S 0.78 34S 4.40


Cloro 35Cl 100 37Cl 32.5

Bromo 79Br 100 81Br 98.0

http://www.webelements.com/


H H

O

H = 1 Da O = 16 Da

H2O = 18 Da

C C

H

H

HH

H

H

O

C C

H

H

HH

H

H

O

H = 1 DaO = 16 Da C = 12 Da C2H6O = 46 Da


46m/z

intensidade

18m/z

intensidade

18 46

intensidade

m/z

Mistura água + metanolMistura água + metanol

Gráfico m/z x Intensidade iônica


NO

O

OO

CH3CH3

CH3CH3 CH3

CH3

N CH3

CH2

+

O

O

CH3

CH3

Substância intacta

O

CH3

CH3 CH3

CH3


C+

C

O

CH2

O

CH3

O

O

CH2

+

CH3

CH3

CH3

N CH3

NO

CH2

+

O

CH3CH3

3

CH3

N CH3

Íons precursor e fragmentos

ModosModos de de AquisiçãoAquisição

Hemoglobin

%

auto01 4 (0.690) Sm (SG, 1x2.00); Cm (3:4) TOF LD+ 3.17e31529.826

1530.830

1531.835

Contínuo


m/z1528 1529 1530 1531 1532 1533 1534 1535

%

19

5

1531.835

1532.806

auto01 4 (0.690) Cn (Cen,1, 80.00, Ar); Sm (SG, 1x2.00); Cm (3:4) TOF LD+ 7981529.816

1530.824

1531.835

Centróide

CromatogramaCromatograma

Pesticide Mix

100

%

0

100

%

pest03 1: Scan ES+ TIC

5.77e65.054.65

3.820.74

8.625.65

8.0210.62

12.71

pest03 1: Scan ES+ 229

2.08e64.65

TIC (Total ion Chromatogram)

Cromatograma m/z 229


1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00Time0

100

%

0

100

%

0

%


8.23e55.10


1.51e65.64



Principais características que devem ser consideradas em umespectrômetro de massas:

� Sensibilidade

� Exatidão e precisão na medida de massas

� Resolução

Parâmetros AnalíticosParâmetros Analíticos


� Resolução

� Faixa dinâmica

� Linearidade

� Reprodutibilidade

A importância de cada parâmetro depende da aplicação

SensibilidadeSensibilidade

Medida como o valor de relação sinal/ruído para um padrão específico, em uma dada concentração.


ResoluçãoResolução

100%

50%

= 500

Largura do pico ( 50%) = 0.05Da

Resolução (FWHM) = 500 = 10000

Relação massa/carga


500.0 500.1499.9

50%

0.05 Da

m/z

0.05

FWHM = Full Width Half Maximum

ExatidãoExatidão de de massamassa

� A exatidão da medida é calculada como a diferença (erro) entre a massa medida (experimental) e a massa teórica.

� A exatidão de massas é medida em

—miliDaltons (1mDa = 0.001 unidades de massa)

ou

— ppm = partes por milhão = ∆m/m x 106


— ppm = partes por milhão = ∆m/m x 106

Exemplo:

Massa real = 400.0000

Massa medida = 400.0020

Diferença = 0.0020 ( 2 mDa)

0.0020.002

400400x 106x 106Erro em ppm =Erro em ppm = = 5 ppm= 5 ppm

ExatidãoExatidão de de massamassa

Massa nominal e massa exata de alguns elementos

Massa Nominal Massa Exata

� Carbono 12 12.0000

� Hidrogênio 1 1.0078

� Oxigênio 16 15.9949

� Nitrogênio 14 14.0031


� Nitrogênio 14 14.0031

Massa nominal e exata de algumas moléculas

Massa Nominal Massa Exata

C8H7NO+ 133 133.05276

C9H11N+ 133 133.06400

C9H7N3+ 133 133.08915

ResoluçãoResolução e e ExatidãoExatidão de de massamassa

� A resolução de um quadrupolo não é suficiente para diferenciar estes dois compostos.


� Dados de ToF com resolução >10,000, mostra claramente dois picos distintos.

� A massa destes picos pode ser medida com exatidão < 5ppm

CálculoCálculo parapara composiçãocomposição elementalelemental

Tolerância 5 ppm Tolerância 50 ppm


Tolerância 5 ppm Tolerância 50 ppm

30 possibilidades!3 possibilidades

LinearidadeLinearidade

Curva de calibração em uma faixa de 0.5 to 5000pg/µµµµL na colunaR2 = 0.9978Compound name: verapamilCorrelation coefficient: r = 0.998932, r^2 = 0.997865Calibration curve: 192.858 * x + 423.057Response type: External Std, AreaCurve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None

1005151


0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 3250 3500 3750 4000 4250 4500 4750 5000pg/µl0

Response

ReprodutibilidadeReprodutibilidade

Robustness study of the Quattro Premier using verapamil in ESI +ve

350000

400000

Injeção de 200 amostras em um período de 24hr


0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Number of Injections

Peak Area CV= 3.0%

FaixaFaixa DinâmicaDinâmica

Faixa de detecção entre o limite de detecção e a saturação do sinal.

10000

1000 4 ordens de magnitude (104)

Saturação do sinal do instrumento A


100

10

1

2 ordens de magnitude (102)

3 x ruído do detector (LOD)

Saturação do sinal do instrumento B

Instrumento A - faixa dinâmica de 4 ordens de magnitude (104)Instrumento B - faixa dinâmica de 2 ordens de magnitude (102)


Instrumentação

Espectrômetro de MassasEspectrômetro de Massas

Fonte de íons Analisador Detector

Alto vácuo 10-5-10-8 mbar

Sistema de dados

Sistema de


QuadrupoloTOFIon trapFT-ICRSetor Magnético

FotomultiplicadorMultiplicador de elétronsMicrochannel Plate

ESI*APCI*MALDIEICI

*Fonte de íons a pressão atmosférica

inserção

HPLCGCBomba seringa


Instrumentação – Fontes de Ionização

FonteFonte de de íonsíons

A fonte de íons gera íons em fase gasosa a partir de moléculas em fase sólida, líquida ou gasosa (dependendo da fonte).

A ionização pode gerar íons positivos e/ou negativos. As formas principais de ionização são:

1) Ejeção ou captura de elétrons – comum nas fontes de íons EI, CI e FI


2) Protonação ou desprotonação – comum nas fontes ESI, APCI, APPI e MALI

e-

H2C CH CH3 H2C CH CH3

e-

H2C CH CH3 H2C CH CH3

H2N CH C

O

NH CH C

OCH3 CH3

OH

H+H2N CH C

O

NH CH C

OCH3 CH3

OH

H

Ionização a pressão atmosférica Ionização a pressão atmosférica -- APIAPI

� ESI (Electrospray)

� APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization)

� APPI (Atmospheric Pressure Photo Ionization)


� APPI (Atmospheric Pressure Photo Ionization)

� APGC (Atmospheric Pressure Gas Chromatography)

� ASAP (Atmospheric Pressure Solids Analysis Probe)

Ionização por ElectrosprayIonização por Electrospray


High Voltage Power Supply

+

2.5-4.0 kV

Counter Electrode-

+

Líquido

+ + + +

++

+ + + --

+-

+-

+--

+

Mais íons negativos do que positivos

++-

- -

-- +

++

-

- --

++

+ ++

+--+

+

--++ ++

++-+

++ + +

++

++- -

Ionização por ElectrosprayIonização por Electrospray


++-+

+

+ + --+++

+-++

+++

-

Mais íons positivos do que negativos

+ + + +

- - --+ + + + +

--- ---

Alta voltagem

Cone de Taylor

Sonda de Electrospray

Gotículas carregadas

positivamente

+

+

+

+

+ +

+

+

+

RompimentoRompimento das das gotículasgotículas do spray do spray ememESIESI

+

Evaporação do solvente +

+

+

+

+

+

+

+

+ +

+

++

+

+

+

+

+

+ +

Fissão Coulombica


Resíduos de carga na superfície das gotículas do spray.

O solvente evapora das gotículas, que diminuem de tamanho até que a densidade de carga na superfície alcança um ponto no qual a densidade de carga excede a tensão superficial que mantém a gota estável.

Neste ponto, a gotícula sofre fissão, e várias gotículas menores são formadas a partir da principal. Essas gotas menores sofrerão o mesmo processo.

Mecanismos de ionização em ESIMecanismos de ionização em ESI


Ponta da sonda de ElectrosprayPonta da sonda de Electrospray

Capilar de aço inoxidável

Tubo de aço inoxidável


Líquido

Pluma do Electrospray


Líquido

Gás nebulisador


Líquido

Gás nebulisador Pluma do Electrospray


Líquido

Gás nebulisador

Gás de dessolvatação


Líquido

Gás nebulisador


Pluma do Electrospray

Fluxo do gás de dessolvataçãoFluxo do gás de dessolvatação

Nitrogênio

Aquecedor


Nitrogênio

Aquecedor

FonteFonte ZZ--SpraySpray

Aquecedor do gás de dessolvatação

Sonda de Electrospray


Válvula de isolamento

Cone de amostra e suporte do gás Cone de amostra e suporte do gás do conedo cone


Fonte ZFonte Z--SpraySpray

Lentes de RF

Analisador

Cone de extração

Para a bomba rotativa


Gás do cone

Cone de amostragem

Bloco de transferência de íons

Suporte do bloco

Válvula de isolamentoESI/ APcI

TemperaturaTemperatura de de dessolvataçãodessolvatação e e fluxofluxode de gásgás dependemdependem do do fluxofluxo do LCdo LC

Fluxo do LC µL/min

Temperatura de

dessolvatação

Fluxo de gás L/hr


dessolvatação

<10 150 300-400

10-50 150-250 400-500

50-100 250-300 500-700

>100 300-400 700-1000

Íons gerados em ElectrosprayÍons gerados em Electrospray

Íons de Electrospray positivos são produzidos pela adição de um íon positivo (e.g H+, NH4+, Na+). Íons que são formados por íons diferentes de H+ são chamados adutos.

