Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa de Lipídios como de Lipídios como Ferramenta para Ferramenta para
Estudos de Ecologia Estudos de Ecologia MicrobianaMicrobiana
Marcelo Ferreira Fernandes
ResumoResumo
• Parte I. Ecologia Microbiana
• Parte II. Diversidade Genética, Estrutural e da Composição Química de Lipídios em Microrganismos
• Parte III. Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana
PARTE IPARTE I
Ecologia Microbiana Ecologia Microbiana
Ecologia MicrobianaEcologia Microbiana
• Objetivos:
– Entender a biodiversidade de microrganismos na natureza e como diferentes guildas interagem em comunidades microbianas
– Medir a atividade dos microrganismos na natureza e monitorar seus efeitos sobre o ecossistema (componentes bióticos e abióticos)
Interações entre Interações entre Microrganismos e Microrganismos e
Impactos Ambientais e Impactos Ambientais e Econômicos Derivados de Econômicos Derivados de
suas Atividadessuas Atividades
O Exemplo do Ciclo do O Exemplo do Ciclo do NitrogênioNitrogênio
N2 (80% atmosfera)
N N
Outros Exemplos de Outros Exemplos de Impactos Ambientais e Impactos Ambientais e
Econômicos Derivados da Econômicos Derivados da Atividade de Atividade de
MicrorganismosMicrorganismos
• Controle da disponibilidade de nutrientes minerais para as plantas– Ciclagem de nutrientes, associações simbióticas (FBN, micorrizas), perdas de nutrientes
• Seqüestro de carbono e balanço de gases de efeito estufa
• Melhoria da qualidade física e química do solo– Formação de húmus, formação e estabilização de agregados de solo
• Controle biológico de pragas e doenças vegetais e animais
• Processos infecciosos (doenças) em plantas e animais
• Decomposição de alimentos e outros bens
• Biolixiviação de minerais de importância econômica (cobre, ouro, urânio...)
• Biorremediação de xenobióticos (pesticidas, petróleo, explosivos, nylon...)
• Tratamento de águas; eutroficação de águas e poluição de lençóis freáticos
• Corrosão de metais, entupimento de tubulações de água e óleo
• Produção de enzimas de importância industrial, fármacos, combustíveis, polímeros para plásticos biodegradáveis etc
• ...
Fatores que Controlam Fatores que Controlam Estes Processos e ImpactosEstes Processos e Impactos
• Bióticos– Presença e atividade de uma guilda específica
– Interações entre guildas
• Abióticas
A Atividade do “Fator Biótico” A Atividade do “Fator Biótico” Visa à SobrevivênciaVisa à Sobrevivência
• Obtenção de energia ou de compostos para síntese celular – Ciclos biogeoquímicos (C, N, P, S, Fe, Mn, Hg...) – Associações simbióticas com plantas e animais – Patógenos, predadores e parasitas
• Transformação de compostos tóxicos ao crescimento microbiano– Ciclos biogeoquímicos
• Proteção contra fatores ambientais adversos
• ...
Diversidade Metabólica MicrobianaDiversidade Metabólica Microbiana
• Vasta diversidade de “modos de vida” ou de conseguir recursos para sobrevivência
– Entre espécies de microrganismos
– Dentro da mesma espécie
Obtenção de Energia (Aerobiose)Obtenção de Energia (Aerobiose)– Corg → CO2 (Fungos, bactérias, protozoários...)
• Decomposição de restos animais e vegetais• Formação do solo (CO2 + H2O H2CO3), formação de humus, ciclagem de nutrientes
– NH4+ → N2O → NO → NO3
- (Nitrosomonas, Nitrobacter...)• Contaminação de águas com NO3
-
• Gases de efeito estufa
– Fe2+ → Fe3+ (Thiobacillus ferroxidans)• Biolixiviação de metais (cobre, ouro, urânio...)
– CH4 + 2 O2 → CO2 + 2 H2O• Importante dreno de metano
– So + H2O + 1 ½ O2 → SO42- + 2 H+ (Thiobacillus, Beggiatoa...)
• Solubilização de fosfatos de rocha pela acidificação do solo, corrosão de estruturas metálicas...
– 2 H2 + O2 → 2H2O (Alcaligenes, Ralstonia...)
– CO + ½ O2 → CO2 (carboxidotróficas: Pseudomonas carboxydovorans)• Principal dreno de monóxido de carbono da Terra
Obtenção de Energia Obtenção de Energia (Anaerobiose: Aceptores de (Anaerobiose: Aceptores de
Elétrons)Elétrons)– CO2 → CH4 (Arqueas metanogênicas: Methanobacterium, Methanococcus)
• Gás de efeito estufa e combustível
– NO3- → NO → N2O → N2 (Alcaligenes, Pseudomonas...)
• Perda de fertilizantes• Gases de efeito estufa
– Fe3+ → Fe2+ (Geobacter, Shewanella, Geospirillum, Thiobacillus ferroxidans, Sulfolobus...)
• Degradação de compostos aromáticos (benzoato, toleno) utilizados como fonte de energia (doadores de elétrons)
• Biolixiviação de metais de sulfetos metálicos.
– SO42- + acetato ou H2 → H2S (Desulfovibrio, Desulfobacter...)
• Toxidez à vida aquática• Desclorinação redutiva de pesticidas clorados
Obtenção de Compostos para Obtenção de Compostos para Síntese e Metabolismo CelularesSíntese e Metabolismo Celulares
• Fotoautotrofia (algas, cianobactérias, Euglena)– Fixação de CO2, via luz
• Quimoautotrofia (muitas bactérias e arqueas)– Fixação de CO2, via oxidação de compostos minerais
• Heterotrofia (fungos, protozoários, bactérias, arqueas)– C orgânico (saprofitismo, simbiose, parasitismo ou predação)
• Fixação Biológica do N2 (algumas bactérias)– N2 NH4
+
• ...
• ...Dinitrogenase
InteraçõesInterações entre Guildas entre Guildas MicrobianasMicrobianas
• Rizóbios (fixadores simbióticos de N2) vs. actinomicetos (produtores de antibióticos) → controle do processo da FBN em soja
• Fermentadores (diversos mcgs) vs. metanogênicos (arqueas anaeróbicas) vs. metanotróficos (bactérias anaeróbicas): balanço de metano entre solo e atmosfera → controle do processo de efeito estufa
CO2 CH4
H2
Fatores Abióticos de Controle Fatores Abióticos de Controle da Atividade, Biomassa e da Atividade, Biomassa e
Composição de Comunidades Composição de Comunidades MicrobianasMicrobianas
Atividade, Biomassa e Atividade, Biomassa e Composição Microbianas são Composição Microbianas são
Afetadas por: Afetadas por: – Disponibilidade de oxigênio
• De modo geral, bactérias e arqueas mais versáteis que eucariotos
– Disponibilidade de água• Fungos e actinomicetos mais resistentes a seca• Holoarqueas = extremófilos
Temperatura • Extremófilos = poucas bactérias; ultra-extremófilos = muitas arqueas
– Disponibilidade de nutrientes• Oligotróficos vs. copiotróficos
– Disponibilidade de energia
– pH• Fungos = ácido; bactérias = neutro (Extremos em Arquea e Bacterias)
– Toxidez por produtos naturais e artificiais
– Interações biológicas...
