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Cromatografia líquida

de alta eficiência

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O que é cromatografia líquida?

A cromatografia fundamenta-se na migração

diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido

a diferentes interações entre duas fases imiscíveis, sendo uma

fase fixa que tem uma grande área superficial chamada fase

estacionária, e a outra um fluido que se move através da fase

estacionária sendo chamada de fase móvel. Na cromatografia

líquida a fase móvel é líquida! (LANÇAS, 1993; DEGANI; CASS;

VIEIRA, 1998).

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Principio da cromatografia líquida

Tempo

AMOSTRA

Coluna

contendo fase

estacionária.

SOLVENTE

Ação da

gravidade!

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

PLANAR

CCD CP CONVENCIONAL

COLUNA

HPLC

ADOSRÇÃO PARTIÇÃO IÔNICA EXCLUSÃO

Tipos de cromatografia líquida:

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Primeiro, o que é HPLC?

•HPLC – É uma abreviação do nome em inglês : High Performance (Pressure)

Liquid Cromatography.

•Historia da HPLC:

- Década de 60 : O começo da HPLC como High pressure LC!

- Década de 70 : Com a melhora do material da coluna e da

instrumentação, HPLC passa a ser High Performance LC!

- Década de 80: A partir dessa década houve um “boom” do HPLC

- 2006- Evolução da técnica: UPLC, RRLC, UFLC...

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Vantagens da HPLC

FE é utilizada inúmeras vezes.

Versatilidade: Único requisito é a solubilidade na FM.

Tempo reduzido de análise.

Alta resolução.

Análise qualitativa: tR , espectro de absorção no UV (DAD), MS.

Análise quantitativa: desvios menores do que 5%.

Boa detectabilidade:

Absorção de UV-Vis de comprimento de onda variável 10-10 g;

Fluorescência: 10-12 g;

Automatização

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Limitações da HPLC

Alto custo do instrumento

Alto custo de manutenção

Alto custo de operação

Falta de detector universal sensível

Índice de refração: baixa detectabilidade (10-6 g), pouco estável.

Espectrômetro de massas: ~US$ 150.000,00

Necessidade de experiência no seu manuseio

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Como é um HPLC comercial?

Reservatórios dos

solventes e

sistema de

degaseificação.

Bomba.

Injetor.

Coluna.

Detector.

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Instrumentação para HPLC

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Instrumentação para HPLC

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Reservatório para a fase móvel

• Filtro do reservatório :

Captar a fase móvel e evitar que partículas suspensas na FM obstruam

os capilares ou contaminem a bomba.

• Filtros de 10 a 40 um

Limpeza periódica!!

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Características da fase móvel

Ser de alto grau de pureza ou fácil purificação

Dissolver a amostra sem decompor seus componentes

Não decompor ou dissolver a fase estacionária

Ter baixa viscosidade

Compatível com o tipo de detector

Polaridade adequada para permitir a separação dos componentes da amostra.

Degaseificação da FM:

Garanti a reprodutibilidade da vazão

Estabilidade da linha base.

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Métodos de degaseificação

• Ultrassom: Muito lento, pouco eficiente, requer agitação, em geral o

pior método quando usado sozinho

• Vácuo + ultrassom: Rápido, eficiente, refazer a cada 12 hrs.

• Purga com Hélio: Contínuo, hélio é razoavelmente caro, leva a

aumento de vazamentos, maior custo operacional.

• Degaseificador on-line: Contínuo, remove o ar logo antes de entrar

na bomba, investimento alto inicial (melhor opção a longo prazo)

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Instrumentação para HPLC

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Sistema de bombeamento

“Têm por finalidade enviar um fluxo constante e reprodutível de FM para o

sistema cromatográfico”

REQUISITOS:

Ser de material inerte

Pressões de até 6000 psi (~400 atm)

Vazão contínua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos)

Vazões de 0,1 a 10 ml/min (aplicações analíticas)

Controle de vazão e reprodutibilidade melhor que 1 %

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Sistema de bombeamento

Tipos de bombas:

Pneumática

Deslocamento

Recíproca

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Bomba pneumática

Vantagens:

Baixo custo

Livre de pulsações

Desvantagens:

Baixa pressão (até 2000 psi)

Baixo volume

Não permite gradiente

Vazão depende da pressão de retorno e viscosidade da fase móvel

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Bomba de deslocamento

Vantagens:

Vazão independe da pressão de retorno e viscosidade da fase móvel

Livre de pulsações

Desvantagens:

Baixo volume

Não permite gradiente

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Bomba recíproca

Vantagens:

Pressão elevada (até 10 000 psi)

Pequeno volume interno (35 a 400 µL)

Permite gradiente

Desvantagem:

Fluxo pulsado

Alto custo

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Sistema de bombeamento

Isocrático :

+ A composição da fase móvel permanece constante ao longo da

análise.