NN C H3

O

H

+ H+

NN C H3

O

H

+

H


O

CH 3

O

CH 3Lidocaína

Íons com carga negativa são formados pela remoção de um próton da molécula, ou por adição de íon negativo.

C H 3

O

OH

C H 3

CH 3

C H 3

O

O

C H 3

CH 3

+ H+

Ibuprofen

Exemplo de ESI Exemplo de ESI -- ßß--CiclodextrinaCiclodextrina

O

OH

OH

OH

O

O

OH

OHOH

O

OOH

OH

OH O

OHO

ß-Ciclodextrina


OH

O

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OHO

O

OH

OH

O

OHO

O

OH

OH

OHß-Ciclodextrina é um anel de 7 unidades de glicose

O

OH

OH OH

O

Elecrospray positivo e negativo da Elecrospray positivo e negativo da ßß--CiclodextrinaCiclodextrina

Quattro micro™

100

%

BetaCyDex_6 1 (2.186) Scan ES- 8.73e61133.36

1134.37

(M-H)-Electrospray negativo


1125 1130 1135 1140 1145 1150m/z0

100

%

0BetaCyDex_5 1 (10.018) 2: Scan ES+

5.53e61135.37

1136.44(M+H)+ Electrospray positivo

10 µg/mL de ß-Ciclodextrina em 20/80 ACN/20 mM Acetato de amôniopH 4 em água, infusão a 10 µL/min

Íons com múltiplas cargasÍons com múltiplas cargas

100

943

893

849

998

1060

Espectro de Electrospray da Mioglobina

17

15

18

1619

20


700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900m/z0

%

808

771

738

707

1131

1212

1305

1414

1542

1696

15

14

13

1211

109

21

22

23

24

Íons de ESI com múltiplas cargasÍons de ESI com múltiplas cargas

Processo de deconvolução

m1 = M+n1Hn1

m1 = M+n1Hn1

m2 = M+n2Hn

m2 = M+n2Hn


2 2

n2

2 2

n2

n2 = n1 + 1n2 = n1 + 1

Íons de ESI com múltiplas cargasÍons de ESI com múltiplas cargas

Espectrômetros de massas separam íons de acordo com a relação massa/carga (m/z).

Carga simples m/z = (M+H+)

Carga dupla m/z = 1/ (M+2H+)


Carga dupla m/z = 1/2 (M+2H+)

Carga n m/z = 1/n (M+nH+)

• Isótopos de íons de carga dupla são separados por 0.5 m/z

• Isótopos de íons de carga tripla são separados por 0.33 m/z

ReconhecendoReconhecendo íonsíons com com múltiplasmúltiplascargascargas

(M+2H)2+


ReconhecendoReconhecendo íonsíons com com múltiplasmúltiplascargascargas

(M+3H)3+


Ionização por electrosprayIonização por electrospray

� Ideal para moléculas de massas baixas até massas muito altas(50 to >500,000 Da)

� Pode produzir espécies multi-carregadas (principalmente paraíons > 1000 Da)


íons > 1000 Da)

� Ionização branda, gera pouca fragmentação

� Fase móvel aquosa (cromatografia de fase reversa)

APCIAPCI

T ~ 400-600 oC


Íons positivos Íons negativos

Corrente na Corona 0.5-3 µA 1-5 µA

Voltagem na Corona 1-4 kV 1-4 kV

Sonda de APcISonda de APcI

Aquecedor

Tubo de açoCapilar de sílica fundida Para inserção da amostra


Aquecedor

Agulha corona(voltagem aplicada)


Aquecedor – 400-600°C

Aquecedor vaporiza o líquido e aquece os gases


Aquecedor – 400-600°C

Gás nebulisador para formação do spray

Corona Pin(Voltage Applied)


Aquecedor

Gás suporte para carregar a amostra para fora da sonda


Aquecedor

Corona

Aquecedor

Descarga em plasma(Amostra vaporizada sai da sonda e é ionizada nesta região)

Capilar de sílica fundida




Aquecedor

Gás de nebulização

Corona

Gás suporte

Ionização por APcIIonização por APcI

� Ionização mais agressiva, com temperaturas mais altas.

� Moléculas de solvente transferidas a fase gasosa (nebulização).

� Ionização ocorre no plasma.


� Função do nitrogênio é evaporar o solvente expelido do capilar.

� Pode apresentar maior sensibilidade do que ESI para algumas

moléculas não polares.

MecanismoMecanismo de de ionizaçãoionização APCI (I)APCI (I)

N +●

N2e-

2e-

2N2

N +● M●+

MCorona Pin

Transferência de carga


N2+●2e- N4+● M●+

M●+

M

� Condições que a fonte está “seca”

� Favorável para compostos relativamente apolares

MecanismoMecanismo de de IonizaçãoIonização APCI (II)APCI (II)

N2+●

N4+●

H2O

H O+●

H3O+●

+OH●

[M+H]+

M

Protonação

Corona Pin


H2O+●

H2O

� Presença de água ou metanol

� Compostos mais polares

Atmospheric Pressure ChemicalAtmospheric Pressure ChemicalIonization (APcI)Ionization (APcI)

� Ideal para moléculas de baixo peso molecular (<1000 Da)

� Forma íons mono-carregados (carga +/- 1)

� Ideal para moléculas de baixo peso molecular (<1000 Da)

� Forma íons mono-carregados (carga +/- 1)


� Gera fragmentação mesmo com baixa energia do cone

� Fase móvel pode ser não polar (cromatografia de fasenormal)

� Gera fragmentação mesmo com baixa energia do cone

� Fase móvel pode ser não polar (cromatografia de fasenormal)

APCI e ESIAPCI e ESI

APcI Electrospray

Ionização Processo em fase gasosa Processo em fase líquida

Sonda Capilar de sílica fundida Capilar de aço inox

Potencial Aplicado a agulha Corona Aplicado ao capilar


Processo Aquecedor da sonda vaporiza Spray de gotículas carregadaso solvente. é produzido.

Todas as moléculas transferidas O solvente é evaporado dasa fase gasosa. gotículas.

Agulha corona produz Gotículas se dividem emíons nitrogênio. gotículas menores.

Moléculas são ionizadas ao Quando as gotículas se tornamcolidirem com íons nitrogênio suficientemente pequenas, íons

são transferidos à fase gasosa.

Ionização APPIIonização APPI


Fonte de APPIFonte de APPI


APPIAPPI

Aplicações para APPI

- Moleculas < 1000 Da

- Moléculas ionizáveis, de polaridade alta ou média.

- Técnica sensível para compostos com alta afinidade por


- Técnica sensível para compostos com alta afinidade por prótons.

- Pode ionizar compostos extremamente não polares que não podem ser ionizados por APCI

- Modos de ionização positivo e negativo.

Técnicas de IonizaçãoTécnicas de Ionização

Mass

a m

olar

10,000

ESI

100,000


Polaridade do analito

Mass

a m

olar

apolar iônico

100

1,000

10

APCI

APPI

EIESI, APCI, APPI


Instrumentação – Ion guides

Hexapolo: RF transfere os íons

Ion guides Ion guides –– Focalização de íonsFocalização de íons


T-Wave™

— Aumento da sensibilidade

— Minimiza ruído

Tranferência de íons

StepWaveStepWave™™


— Extenção da tecnologia T-Wave

Instrumentação –


Instrumentação –

Analisadores de Massas

AnalisadorAnalisador de de massasmassas

O analisador de massas separa íons de acordo com a relação massa/carga (m/z)

Íon com massa molar 1000 Da:

Carga +1 (or -1) pico em m/z 1000Carga +2 (or -2) pico em m/z 500


Carga +2 (or -2) pico em m/z 500

Analisadores de massas mais comuns:

Tempo de Vôo (Time of Flight -ToF)QuadrupoloIon TrapSetor MagnéticoFourier Transform Ion cyclotron resonance (FT-ICR)

AnalisadoresAnalisadores de de massasmassas

Sistema de aquisição de dados

Sistema de inserção


High vacuum 10-5-10-8 mbar


QuadrupoloTOFIon trapSetor Magnético

inserção

Analisador de Massas: QuadrupoloAnalisador de Massas: Quadrupolo


QuadrupoloQuadrupolo

• O quadrupolo funciona como um filtro de massas


Íon com tragetória estávelÍons rejeitados

QuadrupoloQuadrupolo


Teoria do QuadrupoloTeoria do Quadrupolo

O íon m tem tragetóriainstável se o quadrupoloopera com valores de Ue V nesta região


O íon m tem tragetóriaestável se o quadrupoloopera com valores de Ue V nesta região

Teoria do QuadrupoloTeoria do Quadrupolo

Linha operacional do quadrupolo inadequada


com tragetórias estáveis

com tragetórias estáveis

Apenas m3 tem tragetória estável

Teoria do Quadrupolo Teoria do Quadrupolo

Resolução do Quadrupolo


Resolução do QuadrupoloResolução do Quadrupolo


Resolução do QuadrupoloResolução do Quadrupolo

� Resolução unitária


Ion trapIon trap

� A voltagem RF é aplicada ao eletrodoanel (ring electrode) para confinar(trap) os íons.