Impactos Antropogênicos sobre a Impactos Antropogênicos sobre a Microbiota e Processos Microbiota e Processos
Associados Associados • Preparo do solo:
– aeração, temperatura, umidade, pH
• Pesticidas e outros compostos químicos: – toxidez seletiva ou geral
• Culturas, sistemas de culturas, mudanças de uso da terra– quantidade e qualidade de substrato, relações hospedeiro e microrganismos, temperatura
e umidade
• Adubações e calagem: – disponibilidade de nutrientes, pH...
• Irrigação e drenagem: – disponibilidade de água, temperatura e oxigênio...
• Pecuária: – disponibilidade de nutrientes, oxigênio...
• Deposições atmosféricas industriais: – disponibilidade de nutrientes, pH...
Exemplos de Impactos de Exemplos de Impactos de Atividades Humanas sobre Atividades Humanas sobre
a Atividade, Biomassa e a Atividade, Biomassa e Composição das Composição das
Comunidades MicrobianasComunidades Microbianas
Mudança do Uso da TerraMudança do Uso da Terra• Substituição de florestas por pastagens:
– Pisoteio animal → compactação do solo → reduz fluxo de oxigênio para o solo
• Ambiente aeróbico → anaeróbico• Favorecimento de metanogênicos em detrimento de
metanotróficos• Aumento da emissão de CH4 para a atmosfera
– Remoção da cobertura vegetal → maior incidência solar → dessecamento da superfície do solo
• Limitação de água na superfície, mas não no subsolo• Menor atividade de metanotróficos• Aumento da emissão de CH4 para a atmosfera
Ecologia MicrobianaEcologia Microbiana
Atividades
Humanas
Atividades Microbianas
Meio Ambiente
PARTEPARTE II II
Diversidade Genética, Diversidade Genética, Estrutural e da Estrutural e da
Composição Química Composição Química de Lipídios em de Lipídios em
MicrorganismosMicrorganismos
De Onde Vem a Capacidade De Onde Vem a Capacidade dos Microrganismos de dos Microrganismos de
Realizar Tantas Funções e Realizar Tantas Funções e de se Adaptar a Tantos de se Adaptar a Tantos Ambientes Distintos?Ambientes Distintos?
Diversidade GenéticaDiversidade Genética• “Alta diversidade de genes”
– Diversidade metabólica potencialpotencial determinada pelos genesgenes de cada espécie.
– Evolução cria novos genes a partir de outros existentes
– Acúmulo de genes diferentes do ancestral: nova sps.
• Taxonomia molecular baseada em similaridade nas seqüências de genes– Seqüências rRNA (Woese, 1990)– Três domínios muito distintos
• Bacteria• Archea• Eukarya
Árvore da Vida (Woese, 1990)Árvore da Vida (Woese, 1990)
Evolução, estruturas celulares Evolução, estruturas celulares e composições de e composições de macromoléculasmacromoléculas
• Além de gerar diversidade metabólica, a evolução genética resultou em diferenças marcantes em estruturas celularesestruturas celulares e composições de macromoléculascomposições de macromoléculas entre grupos taxonômicos de microganismos:
– Ex: parede celular e estrutura química dos lipídioslipídios
Estruturas Celulares Estruturas Celulares Microbianas Ricas em LipídiosMicrobianas Ricas em Lipídios
MP*PC
(Peptidoglicano)
MP*PC
Peptidoglicano
Membrana Externa*
PC
(Fungos: Quitina)
(Algas: Celulose, glicoproteínas)
MP* MP*
Bactérias Gram +
Bactérias Gram -
Fungos e Algas
Protozoários
Estruturas Celulares Estruturas Celulares Microbianas Ricas em Lipídios Microbianas Ricas em Lipídios
(cont.)(cont.)
MP*PC
(Pseudpeptidoglicano ou glicoproteínas ou proteínas ou
polissacarídeos)
Achaea
BacteriaBacteriaLipídios
Principais nas Membranas
Ácidos Graxos
Bactérias G+
PL (MP)GL (MP)
PL: i15:0, a15:0, i16:0; i17:0, a17:0
Bactérias G- PL (MP, MExt) LPS (MExt.)
PL: 17:0cy, 19:0cy, 18:1ω7cLPS: 3-OH-FA
Actinomicetos
PL (MP) PL: 16:0 10Me, 17:0 10Me; 18:0 10Me
BacteriaBacteriaLipídios
Principais nas Membranas
Ácidos Graxos
Bactérias G+
PL (MP)GL (MP)
PL: i15:0, a15:0, i16:0; i17:0, a17:0
Bactérias G- PL (MP, MExt) LPS (MExt.)
PL: 17:0cy, 19:0cy, 18:1ω7cLPS: 3-OH-FA
Actinomicetos
PL (MP) PL: 16:0 10Me, 17:0 10Me; 18:0 10Me
ArchaeaArchaea
EucaryaEucarya
Lipídios Principais nas Membranas
Ácidos graxos
Fungos PL (MP)Ergosterol (MP)
PL: 18:2ω6cNão se aplica
Eucariotos PL (MP)Esteróis (MP)
PL: 20:4ω6cNão se aplica
PARTEPARTE III III
Lipídios como Lipídios como Ferramenta para Ferramenta para
Estudos de Ecologia Estudos de Ecologia MicrobianaMicrobiana
Ecologia Microbiana Ecologia Microbiana Aspectos de InteresseAspectos de Interesse
• Biomassa microbiana
• Atividade microbiana
• Composição ou estrutura da comunidade
Métodos para Investigação da Métodos para Investigação da Estrutura da Comunidade Estrutura da Comunidade
MicrobianaMicrobiana
• Dependentes de cultivo – Meios seletivos para organismos de
interesse– Plaqueamento da amostra em meio de
cultura sólido – Enumeração e identificação de
microrganismos
Organismos CultiváveisOrganismos Cultiváveis
Bactéria
Fungos
Archaea
Actinomicetos
Protozoários,
Algas
Organismos Viáveis, Não-Organismos Viáveis, Não-CultiváveisCultiváveis
• Torsvik, V. et al. High Diversity in DNA of Soil Bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 56(3):782-787, 1990.
• Apenas 1 a 10% dos microrganismos na natureza são cultiváveis em laboratório;
• Embora não cultiváveis, esses organismos são ativos na natureza;
• Exemplos de impacto:
– Morris et al. (Nature, 2002): • SAR 11, ser vivo mais abundante do planeta, não-cultivável.
– Nitrificação:• Bactérias Nitrosomonas e Nitrobacter (Winogradsky, 1888)• Wuchter et al. (PNAS, 2006):
– Archaea (Crenarchaeota): 100-1000 x mais abundante que bactérias nos oceanos • Leininger et al. (Nature, 2006):
– Archaea (Crenarchaeota): ~3000x mais abundante que bactérias no solo
Métodos de Investigação Métodos de Investigação da Comunidade da Comunidade
Microbiana Microbiana Independentes de Independentes de
CultivoCultivo
Métodos Independentes de Métodos Independentes de CultivoCultivo
– DNA • taxons e funções mais específicos • Primers específicos para grupos taxonômicos microbianos
(rRNA) ou genes para enzimas relacionadas a uma determinada função (ex: bactérias nitrificantes = gene amo...)
