Transcript
Page 1: Catabolismul proteinelor

XVIII. CATABOLISMUL PROTEINELOR

XVIII.1. DIGESTIA PROTEINELOR

Majoritatea compuşilor cu azot, ingeraţi de om, sunt proteine. Atunci când discutăm digestia proteinelor discutăm şi digestia compuşilor cu azot. Moleculele proteice intacte nu pot fi absorbite ca atare prin tractul intestinal la animalele adulte, decât în cazuri excepţionale şi foarte rare. Pentru a putea fi absorbite, proteinele sunt hidrolizate la structuri moleculare mai mici de aminoacizi sau peptide. Cu toate că proteinele au structuri complexe, ele sunt formate dintr-un număr de aminoacizi diferiţi, legaţi între ei prin legătură peptidică (-HN-CO-). Legătura peptidică se rupe uşor conducând la un amestec de aminoacizi liberi. Teoretic o singură enzimă specifică poate asigura scindarea legăturilor polipeptidice deci digestia proteinelor. În realitate situaţia este ceva mai complicată deoarece enzimele digestive prezintă o mare specificitate pentru localizarea respectivelor polipeptide, localizarea punctului de hidroliză şi natura aminoacizilor care intervin în legătura peptidică respectivă.

Cu toate că în alimentaţie, există în mod obişnuit milioane de proteine, ele pot fi digerate de un număr redus de enzime proteolitice, ce pot fi clasificate în două grupe mari: exopeptidaze şi endopeptidaze.

Exopeptidazele au rolul de a îndepărta un aminoacid de la capătul lanţului prin hidroliza unei legături peptidice, cu obţinerea unui aminoacid şi a unei polipeptide cu o moleculă de aminoacid mai puţin în moleculă. De exemplu, ar fi carboxipeptidaza, aminopeptidaza, dipeptidaza, tripeptidaza etc.

Endopeptidazele au rolul, în general, de a hidroliza legăturile peptidice din interiorul lanţului, dând naştere la lanţuri polipeptidice mai mici. Exemple ar fi pepsina, tripsina, chimotripsina, elastina etc.

437

Page 2: Catabolismul proteinelor

Proteinele pătrunse în tractul digestiv suferă acţiunea diferitelor enzime degradându-se până la aminoacizi, care la rândul lor sunt catabolizaţi pe căi diferite.

O enzimă deosebit de importantă pentru laboratorul clinic, din categoria N-aminoacidpeptidazelor este LAP (leucilaminopeptidaza). Nivelul acestei enzime creşte mult şi specific în afecţiunea căilor biliare (icter mecanic), dar rămâne nemodificat în leziunile paremchinului hepatic. Are valoare în diagnosticul diferenţial al icterului mecanic faţă de cel hepatocelular şi cel hemolitic. În ultimele două forme de icter nivelul său rămâne cel normal.

Prezentăm, mai jos, schema de degradare a proteinelor.

XVIII.2. METABOLISMUL INTERMEDIAR AL AMINOACIZILOR

Aminoacizii sunt substanţele cele mai importante ale metabolismului azotului în organismele heterotrofe. De asemenea, ei pot servi ca surse de energie, în special, prin intermediul oxidării lanţului de atomi de carbon. Metabolismul aminoacizilor se găseşte într-o stare dinamică, la fel ca şi cel al hidraţilor de carbon şi al lipidelor.

În sistemele vii valorile pool-ului fiecărui aminoacid la organismele animale adulte, rămâne constantă în condiţiile fiziologice, el corespunde la

438

Page 3: Catabolismul proteinelor

diferenţa dintre stocul de aminoacizi proveniţi din exterior (exogeni) sau ocazional din surse endogene, şi transferul de aminoacizi servind ca substrat pentru procesele anabolice şi catabolice. Sistemele vii nu acumulează aminoacizi şi proteine ca şi compuşi de rezervă, ele trebuie să-şi extragă cantitatea de azot necesară (cel mai bine sub formă de aminoacizi) din hrană. În organismul adult cantitatea de azot primită şi excretată este aceeaşi. Aminoacizii din sursele exogene sunt absorbiţi în tractul digestiv şi transportaţi, prin sânge, la ficat şi alte ţesuturi şi organe tisulare care sunt în permanenţă metabolizate la aminoacizi. Se pare, însă, că aceşti aminoacizi sunt utilizaţi pentru sinteză de proteină în mai mică măsură. Sursa endogenă de de proteine este foarte importantă. Ea reprezintă 2/3 din aportul total de aminoacizi, în timp ce aportul aminoacizilor exogeni este de numai 1/3. Timpul biologic de înjumătăţire al proteinelor din ficat şi din plasmă este de 10 zile, pentru proteinele musculare de 180 de zile şi pentru proteinele din mucoasa intestinală de numai câteva zile, iar a hormonilor de natură proteică şi a enzimelor de numai câteva ore sau chiar minute (insulina umană 6-8 minute). Din aminoacizii eliberaţi o parte sunt reutilizaţi pentru o nouă sinteză de proteine, iar cei rămaşi fiind metabolizaţi la deşeurile azotate (amoniac şi uree), cetone şi dioxid de carbon.

439

Page 4: Catabolismul proteinelor

În următoarea schemă sunt arătate sursele globale de aminoacizi şi utilizarea lor.

O parte din aminoacizii organismului nostru se numesc esenţiali. Ei nu pot fi sintetizaţi de către organism, dar sunt absolut indispensabili bunei sale funcţionări. Aceştia sunt valina, leucina, izoleucina, metionina, treonina, fenilalanina, triptofanul şi în unele condiţii arginina şi histidina.

XVIII.2.1. Schimbul de aminoacizi dintre organe în faza alimentară şi cea postabsorbtivă

440

Page 5: Catabolismul proteinelor

După investigarea unei mese bogate în proteine, ţesuturile eliberează mari cantităţi de aminoacizi liberi, predominând cei ramificaţi: valina, izoleucina, leucina reprezintă 60% din aminoacizi ce intră în circulaţia sistemică (în opoziţie cu circulaţia portală), chiar dacă ei reprezintă numai 20% din totalul aminoacizilor în cazul unei mese sărace în proteine. Concomitent cu eliberarea acestor aminoacizi după o masă, muşchii periferici extrag aminoacizii, predominant cei ramificaţi. Încorporarea de aminoacizi în ţesutul muscular după o masă bogată în proteine este de cca 50% aminoacizi ramificaţi. La 2-3 ore după masă 90-100% din aminoacizii incorporaţi în ţesuturile periferice sunt aminoacizi ramificaţi. Aceşti aminoacizi sunt oxidaţi la nivelul muşchilor ca răspuns la alimentaţie, sevind, probabil, ca donori majori de grupări amino pentru transaminarea piruvatului la alanină.

Menţinerea concentraţiei stării staţionare a aminoacizilor din plasma circulantă între mese, depinde de balanţa netă dintre eliberarea aminoacizilor proteinele de stocare şi utilizarea de către diferite ţesuturi.

Muşchii generează mai mult de 50% din pool-ul total al aminoacizilor liberi, în timp ce ficatul este locul enzimelor necesare ciclului ureei (ureogenetic) pentru eliberarea azotului rezidual. Astfel muşchii şi ficatul joacă un rol major în determinarea nivelului şi turnower-ul aminoacizilor liberi circulanţi.

