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CromatografiaCromatografia
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Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche chehanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti,per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo
Queste tecniche sono basate sulla distribuzione differenzialedei vari componenti fra due fasi, una chiamata fase fissa ofase stazionaria e l’altra chiamata fase mobile o eluente, chefluisce in continuo attraverso la fase fissa
Le tecniche sono molto utilizzate in campo ambientale,biologico, farmaceutico, ecc., essendo particolarmente utilinell’analisi di miscele complesse come sono la maggior partedei campioni di natura organica
La separazione dei componenti di una miscela si ottiene in seguito alle
interazioni chimiche o fisiche che avvengono tra le molecole disciolte nella fase
mobile e la fase stazionaria: queste interazioni possono avvenire con la
superficie adsorbente del supporto solido, o con un liquido che ricopre il
supporto in modo omogeneo o ancora con molecole ad esso legate in maniera
covalente.
Dal momento che i diversi componenti della miscela da separare interagiscono
in maniera differente con la fase stazionaria se la fase mobile è un gas, con la
fase stazionaria e la fase mobile, se la fase mobile è un liquido, si muovono
lungo la colonna cromatografica con velocità diverse: i composti che sono più
“affini” alla fase stazionaria si muovono in media più lentamente di quelli che
sono più “affini” alla fase mobile.
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Un’esperienza comune di cromatografia
Cromatografia su strato sottile cromatogrfia su carta
1898-1903 D. Trebot Day, geologo americano, separò alcuni idrocarburi utilizzando colonne di farina
fossile.
1903-1906 M. Tswett, botanico russo, separò una serie di pigmenti colorati presenti in un estratto di
foglie verdi utilizzando CaCO3 ed etere di petrolio; coniò anche il nome cromatografia che significa
"scrittura mediante il colore".
1930-1931 R. Kuhn e E. Lederer utilizzarono la cromatografia per la separazione di carotenoidi e
xantofille.
1938 N.A. Izmailov e M.S.Shaiber descrissero per la prima volta la cromatografia su strato sottile
1941 A.J.P. Martin e R.L.M. Synge presentarono il primo lavoro sulla cromatografia di ripartizione. Essi
introdussero la teoria dei piatti basata su di un'analogia con la teoria della distillazione e dell'estrazione
controcorrente.
1952 A.J.P. Martin e R.L.M. Synge ebbero il premio Nobel per la chimica per lo sviluppo della
cromatografia di ripartizione. Nello stesso anno, in collaborazione con A.T.James realizza la cromatografia
gas-liquido.
1956 J.J.van Deemter sviluppò la teoria della separazione cromatografica.
1958 E.Stahl mise a punto la tecnica della cromatografia su strato sottile.
1966 Inizia lo sviluppo della moderna tecnica della cromatografia in fase liquida ad alta prestazione.
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La Nascita della CromatografiaLa Nascita della Cromatografia
Scrive Tswett nel 1906:
“Se una soluzione di clorofilla in etere di petrolio è filtrata attraverso una colonna di adsorbente – io
utilizzo soprattutto carbonato di calcio, accuratamente pressato, all'interno di uno stretto tubo di vetro
– allora i pigmenti, si separano, secondo la sequenza di adsorbimento, dall'alto in basso, in molte zone
colorate […] Proprio come i raggi di luce nello spettro, i diversi componenti della miscela appaiono
separati, sulla colonna di carbonato di calcio, secondo una legge e possono essere misurati sia in modo
qualitativo che quantitativo. Io chiamo questa preparazione cromatogramma ed il metodo
corrispondente lo chiamo metodo cromatografico. Ovviamente i fenomeni di adsorbimento fin qui
descritti non sono ristretti ai soli pigmenti della clorofilla ed è lecito presumere che tutti i composti
chimici, sia colorati che incolori, siano soggetti alle stesse leggi.”
Mikhail S. Tsvett
(1872–1919)
La nascita della cromatografia si deve al botanico russo Mikhail Semenovich Tswett,
che per primo la utilizzò nel 1903 per separare i pigmenti naturali contenuti in
estratti vegetali.
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Nell’esperimento di Tswett, la fase stazionaria era carbonato di calcio mentre la fase
mobile o eluente era etere di petrolio, un solvente organico composto da idrocarburi a
basso punto di ebollizione. I composti da separare sono introdotti nella fase mobile e si
ripartiscono lungo la colonna cromatografica in funzione della loro affinità relativa per la
fase mobile e per la fase stazionaria.