+ Capaz de separa um número limitado de analitos.

Gradiente

+ A composição da fase móvel varia durante a análise.

+ Sistema aplicado com a polaridade dos compostos presentes

na amostra , é muito diferente.

+ Separação de amostras complexas.

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Separação isocrática e por gradiente

A eluição isocrática é feita com um único solvente (ou mistura de

solventes). Se um solvente não propiciar uma eluição suficientemente

rápida de todos os componentes, então pode ser utilizada uma eluição

por gradiente.

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Com base nas eluições isocráticas foi elaborado o gradiente a seguir.

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Instrumentação para HPLC

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INJEÇÃO MANUAL

- As amostras são introduzidas com seringas.

- Após virar a alça, a amostra é carregada pela fase móvel até o início

da coluna.

AMOSTRADOR AUTOMÁTICO

- As amostras são postas em um frasco localizado

dentro do amostrador.

- O amostrador automático :

1- Mede o volume correto para injeção.

2- Injeta a amostra.

3 – Prepara o injetor para uma próxima amostra

Sistema de Injeção

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Sistema de Injeção Injetor Rheodyne – Diagrama de fluxo

Bomba

Coluna

Bomba

Coluna

LO

AD

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Sobrecarga de Volume da amostra

Para aproveitar de todos os pratos que uma

colina possui, não se deve injetar um volume

maior que 1% do volume da coluna vazia.

𝑉𝑚𝑎𝑥(µL)=π(raio)2(comprimento)(0,01)

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Instrumentação para HPLC

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Coluna Geralmente em aço inox ( mais popular, maior pressão)

+ Coluna de vidro reforçado (até 600 psi, utilizada para biomoleculas)

+ PEEK polímero ( biocompatível e quimicamente inerte com a maioria

dos solventes)

+ Preço: > US$ 200.00

Tipos de colunas

+ Analíticas : diâmetro interno (i.d) 1,0-4,6 mm, comprimento 15 - 250

mm.

+ Preparativas: i.d ˃ 4,6 mm, comprimento 50 -250 mm.

A escolha de uma coluna apropriada é o ponto crítico para o sucesso

da análise.

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Pré-coluna

Localizada entre o injetor e a coluna

Colunas de 2 a 5 cm, i.d igual ao da coluna.

Mesma FE da coluna de separação.

Protege a coluna

Custo reduzido

Pré-coluna!

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Fase estacionária.

+ As colunas são “recheadas” com partículas porosas com diâmetro

de 1,8 – 5 μm.

+ Estas partículas porosas na coluna têm geralmente uma fase ligada

quimicamente sobre a sua superfície, que interage com os componentes da

amostra para separá-los um do outro.

Coluna

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Condicionamento da Coluna

Necessário para que haja um perfeito equilíbrio

da FM e da FE.

Coluna nova: 4- 8 horas

Coluna parada há alguns dias: 2 horas

Coluna de uso diário: 15 minutos.

Lembre-se: a coluna deve ser

guardada em solvente orgânico.

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LC com fase quimicamente ligada

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Síntese da FE.

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Modos de HPLC

HPLC

Partição Iônica Exclusão Adsorção

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Tipos de cromatografia líquida:

Adsorção:

O mecanismo de separação: competição entre moléculas da

amostra e da fase móvel em ocupar os sítios ativos da fase estacionária,

sólido. (Sílica)

Fase estacionária (polar) é afetada com frequência pela

retenção de moléculas de alta polaridade como álcoois, água.

Partição: (CLL ou CFL)

CLL: O mecanismo de separação: baseia-se nas diferentes

solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase

móvel e na fase estacionária.(sílica purificada)

O maior inconveniente desta técnica é a solubilidade da fase

estacionária na fase móvel.