441

Page 6: Catabolismul proteinelor

Metabolismul aminoacizilor include câteva probleme de interes medical. Acestea ar fi sinteza şi degradarea proteinelor, conversia scheletului hidrocarbonat a aminoacizilor în intermediari amfibolici, sinteza ureei şi formarea unor compuşi fiziologic activi (adrenalina, noradrenalina, DAPA-amina, serotonina, acidul -aminobutiric, tiroxina, creatina, nucleul heminic, baze purinice etc.)

XVIII.2.2. Catabolismul azotului aminoacidic

Aminoacizii de tip din ţesuturile mamiferelor provin fie prin degradarea proteinelor tisulare, fie din dietă. Ultima etapă de transformare a grupării -aminice este ureea care este excretată prin urină. Ureea este produsul final de metabolizarea azotului aminoacidic numai la om şi alte organisme ureotelice.

La organismele uricotelice (reptile şi păsări) produsul final de metabolizare este acidul uric, iar organismele amonotelice (peşti) produc amoniac.

În schema următoare se arată transformarea azotului aminoacidic cu parcurgerea a celor patru procese fundamentale: transaminarea, dezaminarea oxidativă, formarea amoniacului şi ciclul ureogenetic.

442

Page 7: Catabolismul proteinelor

În cele ce urmează vom discuta pe rând cele patru procese implicate în sinteza ureei la nivelul organismului uman. Orice deficit al reacţiilor implicate prezintă un deosebit interes medical.

XVIII.2.2.1. TRANSAMINAREA

Transaminarea este un proces de transfer a unei grupe aminice de pe un aminoacid pe un cetoacid, cu formarea unui nou aminoacid şi respectiv a unui nou cetoacid. Reacţia este catalizată de aminotransferaze sau transaminaze, având ca şi coenzimă piridoxalfosfatul (vitamina B6

fosforilată). În toate reacţiile aminoacizilor piridoxalfosfat-dependente, în faza intermediară se formează o bază Schiff, conform reacţiei:

Baza Schiff se formează prin interacţiunea cu o regiune cationică a situsului activ. În felul acesta enzima participă în cursul transaminării la transportul grupării amino. Cele mai importante transaminaze din ţesutul mamiferelor sunt:

- GOT - glutamic oxalilacetic transaminază sau AST - aspartat aminotransferază şi - GPT - glutamic piruvic transaminază sau ALT - alanin aminotransferază.

443

Page 8: Catabolismul proteinelor

Aminotransferazele sunt enzime ubiquitare, adică sunt răspândite în toate ţesuturile. AST sau GOT se găseşte în ficat, inimă şi muşchii scheletici, fiind distribuită relativ uniform în toate ţesuturile. Raportul dintre nivelul hepatic şi extrahepatic al enzimei este de 1:1. Enzima există sub două forme, una solubilă şi una mitocondrială. Cele două forme sunt perfect distincte cinetic şi electroforetic. ALT sau GPT este mai reactiv în ceea ce priveşte distribuţia. Ea se găseşte aproape exclusiv în faza solubilă a citoplasmei şi în cantităţi mult mai mari în hepatocite. Raportul dintre nivelul hepatic şi extrahepatic al enzimei este de 10:1.

Reacţiile catalizate de aceste enzime sunt:

Reacţiile catalizate de transaminaze asigură o mare plasticitate a căilor metabolice pentru obţinerea aminoacizilor în concentraţia necesară proceselor metabolice-biosintetice. De asemenea, acidul -cetoglutaric, acidul oxalilacetic şi acidul piruvic servesc ca substrate ciclului tricarboxilic.

444

Page 9: Catabolismul proteinelor

Majoritatea aminoacizilor sunt substrate pentru reacţii de transaminare. Excepţie fac lizina, treonina, prolina şi hidroxiprolina. Reacţia de transaminare nu este restrânsă numai la -aminoacizi. Prin transaminarea ornitinei se obţine -semialdehida acidului glutamic conform reacţiei:

Importanţa medicală. Introducerea în laboratorul clinic a determinării AST (GOT) şi ALT (GPT) la sfârşitul anilor 50 au determinat o adevărată revoluţie în ceea ce priveşte diagnosticul clinic enzimologic. Determinarea nivelului seric a acestor două enzime prezintă o deosebită importanţă în diagnosticul fenomenelor de citoliză hepatică şi extrahepatică care însoţeşte anumite stări patologice. Doagnosticul leziunii de organ este posibil în acest fel, datorită distribuţiei inegale a celor două enzime în ţesuturi.

În citoliza extrahepatică, citoliza miocardică (în infarctul miocardic) sau citoliza musculară (distrofii musculare progresive) creşte nivelul ambelor enzime serice, dar mai mult a AST (GOT), de aceea raportul AST/ALT creşte faţă de normal. Raportul AST/ALT (GOT/GPT) se numeşte “coeficientul RITTIS” ŞI ÎN MOD NORMAL ARE VALOARE 1,33. Valorile normale sunt pentru AST (12 mU/ml), iar pentru ALT (9 mU/ml).

La 6 - 12 ore de la instalarea infarctului miocardic se detectează activitate crescută pentru AST. Ea creşte apoi rapid până la un maxim la 20 - 48 de ore după instalarea simptomelor. În cazurile lipsite de complicaţii activitatea scade în scurt timp, revenind la valorile normale după cinci zile sau mai puţin. În infarctul sever, în ser se detectează prezenţa AST mitocondrial şi acest lucru contribuie la prognoză.

445

Page 10: Catabolismul proteinelor

Citoliza hepatică. Valorile mari caracteristice ale amino transferazelor reprezintă o trăsătură obişnuită a hepatitei virale. De aceea raportul AST/ALT sau coeficientul lui Rittis rămâne normal sau aproape normal. Valorile maxime ale celor două enzime, pot atinge la debutul icterului valori de 10 - 30 de ori mai mari decât cele normale, ceea ce se întâlneşte rar la alte boli. Creşterea incepe cu faza prodomală cu 10 zile înainte ca icterul să fie evident. În perioada de însănătoşire asistăm la o scădere rapidă a nivelului seric al enzimelor. Dar dacă în această perioadă survine o recrudescenţă a bolii, tendinţa de scădere a aminotransferazelor este reversibilă şi survine o creştere transientă. Creşterea continuă a activităţii aminotransferazelor este un indiciu al prezenţei unei boli hepatice cronice active. Dacă valorile sunt moderate şi dacă raportul AST/ALT este mai mic decât unitatea este prezentă o hepatită cronică persistentă. Dacă valoruile sunt mai mari decât moderate şi raportul AST/ALT este mai mare decât 1 este prezentă o hepatită cronică agresivă, prognoza este puţin favorabilă şi este absolut necesar un tratament cu steroide şi imunosupresoare.

În mod obişnuit pacienţii cu obstrucţii hepato-biliare prezintă creşterea aminotransferazelor. De obicei, aceste creşteri sunt de 2 - 8 ori mai mari faţă de valoare normală, depinzând de gradul icterului. În cazul în care obstrucţia se datorează unei boli benigne este neobişnuit ca activitatea AST să fie mai mare decât a ALT. În cazul în care obstrucţia se datorează unei tumori maligne activitatea AST este mai mare decât ALT şi ea este aminotransferaza dominantă în aproape jumătate din cazurile care manifestă metastaze hepatice.