� Damping gas (Hélio 99.998%) é necessário para reduzir a energia dos íons

Detection

End Cap


necessário para reduzir a energia dos íonsatravés de colisões, reduzindo as oscilações até que eles estabilizempróximos ao centro do eletrodo, onde oscampos de confinamento estão próximosdo ideal (menos distorcidos), apresentandomelhor resolução e sensibilidade.

RingElectrode

Ion InjectionEnd Cap

Componentes do Ion TrapComponentes do Ion Trap

End Caps


Ion trapmontado

Ring

Ion Trap Ion Trap -- MSMSnn

• Variando a voltagem RF no eletrodo, é feita a varredura de massas.

• MS/MS é possível selecionando um íonno trap, fragmentando-o por colisõescom He, e então fazendo a varredurapara detecção dos fragmentos. É

Detection

End Cap


para detecção dos fragmentos. É possível fazer vários estágios de fragmentação (MSn).

RingElectrode

Ion InjectionEnd Cap

Ion TrapIon Trap


Analisador do Tempo de VooAnalisador do Tempo de Voo

Laser

Detector


Processamento do sinalm/z > m/z

Detector

Laser



Teoria do Tempo de VôoTeoria do Tempo de Vôo

Aceleração Detector


m/z = t2 (2Ve/d2)

Tempo ápós aceleração0

Sinal do detector


Laser

Detector




Laser

Detector


Processamento do sinal

Espectro

m/z > m/z


Detector


m/z > m/zProcessamento do sinal

TOF ReflectronTOF Reflectron

Laser

Reflectron


Detector

Resolução do TOFResolução do TOF

1000.0

1001.0

1000.6

ToF Linear ToF Reflectron

FWHM (Full Width Half Medium)

R = m/∆m


1001.0

1002.0

R = m / largura do pico a meia altura= 1000/0.1 = 10,000

Espectro de Maldi TOF LinearEspectro de Maldi TOF Linear0;G3 28-Apr-20045 pmol IgG (SA) with high mass detector

100 x1072900

48797

Íons de alta massa molar monocarregados


m/z50000 75000 100000 125000 150000 175000 200000 225000 250000 275000 300000 325000 350000 375000

%

0

67013

145044

97317

122390

287805


Instrumentação – Detectores

AnalisadoresAnalisadores de de massasmassas

Sistema de aquisição de dados

Sistema de inserção


High vacuum 10-5-10-8 mbar


FotomultiplicadorMultiplicador de elétronsMicrochannel Plate

inserção

DetectoresDetectores

O detector tem a função de detectar e amplificar o sinal da corrente de íons que vem do analisador e transferir o sinal para o sistema de processamento de dados.

Os três tipos principais de detectores são:fotomultiplicadormultiplicador de elétrons


multiplicador de elétronsmicrochannel plate (MCP)

O detector depende do tipo de analisador:Fotomultiplicador e multiplicador de elétrons são utilizados

com analisadores quadrupolo, setor magnético e ion trap e apresentam larga faixa dinâmica (105-108)

MCP é utilizado com analisadores TOF e apresentam resposta extremamente rápida, com alta sensibilidade.

Multiplicadora de elétronsMultiplicadora de elétrons

A conversion dynode is used to convert either negative or positive ions into electrons. Higher potentials on the

conversion dynodes are used to accelerate high mass ions and thereby enhance sensitivity.

Um dinodo de conversão é utilizado para converter íons positivos ou negativos em elétrons. Potenciais mais altos nos dinodos de conversão são utilizados para acelerar íons de massas altas e assim melhorar a sensibilidade.


+

+ ++--

-

Electron Multiplier(voltage setting lower than Dynode)

Conversion Dynode (Voltage 1- 20 kV)

Current is measured

++

Mass Analyser

and thereby enhance sensitivity.a sensibilidade.

FotomultiplicadoraFotomultiplicadora

High voltage conversion dynode (converts either positive or

negative ions into electrons)

Electrons impinge onto light emmitting phosphor that is

optically coupled to a photomultiplier

Photomultiplier permanently sealed in its own glass

envelope. The detector is protected from contamination and

Dinodo de conversão de alta voltagem converteíons positivos ou negativos em elétrons, que sãoem seguida convertidos em luz (fótons).

O Fotomultiplicador é selado em um envelope devidro, e assim é protegido de contaminação, o quefaz com que seu tempo de vida seja mais longo.


envelope. The detector is protected from contamination and

thus longer lifetimes are achieved.

The photomultiplier has a 10 year maintenance-free lifetime.

dynodedynode

phosphorphosphorphotomultiplierphotomultiplier

faz com que seu tempo de vida seja mais longo.

Um fotomultiplicador tem um tempo de vidaestimado de 10 anos sem manutenção

FotomultiplicadorFotomultiplicador –– DetecçãoDetecção de de íonsíons positivospositivos

Feixe de íons

Dinodo de conversão ≤ -20 kV

Dinodo de conversão ≤ +10

X+X+X+X+X+X+X+

e-

e-


Dinodo de conversão ≤ +10 kV

Disco Phosphor ≤ +20 kV

Fótons

Eletronse-

e-

e-e-

FotomultiplicadorFotomultiplicador –– DetecçãoDetecção de de íonsíons negativosnegativos

X- X- X- X- X-X-X-X-X-

Dinodo de conversão ≤-20 kV

Dinodo de conversão ≤+10 kV


e-

e-e-

e-

X-

e-Dinodo de conversão ≤+10 kV

Microchannel plateMicrochannel plate

A maioria dos espectrômetros TOF utilizam o detector multichannel plate (mcp), que apresenta tempo de resposta < 1 ns e alta sensibilidade (sinal de um único íon > 50 mV).

Apenas alguns poucos das centenas


Apenas alguns poucos das centenas de canais do MCP são afetados pela detecção de um íon, e assim é possível a detecção de muitos íons ao mesmo tempo, o que é importante para MALDI, onde centenas de íons podem ser gerados em alguns nanosegundos.

QToF Premier MicroChannel Plates (MCPs)QToF Premier MicroChannel Plates (MCPs)

MCPs in situ Placa de MCP


O MCP é um multiplicador de elétrons muito rápido, no qual um único íon pode resultar em 1x107 electrons sendo produzidos em um período de 4-5 ns.

Novos detectoresNovos detectores

� Multiplicador de electrons ultra-rápido + eletrônica ADC



Espectrometria de Massas Sequencial

Argon

Espectrometria de Massas Espectrometria de Massas SequencialSequencial


Fonte de íons

1º analisadorSeleção do íon precursor

Quadrupolo

Câmara de colisão 2º analisadorSeleção de fragmentos

Quadrupoloou TOF

Detector

Câmara de colisão para MS/MSCâmara de colisão para MS/MS

Hexapolo

Feixe de íons


Aceleração de íons na entrada e saída

TecnologiaTecnologia TT--WaveWave™™

time

ions


� Aquisições de MRM rápidas— 100 pontos/segundo

— Mantém sensibilidade

— Minimiza contaminação cruzada

Travelling Wave Pulse

Collision Cell

TecnologiaTecnologia ScanWaveScanWave™™


Collision Cell

TriWaveTriWave™™


• Aumento capacidade identificação• Menores LOQs• Espectros mais limpos

100

0

100

%

275

Espectro de MS/MS da Clorfeniramina (MW=274) Íons fragmento de m/z=275

Energia de colisão = 5 eV


M+H

Efeito da alteraEfeito da alteraçção na energia de colisãoão na energia de colisão


150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290m/z0

100

%

0

100

%

0

%275

230

230

275

230




100

0

100

%

230


M+H

Efeito da alteraEfeito da alteraçção na energia de colisão ão na energia de colisão (Cont.)(Cont.)