– LipídiosLipídios • em geral, compara grandes grupos taxonômicos de
microrganismos • poucos marcadores para grupos funcionais específicos• em alguns casos, atividade de guilda com uma função
específica pode ser investigada em associação com técnicas isotópicas
• Marcador fenotípico
Métodos Baseados em DNA Métodos Baseados em DNA (opcional)(opcional)
• Extração do DNA da amostra ambiental
• Amplificação de regiões específicas do DNA (PCR e primers específicos)– Taxonomia (rRNA) – Funções (genes específicos)
• Padrão de bandas em gel de eletroforese– DGGE– LH-PCR– T-RFLP ...
• Clonagem e seqüenciamento de fragmentos amplificados ou recuperados das bandas do gel
• Identificação microbiana utilizando-se ferramentas de comparação de similaridades entre seqüências obtidas com as disponíveis em bancos de dados de seqüências de DNA (NCBI)
Métodos Baseados em LipídiosMétodos Baseados em Lipídios
• Princípio de avaliação da estrutura das comunidades microbianas:
– Diversidade Estrutural de Ácidos Graxos
– Associação entre estrutura e grupos microbianos (biomarcadores microbianos)
– Inferências sobre mudanças na estrutura da comunidade a partir de mudanças no perfil de ácidos graxos
Diversidade Química de Ácidos Microbianos
Saturado (ex: 17:0)
Monoinsaturado (ex: 18:19c)
Poliinsaturado
Ramificado (iso, iX:0)
Ciclopropeno (ex: 19:0cy8c)
Ramificado (anteiso; aX:0)
ex: 18:26c
ex: 18:36c
Nomenclatura dos Ácidos Nomenclatura dos Ácidos GraxosGraxos
• X:Y – X = no de carbonos da molécula– Y = no de insaturações (duplas ligações)Ex: 16:0 (ácido hexadecanóico)
– Se Y>0 (insaturados):• X:YZc, onde Z é a posição da primeira insaturação à partir do C
distal, e “c” indica a conformação “cis”, e t, a “trans”Ex: 16:15c; 18:17t; 18:26c
• iX:Y, aX:Y, X:Y 10-Me– Radical metil lateral na posição 2, 3 ou 10, a partir do C distalEx: i15:0; a15:0; i17:0; 18:0 10-Me
• X:Ycy Zc– cy representa presença de anel ciclopropenoEx: 19:0cy 8c
Ácidos Graxos BiomarcadoresÁcidos Graxos Biomarcadores
• Grupos Taxonômicos
• Poucos de Grupos Funcionais Específicos
BiomarcadoresBiomarcadoresTipo FAME Grupo Microbiano
Poliinsaturados 18:2ω6c Fungos
Poliinsaturado 20:5ω6c Fungos micorrízicos arbusculares
Poliinsaturado 20:4ω6c Protozoários, nematóides
Metil C ω10 16:0 10Me; 17:0 10Me; 18:0 10Me
Actinomicetos
Metil C ω10 16:0 10Me
Desulfobacter (redutoras do SO4
2-)Ciclopropil 17:0cy; 19:0cy
Bactéria Gram negativas
Iso/anteiso i15:0; a15:0; i16:0; i17:0, i17:0
Bactéria Gram positivas
Monoinsaturado 18:1ω7c Bactéria Gram negativas
Monoinsaturado 16:1ω5c (NLFA) Fungos micorrízicos arbusculares
Monoinsaturado 16:1ω5c (PLFA) FMA, Flavobacterium/Cytophaga
Monoinsaturado ω8c
16:1ω8c, 18:1ω8c Bactérias metanotróficas
Misto i17:1ω7c
Desulfovibrio (redutoras do SO4
2-)
Ácidos Graxos em Diferentes Ácidos Graxos em Diferentes Classes de Lipídios ComplexosClasses de Lipídios Complexos• Ácidos graxos raramente ocorrem
livres em células
• Normalmente, eles integram lipídios estruturalmente mais complexos
• Diferentes tipos de ligações químicasligações químicas unem os ácidos graxos ao restante da molécula dos lipídios complexos
Ligações Químicas dos Ácidos Ligações Químicas dos Ácidos GraxosGraxos
• Lipídios com ligações éster– ex: triacilgliceróis – R-COO•
• Lipídios com ligações éter– ex: plasmalógenos, Archaea
– R-CH2O•
• Lipídios com ligação amida – ex: esfingolipídios– R-CO • NH-R’
Éster Metílico de Ácido Graxo Éster Metílico de Ácido Graxo ““Fatty Acid Methyl Fatty Acid Methyl
EsterEster””(FAME)(FAME)
COOH
COOCH3
Metanólise Alcalina Branda (PLFA e EL-FAME) ou
Saponificação – Metanólise Ácida (MIDI)
Ácido Graxo
FAME
Altamente volátil
R
Saponificação/MetilaçãoSaponificação/Metilação• Duas etapas:
– Saponificação: Ácido graxo sabão– Metilação: substituição do Na por metil FAME
• Condições de reação:– Saponificação: altas temperaturas, 3,8 M NaOH em MeOH:H2O
(100oC, 30’)
– Metilação: presença de água, 6 M HCl:MeOH (85oC, 10’)
• Ligações-alvo: – Éster, éter, amina, ácidos graxos livres
• Altamente danosas à estrutura de alguns ácidos graxos:– ciclopropanos
Metanólise Alcalina BrandaMetanólise Alcalina Branda
• Uma só etapa (transesterificação)– Separação de ácidos graxos das moléculas
complexas e esterificação com ·CH3
• Condições de reação: – 0,2M KOH em MeOH (37oC, 1h)– Ausência de água
• Ligações-alvo– Ésteres
Principais Lipídios Principais Lipídios Complexos Contendo Complexos Contendo
Ácidos GraxosÁcidos Graxos
FosfolipídiosFosfolipídios• Universal em membranas celulares,
proporções aproximadamente constantes por massa celular– Exceto em Archaea, ligações são principalmente ésteréster
• Rápida hidrólise do fosfato após morte Rápida hidrólise do fosfato após morte microbiana (Fosfolipídio -> Lipídio Neutro)microbiana (Fosfolipídio -> Lipídio Neutro)
• Microbiota viável
CH
CH2O
O C
H2C O C
O
O
P
O
O-
OR
Lipídios NeutrosLipídios Neutros
CH
CH2HO
O C
H2C O C
O
O
• Presentes em:•Células mortas•Reserva em eucariotos