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La cromatografia è nata dunque all’inizio del XX secolo
come tecnica per la separazione di pigmenti fogliari, ma
già il suo inventore era consapevole delle sue potenzialità
applicative
TswettTswett chiamòchiamò questaquesta tecnicatecnica cromatografiacromatografia daldal
grecogreco scritturascrittura deldel colorecolore o,o, vistovisto ilil significatosignificato deldel suosuo
cognomecognome inin russorusso,, scritturascrittura didi TswettTswett
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Richard Kuhn (1900-1967) Edgar Lederer (1908-1988)
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Twsett era uno spirito inquieto e mobile, in quanto rimangono tracce di suoi soggiorni - spesso con collaborazioni scientifiche - in università tedesche, olandesi, belghe e francesi. Nel 1910 era apparsa una sua importante opera, intitolata "Cromofille dei regni vegetale e animale", in cui erano descritte dettagliatamente le tecniche sperimentali , scritto però in russo. Il chimico tedesco Willstätter si era fatto tradurre per uso privato il libro di Twsett e questa traduzione era poi passata nelle mani del suo allievo Kuhn. Nel 1930, ad appena 22 anni, Edgard Lederer era giunto per il suo lavoro di postdottorato sui pigmenti della carota ad Heidelberg nel laboratorio diretto da Kuhn , messo sulla strada giusta dalla lettura di un libro sui carotenoidi dell'americano L.S. Palmer, edito nel 1922, dove si faceva riferimento al volume di Twsett.
La scienza è spesso
influenzata da
avvenimenti casuali: Sorprendentemente, nel 1930
Lederer venne in possesso
della 'traduzione privata‘ del
libro di Tswett e così riprese il
cammino della cromatografia.
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Archer Martin (1910-2002) Richard Synge (1914-1994)
The Nobel Prize in Chemistry 1952 was awarded jointly to Archer John Porter Martin and Richard Laurence Millington Synge
"for their invention of partition chromatography"
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LONGITUDINAL DIFFUSION AND RESISTANCE TO MASSTRANSFER AS CAUSES OF NONIDEALITY IN
CHROMATOGRAPHYJ. J. VAN DEEMTER, F. J. ZUIDERWEG
Koninklijke/Shell-Laboratorium, Amsterdam (N.V. De Bataafsche Petroleum
Maatschappij)
and
A. KLINKENBERG
N. V. De Bataafsche Petroleum Maatschappij, The Hague
(Received 1 February 1956)
Chem. Engng Sci. 5, 271-289, 1956.
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Giddings ha elaborato in maniera esaustiva la teoria dinamica della cromatografia
13J. Calvin Giddings (1930-1996)
R.A. Dewar (1908-1981) I.G. McWilliam (1933) V. Pretorius (1928-1989)
Il rivelatore a ionizzazione di fiamma fu inventato nel 1957 indipendentemente da due gruppi di ricercatori in Australia e Sud Africa
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-James Lovelock (1919,
England), ambientalista e
scienziato, nel 1957 inventa il
rivelatore a cattura di elettroni
Lovelock ritratto nel 2005
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Nel 1957 M.J.E. Golay realizza le colonne capillari di vetro e ne sviluppa la teoria
Marcel Jules Edouard Golay
1902 1989
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Silice chimicamente legata
1970 oggi
New chromatographic
packings for gas and
liquid chromatography
have been prepared
with chemically-
bonded organic
stationary phases…
These new column
packings have non-
extractable, thermally
and hydrolytically
stable, organic coating
J.J. Kirkland1925
Uwe Neuer1948-2010
Capillary high performance liquid chromatogrphy
Ultra high performance liquid chromatogrphy
• James W. Jorgenson
• The 1.5-µm particles
were obtained and packed into
• 30-µm-i.d. fused-silica
capillary columns up to
• 50 cm in length.
• The particles were evaluated by isocratic reversed-phase UHPLC at pressures up to
• 4500 bar
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Basi del procedimento cromatograficoBasi del procedimento cromatografico•Il campione è introdotto nella fase mobile, che può essere un gas, un
liquido o un fluido supercritico.
•La fase mobile, eluente*, viene fatta percolare in continuo attraverso la
fase stazionaria, che deve essere immiscibile nell’eluente.
•La fase stazionaria (liquida o solida) si trova all’interno di una colonna
oppure è supportata su una superficie piana.