Espectro de MS/MS da Clorfeniramina (MW=274) Íons fragmento de m/z=275


150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290m/z0

100

%

0

% 167230

201180 202

167

201180 194 230



100 1.63e7260

116

183

ExemploExemplo de MS/MS de MS/MS -- PropanololPropanolol

M+H

Espectro de MS/MS do Propanolol (MW=259) Íons fragmento de m/z=260


60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280m/z0

%72

58

7498

86

157

155218

Espectros de MS/MS podem ser bastante complexos

[Glu1]-Fibrinopeptide B Glu-Gly-Val-Asn-Asp-Asn-Glu-Glu-Gly-Phe-Phe-Ser-Ala-Arg

(M+H)+ ��

Magnfied by 100

(M+2H)2+ �MS Scan

Exemplo de Espectros de MS/MS de um Exemplo de Espectros de MS/MS de um ííon on precursor com carga duplaprecursor com carga dupla

100

%

6.34e7x100785.7

1570.4


(M+H)+ ��

MS/MS Scan

200 400 600 800 1000 1200 1400m/z0

100

%

0

%333.1 480.1

684.1

1570.4

1221.1

GluFib_Dau 1 (3.370) Sm (SG, 2x0.50)2.89e6333.0186.9

240.0

684.0

480.0

382.0 627.0

812.9

739.9

942.01056.0

1171.0 1285.0

Íons produzidos por ESI ou APcI

Fragmentos gerados por colisão e íons não fragmentados

Fragmentação na fonte APIFragmentação na fonte API

N

Fragmentação induzida pela voltagem do cone


+ + + +

Voltagem do cone elevada

N2

N2 N2

Íons que são acelerados pela voltagem do cone colidem com moléculas de nitrogênio

++

++

H

733 Da

157 Da

Exemplo de fragmentação induzida pela voltagem do cone


H 575 Da

157 Da

Fragmentação da Fragmentação da Eritromicina induzida Eritromicina induzida pela voltagem do pela voltagem do conecone

MS1Câmara de colisão MS2

Espectro de íons produto (ou fragmentos, ou de íons filhos)

MS/MS Quadrupolo Tandem


VarreduraCIDEstático

MS/MS : Identificação de substâncias desconhecidas

Espectro de íons produto



Espectro de íons precursores

MS1Câmara deColisão MS2



EstáticoCIDVarredura

MS/MS : Estrutural, classes de substâncias


Espectro de íons precursores


Espectro de perdas neutras

MS1CollisionCell MS2



MS1 Cell MS2

ScanningCIDScanning

MS/MS : Estrutural, classes de substâncias

MS1CollisionCell MS2

Monitoramento de reações Múltiplas - Multiple Reaction Monitoring (MRM)



StaticCIDStatic

MS/MS : Análise de compostos alvo

Survey Scan: CromatogramasSurvey Scan: Cromatogramas

MS/MS chromatogram


MS chromatogram

Survey Scan : Espectro de MS/MS Survey Scan : Espectro de MS/MS

Peak at 7.7 min


Peak at 7.1 min

Peak at 4.7 min

Survey Scan : Espectro de MS/MSSurvey Scan : Espectro de MS/MS

Peak at 7.1 min


Peak at 7.7 min

Peak at 4.7 min

MS/MS MS/MS QuadrupoloQuadrupolo--TOF (TOF (QTofQTof) )


Massa exata em MS/MSMassa exata em MS/MS


Configurações de equipamentosConfigurações de equipamentos

HPLC MCP

MALDI

ESIAPCIAPPI Ion Trap/FTICR

Quadrupole/TOF

Ion Trap/TOF

TOF/TOF

Inserção Fonte de íons Analisador Detector


GC

MALDI

Magnetic Sector

TOF

EI/CI

Ion Trap

TOF/TOF

Quadrupole Eletron MultiplierPhotomultiplier


Acoplamento LC - MSMS

Divisor de fluxo?? (Splitter)

Divisor de fluxo?? (Splitter)

Detector UV (Opcional)Detector UV (Opcional)

LC/MSLC/MS


Sistema de cromatografia líquida

Sistema de cromatografia líquida

DescarteDescarte

SondaSonda

MSMS

Coluna analítica

O Fluxo de solvente determina se um divisor de fluxo é necessário.O Fluxo de solvente determina se um divisor de fluxo é necessário.

LC/MS(MS) analysisLC/MS(MS) analysis

� LC/MS System (Single quadrupole)– Full Scan LC/MS

– Single Ion Recording (SIR)

� LC/MS (TOF)– Full Scan LC/MS


– Full Scan LC/MS

� LC/MS/MS (ion trap)– Full Scan LC/MS

– Fragment (daughter) ion monitoring

– Single Ion Recording (SIR)

– Survey Scan (MS and MS/MS)

LC/MS(MS) analysisLC/MS(MS) analysis

� LC/MS/MS System (Q-TOF)— Full Scan LC/MS

— Product ion scan

— DDA (MS and MS/MS)

� LC/MS/MS System (Quadrupole Tandem)


� LC/MS/MS System (Quadrupole Tandem)— Full Scan LC/MS

— Fragment (daughter) ion monitoring

— Precursor (parent) ion monitoring

— Neutral loss monitoring

— Neutral gain monitoring

— Single Ion Recording (SIR)

— Multiple Reaction Monitoring (MRM)

— Survey Scan (MS and MS/MS)

Cromatogramas de SIR and MRMCromatogramas de SIR and MRM

15pg/ml std

100

ASSAY09 Sm (Mn, 2x2) MRM of 3 Channels AP+ TIC

3.76e4288.1

15pg/ml std

15pg/ml std

Time0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75

%

0

100

ASSAY09 Sm (Mn, 2x2) MRM of 3 Channels AP+ 288.1 > 58

3.02e4288.1 288.1>58

TIC


TIC (Total ion chromatogram) = Soma do sinal das transições individuais

Time0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75

%

0

15pg/ml std

Time0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75

%

0

100

ASSAY09 Sm (Mn, 2x2) MRM of 3 Channels AP+ 274.1 > 182.1

1.71e4288.1

15pg/ml std

Time0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75

%

0

100

ASSAY09 Sm (Mn, 2x2) MRM of 3 Channels AP+ 294.1 > 64

3.94e3288.1

274.1>182.1

294.1>64

Integração dos picosIntegração dos picos

Após a integração do pico, a resposta é apresentada como área ou altura do pico (geralmente área).

No método de calibração externa:


Resposta = Area analito

No método de calibração interna:

Resposta = Area analitoArea padrão interno

HPLC x UPLCHPLC x UPLCEquação de van DeemterEquação de van Deemter


Benefícios da Redução do Tamanho Benefícios da Redução do Tamanho da Partículada Partícula

HPLC

5 µm – 150 mmL/dp = 30.000Injeção = 5,0 µLFluxo= 0,2 mL/minRs (2,3) = 2,28

3,5 µm – 100 mmL/dp = 28.571Injeção = 3,3 µL


UPLCTM


Fluxo = 0,5 mL/minRs (2,3) = 2,34

Injeção = 3,3 µLFluxo= 0,3 mL/minRs (2,3) = 2,32


Fluxo = 0,6 mL/minRs (2,3) = 2,29

Benefícios da Redução do Tamanho Benefícios da Redução do Tamanho da Partículada Partícula

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

HPLC Gradiente5 µm Picos = 70Pc = 143


AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00

UPLC Gradiente1,7 µm Picos = 168Pc = 360

Aumento de 2,5x

Mais informação no mesmo tempo de análise

Trasnferência de Métodos Trasnferência de Métodos HPLC x UPLCHPLC x UPLC


Colunas de UPLCColunas de UPLC


Benefícios da Utilização de UPLCBenefícios da Utilização de UPLC

� Aumento da resulção na análise de amostras complexas;

� Diminuição da supressão de ionização causada por espécies que coeluem

com o analito de interesse, acarretando em aumento de sensibilidade em

métodos quantitativos;


� Diminuição do tempo de análise sem comprometimento de resolução

cromatográfica;

� Diminuição da largura do pico cromatográfico, “concentrando” mais o

analito de interesse ao entrar na interface com o MS, aumentando a

sensibilidade do método.

Fatores a serem considerados no Fatores a serem considerados no desenvolvimento de um método de LC/MSdesenvolvimento de um método de LC/MS

1. Modo de ionização.

2. Coluna.

1. Diâmetro e fluxo de solvente


1. Diâmetro e fluxo de solvente

2. Tubulação

3. Fase móvel. Pode afetar tanto a cromatografia quanto no processo de ionização.

� ESI : 1 - 500 µL/min em análises de rotina -

É possível fluxo de até 1 mL/min para as novas fontes de ionização. Anteriormente era utilizado um divisor de fluxo para reduzir o fluxo para aproximadamente 250 µL/min na sonda de ESI.

1. Modo de ionização: Fluxo do LC no MS1. Modo de ionização: Fluxo do LC no MS


� APCI : 0.2 - 2 mL/min

Não é necessário redução do fluxo do LC (splitter). Verificar estabilidade da amostra!

2. 2. SeleçãoSeleção de de colunascolunas

� Existe uma grande variedade de colunas de vários fornecedores.

Os principais fatores a considerar são:

- Separação entre analitos e de outros compostos interferentes na matriz.


matriz.

- Resolução dos picos

� Material da fase estacionária da coluna

Partículas da fase estacionáriaPartículas da fase estacionária

Tamanho doporo:100-120 Å e300 Å


300 Å

Seleção de colunaSeleção de coluna

A fase móvel deve ser compatível com a coluna. Por exemplo:

Muitos tipos de colunas de fase reversa irão degradar rapidamente se for utilizada fase móvel com o pH alto (básico).


Colunas HILIC utilizam gradientes onde a composição da fase móvel varia de baixa proporção de água para alta proporção de água (ao contrario dos gradientes de fase reversa). A proporção de água da fase móvel raramente vai acima de 60%.

Tubulação de PEEKTubulação de PEEK

Ainda não existe convenção oficial para a coloração da tubulação de Peek, mas geralmente as cores utilizadas são:

Cor

Bege (Natural)

Preto

Vermelho

ID (in.)

0.0025

0.004

0.005

Fluxo típicoInfusão0.1 a 0.6 mL/min0.3 a 1 mL/min


Vermelho

Amarelo

Azul

Laranja

0.005

0.007

0.010

0.020

0.3 a 1 mL/min0.7 a 2 mL/min1 a 5 mL/minLinhas de descarte

3. Fase móvel3. Fase móvel

� pH

� Solventes e aditivos


� Composição é muitas vezes uma opção entre o que apresenta melhor ionização e o que dá a melhor separação em LC.