• Reservas de LN em procariotos são Reservas de LN em procariotos são rarasraras
GlicolipídiosGlicolipídios
• EL-glicolipídios
CH
CH2O
O C
H2C O C
O
O
O
OH
H
H
HO
H
H
OHH
OH
Reserva vs. Células Mortas em Reserva vs. Células Mortas em NLFANLFA
min14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
pA
20
30
40
50
60
70
FID1 A, (G:\PLFA20~1\MARCEL~1\11230405.D)
13
.74
6
14
.54
5 1
4.6
23
15
.01
2
15
.17
5
15
.74
6 1
5.8
54
16
.60
0 16
.98
3
17
.21
3 1
7.3
06
17
.48
6
17
.69
7
18
.45
2 1
8.5
28
18
.67
3
18
.89
8
19
.06
1 1
9.1
62
19
.33
5
19
.65
9
20
.34
4 2
0.4
54
20
.63
0
20
.85
3 20
.96
2 2
1.0
59
21
.23
5
21
.411
21
.54
3
22
.10
8
22
.95
9
min14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
pA
20
30
40
50
60
70
FID1 A, (G:\PLFA20~1\MARCEL~1\11230409.D)
13
.74
2
15
.01
0
15
.17
6
15
.74
6
16
.15
3
16
.98
0 1
7.0
88
17
.31
0
17
.48
3
17
.69
5
18
.45
6
18
.89
6
19
.08
7
19
.58
8
20
.57
5
20
.85
2 2
0.9
61
21
.05
6
21
.18
8
21
.40
8
22
.68
7
23
.14
5
15:0i 15:0a
16:0i
16:1ω7c 16:1ω
5c
16:0
16:0 10M
e 17:1i
17:0i17:0a
17:0 cy
16:1 2O
H
17:0 10M
e
18:0 10M
e
18:2ω6c
18:1ω9c 18:1ω
7c
18:0
19:0 cy
16:0ωO
H
16:0 D
CA
NLFA
PLFA
Pastagem (Corvallis, OR, EUA)
Agosto 2005
Protocolos para Protocolos para Extração de FAMEs do Extração de FAMEs do
SoloSolo
Principais Protocolos de Principais Protocolos de Extração de FAMEsExtração de FAMEs
• PLFA (Phospholipid Fatty Acids)– White e Ringelberg (1998)
• MIDI (Microbial Identification™)- Sasser (1990)
• EL-FAME (Ester-linked FAME)– Direto do solo (Schutter e Dick, 2000)– Extrato lipídico (Drjiber et al., 2000)
Método: PLFA Método: PLFA
• Método mais utilizado (padrão)
• Mais caro e trabalhoso– Coluna de SPE-Si: ~R$ 10,00 (no Brasil) – 40-50 ml de clorofórmio, acetona e metanol
amostra-1
– 24 amostras em 2 dias
• Extrai apenas ácidos graxos esterificados em fosfolipídios
Protocolo PLFAProtocolo PLFA
• Bligh e Dyer (1959) modificado– Mistura monofásica metanol:clorofórmio:tampão
fosfato 50 mM (2:1:0,8)– Solo:clorofórmio (1:1, m/v)– Volumes de água e tampão fosfato 100 mM– Ex: 4 g solo úmido com 25% umidade (b.u.)
• 3 g solo seco + 1 g água• 6 ml de metanol, 3 ml de clorofórmio, 2,4 ml TF 50 mM• 2,4 ml TF 50 mM (combinação de água e TF 100 mM)• 1 ml água do solo + 0,2 ml água adicionada + 1,2 ml
TF 100 mM
Fase 1.Fase 1.Extração de Lipídios Totais do Extração de Lipídios Totais do
SoloSolo
1.1. Solo e mistura de solventes em tubo de centrífuga com tampa com revestimento interno de teflon;
1.2. Agitar por 2 h, decantar “overnight”– Variações:
• sonicação (2 min)• tempo de agitação, omissão da decantação;
1.3. Ressuspender solo e centrifugar (10 min e 2000 x g);
1.4. Filtrar sobrenadante papel Whatman #1;
1.5. Adicionar metanol:clorofórmio ao solo remanescente no tubo e repetir passos 1.3 e 1.4 mais duas vezes;
1.6. Partição do filtrado em duas fases: adicionar solução NaCl 2 M (solução:clorofórmio, 1:1);
1.7. Esperar até que a desaparecimento da turbidez na fase superior (aquosa);
1.8. Transferir a fase inferior (orgânica) para um tubo de ensaio e secá-la sob atmosfera de N2 ultra-puro, a 37oC. Armazenar a -20oC.
Fase 2. Fase 2. Fracionamento das Classes de Fracionamento das Classes de
Lipídios (Cromatografia de Lipídios (Cromatografia de Afinidade)Afinidade)
• Extração em fase sólida (ácido silícico)
• Partição de lipídios entre radicais silanóis ativos nos grânulos de ácido silícico e solventes de polaridade crescente (clorofórmio, acetona e metanol)
2.1. Colocar coluna de ácido silícico (3 ml, 500 mg) em aparato de vácuo com tubo de ensaio diretamente abaixo da mesma;
2.2. Adicionar 2 ml de clorofórmio à coluna, sem deixar drenar;
2.3. Ressuspender extrato de lipídios em volume mínimo (100-200 μL) de clorofórmio e transferir para coluna de ácido silícico. Repetir 3 vezes para assegurar transferência quantitativa;
2.4. Acionar vácuo e adicionar 3 x 2 ml de clorofórmio, e coletar esses volumes no tubo de ensaio colocado abaixo;
2.5. Trocar tubo de ensaio por um novo, adicionar 3 x 2 ml de acetona, e coletar volumes no tubo de ensaio abaixo;
2.6. Trocar tubo de ensaio por um novo, adicionar 3 x 2 ml de metanol, e coletar volumes no tubo de ensaio abaixo;
2.7. Secar frações sob atmosfera de N2 ultrapuro , a 37oC, armazenar a -20oC.
Clorofórmio Metanol
Acetona
Esquema do Fracionamento de Esquema do Fracionamento de LipídiosLipídios
Neutros
NLFA
Esteróis Glicolipídios
Poli-β-hidroxialcanoatos
Fosfolipídios
PLFAPLFA
Fase 3. Metanólise Alcalina Fase 3. Metanólise Alcalina para Produção dos FAMES de para Produção dos FAMES de
PL PL • Geração dos FAMEs a partir de fosfolipídios
esterificados;
• Remoção dos ácidos graxos do restante da molécula lipídica e substituição das ligações com glicerol por grupos metil > aumenta a volatilidade dos compostos
• Para PLFA, proceder reação apenas na fração contendo fosfolipídios;
• Nota:Nota: Dependendo do objetivo do estudo, a fração neutra e glicolipídica também poderão ser tratadas posteriormente para análise cromatográfica de compostos de interesse.