XVIII.2.2.2. DEZAMINAREA OXIDATIVĂ

La mamifere procesul de dezaminare oxidativă are loc la nivelul ţesutului hepatic şi a ţesutului renal. Enzimele implicate în dezaminarea oxidativă sunt aminoacid oxidazele de tip L şi D. Aminoacid oxidazele sunt flavoproteine autoxidabile. FMNH2 şi FADH2 sunt reoxidate direct de către oxigenul molecular cu formare de H2O2 fără participarea citocromilor sau a altor transportori de electroni. H2O2 fiind un produs toxic pentru organism, este imediat degradată sub acţiunea catalazelor la O2 şi H2O. Dacă catalaza este absentă, produsul de reacţie -cetoacidul este decarboxilat neenzimatic de către H2O2 formând un acid carboxilic cu un atom de carbon mai puţin.

Reacţia are loc în modul următor:

446

Page 11: Catabolismul proteinelor

Unii aminoacizi cum sunt serina, treonina, aminoacizii dicarboxilici şi cei bazici nu prezintă, în general, reacţia de dezaminare oxidativă. De exemplu, acidul glutamic este metabolizat, nu sub acţiunea aminoacid oxidazelor, ci sub acţiunea L-glutamatdehidrogenazei (GDH), enzimă NAD+ sau NADP+ dependentă, transformându-se în acid -cetoglutaric, prin intermediul acidului iminoglutaric, conform schemei:

Reacţia este reversibilă iar echilibrul este deplasat spre sânga.Mamiferele conţin un grup de -aminoacid oxidaze FMN-

dependente, fiind prezente numai în ficat şi în rinichi. Activitatea acestor enzime este în general scăzută şi sunt fără efect asupra glicinei, -amino--hidroxiaminoacizilor şi a izomerilor de tip L ai aminoacizilor dicarboxilici. În ficatul şi rinichii majorităţii memiferelor se găseşte o D-aminoacidoxidază FAD-dependentă cu o specificitate largă. Totuşi, D-

447

Page 12: Catabolismul proteinelor

asparagina şi D-glutamina nu sunt oxidate, dar glicina şi izomerii de tip D a aminoacizilor cu caracter bazic sau acid sunt puţin oxidaţi.

O serie de amine de mare importanţă biologică, ca de exemplu, norepinefrina (noradrenalina), epinefrina (adrenalina) şi dopamina, pot fi şi ele dezaminate oxidativ cu formarea amoniacului şi a aldehidelor corespunzătoare sub acţiunea unor flavoproteine monoamin şi diamin oxidaze.

În concluzie rezultatul dezaminării oxidative a aminoacizilor este un cetoacid şi amoniac. Amoniacul fiind un produs toxic este îndepărtat. La mamifere prin ciclul ureogenetic a lui Krebs-Henseleit sau prin formare de glutamină sub acţiunea glutaminsintetazei.

Cetoacidul format este catabolizat direct sau indirect în compuşi care intră în ciclul citric.

De aceea se poate considera că aminoacizii constituie rezerve energetice prin oxidarea lor în ciclul citric în special în diabet. De asemenea, participă în procesele de biosinteză. În cazul diabeticilor se consumă cu precădere leucină şi izoleucină, creindu-se, astfel, un deficit al acestor aminoacizi.

Un grup de aminoacizi din care amintim serina, homoserina, treonina, cisteina şi posibil homocisteina, prezintă o dezaminare neoxidativă sub acţiunea unor dehidraze, având ca şi coenzimă piridoxal fosfatul. În acest caz se formează, de asemenea, amoniac şi un cetoacid.

448

Page 13: Catabolismul proteinelor

XVIII.2.2.3. FORMAREA AMONIACULUI

În afara amoniacului care apare în ţesuturi ca rezultat al metabolizării aminoacizilor (dezaminare oxidativă), o cantitate considerabilă se mai formează din proteinele alimentare sub acţiunea bacteriilor intestinale şi din ureea prezentă în lichidele secretate din tractul gastrointestinal. Acest amoniac este absorbit din intestin în sângele portal venos, care conţine cantităţi mai mari de amoniac decât sângele sistemic. În condiţii normale, ficatul îndepărtează promt amoniacul din sângele portal, astfel încât sângele ce părăseşte ficatul, este în mod virtual liber de amoniac. Acest lucru este esenţial deoarece cantităţi mici de amoniac sunt toxice pentru sistemul nervos (normal în sânge se găsesc 10-20 gNH3/100 ml.)

Simptomele intoxicaţiei cu amoniac sunt rezultatul unei slăbiri ale funcţiilor creierului şi se manifestă prin greaţă şi vărsături, letargie, ataxie, convulsii, iar în cazuri mai grave comă prin hiperamonemie (cca 100 gNH3/100 ml.) şi chiar moartea. Aceste simptome sunt asemănătoare comei hepatice, când nivelul amoniacului din ficat şi probabil din creier este foarte crescut. Întoxicaţia cu amoniac pare să fie un factor etiologic în coma hepatică. Simptome asemănătoare apar şi în hepatomegalie şi în general, când funcţiile hepatice sunt puternic alterate, deoarece ficatul este sediul transformării amoniacului în uree.

Mecanismul prin care amoniacul îşi exercită efectul asupra creierului nu se cunoaşte. Poate că se datorează descreşterea formării de ATP pe calea ciclului citric din cauta transformării unei cantităţi excesive de -cetoglutarat în glutamat şi glutamină. Nivelul acestor metaboliţi, la fel ca şi a amoniacului, este crescut în creier în decursul întoxicaţiei cu amoniac. Alterări ale proceselor de transmisie neurală datorită unor formări excesive de acid -aminobutiric (GABA) din glutamat poate fi, de asemenea, implicate.

Conţinutul de amoniac din sângele din venele renale, mai mare decât în arterele renale, indică faptul că amoniacul este produs în rinichi şi apoi trece în sânge. Excreţia în urină a amoniacului produs în celulele tubilor renali, constituie cel mai semnificativ aspect al metabolismului amoniacului renal. Producerea de amoniac este un mecanism important al tubilor renali, de reglare a balanţei acido-bazice şi conservare de cationi, fiind foarte crescut în acidoza metabolică şi scăzut în alcaloză.

Amoniacul produs la nivelul rinichilor derivă din aminoacizi intracelulari şi în special din glutamină. Eliberarea de amoniac este catalizată de glutaminaza renală, conform reacţiei:

449

Page 14: Catabolismul proteinelor

Amoniacul poate fi excretat sub formă de săruri de amoniu, marea majoritate este excretată sub formă de uree, care se formează în ciclul ureogenetic al lui Krebs-Henseleit. Practic amoniacul format în ţesuturi, dar prezent în sângele periferic în urme, este îndepărtat rapid din circulaţie sub formă de glutamină şi uree.

Formarea de glutamină este catalizată de glutaminsintetază, enzimă prezentă în cantităţi mari în ţesutul renal.

La animale, plante şi microbi există o reacţie catalizată de L-asparaginază analoagă celei catalizate de glutaminază la om. Asparaginaza şi glutaminaza sunt utilizaţi ca agenţi antitumorali, deoarece tumorile necesită cantităţi mari de acid aspartic şi acid glutamic.

În timp ce la nivelul creierului calea majoră de îndepărtare a amoniacului este formarea glutaminei, în ficat calea majoră o constituie transformarea în uree. La un om cu o activitate moderată, consumând cca. 300 g hidraţi de carbon, 100 g lipide şi 100 g proteine, excretă zilnic 16,5 g azot. Din acesta 95% se elimină prin rinichi, iar 5% este stocat şi apoi eliminat prin fecale. Ureea constituie 80-90% din azotul excretat.