•La fase mobile e la fase stazionaria sono scelte in modo che i componenti
della miscela da separare si distribuiscano tra le due fasi
� i componenti più affini alla fase stazionaria passeranno più tempo in
questa fase, quindi si sposteranno più lentamente attraverso il sistema
� i componenti più affini alla fase mobile si sposteranno invece più
velocemente
La separazione dei componenti avviene in quanto ogni sostanza ha una
distribuzione caratteristica tra le due fasi (costante di distribuzione
Kd=Cs/Cm)
*Eluire: In chimica, riportare in soluzione, con opportuno solvente, le sostanze adsorbite da un mezzo adsorbente.
Dal lat. eluĕre ”lavare”
Visualizzazione della separazioneVisualizzazione della separazione
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Ponendo all’uscita della colonna un
rivelatore che misuri il flusso di massa o
la concentrazione del soluto nell’eluato
(cioè la fase mobile che esce dalla
colonna) e riportando il segnale in
funzione del tempo si può ottenere un
cromatogramma
La posizione dei picchi sull’asse dei
tempi, o tempo di ritenzione, serve per
identificare i componenti del campione
L’area sottesa dai picchi è proporzionale
alla quantità o alla concentrazione di
ogni singolo componente e può essere
utilizzata a scopo quantitativo
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ISOTERME DI RIPARTIZIONE
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Picco gaussiano
Forma generale delle isoterme di adsorbimento Stephen Brunauer, Lola S. Deming, W.Edwards Deming, Edward Teller
In ascissa è riportato il rapporto tra la pressione totale e la pressione parziale
dell'adsorbente nel Bulk del fluido, mentre in ordinata è riportata la capacità di
adsorbimento (definita come il rapporto della massa di adsorbato rispetto alla massa di
adsorbente)
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ISOTERME NON LINEARI
Anche nelle isoterme di ripartizioneil range lineare è limitato
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Asimmetry factor
Anche nel caso di isoterma lineare,
il picco non è mai perfettamente
gaussiano. Fenomeni di chanelling
dovuti ad impaccamento non
uniforme, siti attivi residuali e
volumi morti extracolonna
possono alterare più o meno
pesantemente la forma del picco.
Con colonne nuove un Fa
compreso tra 0.9 ed 1.1 è
accettato nelle specifiche del
collaudo. Tale fattore aumenta con
l’uso, specialmente con l’accumulo
di materiale particolato in testa
alla colonna e con la perdita di
disattivazione del supporto.
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PRINCIPI TEORICI DELLA CROMATOGRAFIAPRINCIPI TEORICI DELLA CROMATOGRAFIA
Esempio: separazione di un campione a tre componenti in una colonna chiusa.La fase stazionaria consiste di particelle solide porose contenute all’interno diun tubo lungo e sottile (colonna). Nel passaggio attraverso la colonna ognicomponente X si distribuisce fra la fase stazionaria (s) e la mobile (m):
Xm Xs
A: il campione viene iniettato all’entratadella colonna
B →→→→ C: la fase mobile fa spostare ilcampione attraverso la fase stazionariacon differente velocità di migrazione perle 3 sostanze che hanno Kx differenti.D: le sostanze sono separate
A B C D
Flu
sso
de
l so
lve
nte
m
sX
[X]
[X]K =
Il coefficiente di ripartizione (o di distribuzione) del componente X è
definito come:
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Tempo di ritenzioneTempo di ritenzione
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Il tempo di ritenzione tR è il tempo che impiega il massimo della concentrazione di un
componente della miscela iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere
rivelato come picco dal detector. Un tipico cromatogramma per una miscela a due
componenti ha due situazioni diverse:
•• il picco il picco a sinistra rappresenta un a sinistra rappresenta un soluto che soluto che non non ha alcuna interazione con ha alcuna interazione con la fase la fase
stazionaria stazionaria ed esce al cosiddetto ed esce al cosiddetto tempo morto, tempo morto, ttMM
•• il picco il picco a destra rappresenta un a destra rappresenta un soluto che soluto che haha, invece, invece, , interazione con interazione con la fase la fase
stazionaria stazionaria ed esce ed esce al tempo al tempo ttRR > > ttMM
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Un parametro importante che viene usato molto spesso per descrivere la velocità di migrazione dell’analita lungo la colonna è il fattore di capacità, k’.