3.1. Redissolver os lipídios fracionados secos em 1 ml de tolueno: metanol (1:1, v/v) e 1 ml de KOH metanólico (0,2 N);
3.2. Agitar tubo em vortex, rapidamente, e colocá-los em banho-maria a 37oC por 15 min.;
3.3. Após amostras esfriarem até a temperatura ambiente, adicionar 2 ml de hexano:clorofórmio (4:1, v/v), e misturar amostra;
3.4. Neutralize pH (6 a 7) da mistura com adição de 0,2 ml de ácido acético 1N. Verificar pH final em papel de tornassol;
3.5. Adicione 2 ml de água destilada para separar fases e misture amostra em vortex por 30 s. Esperar separação de fases se completar (~10-15 min.);
3.6. Transferir fase orgânica (superior) para um tubo de ensaio novo,
3.7. Reextrair fase inferior: adicionar 2 ml de clorofórmio:hexano (4:1 v/v), agitar em vortex 30 s., esperar separação de fases, transferir para tubo novo (repetir 2x)
3.8. Evaporar solvente sob N2 ultrapuro, a 37oC; armazenar a -20oC, sob N2.
PLFA (Esquema Geral)PLFA (Esquema Geral)
3 g solo + CHCl3:CH3OH:tampão
(1:2:0,8)
transferir para coluna SPE-silica
FAMEs em hexano, em frasco GC
2 h, agitar 100 rpm
Filtrar (Whatman 1), repetir 2x após adicionar CHCl3 e CH3OH ao solo remanescente, vortex e
centrifugação
adição de NaCl 2M
Fase orgânica (inferior) contém lipídios totais
partição de fases
tranferir fase orgânica
extrato lipídico
secar sob N2
40oC
extrato lipídico seco
centrifugar 500 x g
Eluir c/ CHCl3, acetona e CH3OH
Lipídios Neutros
ClorofórmioAcetona
Metanol
Glicolipídios Fosfolipídios
secar sob N2, 40oC
Transesterificação (geração de FAMEs)
KOH (0,2 N) em metanol, 40oC
CG-FID
ressuspender em 3 x 200 ul CHCl3
Descartar Perfil de FAMEs
Partição com água, recuperar FAMEs (fase superior) em hexano, secar sob
N2, resuspender em hexano
Fase 4. Preparo de Amostras, Fase 4. Preparo de Amostras, Separação em CG, Quantificação e Separação em CG, Quantificação e
Identificação de CompostosIdentificação de Compostos4.1. PLFA secos são ressuspensos em hexano, agitados em vortex, e transferidos
para frasco GC com “insert” de 200 μL;
4.2. Injeção em CG-FID, equipado com coluna não-polar (ex: 5% diphenyl, 95% methylpolysiloxane fase estacionária; ex: Ultra-2, DB-5, HP-5), com 25 m, 0,2 mm diam. int.; 0,33m espessura filme); rampa de temperatura: 170-280oC a 4oC min-1; mais 5 min. a 280oC para limpeza da coluna.
4.3. Curva-padrão: FAME 13:0 (“methyl tridecanoic acid”): relação entre área de pico cromatográfico e quantidades conhecidas do FAME.
Alternativamente: adição de padrão interno: usualmente FAME 19:0.Resultados em mol de FAMEs individuais por g de solo (pmol FAME g-1 solo seco).
4.4. Misturas padrões de FAMEs microbianos (BAME e FAME-37): comparar TR com amostras
4.5. ECL vs. TR (Biblioteca de ECLs. Ex: MIDI)- Relação linear entre TR e número de C de série homóloga de ácidos graxos saturados de cadeia linear
4.5. CG-EM (confirmação de compostos): importante, mas, em geral, não realizada.
Curva Padrão Curva Padrão Tridecanoato de Metila (FAME Tridecanoato de Metila (FAME
13:0)13:0)
min5 10 15 20 25
pA
100
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\11210213.D)
2.03
1
min5 10 15 20 25
pA
100
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\11210214.D)
2.03
1
12.39
4
min5 10 15 20 25
pA
100
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\11210215.D)
2.03
7
12.39
4
min5 10 15 20 25
pA
100
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\11210216.D)
2.03
2
12.39
6
min5 10 15 20 25
pA
100
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\11210217.D)
2.03
3
12.40
1
min5 10 15 20 25
pA
100
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\11210218.D)
2.02
9
4.88
7
9.41
5 12.41
1
0 pmol ml-1
60 pmol ml-1
151 pmol ml-1
605 pmol ml-1
302 pmol ml-1
1210 pmol ml-1
y = 0.5935x + 2.3384
R2 = 0.9996
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 500 1000 1500
FAME 13:0 (pmol ml-1)
Áre
a (C
G)
pmol FAME 13:0 ml-1 Área CG
0 0
60 35.9
151 87.6
302 187.6
605 368.5
1210 716
BrancosBrancos- Verificar contaminações das amostras durante procedimento de extração- Todo o procedimento é realizado de modo idêntico às amostras, porém sem solo
min15 16 17 18 19 20 21 22 23
pA
20
30
40
FID1 A, (G:\PLFA20~1\MARCEL~1\11230405.D)
14.
545
14.
623
15.
012
15.
175
15.
746
15.
854
16.
600
16.
983
17.
213
17.
306
17.
486
17.
697
18.
452
18.
528
18.
673
18.
898
19.
061
19.
162 1
9.33
5
19.
659
20.
344
20.
454
20.
630 20.
853
20.
962
21.
059
21.
235
21.
411
21.
543
22.
108
22.
959
min15 16 17 18 19 20 21 22 23
pA
20
30
40
FID1 A, (G:\PLFA20~1\MARCEL~1\11230413.D)
min15 16 17 18 19 20 21 22 23
pA
20
30
40
FID1 A, (G:\PLFA20~1\MARCEL~1\11230410.D)
15.
012
15.
178
16.
980 1
7.30
3
17.
484 17.
692
18.
525
18.
899
19.
086
20.
569
20.
850
20.
957
21.
056
21.
409
22.
687
min15 16 17 18 19 20 21 22 23
pA
20
30
40
FID1 A, (G:\PLFA20~1\MARCEL~1\11230416.D)
18.
458
PLFA Br
PLFA
NLFA Br
NLFA
Efeito do Desmatamento sobre a Efeito do Desmatamento sobre a Estrutura da Comunidade Estrutura da Comunidade
MicrobianaMicrobiana
Floresta Adulta (>150 a) vs. Floresta Recem-Cortada (10 a)
min16 17 18 19 20 21 22 23
pA
20
30
40
50
60
70
80
90
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\10170355.D)
15.
346
15.
511
15.
934
16.
080
16.
187
16.
246
16.
939
17.
004 1
7.32
7
17.
542
17.
655
17.
733 1
7.83
5
18.
042
18.
136
18.
192
18.
421
18.
487
18.
751
18.
802 1
8.87
7 1
8.93
9 1
9.02
2
19.
244
19.
408
19.
513 1
9.69
0
19.
834
19.
935
20.
005
20.
125
20.
263
20.
694
20.
807
20.
935
20.
986
21.
101
21.
214
21.
321
21.
424
21.
534
21.
595
21.
763
21.
897
22.
065
22.
163
22.
349
22.
466
22.
525
22.
860
23.
059
23.
138
23.
326
min16 17 18 19 20 21 22 23
pA
20
30
40
50
60
70
80
90
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\10170346.D)
15.
350
15.
513
15.
621
15.
761
15.
933
16.
081
16.
189
16.
250
16.
497
16.
810
16.
938
17.
007
17.
217
17.
330
17.
541
17.
661
17.
735
17.
838
18.
052
18.
141
18.
406
18.
495
18.
753
18.
807
18.
881
18.
941
19.
027
19.
138
19.
248
19.
413
19.
542
19.
694
19.
834
19.
936
20.
009
20.
125
20.
268
20.
697
20.
810
20.
930
20.
992
21.
065
21.
100
21.
229
21.
332
21.
437
21.
540
21.
598
21.
767
21.
902
22.
067
22.
169
22.
296
22.
349
22.
465
22.
524
22.
585
22.
721
22.
862
23.
062
23.
143
23.
231
23.
333
23.