Interconversia amoniacului şi a glutaminei, catalizată de glutamin sintetază şi glutaminază, poate fi prezentată schematic:

450

Page 15: Catabolismul proteinelor

XVIII.2.2.4. CICLUL UREOGENETIC

În cursul reacţiilor ce alcătuiesc un ciclu complet dintr-un mol de amoniac rezultă 1 mol de uree şi se consumă 3 moli de ATP (doi trec în ADP şi fosfat şi uul în AMP şi pirofosfat). Reacţiile succesive sunt catalizate de cinci enzime.

Carbamoil sintetaza prezentă în mitocondriile hepatice ale organismelor ureotelice, inclusiv organismul uman, catalizează sinteza carbamoilfosfatului cu consum a două molecule de ATP.

451

Page 16: Catabolismul proteinelor

Ornitincarbamoillaza se găseşte în mitocondriile hepatice, catalizează reacţia de sinteză a citrulinei, pentru care are o mare specificitate.

Argininosuccinatsintetază catalizează reacţia de sinteză a argininosuccinatului, cu consumul unei molecule de ATP.

Argininosuccinaza, prezentă în ţesutul hepatic şi renal al mamiferelor, este o enzimă labilă la rece. Catalizează reacţia de scindare a argininosuccinatului în arginină şi acid fumaric, care intră în ciclul citric.

În continuare acidul fumaric, în ciclul acidului tricarboxilic, va suferi o transformare obişnuită, adică în prezenţă de fumarază trece în acid malic, care la rândul său, sub acţiunea malat dehidrogenazei trece în

452

Page 17: Catabolismul proteinelor

oxalilacetat. Oxalilacetatul schimbă gruparea funcţopnală cu acidul glutamic în prezenţă de AST (GOT) cu regenerarea acidului aspartic.

Arginaza, prezentă în ficatul tuturor animalelor ureotelice, este activată de prezenţa ionilor de Co+2 şi Mn+2. Are, rol de a oliva arginina în ornitină şi uree. În cantităţi mici se găseşte şi în rinichi, creier, glandă mamară, ţesut testicular şi piele. Ornitina şi lizina sunt inhibitori competitivi foarte puternici ai enzimei.

Ciclul ureogenetic este o cale metabolică foarte costisitoare pentru organism, deoarece pentru fiecare moleculă de uree ce se formează, se consumă trei legături macroergice.

453

Page 18: Catabolismul proteinelor

Cantitatea de uree excretată de un om adult normal prin urină este de 25-30 g în 24 de ore. Această cantitate reprezintă 90% din substanţele azotate excretate şi variază proporţional cu cantitatea de proteină ingerată.

În condiţii normale excreţia de amoniac reprezintă numai 2,5-4,5% din totalul azotului urinar. Excreţia amoniacului reprezintă o funcţie importantă în menţinerea balanţei acido-bazice. Amoniacul se formează la nivelul rinichilor unde se combină cu ionii de hidrogen formând ioni de amoniu. Conţinutul său creşte în acidoză şi scade în alcaloză.

Boli metabolice legate de dereglări apărute în ciclul ureogenetic. Lipsa uneia dintre enzimele care intervin în ciclul ureogenetic, determină apariţia unor afecţiuni, care toate sunt cauzate de intoxicaţie cu amoniac, acesta nu se mai poate transforma în uree, produs netoxic care se elimină.

Deficitul de carbamoilfosfat sintetază este probabil ereditar şi cauzează hiperamonemia de tip I.

Deficitul de transcarbamoilază a fost întâlnit la numeroşi subiecţi. Aceasta afecţiune este legată de cromozomul X. Mamele acestor pacienţi prezintă şi ele hiperamonemie şi intoleranţa la alimente bogate în proteine. În sânge, lichid cerebrospinal şi urină s-au găsit, în asemenea cazuri, cantităţi mari de glutamină, iar în ţesuturi cantităţi mari de amoniac. Boala este cunoscută sub numele de hiperamonemie de tip II.

Lipsa activităţii argininosuccinat sintetazei, conduce la citrulinemie, o boală foarte rară. În sângele şi în lichidul cerebrospinal al pacienţilor se găsesc cantităţi mari de citrulină, iar în urină eliminarea este masivă (1-2 g citrulină în 24 de ore).

Absenţa argininsuccinazei conduce la argininosuccinurie. Enzima este absentă în creier, ficat, rinichi, eritrocite şi fibroblastele din piele.

Absenţa arginazei conduce la hiperarginemie. Se caracterizează prin creşterea nivelului de arginină în sânge şi lichid cefalospinal. Arginaza cerebrospinală nu este întodeauna absentă. Uneori poate fi mai scăzută.

XVIII.2.3. Catabolismul scheletului de atomi de carbon ai aminoacizilor

În acest capitol ne vom ocupa de procesul de transformare a catenei hidrocarbonate în catabolismul aminoacidic. Acest capitol ne permite să urmărim strânsa legătură dintre aminoacizi, hidraţi de carbon şi lipide, legătură ce se realizează la nivelul ciclului citric şi este reprezentată mai sus. Intermediarii metabolici ce iau naştere prin transformarea scheletului de

454

Page 19: Catabolismul proteinelor

carbon ai aminoacizilor se numesc: glicogeni, cetogeni sau glucogenici şi cetogenici, după cum formează glicogen, grăsimi sau ambele.

AMINOACIZI ŞI INTERMEDIARII LOR AMFIBOLICI

glicogenici cetogenici glicogenici şi cetogeniciAla Hip Leu IleArg Met LysAsp Pro PheCys Ser TrpGly Val Tyr

His

455

Page 20: Catabolismul proteinelor

XVIII.2.3.1. AMINOACIZI CE FORMEAZĂ PIRUVAT

Transformarea scheletului de carbon ai aminoacizilor poate fi urmărită cel mai bine prin schema:

Glicina. Intermediarii amfibolici ce se formează din glicină includ piruvatul, dioxidul de carbon şi 5,10-metilentetrahidrofolatul. Formarea piruvatului din glicicnă poate avea loc în momentul conversiei glicocolului în serină, reacţie catalizată de serinhidroximetil transferază în prezenţa tetrahidrofolatului. Apoi serina se deshidratează.

Serina. Conversia serinei la piruvat are loc sub acţiunea serin dehidrazei, enzimă piridoxalfosfat dependentă. Printr-o reacţie de transaminare acidul piruvic se poate transforma în alanină. Reacţia este reversibilă.

Alanina. Din reacţia de mai sus se observă că alanina sub acţiunea alaninaminotransferazei (ALT), printr-un proces de transaminare, trece în piruvat. Acesta la rândul său suferă un proces de decarboxilare oxidativă sub acţiunea complexului multienzimatic al piruvatdehidrogenazei (PDH) trecând în acetil-CoA.

456

Page 21: Catabolismul proteinelor

Treonina. Sub acţiunea treonin aldolazei, treonina se scindează în aldehidă şi glicocol. La rândul ei aldehida acetică se transformă în acetil-CoA care intră în ciclul citric. Glicina trece în serină sub acţiunea serinhidroximetil transferazei, iar apoi în acid piruvic, care prin decarboxilare oxidativă se transformă în acid piruvic.