Due sostanze saranno separabili se presentano valori diversi di k’.
M
SAA
V
VK
mobilefasenellaAdimoliditotalen
astazionarifasenellaAdimoliditotalen'k
⋅=
°
°=
M
MRA
t
tt'k
−=
La selettività quantifica l’entità della separazione fra due specie: riguarda lacapacità di un sistema cromatografico di distinguere fra due componenti ed èdipendente dalla distribuzione relativa delle specie fra la fase mobile e quellastazionaria, con (tR)B> (tR)A. Viene misurato dal fattore di selettività α
MAR
MBR
A
B
t)t(
t)t(
'k
'k
−
−==α
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poiché CS / CM = KA .
VS / VM = ψ (rapp. di fase); k’A = KA × ψ.
Ma k’ è anche uguale al rapporto tra i
tempi trascorsi nelle
Due fasi, per cui
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Se con Q indichiamo la portata della fase mobile (in inglese “flow rate”), Q =
V/t; t =V/Q; se manteniamo Q= costante e indichiamo il volume di ritenzione
con VR ed il volume di fase mobile con VM, abbiamo
k’= KAxVs=(tR – tM)Q-1 / tM Q-1 = VR - VM / VM = KA × VS / VM
VR - VM = KA × VS; V’R = KA × VS
V’R è detto volume di ritenzione corretto
t’R= tR-tM è detto tempo di ritenzione corretto
Attenzione: Molto spesso nel dialetto di laboratorio si usa flusso per indicare la portata, ciò nasce
probabilmente dalla traduzione letterale dall’inglese di flow rate che da velocità di flusso viene poi abbreviata in
flusso, che in realtà indica in italiano una cosa diversa (volume/superficie
RELAZIONI TERMODINAMICHE
La costante di equilibrio tra le fasi può essere messa
in relazione con la energia libera del processo
(funzione di Gibbs)
log K = - ΔG0/2,3RT
E ricordando la relazione tra K e k’
log k’ = log VS/VM - ΔG0/2,3RT
Log k’ = logψ - ΔH0/2,3RT + ΔS0/2,3R
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log KA = - ΔH0/2,3RT + ΔS0/2,3R
V’R = KA × VS
log V’R = - ΔH0/2,3RT + ΔS0/2,3R – log Vs
Ma anche
Equazione di van’t Hoff
Premio Nobel 1901
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EQUILIBRI CHIMICI SECONDARI
Quando più di un processo contribuisce alla ritenzione, trascurando glieffetti di correlazione, possiamo scrivere:
k’ = Σi ψi Ki = Σi k’i
Se fi e fj sono, rispettivamente, la frazione di soluto in forma i e j si ha:
k’ = fi k’i +fj k’j Es.
AH ↔ A– + H+ ; Ka = [A–] [H+] / [AH] ; f– = [A–] / [AH] + [A–]
Dividendo per [A–] e sost. [HA]/ [A–] con [H+]/ Ka si ha:
f– = 1/{1 + ([H+] / Ka)} ; f = 1- f- =[H+] / Ka
k’ = 1/{1 + ([H+] / Ka)} k’i + ([H+] / Ka) k’j
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Dispersion Forces
• London's dispersion forces arise from charge fluctuations throughout a
molecule resulting from electron/nuclei vibrations.
Ud = 3hν0α2 /4r6
• where (α) is the polarizability of the molecule,
• (ν0) is a characteristic frequency of the molecule,
• (h) is Plank's constant, (h= Jxsec)
• and (r) is the distance between the molecules
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Dipole-Dipole Interactions
• The interaction energy (UP) between two dipolar molecules is
given, to a first approximation, by
• Up =2α2µ2 /r6
• where (α) is the polarizability of the molecule,
• (µ) is the dipole moment of the molecule,
• and (r) is the distance between the molecules.
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Dipole-Induced-Dipole Interactions
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Ionic Forces
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.