Solventes e aditivos geralmente utilizadosSolventes e aditivos geralmente utilizados

Solventes

– Água

– Acetonitrila

– Metanol

– Isopropanol

Aditivos

– Ácido acético

– Ácido fórmico

– Hidróxido de amônio

– Acetato de amônio*

– Formiato de amônio*


– * Podem ser utilizados como tampão.

– Concentração de sais deve ser mantida abaixo de 10 mM.

Efeito da fase móvel: CetoprofenoEfeito da fase móvel: Cetoprofeno

ACN

MeOH

ACN / Ácido fórmico

18.1

12.7

39.6


Time3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00

%

0

100

MeOH / Ácido fórmico

ACN / NH4OH

MeOH / NH4OH

Gradiente = 5% B em 0 min; 90% B em 8.5 min; 90% B em 8.5 até 11 min; Concentraçãode aditivos orgânicos: Ácido fórmico = 0.05%; NH4OH = 2.9 mM (0.02%)

60.6

37.9

100.0

IPA, etanol, 2-metoxietanol, etc.

Ácido trifluoroacético (TFA) - Proteinas e Peptídeos

Trietilamina (TEA) – Pode melhorar ionização no modonegativo

IPA, etanol, 2-metoxietanol, etc.

Ácido trifluoroacético (TFA) - Proteinas e Peptídeos

Trietilamina (TEA) – Pode melhorar ionização no modonegativo

Outros solventes e aditivosOutros solventes e aditivos


negativo

Tetrahidrofurano (THF)

Cromatografia de fase normal

Solventes para limpeza de colunas somente (CH2Cl2, Acetona)

negativo

Tetrahidrofurano (THF)

Cromatografia de fase normal

Solventes para limpeza de colunas somente (CH2Cl2, Acetona)

� TFA – Utilizado na análise de proteínas e peptídeos– Causa supressão de íons em electrospray positivo quando em

concentrações acima de 0.1%.– Causa forte supressão de íons em ESI negativo.

� TEA– Pode melhorar o sinal em ESI negativo de compostos pouco

básicos.

Solventes e aditivos que devem ser utilizados com Solventes e aditivos que devem ser utilizados com cuidadocuidado


básicos.– Facilmente ionizado, gerando um sinal intenso (M + H)+ em m/z

102.– Suprime o sinal em ESI positivo para compostos pouco básicos.

� THF– 100% THF é altamente inflamável.– Não deve ser utilizado com APCI se ar for utilizado como gás

nebulizador.

100 3652.30e6 Exemplo: Cetoéster

Electrospray positivo

Cromatograma extraído do íon m/z = 365 a partir de dados de

Sem AditivosApenas águae ACN

Efeito do ácido fórmico e TFAEfeito do ácido fórmico e TFA


6.00 7.00 8.00 9.00Time0

% 7.56

m/z = 365 a partir de dados de MS em Full Scan.

Fase móvel = 30/70 Água/ACN

Considerando a ionização por ESI Positivo, abaixar o pH pode ajudar

100 3652.19e6

7.52100 3652.30e6

0.03%Ácido fórmico

A adição de ácidofórmico à fase móvelreduziu o pH da fasemóvel e aumentou o sinal [M+H+] em ESI positivo.

Sem AditivosApenas águae Acn



6.00 7.00 8.00 9.00Time6

%

6.00 7.00 8.00 9.00Time0

% 7.56

positivo.

100

Raylo_1_004 Sm (Mn, 2x3) F1365

2.30e6 100 3652.30e6

0.03%TFA

100 3652.19e6

7.52


Sem AditivosApenas águae Acn

0.03%Ácido fórmico


6.00 7.00 8.00 9.00Time0

% 7.56

8.00 10.00Time0

%

9.24

6.00 7.00 8.00 9.00Time6

%

Sais não voláteis (fosfatos, boratos, citratos, etc.)

Detergentes (suprimem ionização)

Ácidos inorgânicos (ácido sulfúrico, ácido fosfórico, etc.)

Sais não voláteis (fosfatos, boratos, citratos, etc.)

Detergentes (suprimem ionização)

Ácidos inorgânicos (ácido sulfúrico, ácido fosfórico, etc.)

Solventes e tampões que não devem ser Solventes e tampões que não devem ser utilizadosutilizados


Atacam PEEK

HNO3 concentrado

H2SO4 concentrado

Incham PEEK

– DMSO

– THF

– CH2Cl2

Solventes que não devem ser utilizados com tubulação de PEEK

Splitter de volume morto zero

Tubulação PEEK

Sonda de

Electrospray

Coluna

analítica

Divisor de fluxoDivisor de fluxo


Para reduzir o fluxo para o MS podemos:

— Reduzir o tamanho da tubulação de descarte.

— Aumentar o diâmetro da tubulação de descarte.

Tubulação de PEEK

Descarte, DAD ou Coletor de frações

O sinal em ESI é dependente da concentração do analito na solução. Isso permite que seja feita a divisão do fluxo sem redução na intensidade do sinal.

O sinal em ESI é dependente da concentração do analito na solução. Isso permite que seja feita a divisão do fluxo sem redução na intensidade do sinal.

1.0 1.0 mL/minmL/min1.0 1.0 mL/minmL/min

0.1 mL/min0.1 mL/min0.1 mL/min0.1 mL/min

SplittingSplitting PósPós--ColunaColuna


As vantagens do divisão do fluxo são:

• Reduz a necessidade de limpeza na fonte

• Otimiza as condições de fluxo.

As vantagens do divisão do fluxo são:

• Reduz a necessidade de limpeza na fonte

• Otimiza as condições de fluxo.

0.9 mL/min0.9 mL/min0.9 mL/min0.9 mL/min

100

%

FlowSplitTest_NoSplit F1397.6 > 361.7

5.10e35.72

100

%

FlowSplitTest_Split F1397.6 > 361.7

4.78e35.72

Fluxo do LC = 0.6 mL/minSplit 1:2 (0.3 mL/min to MS)

Fluxo do LC = 0.6 mL/minSem Split (0.6 mL/min to MS)

Efeito do fluxo de solvente no sinal em Electrospray Efeito do fluxo de solvente no sinal em Electrospray (An(Anáálise em MRM de dois compostos)lise em MRM de dois compostos)


4.00 5.00 6.00Time0

100

%

0FlowSplitTest_NoSplit F1

335.6 > 291.81.68e4

4.91

4.00 5.00 6.00Time0

100

%

0FlowSplitTest_Split F1

335.6 > 291.81.86e4

4.92

� Gradientes de fase móvel podem ser utilizados para separar analitos de componentes interferentes da matriz, que podem causar supressão de íons.

� O sistema de LC é configurado com fases móveis orgânica e aquosa.

Gradientes de fase móvel em LCGradientes de fase móvel em LC


� A porcentagem do solvente orgânico na fase móvel é aumentado gradativamente durante a corrida (em fase reversa).

� Gradientes são utilizados para melhorar a separação e reduzir o tempo de análise e preparação de amostra em LC.

Geralmente, um gradiente tem 3 fases.

1) Início da corrida: Fase móvel tem uma baixa proporção de solvente orgânico. Os analitos são retidos na coluna e os sais são eluídos da coluna.

2) Meio da corrida: A composição da fase móvel é alterada

Geralmente, um gradiente tem 3 fases.

1) Início da corrida: Fase móvel tem uma baixa proporção de solvente orgânico. Os analitos são retidos na coluna e os sais são eluídos da coluna.

2) Meio da corrida: A composição da fase móvel é alterada



2) Meio da corrida: A composição da fase móvel é alterada gradativamente de baixa proporção de solvente orgânico para alta proporção de solvente orgânico. Neste tempo, os analitos eluem da coluna e são transferidos ao MS onde são analisados.

3) Final da corrida: Fase móvel com alta proporção de solvente orgânico, que lava a coluna eliminando componentes hidrofóbicos da matriz que permaneceram na coluna.

2) Meio da corrida: A composição da fase móvel é alterada gradativamente de baixa proporção de solvente orgânico para alta proporção de solvente orgânico. Neste tempo, os analitos eluem da coluna e são transferidos ao MS onde são analisados.

3) Final da corrida: Fase móvel com alta proporção de solvente orgânico, que lava a coluna eliminando componentes hidrofóbicos da matriz que permaneceram na coluna.

100 %100 %

Coluna é Coluna é

Analitos retidos na coluna, sais passam pela coluna e são eliminados.Analitos retidos na coluna, sais passam pela coluna e são eliminados.

Analitos eluem da coluna

Analitos eluem da coluna

Componentes Componentes


Percentual Percentual


0 %0 %TempoTempo

Coluna é equilibrada para a próxima corrida

Coluna é equilibrada para a próxima corrida

Componentes hidrofóbicos da matriz são eluídos da coluna.

Componentes hidrofóbicos da matriz são eluídos da coluna.

Percentual orgânico na fase móvel


Gradientes de fase móvelGradientes de fase móvel



100 %100 %


0 %0 %TempoTempo

Se os analitos de interesse eluem da coluna no tempo t, então a porcentagem do componente orgânico pode aumentar rapidamente após o tempo t para reduzir o tempo de análise.