505
~ 10 anos
>150 anos
16:0
com
um
18:2
6c
fun
go
Método: MIDIMétodo: MIDI• Adaptado de método comercial para identificação de bactérias
em cultura pura, de acordo com perfil de lipídios celulares totais
• Mais rápido (?) e barato que PLFA
• Requer menor quantidades de solo (??)
• Mais perigoso (base e ácido concentrados, alta temperatura)
• Extração diretaExtração direta, sob condições extremas de pH e temperatura (saponificação/metilação ácida)
• Extrai FAMEs de potencialmente todos os lipídios celulares (éster, éter, amida...) e não-celulares (reserva, células mortas, fontes não-microbianas, matéria orgânica do solo...), incluindo ácidos graxos livres
• Forte potencial de alterar a estrutura química de muitos ácidos graxos, especialmente os com aneis ciclopropeno e os insaturados
Protocolo MIDIProtocolo MIDI
SaponificaçãoSaponificação
• Pesar 3 g de solo em tubo de de vidro (20 ml) com tampa de rosca revestida com Teflon;
• Adicionar 3 ml de solução de NaOH (3,8N) em água:metanol (1:1 v/v);
• Agitar em vortex e ferver por 30 min.
• Produto: sais de sódio de cadeia longa (sabão)
Metilação ÁcidaMetilação Ácida
• Adicionar 6 ml de mistura HCl (6M):metanol (1:0,85 v/v);
• Aquecer em banho-maria 85oC, 10 min.
• Produto: FAMEs
Recuperação dos FAMEsRecuperação dos FAMEs
• Adicionar 3 ml de hexano (partição de fases);
• Transferir todo conteúdo do frasco para para tubos de centrífuga de 35 ml, com rosca revestida por Teflon;
• Centrifugar a 480 x g por 10 min. para separar MOS da fase orgânica;
• Transferir fase orgânica (superior) para tubos de 13 x 100 mm com tampa revestida de Teflon;
Lavagem da Fase OrgânicaLavagem da Fase Orgânica
• Adicionar 3 ml de base fraca (0,3 M NaOH) para lavar residual de reagentes ácidos
• Agitar tubo lentamente por 5 min
• Transferência da fase superior para tubos CG (2ml)
Análise cromatográfica, Análise cromatográfica, quantificação e identificação quantificação e identificação
dos compostosdos compostos
• Idem PLFA
Método: EL-FAMEMétodo: EL-FAME
• Mais rápido (!), fácil (!) e barato que PLFA
• Extrai ácidos graxos esterificadosesterificados em diversas classes de lipídios (neutros, glicolipídios e fosfolipídios)
• Contribuição de lípídios de reserva e de células mortas (LN), além de glicolipídios esterificados, para o perfil de FAMEs
• Duas variações de extração: – direta do solo (Schutter e Dick, 2000);– a partir do extrato de lipídios totais (Drijber et al., 2000).
Protocolo EL-FAMEProtocolo EL-FAME
Metanólise Alcalina BrandaMetanólise Alcalina Branda
• Pesar 3 g de solo em tubo centrífuga de 35 ml com tampa revestida de Teflon;
• Adicionar 15 ml de KOH (0,2 N) em metanol;
• Agitar em vortex e incubar a 37oC por 1 h (transesterificação, idêntica à do PLFA)
• Agitar tubos em vortex a cada 10 min. durante o tempo de incubação.
• Adicionar 3 ml de ácido acético 1,0 M para neutralizar pH do conteúdo do frasco
Recuperação dos FAMEsRecuperação dos FAMEs
• Partir fases adicionando 10 ml de hexano;
• Centrifugar a 480 x g, 10 min.;
• Transferir fase orgânica para tubo de ensaio e secar sob N2 ultrapuro;
• Ressuspender extrato seco em 3 x ~70 µL de hexano, agitando em vortex após cada adição do solvente, e transferir para frasco CG, com insert de 200 µL.
Análise cromatográfica, Análise cromatográfica, quantificação e identificação quantificação e identificação
dos compostosdos compostos
• Idem PLFA
Comparação entre MétodosComparação entre Métodos
EL-EL-FAMEFAME PLFAPLFA
MIDIMIDI
AG Éster Fosfolipídios
AG Éster
AG Totais
min16 17 18 19 20 21 22 23
pA
20
25
30
35
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\10020330.D)
15.
372
15.
538
16.
113
16.
220
16.
973
17.
354
17.
578 17.
681
17.
863
18.
065
18.
164
18.
832
18.
903
18.
964
19.
048
19.
275
19.
439
19.
547
19.
719
19.
970
20.
037
20.
727
20.
839
21.
243
21.
345
21.
445
21.
627
21.
793
21.
930
22.
492
22.
552
23.
291
23.
350
min16 17 18 19 20 21 22 23
pA
20
25
30
35
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\09300315.D)
15.
371
15.
537
16.
109
16.
215
16.
526
16.
975
17.
038
17.
185 1
7.35
4
17.
588
17.
682
17.
863
18.
070
18.
163
18.
833
18.
903
18.
966
19.
048
19.
275
19.
438
19.
545
19.
718
19.
878
19.
964
20.
037
20.
725
20.
836
21.
009
21.
129
21.
244 2
1.35
0 2
1.44
6 2
1.57
1 2
1.62
3
21.
793
21.
928
22.
219
22.
429
22.
492
22.
553
22.
759
22.
997
23.
093
23.
291 23.
350
23.
544
min16 17 18 19 20 21 22 23
pA
20
25
30
35
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\10040329.D)
15.
177 1
5.36
6
15.
531
15.
684
15.
957
16.
103
16.
211
16.
515
16.
970
17.
173
17.
348
17.
592
17.
676
17.
857
18.
061
18.
153
18.
510
18.
671
18.
828
18.
898
18.
964
19.
043
19.
139
19.
268
19.
436
19.
538
19.
606
19.
710
19.
828
19.
963
20.
034
20.
722
21.
000
21.
236
21.
341
21.
439
21.
681
21.
788
21.
888
22.
183
22.
247 22.
417
22.
591
22.
698
22.
813
22.
989
23.
140
23.
251
23.