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Interazione solutoInterazione soluto--fasifasi
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Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi
(mobile e stazionaria) sono deboli: se così non fosse non ci sarebbe
trattenimento sulla fase stazionaria oppure, al contrario, eluizione. Sono
sfruttate a scopo separativo le seguenti interazioni:
In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la polarità
delle due fasi. Spesso possono essere presenti più tipi di interazione nello
stesso processo cromatografico
•• legami legami idrogenoidrogeno
•• interazioni dipolointerazioni dipolo--dipolodipolo
•• interazioni dipolointerazioni dipolo--dipolo indottodipolo indotto
•• forze di Van der forze di Van der Waals (dipolo indottoWaals (dipolo indotto--dipolo indotto) dipolo indotto)
formazione formazione di composti di interazionedi composti di interazione
•• attrazione attrazione coulombianacoulombiana
•• interazioni stericheinterazioni steriche
Hydrophobic and Hydrophilic
Interactions
• n-heptane and water are immiscible, notbecause water molecules repel n-heptane
molecules, they are immiscible because the forces between two n-heptane molecules and the forces between two water molecules are much greater than the forces between a n-heptane molecule and a water molecule.
Thus, water molecules and n-heptane molecules interact very much more strongly
with themselves than with each other.
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Molecular Forces and Chromatographic Selectivity
• To choose a suitable stationary phase for a
particular separation it is necessary to select a
substance with which the solutes will interact
relatively strongly. If the solutes to be
separated are predominantly dispersive, then
a hydrocarbon-like stationary phase would be
appropriate.
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Chromatogram of the Hydrocarbons Contained in Unleaded Gasoline Using a Dispersive (Non-
polar) Stationary Phase
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Two separations by GC illustrate the different selectivity
that can be obtained by using dispersive or polar stationary
phases
Polyethylene Glycol (polar) Carbopack (dispersive)
IONIC INTERACTION
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Meccanismi Meccanismi della separazionedella separazione
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In base ai tipi di interazione prima descritti possiamo suddividere imeccanismi di separazione impiegati in cromatografia in:
Il meccanismo di esclusione dimensionale è dovuto solo all’ingombro stericoè non prevede interazioni con la fase stazionaria.
•• adsorbimentoadsorbimento
•• ripartizioneripartizione
•• Interazioni solvofobicheInterazioni solvofobiche
•• scambio ionicoscambio ionico
•• affinitàaffinità
•• esclusione dimensionaleesclusione dimensionale
AdsorbimentoAdsorbimentoLa fase stazionaria è un solido di granulometria piccola,impaccato in colonna o steso su un supporto; sulla superficiedei granuli si trovano “siti attivi” che possono stabilire legamideboli (reversibili!) con le molecole della miscela daseparare. Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento,che può essere gas-solido o liquido-solido a seconda dellanatura della fase mobile.
AttenzioneAttenzione:: sese lala superficiesuperficie contienecontiene
eterogeneitàeterogeneità geometriche,geometriche, esseesse
possonopossono essereessere sitisiti aa maggioremaggiore
energiaenergia didi interazioneinterazione cheche dannodanno
luogoluogo aa isotermeisoterme nonnon linearilineari..
LaLa cromatografiacromatografia didi adsorbimentoadsorbimento èè
utilizzatautilizzata perper separareseparare sostanzesostanze
neutreneutre polaripolari oo nonnon polari,polari, didi naturanatura
organicaorganica oo inorganicainorganica
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RipartizioneRipartizione
La fase stazionaria è un liquido che impregna un solido granulare
inerte o è ad esso chimicamente legato; in questo liquido le
molecole da separare sono solubili; la fase stazionaria e la fase
mobile devono invece essere immiscibili. Durante l’eluizione le
molecole si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi secondo la
diversa solubilità di ognuna. Si parla quindi di
cromatografia di ripartizione
che può essere
gas-liquido o liquido-liquido
a seconda della natura della fase
mobile
Attenzione: Se la fase mobile può
interagire con la fase stazionaria
non si ha meccanismo di ripartizione
Può essere realizzata una cromatografia liquido-liquido?
• In realtà, tale tipo di cromatografia non può essere realizzata nella pratica perché non esistono liquidi totalmente immiscibili:
• Bisogna ancorare stabilmente la fase stazionaria alla superficie del supporto.
• Lo strato legato al supporto non ha le caratteristiche di un liquido, inoltre può essere permeato anche dalle molecole della fase mobile, oltre che dai soluti.