Se os analitos de interesse eluem da coluna no tempo t, então a porcentagem do componente orgânico pode aumentar rapidamente após o tempo t para reduzir o tempo de análise.

tt

LC-AS

Coluna analíticaDescarte

LC-AS

Coluna analíticaDescarte

Exemplo de valvula de desvio de fluxoExemplo de valvula de desvio de fluxo

1

6

5

1

6

5


LC-AS = LC AutosamplerMS

‘Load’ Position ‘Inject’ Position

MS

5 5

No método de MS, programar o solvent delay para o período de tempo que a válvula será mantida na posição ‘Load’.

Considerações da preparação da amostra para Considerações da preparação da amostra para LC/MSLC/MS

� Em alguns casos pode ser necessário limpar as amostras antes da análise

� Componentes interferentes na amostra podem entupir a coluna ou então eluir no mesmo tempo que os analitos, o que pode ocasionar em supressão de íons.

� Extração líquido-líquido, SPE, ou outros métodos de limpeza de


� Extração líquido-líquido, SPE, ou outros métodos de limpeza de amostra podem ser necessários.

� Derivatização pode ser necessária.

� Filtros e pré-colunas podem ajudar.

Efeito da solução da amostra na cromatografiaEfeito da solução da amostra na cromatografia

Ácida

Ótimo formato de pico, mas com muito carryover

0

100

%

0

100

%

Purge_Soln_5_Acidic MRM of 1 Channel ES+ TIC

1.97e44.76

Purge_Soln_4_Neutral MRM of 5 Channels ES+ TIC

8.61e44.74

Purge_Soln_3_WeakBase MRM of 1 Channel ES+ TIC

0

100

%

0

100

%

Purge_Soln_5_Acidic MRM of 1 Channel ES+ TIC

1.97e44.76

Purge_Soln_4_Neutral MRM of 5 Channels ES+ TIC

8.61e44.74


0.1% Ácido fórmico0.1% Ácido fórmico

Água/MeOH(Sem aditivos)Água/MeOH(Sem aditivos)

Solução daamostrautilizada

Solução daamostrautilizada


Variação do pH

Básica

3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00Time6

100

%

2

100

%

1

100

%


2.43e44.54

Purge_Soln_2_Base MRM of 1 Channel ES+ TIC

2.01e44.58

Purge_Soln_1_StrongBase MRM of 1 Channel ES+ TIC

2.25e44.22

4.58

3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00Time6

100

%

2

100

%

1

100

%


2.43e44.54

Purge_Soln_2_Base MRM of 1 Channel ES+ TIC

2.01e44.58

Purge_Soln_1_StrongBase MRM of 1 Channel ES+ TIC

2.25e44.22

4.58

0.01% NH4OH &2 mM de acetato de amônio0.01% NH4OH &2 mM de acetato de amônio

0.1% NH4OH &2 mM de acetato de amônio0.1% NH4OH &2 mM de acetato de amônio

0.2% NH4OH & 2 mMde acetato de amônio0.2% NH4OH & 2 mMde acetato de amônio Divide

o pico

Bom formato de pico com pouco carryover

O que é Efeito Matriz (EM)?O que é Efeito Matriz (EM)?

� Alteração (aumento/diminuição) na resposta do analito

quando analisado em solução e em na matriz de interesse;

� Alteração se dá em função da natureza competitiva do

processo de ionização em MS;


processo de ionização em MS;

� Comumente observado em matrizes complexas: plasma,

urina, extratos vegetais, resíduos de animais e vegetais.

Quais as consequências do EM?Quais as consequências do EM?

� Baixa exatidão;

� Baixa reprodutibilidade;

� Diminuição da linearidade;

� Alteração no tempo de retenção;


� Alteração no tempo de retenção;

� Imprevisibilidade: pode causar diminuição/aumento do

sinal dentro do mesmo lote de amostras.

Fatores que afetam a formação de Fatores que afetam a formação de íons em ESIíons em ESI

� Variáveis do Sistema:

– Campo elétrico;

– Diâmetro do capilar;

– Voltagem do capilar.

� Variáveis do Composto:


� Variáveis do Composto:

– Atividade superficial;

– Afinidade por prótons;

– Energia de solvatação.

� Variáveis do Método:

– Fluxo de fase móvel;

– Concentração de eletrólitos;

– pH.

O que pode dar errado no processo?O que pode dar errado no processo?

O que

Ficar em

solução

Precipitar

como sólido

neutro

Transferência

de cargas


O que

pode dar

errado?Precipitar

como

composto de

inclusão

Transferência

para fase

gasosa como

neutro

Formação de

cluster com

solventes

Como monitorar o EM?Como monitorar o EM?I I –– Método de Infusão PósMétodo de Infusão Pós--ColunaColuna


Infusão Constante do Padrão

Injeção de Branco e

Matriz Extraída

Informação Qualitativa do EM


Infusão em Solvente



Infusão em Matriz Extraída Dependente da matriz

Dependente do composto


Como prevenir supressão de íonsComo prevenir supressão de íons

� Curva de calibração feita na matriz

� Padrões internos• análogos

• Marcados isotopicamente (13C, D, 15N, 18O, etc)

� Melhorar a limpeza da amostra (clean up).


� Usar cromatografia para separar componentes que co-eluem:

– UPLC apresenta melhor resolução, ou seja picos mais separados, reduzindo o efeito de matriz.

Efeitos de matrizEfeitos de matriz

Branco de matriz (sem analitos)

Solução de padrões em solvente (sem matriz)

Quantificação dos efeitos de matriz


Padrões adicionadosna matriz extraída

Efeito de matriz % = ( - 1) x 100Resposta Analitos adicionados após extração

Resposta Solução de padrões em solvente

- As duas amostras devem estar na mesma solução- Valor negativo = supressão- Valor positivo = acréscimo

RecuperaçãoRecuperação

Adição de padrões no branco de matriz

Branco de matriz (sem analitos)


( )Adição de padrões na matriz extraída

% RE = 100 x

Resposta analitos adicionadosantes da extração

Resposta analitos adicionados após a extração

Recuperação do procedimento de extração:

Desenvolvimento de Métodos Quantitativos


Desenvolvimento de Métodos Quantitativos por LC – MS e LC - MSMS

MS1

Single Ion Recording (SIR)

MS/MS com Quadrupolo TandemMS/MS com Quadrupolo Tandem


Estático

MS : Análise de compostos alvo

MS1Câmara deColisão MS2

Multiple Reaction Monitoring (MRM)



EstáticoCIDEstático

MS/MS : Análise de compostos alvo

MRM

MRM e SIR em matrizes complexas


SIR

Etapas do desenvolvimento de método Etapas do desenvolvimento de método de LC/MSde LC/MS

Experimentos de infusão para definir o método de ionização e otimizar as condições de MS para a sensibilidade e seletividade necessária.

Otimização de valores da energia do cone para cada íon precursor

Experimentos de MS/MS para determinação dos fragmentos a serem monitorados em MRM e

100

TIBFS1 MS2 AP+ TIC

2.92e969.169.0

69.069.069.0

69.0


Experimentos de MS/MS para determinação dos fragmentos a serem monitorados em MRM e otimização da energia de colisão para cada transição.

Desenvolvimanto do método de LC

Otimização das etapas de extração e preparação da amostra. Estudos de recuperação e efeito de matriz.

Criação do método para processamento de dados e quantificação.

Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50

%

0

69.069.069.169.2 69.0 69.069.0

69.069.069.2 69.069.1 69.1 69.169.1 69.169.2

69.0 69.1 69.1

69.069.0 69.169.2 69.2

Time0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70 1.80 1.90 2.00

%

0

100

acq11mix6 1: Scan ES+ BPI

1.31e81.05

0.74

0.58

0.24

0.680.64

1.00

1.22

1.26

1.41

Peak at 1.41 min 1.5 sec at baseline10000da/sec 23 scans across peak

Terfena

dine

Oxy

butynin

Trim

ipramine

Diphe

nhyd

ramine

Proprano

lol

Lidoc

aine

Doxylamine

Caffe

ine

Ephed

rine

Transições em MRM


Transições de MRM são escolhidas por:- Intensidade do íon fragmento- Seletividade do íon fragmento

Métodos de MRM e SIR


Método MRMMétodo SIR

Alguns métodos (ex: análise de pesticidas) necessitam mais de uma transição por composto analisado. Neste caso, a transição principal é chamada de transição de quantificação, enquanto que as demais (geralmente 1 a 3) são chamadas transições de confirmação.

100

080_METHAMIDOPHOS 41 (0.752) Daughters of 142ES+ 6.37e594

Quantificação

Transições de confirmação em MRM Transições de confirmação em MRM


80 90 100 110 120 130 140 150 160m/z0

%

125

112

110

142

143

Confirmação 1

Confirmação 2

Transições de confirmação em MRM Transições de confirmação em MRM

100

%

F1:MRM of 3 channels,ES+142 > 93.9

9.889e+004

12March_01 Smooth(SG,1x2) 50 pg/uL Solvent Standard,

Methamidophos2.137139 Quantificação

Não apenas a presença das transições de confirmação, mas também a relação da área dos picos de quantificação/confirmação podem ser utilizadas para confirmar a presença de uma substância.