Cistina şi cisteina. Cistina este convertită în cisteină sub acţiunea unei oxidoreductaze NADH-dependente, conform reacţiei:

457

Page 22: Catabolismul proteinelor

Cisteina se metabolizează mai departe la piruvat şi respectiv la Ac-CoA pe trei căi. Astfel:

ao o cale, via cisteindesulfhidrază, printr-o reacţie piridoxal fosfat dependentă;

bo printr-o reacţie de transaminare şi apoi pierderea de hidrogen sulfurat sub acţiunea unei transsulfuraze;

co prin oxidarea grupării SH cu formare de acid cisteinsulfinic, urmată de o transaminare şi apoi pierderea unei molecule de dioxid de sulf sub acţiunea unei desulfinaze.

Acidul cisteinsulfinic obţinut în cursul acestei reacţii se poate transforma ulterior în taurină pe următoarele două căi:

1o fie printr-o decarboxilare, urmată de oxidarea grupării sulfinice la grupare sulfonică;

2o fie oxidarea grupării cu sulf, urmată de decarboxilare.Acidul cistein sulfuric şi acidul cisteic reprezintă o sursă de taurină

pentru ficat. Taurina serveşte pentru conjugarea acizilor biliari.

458

Page 23: Catabolismul proteinelor

Taurina se formează după următoarele scheme de reacţie:

Cistinuria. Este o boală metabolică în care secreţia urinară de cistină creşte de 20-30 de ori faţă de normal. Excreţia de lizină, arginină şi ornitină este de asemenea mărită. Cistinuria este o boală care se datorează transportului renal deficitar şi anume este deficitar mecanismul renal de reabsorbţie. Complicaţia majoră a acestei boli este formarea de calculi de cistină la nivelul tubilor renali, deoarece cistina este relativ puţin solubilă, va precipita la acest nivel.

Cistinoza. Spre deosebire de cistinurie este o boală ereditară de se caracterizează prin depuneri de calculi în toate organele şi în special la nivelul sistemului reticuloendotelial. Este, în general, însoţită de o aminoacidurie generalizată. Majoritatea pacienţilor mor, manifestând o boală renală acută.

Hidroxiprolina. Trei din cei cinci atomi de carbon ai hidroxiprolinei sunt transferaţi la piruvat, ceilalţi formează acid glioxilic.

459

Page 24: Catabolismul proteinelor

Prima etapă din catabolismul hidroxiprolinei este catalizată de o dehidrogenază mitocondrială. Secvenţa reacţiilor este prezentată mai jos.

Deficitul de catabolizare a hidroxiprolinei, la fel ca şi în cazul prolinei este însoţit de o severă retardare mintală.

Hidroxiprolinemia se datorează absenţei enzimei care catalizează conversia 4-hidroxiprolinei la acid L-1-prolin-3-hidroxi-5-carboxilic. Semnele clinice includ retardare mintală, un nivel crescut al hidroxiprolinei plasmatice şi o creştere anormal de ridicată a excreţiei urinare de hidroxiprolină şi hidroxiprolin peptidă.

XVIII.2.3.2. AMINOACIZII CE SUNT CONVERTIŢI DIRECT ÎN ACETIL CoA

Majoritatea aminoacizilor care au ca şi produs final de metabolizare acetil-CoA, formează mai întâi acid piruvic, care printr-un proces de decarboxilare oxidativă sub acţiunea complexului multienzimatic al piruvat dehidrogenazei, trece în cele din urmă în acetil-CoA. Astfel sunt alanina, serina, glicina, treonina, cisteina, cistina şi hidroxiprolina. Există, însă, un număr de cinci aminoacizi care se metabolizează direct în acetil-CoA, fără a

460

Page 25: Catabolismul proteinelor

mai trece prin stadiul de acid piruvic. Aceştia sunt fenilalanina, tirozina, triptofanul, lizina şi leucina.

Fenilalanina şi tirozina. Fenilalanina este convertită mai întâi la tirozină sub acţiunea fenilalaninhidroxilazei după care urmează calea comună de metabolizare conform reacţiilor:

Cele cinci secvenţe de reacţii sunt în acest caz transaminarea sub acţiunea tirozin--cetoglutarat transaminazei, enzimă inductibilă în ficat. A doua reacţie constă într-o hidroxilare în poziţia orto a acidului p-hidoxifenilpiruvic, însoţită de o decarboxilare oxidativă şi de o migrare a lanţului cu trei atomi de carbon. P-hidroxifenilpiruvat hidroxilaza care catalizează această reacţie, este o metaloenzimă cu cupru, similară tiroxinazei. Ca şi factor şi ca agent reducător intervine acidul ascorbic. Produsul de reacţie este acidul homogentizinic sau alcaptona.

461

Page 26: Catabolismul proteinelor

A treia reacţie este o reacţie de oxidare. Sub acţiunea homogentizat oxidazei, o metaloenzimă cu fier prezentă în ficatul mamiferelor, nucleul benzenic se rupe formând acid maleilacetoacetic.

În a patra etapă, acidul maleilacetoacetic este izomerizat sub acţiunea maleilacetoacetat cis-trans izomerazei, o -SH enzimă din ficatul mamiferelor, trecând în acid fumarilacetoacetic.

Ultima reacţie constă în scindarea acidului fumarilacetoacetic sub acţiunea fumarilacetoacetat hidrolazei în acid fumaric şi acid acetilacetic. Aceasta din urmă sub acţiunea -cetotiolazei poate fi convertit în acetil-CoA şi acid acetic.

Afecţiunile care apar în cazul dereglării metabolismului tirozinei se caracterizează, în general, prin excreţia crescută a tirozinei şi a cataboliţilor săi din urină.

Tiroxinoza se datorează probabil absenţei fie a p-hidroxifenil-piruvat-hidroxilazei, fie a tirozin transaminazei. Pacienţii excretă în urină cantităţi mari de tirozină, până la 1,5-3 g în 24 h. Dacă dieta este bogată în tirozină, se excretă, de asemenea, cantităţi mari de DOPA (dihidroxi-fenilalanină) şi acid p-hidroxifenilacetic.

Alcaptonuria se manifestă prin închiderea la culoare a urinii în prezenţa aerului până la brun negru. Mai târziu apare şi pigmentare a ţesutului conjunctiv şi o formă de artrită. Deficitul metabolic este atribuit homogentizoxidazei, enzimă de deciclizare a alcaptonei. Incidenţa afecţiunii este de aproximativ 1:5000000. Boala nu prezintă manifestări clinice grave.

Triptofanul este un aminoacid esenţial, deci nu poate fi sintetizat, de aceea aportul său extern este absolul necesar pentru buna funcţionare a organismului. Calea de metabolizare a triptofanului a putut fi studiată cu ajutorul mutanţilor de neurospora, o bacterie Pseudomonas precum şi izolarea din urină a metaboliţilor triptofanului. S-a observat următoarea secvenţă de reacţii:

462

Page 27: Catabolismul proteinelor

Triptofanpirolaza sau oxigenaza este o metalenzimă cu fier porfirinic (heminic) prezentă în ficatul mamiferelor, amfibiilor, păsărilor şi insectelor. Este o enzimă inductibilă de către triptofan. De asemenea este inhibată printr-un mecanism de tip feed back de către derivaţii acidului nicotinic, incluzând şi NADPH. Enzima poate cataliza reacţii similare cele de formare de N-formilkinurenină cu arilformil amine.