CFL: A fase estacionária está imobilizada por meio de ligações

químicas. (Normal ou Reversa)

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Fase normal x Fase reversa

Fase normal:

fase estacionária polar;

fase móvel apolar (n-alcanos, clorofórmio, acetato de etila);

solutos neutros;

polaridade soluto t. retenção;

mecanismo retenção: adsorção

Fase reversa:

fase estacionária apolar;

fase móvel polar (tampões, água, metanol, acetonitrila, THF);

solutos apolares, não-iônicos;

polaridade f. móvel t. retenção;

mecanismo retenção: interações apolares com radicais da coluna.

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Fase Normal

Si

OH

silanol livre

••

Si-OH + R3SiCl Si-O-Si-(CH3)2R + HCl

Ciano (-C2H4CN)

Diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH)

Amina (–C3H6NH2)

R =

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CROMATOGRAFIA DE FASE

NORMAL •Nos trabalhos pioneiros usou-se

fases altamente polares, como

água e trietilenoglicol

adsorvidos sobre sílica ou

alumina e solventes apolares,

como hexano ou éter

isopropílico, eram usados como

fase móvel; por razões históricas,

este tipo de cromatografia é

chamado de fase normal

•Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a sua

maior solubilidade na fase móvel; aumentando a polaridade da fase móvel tem

o efeito de diminuir o tempo de eluição

Polaridade do soluto: a > b > c

c b a tempo

c b a tempo

Po

lari

dad

e d

a f

ase m

óvel

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Fase reversa

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CROMATOGRAFIA DE FASE

REVERSA

•Na cromatografia de fase reversa, a

fase estacionária é apolar, um

hidrocarboneto por exemplo (C18), e a

fase móvel é relativamente polar

(água, metanol, acetonitrila, etc)

•Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior

solubilidade na fase móvel; aumentando-se a polaridade da fase móvel aumenta-se

o tempo de eluição

Polaridade do soluto: a > b > c

a b c

tempo

a b c

tempo

Po

lari

dad

e d

a f

ase m

óvel

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Efeito do comprimento da cadeia na

retenção.

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Tipos de cromatografia líquida:

Iônica:

A fase estacionária é, normalmente, uma resina de poliestireno e

divinilbenzeno, a qual são ligados grupos iônicos, como por exemplo,

-SO-3 trocadores fortes de cátion

-CO-2 trocadores fracos de cátion

-NR+3 trocadores fortes de ânions

-NH2R+ trocadores fracos de ânions

Os grupos iônicos têm um contra-íon (com carga oposta) que pode

ser deslocado pelos íons da fase móvel de carga similar a ele.

Exclusão:

A separação é efetuada de acordo com o tamanho efetivo das

moléculas.

A coluna é recheada com matéria inerte cujos poros têm tamanho

controlado. Onde, as moléculas menores penetram a maioria dos poros.

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Instrumentação para HPLC

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Características de um detector

Sensibilidade e seletividade adequada

Ampla faixa linear

Baixo volume interno

Resposta Rápida

Boa estabilidade e reprodutibilidade

Não destruir a amostra

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Baixo volume interno

O volume do detector é a região do fluxo cromatográfico ao qual o detector responde.

Grande volume alargamento dos picos registrados.

Características de um detector

Resposta Rápida

O sistema de detecção deve idealmente apresentar um sinal que represente um exato instante de uma porção do caminho (volume do detector).

Detector lento picos deformados (baixo e largo) e com cauda longa.

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Características de um detector

Boa estabilidade e reprodutibilidade

Alta confiabilidade e facilidade de uso

Não destruir a amostra para:

Permite coletar o eluato

Utilizar um segundo tipo de detector

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Um feixe de luz ultravioleta é dirigido através de uma célula de fluxo e um sensor

mede a luz que passa através da célula.

Quando um composto que absorve a energia da luz elui da coluna, ocorrerá uma

alteração na quantidade de energia que incide sobre o sensor.

Essa alteração da quantidade de energia é amplificada e dirigida para um

sistema de registro de dados.

Como resposta, um espectro de UV é obtido, o que pode ajudar na identificação

de alguns compostos.