1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00min-0

100

%

F1:MRM of 3 channels,ES+142 > 112

4.002e+004


Methamidophos2.132970

min-0

100

%

F1:MRM of 3 channels,ES+142 > 125

5.852e+004


Methamidophos2.114176

min-0

Confirmação 1

Confirmação 2

UPLCUPLC

� partículas de 1.7µm

� Separações mais rápidas


� Separações mais rápidas

— 2-5x

� Maior resolução

— Separação de metabólitos

— Redução nos efeitos de matriz

� Maior sensibilidade

— LOQ 3x mais baixo

UPLC UPLC -- MSMS x HPLC MSMS x HPLC -- MSMSMSMS

%

0

QM_HPLC_ESI+_4Compound_041205_010 MRM of 4 Channels ES+ 309 > 280.84

1.06e5Height

0.9928719

HPLC-MS/MS

ESI+, Alprazolam


Aumento de 3,7 vezes na altura do pico.

Relação sinal-ruído de 4.7 vezes.

Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00

%

0

0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.000

QM_UPLC_ESI+_2Compound_042605_010 MRM of 2 Channels ES+ 309 > 280.84

1.06e5Height

0.54105629

UPLC-MS/MS

Compatibilidade com UPLC:Compatibilidade com UPLC:Velocidade de aquisição em MRM Velocidade de aquisição em MRM

� O ciclo de tempo por transição de MRM é composto por dois parâmetros:

– Período em que os íons serão monitorados (dwell time)

– Período entre a aquisição de duas transições sucessivas de


– Período entre a aquisição de duas transições sucessivas de MRM necessário para eliminar os íons da transição anterior da câmara de colisão (inter-channel delay).

� Para reduzir o ciclo de tempo, deve-se reduzir o tempo dos íons na câmara de colisão, porém com precaução.

Modos de aquisiçãoModos de aquisição

Full scan m/z 50-1000 em 1 segundo, Inter scan delay* = 0.02

1.02 segundos por ponto cromatográfico

Métodos de varredura: Full Scan, Daughter, Parent scan:


0.21 segundo por ponto cromatográfico

Métodos estáticos: MRM ou SIR

Exemplo: 3 transições, Dwell time = 0.05 s, Inter channel delay* = 0.02

*Inter-channel delay: Tempo para limpar os quadrupolos e a câmara de colisão dos íons da aquisição anterior.

Dwell timeDwell time

Dwell time – tempo de aquisição (em segundos) para o monitoramento de cada transição (MRM) íon (SIR).

O objetivo da otimização do dwell time é a obtenção de um pico cromatográfico com pelo menos 13 pontos para garantir um formato de pico adequado para a integração e quantificação. O dwell time ideal é determinado considerando-se a largura do pico cromatográfico na base e o número de transições monitoradas.

Exemplo:


Exemplo:

Largura do pico = 30 segundos (s)

Número de transições = 7

30 s/13 pontos = 2.3 s por ponto

2.3 s/7 transições = 0.32 s por transição

Inter-channel delay ~0.02 s

Melhor dwell time = 0.30 s

Dwell timeDwell time

Efeito do dwell time sobre a relação sinal-ruído:


O dwell time ideal é o tempo mais longo que ainda permita a obtenção do número de pontos cromatográficos suficientes (13 pontos por pico)

Câmara de colisão tradicional (“multipolo”)Efeito do tempo de aquisição na intensidade do sinal

Velocidade de aquisição em MRMVelocidade de aquisição em MRM


100 pontos de aquisição por segundo

Câmara de colisão T-WaveEfeito do tempo de aquisição na intensidade do sinal

Velocidade de aquisição em MRMVelocidade de aquisição em MRM


SintomasSintomas –– dwell time dwell time inadequadoinadequado

� Problemas com reprodutibilidade entre injeções

� Queda de sensibilidade

� Formato de pico não ideal


� Problemas com linearidade

Considerações importantesConsiderações importantes

� Largura do pico cromatográfico


� Numero de compostos analisados

� Os parâmetros acima afetam diretamente o número de pontos atravéz do pico.

Parametros que influenciam o número Parametros que influenciam o número de pontos em um picode pontos em um pico

� A soma destes parâmetros em cada função resulta no tempo de cada ciclo.


Pontos de aquisição?Pontos de aquisição?

� A relação entre o tempo do ciclo e a largura de pico é extremamente importante.

Um ciclo de aquisição


Cálculo do tempo do cicloCálculo do tempo do ciclo


Dwell time

Inter-channel delay

Inter-scan delay

Tempo

Tempo do ciclo

� Uma função contendo 10 transições de MRM

– Tempos Individuais

o Dwell time 50ms (0.05 s)

o Inter-channel delay 5ms (0.005 s)

Inter-scan delay 10ms (0.01 s)

Cálculo do tempo do cicloCálculo do tempo do ciclo


o Inter-scan delay 10ms (0.01 s)

– Tempo Total do ciclo

o (0.05 x 10)

o (0.005 x 9) = 0.55 s

o 0.01

– 9 pontos em um pico cromatográfico de 5 s

∑

Compatibilidade com UPLC:Compatibilidade com UPLC:Picos mais estreitos = menos pontos de dados?Picos mais estreitos = menos pontos de dados?

100 ms Dwell Time, 10 ms Delay

%

0.63

%

0.63 Peak Width = 1.8 s

Points Across Peak = 7

Convert the x axis to scan number


Peak Width 1.8 s

0 100 105 110 115 120 125 130Scan0

Time0.25 0.75 1.25 1.75

Points Across Peak = 60

0.25 0.75 1.25 1.75Time0

%

0.63

1100 1200 1300 1400Scan0

%

0.63

5 ms Dwell Time, 5 ms Delay

Convert the x axis to scan number


Screening com Tof

Vantagens

� Alta sensibilidade— MRM em QqQ

� Alta seletividade

Desvantagens

� Necessidade de otimização individual dos analitos— Necessidade dos padrões

individuais

Análises FocadasAnálises FocadasQuadrupolos TandemQuadrupolos Tandem


— Desde que as transiçõesescolhidas sejam específicas

� Alta faixa dinâmica

� Conforme legislação em vigor— Monitoramento de transições

de quantificação econfirmação

individuais

� Sensibilidade dependente do número de analitos— Duty cycle vs. número de

transições

� Incapacidade de reinterpretardados obtidos anteriormente— Em caso de necessidade de

novos analitos, é necessário a reanálise

Aumento no Maximizar

Identificação de

compostos

desconhecidos

Possível mesmo Metabólitos,

Análise

universal, não-

focada

Screening com TofScreening com TofQual o objetivo?Qual o objetivo?


Aumento no

número de

compostos

Reanálise de

dados obtidos

anteriormente

informação em

uma única

análise

Possível mesmo

que na ausência

de padrões

Reinjeções

desnecessárias

produtos de

degradação

Como funciona um Tof/Qtof?Como funciona um Tof/Qtof?


XXMassa Exata = Confiança

C34H41010C34H41010

C29H33N14SC29H33N14SC33H41N209C33H41N209

Nominal mass, quadrupole or ion trap

609.2806

Exact massExact mass


C34H37N605C34H37N605

C38H4107C38H4107

C27H37N1203SC27H37N1203S

C29H33N14SC29H33N14S

C28H37N1004SC28H37N1004S

C31H41N605SC31H41N605S

C34H37N100SC34H37N100S611.2923

610.2874

Estabilidade naExatidão de Massas

• XIC estreitos• Redução de falsospositivos

Necessidades de Tofs para Anállise Necessidades de Tofs para Anállise de Resíduosde Resíduos


Aumento naconfiabilidade, redução de

falsospositivos

Velocidade

• Uma única injeção paraanálises quali e quantitativas

Resolução

• Cromatográfica e MS• Seletividade nos íonsfragmentos

Sensibilidade

• Atingir limitesregulatórios• Descoberta de novoscontaminantes

Sistema de Detecção de ÍonsSistema de Detecção de ÍonsDetectores ConvencionaisDetectores Convencionais

MCP Convencional

Detector do Tof


Sistema de Detecção de ÍonsSistema de Detecção de ÍonsDetectores ConvencionaisDetectores Convencionais


Sistema de Detecção de ÍonsSistema de Detecção de ÍonsNovo ADC Híbrido WatersNovo ADC Híbrido Waters

Novo ADC Híbrido

Detector do Tof

MCP Convencional

Detector do Tof


ADC Híbrido: Melhor dos Mundos!ADC Híbrido: Melhor dos Mundos!