Hidroxilarea kinureninei la 3-hidroxikinurenină este catalizată de kinurenin hidroxilază, enzimă NADPH dependentă, asemănătoare reacţiei de hidroxilare a fenilalaninei la tirozină.

463

Page 28: Catabolismul proteinelor

Kinureninaza care catabolizează reacţia de formare a acidului 3-hidroxiantranilic, are ca şi coenzimă piridoxalfosfatul. Deficitul de vitamină B6 are ca şi consecinţă principală, imposibilitatea metabolizării derivaţilor kinureninici, care sunt transformaţi la nivelul ţesuturilor extrahepatice în acid xanturenic. Acest metabolit anormal apare în urina oamenilor, maimuţelor şi şobolanilor în caz de deficit de vitamina B6.

La multe animale posibilitatea conversiei triptofanului în acid nicotinic, suplineşte deficitul de acid nicotinic din dietă (şobolan, iepure, câine, porc etc). La şi alte animale triptofanul determină o creştere a secreţiei derivaţilor acidului nicotinic. În cazul deficitului de vitamină B6, sinteza de NAD+ şi NADP+ poate fi împiedicată, ca rezultat a unei conversii neadecvate a triptofanului în acid nicotinic într-o cantitate suficientă, sinteza de nucleotide are loc şi în absenţă de B6.

O anomalie ereditară a metabolismului triptofanului este cunoscută sub numele de boala lui Hartnup. Se caracterizează printr-o urticarie a pielii asemănătoare pelagrei, ataxie cerebrală şi deteriorare mintală. Urina acestor pacienţi conţine cantităţi mari de acid indolacetic şi triptofan.

În urina pacienţilor cu această boală s-au izolat, până în prezent, 38 de acizi indolici diferiţi. S-a observat că în cazul unor pacienţi cu boli psihice, excreţia urinară tinde să revină la normal prin administrarea de antibiotice cu spectru larg.

Lizina. Mamiferele transformă scheletul de carbon al lizinei în acid -aminoadipic care trece apoi în acid -cetoadipic.

Etapa de formare a glutaril-CoA este etapă de decarboxilare oxidativă. Glutaril-CoA printr-o serie de reacţii ajunge la dioxid de carbon şi apă. Catabolismul lizinei prezintă două anomalii metabolice rare.

Hiperlizinemie asociată cu hiperamonemie este caracterizată prin creşterea nivelului plasmatic de lizină. Nu este asociată cu retardare mintală. Nu se cunoaşte exact deficitul metabolic. Hiperamonemia nu reflectă un deficit pentru nici una din enzimele ciclului ureogenetic.

464

Page 29: Catabolismul proteinelor

465

Page 30: Catabolismul proteinelor

Hiperlizinemia persistentă în care lizina plasmatică este crescută dar nu foarte mult. Nu este însoţită de retardare mintală evidentă. Uneori creşte mult nivelul plasmatic al unui catabolit al lizinei saccharopina.

XVIII.2.3..3. AMINOACIZI CE FORMEAZĂ PRIN METABOLIZARE SUCCINIL-CoA

Succinil-CoA este produsul amfibolic final de catabolizare a metionibei, leucinei, izoleucinei şi valinei. Patru cincimi din carbonii valinei, trei cincimi din carbonii metioninei şi jumătate din cei ai izoleucinei formează succinil-CoA.

Leucina, izoleucina şi valina. Datorită asemănării structurale ne-am aştepta ca reacţiile biochimice să fie similare. Aceste reacţii, însă, diferă în parte, iar produşii finali de catabolizare sunt şi ei diferiţi. Valina este un aminoacid glicogenic, în timp ce leucina este cetogenic, iar izoleucina atât cetogenic cât şi glicogenic.

Primele trei etape de carboxilare sunt asemănătoare. Prima este o transaminare, a doua o decarboxilare oxidativă cu formare de tioester acil-CoA, iar a treia este o dehidrogenare cu formare de tioestei ai acil-CoA, - nesatruraţi. Începând cu a patra reacţie apar diferenţele în ceea ce priveşte metabolizarea în continuare.

Blocajul enzimelor din poziţiile (2) şi (3) conduce la boli metabolice ereditare. Dacă este blocată enzima din poziţia (2) este afectat metabolismul celor trei aminoacizi Leu, Val şi Ile. Dacă este afectată enzima din poziţia (3) este dereglat numai metabolismul leucinei.

Schematic catabolismul acestor aminoacizi se poate reprezenta astfel:

466

Page 31: Catabolismul proteinelor

LEUCINA

467

Page 32: Catabolismul proteinelor

VALINĂ

468

Page 33: Catabolismul proteinelor

IZOLEUCINA

Până în prezent se cunosc patru deficite metabolice ale aminoacizilor ramificaţi. Dintre toate, cel mai mult studiată este boala siropului de arţar sau boala urinii cu miros de sirop de arţar. Este o boală ereditară, caracterizată prin lipsa sau reducerea foarte mult a activităţii -cetoaciddecarboxilazei, enzimă care transformă pe toţi cei trei aminoacizi ramificaţi în aciltioesteri (acil-CoA) cu eliminare de dioxid de carbon. Urina bolnavilor prezintă un miros specific asemănător siropului de arţar sau de zahăr ars. Plasma şi urina conţin cantităţi mari din aceşti trei aminoacizi, precum şi cetoacizii lor corespunzători. La naştere copilul pare normal, boala manifestându-se numai după prima săptămână de viaţă extrauterină. Copilul prezintă dificultăţi la alimentare, vomită şi uneori apar stări

469

Page 34: Catabolismul proteinelor

letargice. Copii care supravieţuiesc prezintă leziuni intinse ale creierului. Fără tratament mor la sfârşitul primei săptămâni de viaţă.

Hipervalinemia este o altă boală metabolică ereditară, se datorează imposibilităţii transformării valinei în acid cetoizovalerianic. Este caracterizat prin creşterea nivelului plasmatic al valinei (nu şi al leucinei sau a izoleucinei).

Acidemia izovalerianică se datorează activităţii scăzute a izovaleril-CoA-dehidrogenazei. Se caracterizează printr-un miros intens de brânză a respiraţiei şi a fluidelor corporale, vomă, acidoză şi comă, printr-o precipitarea excesivă a proteinelor ingerate sau apariţia de boli infecţioase. De asemenea, apare retardarea mintală şi excreţia de acid izovalerianic prin urină şi transpiraţie.

Cetonuria intermitentă este o boală metabolică ereditară cauzată tot de un deficit metabolic al aminoacizilor ramificaţi, este o variantă a bolii urinii cu miros de arţar.

Metionina. Produsul final de metabolizare a metioninei este propionil-CoA. Catabolismul se realizează în mai multe etape. În prima etapă, metionina se condensează cu ATP formând S-adenozilmetionina, forma activă a metioninei. Este un compus foarte important pentru metabolism, deoarece gruparea S-metil activă este utilizată în reacţiile de metilare cu formare de compuşi metilaţi importanţi. Astfel, betainele, colina, creatina, adrenalina, melatonina, sarcozina, nucleotide metilate şi alcaloizii din plante..