345
PLFA
EL-FAME
MIDI
Impacto da Escolha do Método de Impacto da Escolha do Método de Extração sobre os Perfis de Ácidos Extração sobre os Perfis de Ácidos
GraxosGraxos
Efeito da Escolha do Efeito da Escolha do Protocolo de Extração Protocolo de Extração
sobre a Interpretação de sobre a Interpretação de Resultados de Estrutura da Resultados de Estrutura da
Comunidade MicrobianaComunidade Microbiana
Amostras de SoloAmostras de Solo • 29 amostras de solo através do Estado do
Oregon, EUA (0-10 cm depth)
• Ecossistemas diversos– Sem vegetação na data de amostragem– Herbáceas (culturas anuais, pastagens e pomares)– Florestas (gimnospermas com >150a; clareiras de
10 a; mistas)
• Ampla faixa de propriedades do solo– COT, MOP, MO-nP, pH, textura
• Amostras de solo peneiradas (< 2mm)
• Extração de FAMEs pelos 3 métodos
Análise de FAMEsAnálise de FAMEs
• Cromatografia gasosa
• Identificação inicial por comparação dos TR entre amostras e padrões de FAMEs microbianos
• Confirmação de compostos abundantes por EMEM
• Dados de composição de AG analisados em mol%mol%
Mol%
MIDI versus PLFAMIDI versus PLFA
• Análise estatística: ordenação multivariada NMS– Distância de Sorensen
– PC-ORD 4, modo autopiloto “lento e abrangente”
– Correlações com variáveis de solo e caracterização da mudanças no perfil de FAMEs utilizando coeficiente de Pearson (“joint plots”)
MIDI versus PLFA - ResultadosMIDI versus PLFA - Resultados
• CG-MS: alguns biomarcadores de substâncias vegetais (cutina, suberina, e ceras) presentes em grandes quantidades no extrato de MIDI, mas não em PLFA
16:0 16OH
14:0 14OH
12:0 12OH
16:0 alcohol
16:0 DCA
CG-EM
CG = 19cy:0 10c
CG = 17:17c
suberina, cutina, ceras
cutina, ceras
cutina, ceras
suberina
suberina, cutina, ceras
Compostos Vegetais
Compostos de Planta Compostos de Planta MIDI vs. PLFAMIDI vs. PLFA
mol% FAMEs MIDI PLFA
16:0 Alcohol 1.62 0.00 16:0 16OH 6.70 0.29 16:0 DCA 2.87 0.06 14:0 14OH 6.61 0.00 12:0 12OH 1.69 0.00
FAMEs FAMEs MIDI vs. PLFAMIDI vs. PLFA
mol% FAMEs MIDI PLFA
17:0cy 0.75 3.51 19:0cy 0.41 5.40 18:1ω7c 2.14 9.80 17:0i 0.53 1.67 17:0a 0.67 1.90 16:0 10Me 1.14 4.66 17:0 10Me 0.34 1.05 18:0 10Me 0.53 2.03
Non-metric Multidimensional Scaling
mol% of FAMEs PLFA
MIDI
Forest
Forest
Correlation Axis 1MIDI vs. Axis 1PLFA: r = 0.87
Correlation Axis 2MIDI vs. Axis 2PLFA: r = 0.28
MIDI
EL-FAME versus PLFAEL-FAME versus PLFA
• Mesmo método de produção de FAMEs (metanólise alcalina branda)
• Diferentes reservatórios de lipídios alvos de produção de FAMEs
PLFA vs. PLFA + NLFA + GLFA
EL-FAME versus PLFAEL-FAME versus PLFA
Objetivo:
Avaliar a interferência de NL e GL no que se refere à comparação da interpretação de dados de comunidade microbiana entre o EL-FAME e o PLFA (padrão)
Amostras de solo:
Idem estudo de comparação entre PLFA vs. MIDI
Análises estatísticas:
Modelos de regrassão múltipla (stepwise)
Ordenação das amostras com base na relação entre EL/PL com respeito às concentrações molares dos FAMEs (mol%) nos respectivos extratos
Organic C Vegetation Interactions
FAMEs Intercept EL POM nPOM pH Herb Forest EL vs.
pH EL vs. Forest
EL vs. Herb
POM-C vs. Forest R2
FUNGI 534*** 10.0*** 11.6*** 6.6*** 0.45*** 0.14*** 0.92 GP 2335*** 4.1*** 14.5*** 1.09*** 3.4*** 0.07*** 0.92 GN 1806*** 2.5*** 19.3*** 1.10*** 4.0*** 0.07*** 0.91 ACT 1049*** 3.1*** 14.8*** 3.9*** 0.08*** 0.91 AMF 299*** 0.4ns* 19.8*** 1.0ns 1.6*s* 6.5*** 1.68** 0.44** 0.05*** 0.90 EUK 90*** 7.4*** 4.3*** 2.0*** 4.6*** 0.27*** 0.93 16:0 1817*** 7.9*** 12.5*** 4.1*** 0.10*** 0.95 18:0 353*** 7.1*** 11.4*** 3.9*** 0.10*** 0.94 16:1ω7c 932*** 5.5*** 20.0*** 1.2ns* 4.0*** 0.57** 0.63** 0.06*** 0.92 18:1ω9c 1208*** 8.2*** 18.1*** 3.7*** 0.07*** 0.94 Total 14485*** 4.8*** 17.2*** 4.0*** 0.07*** 0.93
Multiplicative changes (exp ß) on FAME amount (pmol g-1 soil)
Stepwise Multiple Regression (Backward Selection)
FAME ~ (method of extraction, vegetation, POM, nPOM, pH)
controls( PLFA , no veg )
TOTAL FAME (EL) = 14485 * 4.8(EL=1) * 17.2POM * 4.0Forest * 0.07(POM*Forest)
TOTAL FAME (PL) = 14485 * 4.8(EL=0) * 17.2POM * 4.0Forest * 0.07(POM*Forest)
4.8
1.0
TOTAL FAME (EL/PL) = 4.8
Lipid
Source Interactions NL vs.
Lipid Source Interactions GL vs.
FAMEs NL Forest Herb Model R2 GL Forest Herb Model R2
Fungi 2.27*** 0.56* 0.83 0.28*** 0.84
GP 0.31*** 0.82 0.23*** 0.89
GN 0.19*** 0.86 0.09*** 0.94
Act 0.17*** 0.90 0.19*** 0.92
AMF 8.65*** 0.32** 0.71 0.31*** 0.46*** 0.81
Euk 1.95*** 0.80 0.00
16:0 1.52*** 0.65 0.65*** 0.84
18:0 0.78ns 0.76 0.69*** 0.81
16.1ω7c 2.95*** 0.45* 0.31** 0.59 0.19*** 0.63*** 0.90
18.1ω9c 2.19*** 0.75 0.34*** 0.86
Total 1.02 ns 0.70 0.32*** 0.89
Multiplicative changes (exp ß) on FAME amount (pmol g-1 soil) associated with lipid sources (neutral lipids vs. phospholipids; and glycolipids vs. phospholipids
Stepwise Multiple Regression (Backward Selection)
FAME ~ (lipid source, vegetation, POM, nPOM, pH)
Vegetation: non-vegetation at sampling (control), herbaceous, and forest
Lipid source: PLFA (control), NLFA or GLFA
NMS with EL-FAME:PLFA mol% ratios
EL-FAME (mol%)
15:0i 18:26c
… 20:46c
CO 0.05 0.26 0.20
PMa 0.09 0.21 0.23
…
OGc 0.01 0.34 0.12
PLFA (mol%) 15:0i 18:26c
… 20:46c
CO 0.12 0.15 0.11
PMa 0.16 0.12 0.16
…
OGc 0.06 0.22 0.22
ELFA/PLFA 15:0i 18:26c
… 20:46c
CO 0.41 1.73 1.82
PMa 0.56 1.75 1.44
…
OGc 0.17 1.53 0.55
No vegetation
Herbaceous
Forest
Outros Lipídios ImportantesOutros Lipídios Importantes
• Ergosterol (esterol): – exclusivo de fungos (biomassa de
fungos)– altamente correlacionado com PLFA
18:26c
• Poli-hidroxialcanoatos (PHAs)– reservas em bactérias– em SPE-Si é eluído com acetona
Outros Usos dos Métodos Outros Usos dos Métodos Baseados em Lipídios na Baseados em Lipídios na
Investigação da MicrobiotaInvestigação da Microbiota
• Diversidade e estrutura da comunidade microbiana
• Biomassa microbiana – Total– Grupos microbianos específicos
• Estado nutricional de fungos do solo• Respostas de bactérias a estresses
ambientais
Biomassa Microbiana ViávelBiomassa Microbiana ViávelMétodo 1. Soma dos PLFAs
BM total: soma de todos os PLFAs3,0 x 104 células/pmol PLFA (bactéria)1,2 x 104 células/pmol PLFA (algas)
BM grupo-específica: soma de PLFAs do grupoDados quantitativos obtidos na análise de PLFA
Método 2. Quantificação do P na fase orgânicaPrincípio: P na fase orgânica do extrato é derivado de fosfolipídios.Vantagem: simples, dispensa CG
Efeito da Substituição de Floresta Efeito da Substituição de Floresta por Agricultura (Trigo ~26 anos) por Agricultura (Trigo ~26 anos)
sobre a BMsobre a BM
Método BM 1 (Soma dos PLFAs) Método BM 1 (Soma dos PLFAs) Floresta vs. Agricultura (Trigo ~26 Floresta vs. Agricultura (Trigo ~26
anos)anos)
min15 16 17 18 19 20 21 22 23
pA
20
30
40
50
60
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\10180305.D)
14.