Scan No. Measured Mass ∆∆∆∆M (mDa) ∆∆∆∆M (ppm)

505 202.0434 -0.50 -2.47

506 202.0439 0.00 0.00

507 202.0436 -0.30 -1.48

508 202.0442 0.30 1.48

509 202.0437 -0.20 -0.99

510 202.0440 0.10 0.49

511 202.0439 0.00 0.00

512 202.0435 -0.40 -1.98

Redução de Falsos Positivos Redução de Falsos Positivos Tiabendazol 20 ppb em feijões Tiabendazol 20 ppb em feijões verdesverdes


m/z202.050

%

0

100 202.0434

512 202.0435 -0.40 -1.98

513 202.0441 0.20 0.99

514 202.0435 -0.40 -1.98

515 202.0433 -0.60 -2.97

516 202.0442 0.30 1.48

RMS = 0.30 1.50

m/z202.050

%

0

100 202.0434

m/z202.050

%

0

100 202.0439

m/z202.050

%

0

100 202.0436

m/z202.050

%

0

100 202.0442

m/z202.050

%

0

100 202.0437

m/z202.050

%

0

100 202.0440

m/z202.050

%

0

100 202.0439

m/z202.050

%

0

100 202.0435

m/z202.050

%

0

100 202.0441

m/z202.050

%

0

100 202.0435

m/z202.050

%

0

100 202.0433

m/z202.050

%

0

100 202.0442

202.0757

%

100

2.00 4.00

%

0

100 2.03

2.02

%

0

100

0.50 1.00 1.50

%

0

100

0.50 1.00 1.50

%

0

100 0.910.96 1.29

0.910.96

0.91

100 mDa

30 mDa

10 mDaMSE = Alta seletividade paraprecursores e fragmentos

XIC precursorm/z 202.0439

XIC fragmentom/z 175.0330

Screening com TofScreening com TofJanelas de Janelas de XIC XIC EstreitasEstreitas


Time2.00 4.00

%0

100

2.00 4.00

%

0

4.433.72

Tim e0.50 1.00 1.50

%

0

100

0.50 1.00 1.50

%

0

100

0.50 1.00 1.50

%

0

100

0.50 1.00 1.500

0.91

0.90

0.90

3 mDa

1 mDa

0.3 mDa

TIC

Tiabendazol

Fenurom, m/z 165.1028

Exatidão de Massas é tudo???Exatidão de Massas é tudo???


Análise de Composição ElementarAnálise de Composição ElementarExatidão de Massas e Padrão Exatidão de Massas e Padrão IsotópicoIsotópico

©2012 Waters Corporation 217BMC Bioinformatics 2006, 7, 234

13C = 15%

Menor Score i-Fit corresponde a

composição correta

Ferramentas de SoftwareFerramentas de SoftwareiFit e EleCompiFit e EleComp


13C = 15%

Resultados de composição ordenados por i-FIT: menor

valor indica maior concordância com padrão

teórico

Exatidão de Massas é tudo???Exatidão de Massas é tudo???


Resolução x Erro na Medida do Resolução x Erro na Medida do Padrão IsotópicoPadrão Isotópico


Faixa Dinâmica no EspectroFaixa Dinâmica no Espectro


m/z200 400 600 800 1000

%

0

10099.0082

315.0670

389.1552

10097.0771 308.1660

%

0

1001.06

XIC

Faixa Dinâmica no EspectroFaixa Dinâmica no EspectroTolerância a MatrizTolerância a Matriz


m/z200 400 600 800 1000

%

0

m/z325 330 335 340

%

0

100326.2351

328.1007

331.1977 337.0485 341.1390

Time0.50 1.00 1.50

%

0

100

0.50 1.00 1.500

1.34

TIC

Malaoxom em esgoto, 0.2 µg/LMassa Teórica = 337.0487

Aquisição com baixa EC: formação de M+H ou M-H

MSMSEE ((ModoModo de de AquisiçãoAquisiçãonãonão--dependentedependente))

MSMSEE: Todos os Dados, o Tempo : Todos os Dados, o Tempo InteiroInteiro


Aquisição com rampa de EC: formação de fragmentos

%

100

Padrão 1Simetrina

m/z 214.1126

Padrão 2Desmetrina

m/z 214.1126

100

0.00 2.00 4.00

%

0

100

XIC de m/z 96.0559

XIC de m/z 172.0650

Desmetrina

MSMSEE: Todos os Dados, o Tempo : Todos os Dados, o Tempo InteiroInteiro


Time2.40 2.50 2.60 2.700

MSE de fragmentosespecíficos em águas fluviais

Time0.00 2.00 4.00

%

0

100SimetrinaouDesmetrina?

0.00 2.00 4.00

%

0

m/z50 100 150 200 250

%

0

100172.0650

82.0401124.0617

214.1124

m/z50 100 150 200 250

%

0

100214.1128

124.0874

96.0559144.0597

215.1148

Identificação de fragmentos específicos com padrões

%

100

Fastnet_040310_water068 F2144.139 0.01Da

2.46e41.40

m/z = 144.1388∆M = 0.0 ppm

100


9.56e4

}

Fragmentos = 14 pontos/pico

Velocidade e ResoluçãoVelocidade e ResoluçãoMSMSEE acoplado a UPLCacoplado a UPLC


Time1.25 1.50 1.75

%

0

100

1.25 1.50 1.750


9.04e41.40

∆M = 0.0 ppm

m/z = 298.2746∆M = 1.3 ppm

Time0.50 1.00 1.50

%

0

}28 pontos/pico para Espiroxamina

MSE = Todas as m/zem UMA injeção

Centenas de Pesticidas, < 85 segundos

Precursor = 14 pontos/pico

2.00 4.00

%

0

100 TQ MRM

3000

4000

5000

6000

7000

Response

R2 = 0.9998

100QTof XIC 1000

1500

2000

2500

3000

Response

R2 = 0.9987

Análises QuantitativasAnálises QuantitativasPropiconazol em feijões verdesPropiconazol em feijões verdes


Time2.00 4.00

%

0

100QTof TIC

0

1000

2000

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Concentration (µµµµg/kg)2.00 4.00

%

0

QTof XIC

0

500

1000

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Concentration (µµµµg/kg)

Matriz de feijões verdes fortificada

� Técnica utilizada:— UPLC-QTof

o Screening e quantificação multirresíduo abrangente

— UPLC-QqQ

o Screening e quantificação multirresíduo limitado

Análise de Caso Real:Análise de Caso Real:Pesticidas em morangosPesticidas em morangos


� Quantificação:— Matriz fortificada com 110 pesticidas

� Screening com Tof— Banco de dados contendo centenas de pesticidas

� b utilizado para processamentoautomático

Preparo de amostranão-seletivo

Aquisição de amostras abrangente, com informações de precursores e fragmentos independentes

Análise AnáliseNão-Focada

Aquisição de dados não-focada

Sequência Integrada: Sequência Integrada: Screening Screening e Elucidaçãoe Elucidação


DESCOBERTA

Análise Focada

Gerar lista de possíveiscompostos

Quantificar

Gerar lista de componentes

Lista de compostosdetectadosconhecidos

Elucidaçãoestrutural de desconhecidos

Adicionar novos compostos à biblioteca

Não-Focada

Análise AnáliseNão-Focada




Sequência Integrada: Sequência Integrada: ScreeningScreening


DESCOBERTA

Análise Focada


Quantificar





Não-Focada

� B checa a presença/ausência de resíduos

—Centenas de pesticidasprocessados em menos de 3

Análise Focada em MorangosAnálise Focada em Morangos1270 pesticidas em 10 minutos1270 pesticidas em 10 minutos


sample A

Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00

%

0

100

1012_SYNAPT_170407_034 2: TOF MS ES+ BPI

5.94e34.71

3.97

2.24

0.860.81

1.16

2.151.261.641.33 1.89

3.47

2.29

2.61

2.66

3.63

3.75

4.37

4.07

4.22

4.51

5.43

4.75

5.00

4.84

5.31

5.73

5.62

6.60

processados em menos de 3 minutos

— 5 pesticidas encontrados emcada uma das duas amostras

Sample 1— Azoxystrobin 8 ppb

— Pyrimethanil 42 ppb

— Myclobutanil 6 ppb

— Fenhexamid 18 ppb

Sample 1— Azoxystrobin 9 ppb

— Pyrimethanil 44 ppb



Tandem QuadTOF

Análise Focada em MorangosAnálise Focada em MorangosQtof x QqQQtof x QqQ



— Bupirimate 6 ppb

Sample 2— Boscalid 60 ppb


— Cyprodinil 8 ppb

— Pyroclostrabin 10 ppb

— Fludioxonil 4 ppb


— Bupirimate 6 ppb

Sample 2— Boscalid 63 ppb


— Cyprodinil 8 ppb

— Pyroclostrabin 11 ppb

— Fludioxonil 4 ppb

Identificarcompostosalvo

Localizaroutroscomponentes

Identificaroutroscomponentes

Confirmaçãode identificação

Screening Screening UniversalUniversal


alvo• Screening focado

componentes• Deconvoluir• Compararamostras

componentes• Elucidaçãoestrutural

identificação•Análise de padrões•MS/MS e MSE

Análise




AnáliseNão-Focada

Sequência Integrada: Sequência Integrada: ElucidaçãoElucidação



Quantificar

Análise Focada

DESCOBERTA





Não-Focada

Contaminantedesconhecidoem águafluvial

Componente DesconhecidoComponente DesconhecidoContaminante em água fluvialContaminante em água fluvial


Nãoobservadoem águapotável

%

1002.43

%

1003.40

2.91

4.24

4.12

Composição elementar e i-Fit sugerem C15H13N2O como melhor candidato



Time2.00 4.00

0

Componente desconhecido em água fluvialm/z 237.1031 (ChromaLynx XS)

Time2.00 4.00

0

m/z150 200 250 300 350

%

0

100194.0967

193.0888

123.0809m/z 194.0970∆M = -0.3 ppm

Fragmentos MSE

%

100194.0971

Espectro MS/MS



Componente desconhecido em água fluvial

m/z150 200 250 300 350

%

0

100

150 200 250 300 350

237.1031

125.1075

139.1220m/z 237.1028∆M = +0.3 ppmPrecursor

m/z200 220 240

0

195.1004

237.1031

Padrão de Carbamazapina

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