Secvenţa reacţiilor în cazul catabolizării metioninei este:

Prin pierderea grupării metil, S-adenozilmetionina se transformă în S-adenozilhomocisteină. Aceasta prin condensare cu serina formează cistationină, care la rândul ei este scindată în homoserină şi cisteină. Printr-o reacţie de dezaminare, homoserina se transformă în acid -cetobutiric,

470

Page 35: Catabolismul proteinelor

care prin decarboxilare oxidativă este transformat în propionil-CoA. Dacă transformarea homoserinei în acid -cetobutiric este blocată, apare o boală metabolică ereditară cistatinuria

471

Page 36: Catabolismul proteinelor

Homocistinuria este o afecţiune metabolică. La nivel plasmatic metionina este crescută. În urină homocisteina este excretată masiv (peste 300 mg în 24 h) asociată uneori cu S-adenozilmetionină. Homocistinuria se datorează activităţii anormale a cistatiosintetazei. Clinic boala este asociată cu tromboză, osteoporoză, frecventă retardare mintală şi dizlocarea cristalinului la ochi.

XVIII.2.4. Conversia aminoacizilor la produşi specializaţi

Acest subcapitol cuprinde transformarea aminoacizilor în compuşi deosebiţi având un mare interes biologic. Astfel, aminele biogene de mare importanţă (histamina, dopamina, adrenalina, noradrenalina, serotonina, acidul -aminobutiric, sinteza creatinei şi a creatinfosfatului, formarea acidului -aminolevulinic precursor al porfirinelor etc.

XVIII.2.4.1. DECARBOXILAREA AMINOACIZILOR

Reacţiile de decarboxilare a aminoacizilor fac parte din reacţiile ce conduc la formarea unor compuşi speciali. Decarboxilarea are loc sub acţiunea unor decarboxilaze specifice răspândite în toate ţesuturile. Anumite decarboxilaze se găsesc numai în anumite ţesuturi. Coenzima decarboxilării este piridoxalfosfatul.

Histidina se decarboxilează în prezenţa unei L-aminoacid decarboxilază aromatică şi se transformă în histamină. Această enzimă acţionează şi asupra 5-hidroxitriptofanului, DOPA, fenilalaninei, tirozinei şi chiar asupra triptofanului ca atare. Decarboxilarea histidinei mai poate avea loc sub acţiunea histidin decarboxilazei, o enzimă complet diferită, care este prezentă în majoritatea ţesuturilor.

Histamina se formează la nivelul mastocitelor. Este o substanţă cu acţiune puternic vasodilatatoare acţionând la nivelul capilarelor. Ea este implicată în unele procese patologice ca stări alergice, şoc etc. În şocul histamic, histamina din ţesuturi este eliberată în circulaţie. Datorită efectului

472

Page 37: Catabolismul proteinelor

vasodilatator al histaminei, sângele se acumulează în capilare, având loc aşa numitul fenomen de prăbuşire a capilarelor. Tensiunea scade brusc şi apare hemoragia intravasculară. Compuşii din organism care conţin histidină sunt ergotioneina (în hematii şi ficat), carnosina (o dipeptidă cu -alanină şi histidină) şi anserina (1-metil-carnisina). Ultimii doi se găsesc în muşchi.

În urina normală se găseşte 3-metil-histidina într-o proporţie de 50 mg/ 100 ml. Această valoare scade foarte mult la pacienţii cu boala lui Wilson.

Histidina poate fi metabolizată la acid glutamic, proces ce include patru reacţii. Prima reacţie este dezaminarea desaturantă care are loc sub acţiunea histidinazei, în urma căreia rezultă acidul urocanic. Aceasta sub acţiunea urocanazei, printr-un proces de reducere internă şi adiţia unei molecule de apă, se transformă în acid N-forminoglutaric (FIGLU). În prezenţa glutamatformilaminotransferazei şi a acidului tetrahidrofolic, gruparea formil este transferată pe acidul folic şi se obţine acidul gluatmic liber. Printr-un proces de transaminarea, acesta, poate fi transformat în acid cetoglutaric. Acesta intră în ciclul lui Krebs sau în metabolismul lipidic.

La pacienţii care prezintă deficit de acid folic, trecerea de la acid N-formiminoglutaric la acid glutamic este parţial blocată şi acidul foriminoglutaric este excretat prin urină. Această observaţie stă astăzi la baza unui test pentru stabilirea deficitului de acid folic. În acest caz după o administrare masivă de histidină, în urină este detectat acidul N-form-inomoglutamic. Testul este utilizat în diagnosticul anemiei megaloblastice (anemie pernicioasă) prin deficit de acid folic.

473

Page 38: Catabolismul proteinelor

Histidinemia este o boală metabolică ce se caracterizează printr-o creştere a nivelului histidinei în sânge şi în urină. Creşte, de asemenea, şi excreţia acidului imidazolpiruvic. Blocajul metabolic se datorează unei activităţi scăzute a histidinazei hepatice care nu mai transformă histidina în acid urocanic. În felul acesta histidina va fi transformată în acid imidazolpiruvic, formă sub care se şi excretă prin urină.

Sarcina normală este adesea însoţită de histidinurie, probabil datorită schimbării caracteristice ale funcţiilor renale în cursul sarcinii.

Imidazolaminoaciduria a fost descoperită la pacienţi cu degenerare cerebromaculară. Pacienţii au excretat în urină cantităţi relativ mari de histidină, 1-metil histidină, carnozină şi anserină. Boala se transmite genetic.

Triptofanul. O cale secundară de matabolizare a triptofanului include oxidarea sa la un derivat 5-hidroxilat, reacţie analoagă conversiei fenilalaninei în tirozină sub acţiunea triptofanhidroxilazei hepatice, care catalizează şi hidroxilarea triptofanului. Decarboxilarea 5-hidroxitriptofanului conduce la formare de hidroxitriptamină sau serotonină, un puternic vasodilatator arterial şi stimulator al contracţiei musculaturii netede.

5-Hidroxitriptofan decarboxilaza este prezentă în rinichi, ficat şi stomac. Formarea 5-hidroxitriptaminei sau a serotoninei are loc în special la nivelul celulelor nervoase şi în trombocite.

Enzima limitantă de formare de serotonină este hidroxilaza. În unele cazuri patologice se formează cantităţi mari de serotonină în celulele tumorale a ţesutului argenafin din cavitatea abdominală (carcinomul intestinului subţire). Carcinomul este considerat ca o consecinţă a metabolizării anormale. 1% din triptofan se metabolizează, în mod normal, la serotonină, restul pe calea hidroxiindolului. În cazul pacienţilor cu carcinom la intestinul subţire, 60% din triptofan se metabolizează sub formă

474

Page 39: Catabolismul proteinelor

de serotonină. Paralel se reduce foarte mult formarea de acid nicotinic pe seama triptofanului şi apar simptome de pelagră.

Serotonina este un mediator chimic al influxului nervos, mecanismele serotonigene sunt implicate în afecţiunile psihice. Serotonina eliberată la nivelul trombocitelor participă în fenomenele de hemostază datorită acţiunii sale vasoconstrictor arteriolar.

Majoritatea serotoninei se metabolizează prin dezaminare oxidativvă sub acţiunea monoaminozidazei (MAO) la acid 5-hidroxi-indolacetic.

Acidul glutamic. La sistemul nervos, în creier, are loc decarboxilarea acidului glutamic cu formare de acid -aminobutiric sau GABA, mediator chimic al influxului nervos.

475

Page 40: Catabolismul proteinelor

Acidul -aminobutiric este metabolizat prin dezaminare oxidativă la acid succinic, fie redusă la acid -hidroxibutiric.