Detector por espectrofotometria UV-

visível

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Detector por espectrofotometria UV-

visível

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Detector por espectrofotometria

UV-visível

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Detector por arranjo de diodos

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Detector por arranjo de diodos

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Detector por espectrofotometria UV-

visível

Princípio de operação Absorvância de luz na faixa UV-visível

tipo Seletivo, depende de propriedades do

composto

Min. quanti. detectável

(g/mL)

10-9

Sensib. a temperatura Baixa

Sensib. a vazão da f. móvel Não

Útil com gradientes Sim

Aplicabilidade Compostos que absorvem no selecionado

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Detector por fluorescência

Em comparação com detectores de UV-Vis, os detectores de

fluorescência oferecem uma maior sensibilidade e seletividade, que

permite quantificar e identificar compostos e impurezas em matrizes

complexas em níveis extremamente baixos.

Os detectores de fluorescência detectam apenas substâncias que

apresentam fluorescência.

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Detector por fluorescência

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Detector por fluorescência

Princípio de operação Excitação com luz produz emissão

fluorescente

tipo Altamente seletivo

Min. quanti. detetável (g/mL) 10-9 (excitação a laser: 10-12)

Sensib. a temperatura Baixa

Sensib. a vazão da f. móvel Não

Útil com gradientes Sim

Aplicabilidade Compostos ou derivados que fluorescem

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Detector por índice de refração

A capacidade de um composto ou solvente para desviar a luz, fornece uma

maneira de detectá-lo.

O IR é uma medida da capacidade de uma molécula em desviar a luz em

uma fase líquida.

A quantidade de deflexão é proporcional à concentração.

O detector IR é considerado universal porém, pouco sensível e sofre com a

variação da temperatura.

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Detector por índice de refração

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Detector por índice de refração

Princípio de operação Mudança no índice de refração da fase móvel

tipo Universal, depende de propriedade da f.

móvel

Min. quanti. detetável (g/mL) 10-7

Sensib. a temperatura alta

Sensib. a vazão da f. móvel Não

Útil com gradientes Não

Aplicabilidade Geral

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Detector eletroquímico

Princípio de operação Oxidação ou redução em potencial fixo

tipo Seletivo, depende de propriedades do

composto

Min. quanti. detetável (g/mL) 10-12

Sensib. a temperatura Média

Sensib. a vazão da f. móvel Sim

Útil com gradientes Não

Aplicabilidade Espécies que oxidam ou reduzem

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Detector por condutividade elétrica

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Detector por condutividade elétrica

Princípio de operação Condutividade elétrica devida a presença de

íons

tipo Seletivo, depende de propriedades do

composto

Min. quanti. detetável (g/mL) 10-8

Sensib. a temperatura Média

Sensib. a vazão da f. móvel Sim

Útil com gradientes Não

Aplicabilidade Soluções aquosas com compostos iônicos

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E aqui termina a aula,

!!!!!

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Referências bibliográficas

http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/index.html

SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A.

Princípios de análise instrumental. 5ª. Ed., 2002.

COLLINS, C. H., BRAGA, G. L., BONATO, P. S.

Introdução a métodos cromatográficos.

WESTON, A., BROWN, P. R. HPLC and CE - principles

and practice. 1997.

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ESCOPO DA CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO

Figura 28-1 Skoog p642 vp

•espécies MM>104: cromatografia

por exclusão

•espécies iônicas de baixa MM:

cromatografia por troca iônica

•espécies pequenas e polares,

mas não-iônicas: métodos de

partição (série homóloga)

•espécies não-polares:

cromatografia por adsorção

(isômeros estruturais,

hidrocarbonetos alifáticos)

TROCA IÔNICA

PARTIÇÃO ADSORÇÃO

fase normal

fase reversa

EXCLUSÃO

filtração em gel

permeação em gel

insolúvel em água solúvel em água

não-polar iônico

polar não-iônico

POLARIDADE DO SOLUTO

102

103

104

105

106

mas

sa m

olecu

lar

aplicações

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HPLC x GC

Fator GC HPLC

Requisito p/ amostra volátil e termicamente

estável solúvel na fase móvel

Tipos de amostra gases, líquido e sólidos líquidos e sólidos

Quantidade mínima

detectável 10-12 g (ECD) 10-9 g (UV)

Tempo de análise minutos até poucas

horas

minutos até muitas

horas

Pratos teóricos por

coluna 2.000-300.000 500-25.000

Capacidade analítica até 200 componentes até 50 componentes

Tempo de treinamento

do operador cerca de 3 meses pelo menos 6 meses

Comparação entre as características de GC e HPLC

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(a) (b)

(d) (c)


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