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Scambio ionicoScambio ionico
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La fase stazionaria è costituita da un polimero o da silice
contenente siti attivi ionizzati o ionizzabili, i cui controioni possono
essere scambiati con altri ioni aventi carica dello stesso segno. Il
meccanismo di separazione è basato sulla competizione per i siti di
scambio tra gli ioni presenti nella fase mobile e quelli presenti nel
campione. Si parla di cromatografia di scambio ionico (IEC)
La cromatografia a La cromatografia a
scambio ionico scambio ionico è è
impiegata per la impiegata per la
separazione di separazione di sostanze sostanze
ioniche ioniche o ionizzabilio ionizzabili
AffinitàAffinità
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In questo caso si utilizzano reazioni di tipo chimico obiochimico, reversibili e molto specifiche, in modo che lemolecole da separare interagiscano con la fase stazionaria esi ottenga così l’eluizione selettiva di alcuni componenti dellamiscela. Si parla di cromatografia di affinità (AFC)
LaLa cromatografiacromatografia didi affinitàaffinità èè
impiegataimpiegata soprattuttosoprattutto nellanella
separazioneseparazione didi molecolemolecole didi
interesseinteresse biochimicobiochimico
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Esclusione Esclusione dimensionaledimensionaleLa fase stazionaria è un solido poroso o un gel. Le molecoledell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei pori sele loro dimensioni sono compatibili e vi rimangono per uncerto tempo dipendente dalle dimensioni stesse; le molecolepiù grandi sono invece escluse dai pori ed escono dallacolonna in tempi brevi.
SiSi parlaparla didi cromatografiacromatografia didi esclusioneesclusione
dimensionaledimensionale (SEC)(SEC) concon lele variantivarianti GelGel
permeazionepermeazione perper lala separazioneseparazione didi
sostanzesostanze insolubiliinsolubili inin acquaacqua ee GelGel
filtrazionefiltrazione perper lala separazioneseparazione didi
sostanzesostanze solubilisolubili inin acquaacqua
LaLa tecnicatecnica èè impiegataimpiegata perper lala
separazioneseparazione didi molecolemolecole didi grandigrandi
dimensionidimensioni
CLASSIFICAZIONE DEI METODI CROMATOGRAFICI
Non è più usata
Il meccanismo è complesso
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Equilibrio tra le fasi
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FASE 1
FASE 2
Equilibrio
prima dopo
FASE 1 FASE2
Concentrazione 0 C1
Volume V1 V1
Concentrazione C0 C2
Volume V2 V2
Dc = C1/C2, dove C indica la somma della concentrazione
delle varie forme in cui può essere presente la sostanza che si
ripartisce tra le fasi.
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p = frazione di soluto nella fase 1 =
q = frazione di soluto nella fase 2 =
C0 V2 = C1 V1+ C2 V2
Dividendo per C2V2 numeratore e
denominatore, poiché C1/C2 = Dc e V1/V2 = Vr
si ha:
p =
q =
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r=0 r=1 r=2 r=3
n=0
n=1
n=2
n=3
n=4
Le frazioni di soluto nei recipienti dopo l’equilibrio sono i termini individuali dell’espressione (q+p)n
Se indichiamo con (Fr,n) la frazione di soluto contenuta in r dopo n trasferimenti abbiamo:
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rmax
È possibile dimostrare che, matematicamente
Il calcolo di F mediante l’espressione fattoriale diventa particolarmente lungo
quando n ed r diventano grandi.
Fortunatamente, in queste condizioni, la distribuzione binomiale può essere
approssimata ad una distribuzione normale (gaussiana) che ha la forma:
Per n>24
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f(x) = Ae−B(x−x0)
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Separazione di due soluti (Dc1 =3, Dc2=1/3) per n=25 ed n=100
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Lyman C. Craig (1906-1974)
A manual version of Lyman C. Craig's CCD machine
designed by Erich Hecker
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TEORIA DEL PIATTOrelazione con la distribuzione in controcorrente
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In cromatografia sia r che n sono
molto grandi, ma n>> r, per cui
Applicando l’approssimazione di Stirling
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La frazione di ogni soluto sarà distribuita entro un certo numero di recipienti (piatti
teorici) specificato dalla precedente equazione.