820
14.
874
14.
946
15.
111
15.
345
15.
510
15.
625
16.
077
16.
187
16.
935
17.
325
17.
540
17.
654
17.
733
17.
833
18.
045
18.
134
18.
417
18.
486 1
8.80
3 1
8.87
3 1
8.94
2 1
9.02
2
19.
245
19.
409
19.
515
19.
686
19.
830
19.
934
20.
004
20.
122
20.
266
20.
693
20.
805
20.
916
20.
989
21.
098
21.
220
21.
324
21.
424
21.
532 21.
592
21.
761
21.
896
22.
172
22.
291
22.
345
22.
460
22.
521
22.
581
22.
861
23.
058
23.
136
23.
251
23.
321
23.
513
min15 16 17 18 19 20 21 22 23
pA
20
30
40
50
60
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\10180306.D)
14.
952 1
5.34
3 1
5.51
1
16.
080
16.
188
16.
943 17.
325
17.
562 1
7.65
3
17.
832
18.
038
18.
134
18.
802
18.
875
18.
935
19.
020
19.
243
19.
410
19.
513
19.
686
19.
935
20.
006
20.
694
20.
808
20.
985 21.
210 21.
316
21.
415
21.
532
21.
593
21.
761
21.
896
22.
460
22.
523
23.
257
23.
318
23.
570
Floresta
Agricultura
Método BM 2. Quantificação do Método BM 2. Quantificação do P na Fase Orgânica do Extrato P na Fase Orgânica do Extrato
de Solode Solo• Protocolo: White et al. (1979) (resumo)1. Extração de lipídios totais, por 2 h (Bligh e Dyer, 1959);2. Partição com NaCl 2 N;3. Recuperação da fase orgânica (inferior);4. Secagem sob N2 ultrapuro;
5. Digestão com ácido perclórico, 180oC (3-4h);6. Adicionar solução molibdênio (White et al., 1979);7. Após 10 min, adicionar solução de ANSA (1-amino-2-
naftol-4-ácido sulfônico);8. Ferver por 10 min. em banho-maria;9. Ler absorvância a 830 nm.
Comparação com Outros Comparação com Outros Métodos de Deteminação da Métodos de Deteminação da
BMBM(Frostegard et al., 1991)
• P-lipídio vs. SIR (respiração induzida por substrato)
SIR (g CO2/g solo) = 17,6 + 0,13 P-lipídio (nmol P/g solo)
R2 = 0,86
• P-lipídio vs. conteúdo celular de ATP
ATP (g ATP/g solo) = 0,92 + 0,0046 P-lipídio (nmol P/g solo)R2 = 0,89
• Bååth, 2003– Princípio: sob excesso de C e deficiência de N
ou P, a comunidade fúngica não cresce, mas acumula lipídios.
– Experimento e Resultados:
• Glucose apenas: NL aumenta e PL permanece constante
• Glucose + N + P: NL constante e PL aumenta
– Bååth, E. Microbial Ecology, 45:373-383, 2003
Estado Nutricional de Fungos Estado Nutricional de Fungos do Solodo Solo
Protocolo:Protocolo: Estado Nutricional de Fungos Estado Nutricional de Fungos
do Solodo Solo• Bååth et al., 2003 • Idem procedimento para estrutura da
comunidade, exceto:– Não descartar a fração LN– Fração de LN e PL são transesterificada– Relação NL:PL do FAME 18:26c (fungo)– Quanto maior a relação NL:PL maior é a
deficiência nutricional (N ou P) da comunidade fúngica
Respostas de Bactérias a Respostas de Bactérias a Estresses AmbientaisEstresses Ambientais
• Sob estresses (dessecamento do meio e restrição nutricional)
– Aumento da relação entre FAMEs cíclicos e precursores
• 19:0cy / 18:17c ou 17:0cy /16:17c – Kieft et al., 1994, AEM, 60:3292-3299, 1994
– Custo de manutenção para mitigar estresse: aumenta gasto de energia, menor eficiência de conversão de carbono em biomassa microbiana: impacto na conservação de MOS.
Experimento (Fernandes, 2007) • Incubação por 425 d, microcosmos, solo de Tabuleiros Costeiros, SE
(Argissolo amarelo)
• 3 resíduos x 2 N x 7 datas, 4 repetições– Resíduos: controle, palha de milho, casca de coco– Doses N: equivalente 15 e 150 kg N ha-1
– Datas: 12, 33, 54, 112, 212, 350 e 425 dias– 130 aos 280 d sob seca (-1,5 MPa)
• Variável resposta: 19:0cy/18:17c
• Estatística: Regressão múltipla – stepwise, forward– Modelo inicial: grande média– Modelo cheio: todas as interações entre todos os fatores– F para incluir termos no modelo < 4,0
Regressão Múltipla (stepwise forward)
• Call: lm(formula = ST ~ MILHO + TIME + UMIDO + TIME:MILHO, data = STRESS.19.INCUB, na.action = na.exclude)
• Residuals:• Min 1Q Median 3Q Max • -0.4682 -0.1053 -0.006328 0.111 0.6178
• Coefficients:• Value Std. Error t value Pr(>|t|) • (Intercept) 1.91311.9131 0.0448 42.7342 0.00000.0000• MILHO -0.6297-0.6297 0.0451 -13.9688 0.00000.0000• TIME 0.00230.0023 0.0001 20.2161 0.00000.0000• UMIDO -0.3261-0.3261 0.0404 -8.0648 0.00000.0000• TIME:MILHO -0.0011-0.0011 0.0002 -5.6939 0.00000.0000
• Residual standard error: 0.1823 on 163 degrees of freedom• Multiple R-Squared: 0.89080.8908 • F-statistic: 332.3 on 4 and 163 df, the p-value is 0
19:0cy/18:7c = f(resíduo, t, umidade, N)
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
0 100 200 300 400 500
Dias de Incubação
19:0
cy
/ 18:
1w7c
SECA
• FIM