Se vogliamo calcolare la frazione di soluto per rmax (massimo del picco), ricordando
che rmax = np si ha
Consideriamo la situazione in cui il soluto costituito da m moli totali, e la sua
massima concentrazione si trovi in rmax = N, avremo che la quantità totale Q
nel recipiente rmax = N sarà
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Il soluto si muove lungo la colonna di N piatti in un tempo =tR (tempo
impiegato dal massimo della concentrazione ad uscire dalla colonna), per cui
la velocità di uscita espressa come piatti/tempo sarà N/tR e la velocità della
massima quantità Smax sarà
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La quantità m è proporzionale all’area del picco, mentre la velocità
del massimo di concentrazione di uscita (massimo del picco) è
proporzionale alla sua altezza. considerando in prima
approssimazione il picco triangolare ed esprimendo l’altezza in unità
arbitrarie e la base in unità di tempo avremo
e considerando il picco
gaussiano (tw = 4τ), dove τ è la
deviazione standard espressa
in unità di tempo
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Piatti Piatti teoriciteorici
• Per descrivere il processo cromatografico è utilizzata una similitudinederivante dalla teoria della distillazione e dell’estrazione incontrocorrente. Il sistema cromatografico è immaginato simile ad unacolonna di distillazione, cioè composta da una serie di strati sottilichiamati piatti teorici; in ognuno di questi microelementi della colonna sirealizza l’equilibrio di distribuzione del soluto tra fase stazionaria e fasemobile. Lo spostamento del soluto lungo la colonna è dovuto all’azionedinamica della fase mobile
II terminitermini numeronumero didi piattipiatti
teoriciteorici (N)(N) ee altezzaaltezza deldel
piattopiatto (HETP,(HETP, HeightHeight
EquivalentEquivalent toto TheoricTheoric
PlatePlate)) sonosono comunementecomunemente
utilizzatiutilizzati inin cromatografiacromatografia
perper quantificarequantificare lele
prestazioniprestazioni deidei sistemisistemi
cromatograficicromatografici
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1)1) AltezzaAltezza equivalenteequivalente didi piattopiatto teoricoteorico HH
2)2) NumeroNumero didi piattipiatti teoriciteorici NN
LL == lunghezzalunghezza colonnacolonna H
LN=
PiattoPiatto teoricoteorico:: sezionesezione delladella colonnacolonna cheche consenteconsente didi realizzarerealizzare unun equilibrioequilibrio reversibilereversibile
didi ripartizioneripartizione didi unun componentecomponente frafra lele fasifasi.. PoichéPoiché inin cromatografiacromatografia sisi haha unauna sequenzasequenza
continuacontinua didi statistati didi scambioscambio didi materiamateria inin condizionicondizioni didi nonnon--equilibrio,equilibrio, dovutodovuto alal continuocontinuo
fluirefluire delladella fasefase mobile,mobile, NN haha unun significatosignificato puramentepuramente matematicomatematico..
PiùPiù elevatoelevato èè ilil numeronumero didi piattipiatti teorici,teorici, piùpiù grandegrande èè lala probabilitàprobabilità didi unauna separazioneseparazione
(migliore(migliore èè lala capacitàcapacità didi separazioneseparazione delladella colonna)colonna).. NN èè proporzionaleproporzionale allaalla lunghezzalunghezza
delladella colonnacolonna..
L’altezzaL’altezza equivalenteequivalente alal piattopiatto teoricoteorico (H(H == L/NL/N)) consenteconsente didi confrontareconfrontare l’efficienzal’efficienza didi
colonnecolonne didi differentedifferente lunghezzalunghezza..
2
R
W
t16N
= W
2
=
σ
Rt
N
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w½= 2.35σ
LIMITI DELLA TEORIA DEL PIATTO
• K è costante ed indipendente dalla
concentrazione del soluto
• L’equilibrio è rapido rispetto alla velocità della
fase mobile
• Non c’è diffusione longitudinale del soluto
(recipienti con pareti)
• La fase mobile è aggiunta per incrementi e
non in continuo.
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DI queste assunzioni solo la prima è valida nella
cromatografia analitica ed è mantenuta nella teoria
dinamica che risulta anche essa valida solo per la
cromatografia con isoterma di ripartizione lineare
I piatti nella colonna non esistono, sono una
approssimazione e non una realtà fisica, l’equilibrio non è
istantaneo e la diffusione avviene lungo tutta la colonna,
mentre il passaggio da una fase all’altra avviene senza
che l’equilibrio sia stabilito.
Infine, la larghezza del picco dipende dalla velocità con
cui la fase mobile fluisce lungo la colonna.
LeLe molecolemolecole didi unun analitaanalita nonnon sisi muovonomuovono lungolungo lala colonnacolonna concon lala stessastessa velocitàvelocità:: lala lorolorodispersionedispersione haha generalmentegeneralmente unun profiloprofilo GaussianoGaussiano.. IlIl centrocentro deldel profiloprofilo (banda(banda didieluizione)eluizione) rappresentarappresenta lala velocitàvelocità mediamedia..
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II fattorifattori cheche provocanoprovocano deviazionideviazioni daldal valorevalore mediomedio sonosono::
1.1. diffusionediffusione longitudinalelongitudinale (diffusione(diffusione delledelle molecolemolecole dalladalla zonazona
aa maggioremaggiore concentrazioneconcentrazione aa quellaquella aa minoreminore inin direzionedirezione
parallelaparallela all’asseall’asse delladella colonnacolonna));;
2.2. percorsipercorsi multiplimultipli;;
3.3. trasferimentotrasferimento didi massamassa tratra fasefase
mobilemobile ee fasefase stazionariastazionaria..
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LA TRATTAZIONE FISICA DI QUESTI FENOMENI HA DATO
ORIGINE ALLA
TEORIA
DINAMICA
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TEORIA DINAMICA
σ2 = Σσj2 H = ΣHj
Diffusione longitudinale
σmd = (2γm Dm t)½
Ricordando che *
N = tR 2/σt
2 = L2/ σL2 ; H = L/N = σL
2/L e t/L =1/u
Hmd = 2γm Dm /u ; Hsd = 2k’γs Ds /u
Dove γ è il fattore di ostruzione, D il coefficiente di interdiffusione e u la velocità lineare
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MOLTEPLICITA DEI CAMMINI
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Detta anche “eddy diffusion”
Hfed = 2 λ dp
• λ è una misura della non eguaglianza dei flussi
vale solo per le colonne impaccate
TRASFERIMENTO DI MASSAColonne impaccate
Nella fase mobile Hmfd = ω dp2 u/Dm
ω = fattore di impaccamento
dp = diametro delle particelle
Nella fase stazionaria Hsfd = 2/3(2k’/[1+k’]2) (df2/Ds) u
df = spessore del film di fase stazionaria
Colonne tubolari
Nella fase mobile Hmfd = (1+6k’+11k’2)dt2u/96(1+k’)2Dm
dt = diametro del tubo
Nella fase stazionaria la formula è come per le impaccate78
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Equazione di Van DeemterL’equazione che meglio riproduce i dati sperimentali è
la combinazione di tre equazioni che esprimono i
tre fenomeni diffusivi H = A + B/u + Cmu + Cs u
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The concept of reduced plate height (h ) and reduced velocity (ν) was introduced in an attempt to form a basis for the comparison of different columns packed with particles of different diameter.In fact, the reduced plate height merely measures the plate height in units of particle diameters. The reduced plate height is dimensionless.The reduced velocity compares the mobile phase velocity with the velocity of the solute diffusion through the pores of the particle. In fact, the mobile phase velocity is measured in units of the intraparticle diffusion velocity. As the reduced velocity is a ratio of velocities, like the reduced plate height, it also is dimensionless.
It should be noted that the constants ofthe equation were arrived at by a curvefitting procedure and not derived theoretically from a basic dispersion model; as a consequence the Knox equation has limited use in column design. It is, however, extremely valuable in accessing the quality of the packing
L’equazione di Giddings modifica l’equazione di Van Deemter
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Sources of Extra Column Dispersion
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Risoluzione cromatograficaRisoluzione cromatografica
La possibilità di separare due
o più sostanze è descritta dal
parametro detto risoluzione,
che misura la capacità di un
sistema cromatografico di
separare due analiti con
caratteristiche simili:
Se la risoluzione non è
sufficiente (R < 1), i due
picchi non possono essere
quantificati in maniera
corretta
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[ ]
BABA
ARBR
WW
Z2
WW
)t()t(2R
+
∆=
+
−=
1k
k1N
4
1R
IB
IB
+
α
−α=
EffettoEffetto delladella selettivitàselettività,, dell’efficienzadell’efficienza ee deldel fattorefattore didi capacitàcapacità sullasulla risoluzionerisoluzione
risoluzione scarsarisoluzione scarsa
picchi non separati
buona risoluzione dovuta a buona risoluzione dovuta a buona efficienzabuona efficienza
picchi stretti
buona risoluzione dovuta a buona risoluzione dovuta a buona selettivitàbuona selettività
picchi distanti
risoluzione scarsa risoluzione scarsa dovuta ad dovuta ad un basso fattore un basso fattore di capacitàdi capacità
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Risoluzione e separazione
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Capacità di picco
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ELUIZIONE IN GRADIENTE
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