Lizina şi ornitina. Sub acţiunea bacteriilor de putrefacţie lizina şi ornitina suferă reacţii de decarboxilare formând diamine deosebit de toxice din grupul toxinelor cadaverice. Astfel lizina formează putresceină iar ornitina formează putresceină.

476

Page 41: Catabolismul proteinelor

XVIII.2.4.2. OBŢINEREA PRODUŞILOR SPECIALIZAŢI PE CĂI DIFERITE

Fenilalanina şi tirozina. La nivelul celulelor neurale şi adrenale, fenilalanina şi tirozina se transformă în norepinefrină (noradrenalină) şi epinefrină (adrenalină). În faza intermediară se formează şi DOPA-amină. La nivelul melanocitelor se formează melanină. Toate aceste substanţe, rezultate în urma metabolizării acestor doi aminoacizi aromatici prezintă o importanţă deosebită. Melanina este pigmentul pielii şi a părului. Hidroxilarea tirozinei cu formare de DOPA la nivelul melanocitelor sau celulelor formatoare de pigmenţi, are loc sub acţiunea tirozinazei, enzimă cupru dependentă. DOPA-oxidaza transformă apoi DOPA în DOPA-chinonă. Acesta prin ciclizare formează compuşi indolici, care prin polimerazare generează melanina. Aceste reacţii specifice au loc în melanocite, celule ce derivă din crestele neurale.

DOPA-amina, noradrenalina şi adrenalina sunt amine biogene cu rol de mediatori chimici ai influxului nervos, iau naştere în celulele neurale şi adrenale sub acţiunea unui set de enzime. Astfel, după ce fenilalanina este transformată în tirozină, aceasta sub acţiunea tirozin hidroxilazei, enzimă cupru dependentă, având ca şi coenzimă tetrahidrobiopterina, este transformată în DOPA. Aceasta este decarboxilată sub acţiunea DOPA-decarboxilazei, enzimă piridoxal dependentă, formând DOPA-amină. Aceasta la rândul ei, suferă o reacţie de hidroxilare sub acţiunea DOPA--decarboxilazei, enzimă cupru dependentă, care utilizează vitamina C. Se formează noradrenalină, care este metilată sub acţiunea fenil etanolami-N-metil-transferazei şi în prezenţă de S-adenozilmetionină formând adrenalină.

-formarea melaninei:

477

Page 42: Catabolismul proteinelor

- formarea adrenalinei:

Aminele biogene care iau naştere în cursul acestor reacţii la nivelul sistemului nervos, sunt condiţionate de doi factori: biosinteză şi incativare prin catabolism. Aceste amine cu funcţii de mediatori chimici ai influxului nervos sunt inactivate de către aminoxidaza (MAO), enzimă localizată pe membrana mitocondrială externă. Specificitatea de substrat a acestei enzime este destul de largă. Unul din substratele prevăzute este DOPA-amina dar şi

478

Page 43: Catabolismul proteinelor

serotonina. Sub acţiunea MAO, DOPA-amina se transformă într-o aldehidă conform reacţiei.

La boala lui Parkinson, care este o consecinţă a leziunii sistemului nervos extrapiramidal, nivelul de DOPA-amină este foarte scăzut faţă de normal. În acest caz menţinerea nivelului normal al DOPA-aminei se face prin aport de precursori sau de administrare de MAO, adică substanţe din clasa tranchilizantelor şi antidepresivilor.

Tot din fenilalanină şi tirozină pot să apară şi alţi compuşi deosebit de importanţi cum sunt hormonii tiroidieni. Acţiunea fiziologică a acestor hormoni a fost studiată pe bolnavi afectaţi de tulburări funcţionale tiroidiene şi pe animale cu glanda extirpată. În funcţie de gradul leziunilor tiroidiene şi de simptomele însoţitoare, se vorbeşte despre mixedem şi cretinism, în cazul hipofuncţiilor tiroidiene; manifestări similare sunt caracteristice pentru guşa endemică, produsă prin lipsa de iod din alimente şi din apa potabilă. Pe animale tiroidectomizate a fost studiată casexia tireoprivă, manifestând în cel mai înalt grad consecinţele lipsei hormonilor tiroidieni. Invers, hiperfuncţia tiroidiană produce dereglări metabolice grave constituind boala lui Basedow.

479

Page 44: Catabolismul proteinelor

T3 şi T4 liberi sunt hormoni metabolic activi în plasmă. Legătura cu macromoleculele proteice este deosebit de importantă deoarece previne clearenceul rapid şi degradarea T3 şi T4 circulanţi de către rinichi.T3 şi T4 pot fi disociaţi din legătura lor proteică de către anioni competitivi cum sunt salicilaţii, dinitrofenolul etc. Deoarece T3 se leagă mai slab de proteine serice, el dispare din sânge mai rapid de 20 de ori decât T4.

Dereglările care apar în cursul catabolizării acestor doi aminoacizi (fenilalanina şi tirozina) conduc la grave tulburări metabolice cu deficienţe, în special, la nivelul sistemului nervos. Cea mai gravă este absenţa fenilalaninhidroxilazei, prima enzimă din lanţul metabolic, care are rol de a transforma fenilalanina în tirozină. Apare o boală metabolică cunoscută sub denumirea de fenilcetonurie sau idioţenie fenilpiruvică. Este o boală congenitală cu o frecvenţă de 1:10000 noi născuţi. Se manifestă prin depigmentare, diminuarea funcţiilor biologice şi retardare mintală. Pacienţii sunt incapabili să convertească fenilalanina în tirozină, aşa cum am amintit, în schimb au loc alte reacţii din care rezultă o serie de cataboliţi toxici în special pentru sistemul nervos (acid fenilpiruvic, acid fenil acetic, acid fenilacetilglutamic etc).

Aceşti metaboliţi apar şi în urina oamenilor sănătoşi, dar în cantităţi nesemnificative. Copiii pot fi salvaţi de la retardare mintală dacă imediat după naştere se depistează afecţiunea şi se administrează copilului o dietă lipsită de fenilalanină până la vârsta de 6 ani când sistemul nervos fiind complet dezvoltat, prezenţa fenilalaninei nu afectează.

480

Page 45: Catabolismul proteinelor

Tirozinemia este o afecţiune ereditară de hepatosplino-megalie, ciroză nodulară hepatică, metabolism anormal al tirozinei şi a metioninei, parahidroxifenil-lactacidurie. Totodată se observă creşterea nivelului plasmatic al tirozinei.

-Alanina intră în compoziţia acidului pantotenic şi reprezintă componenta majoră a pereţilor bacterieni.

Serina este implicată în sistemul de sinteză a sfingozinei. De asemenenea, participă la sinteza bazelor purinice şi pirimidinice. Carbonul din este o sursă de grupări metil pentru timină şi colină şi a carbonului 2 şi 8 din nucleul purinic.

Arginina serveşte ca şi donor de grupare guanidinică pentru sinteza creatinei la primate şi pentru sinteza streptomicinei la Streptomices. Sub acţiunea florei intestinale formează apermina şi spermidina. Etapele sintezei creatinei:

481

Page 46: Catabolismul proteinelor

Sinteza acidului guaninoacetic are loc numai la nivelul rinichilor, nu şi în miocard sau în ficat. În schimb metilarea acidului guaninacetic la creatină are loc numai în ficat. Creatinfosfatul este un compus macroergic specific muşchilor. În acest fel se ciclizează neenzimatic pierzând apă şi acid fosforic trecând în creatină.

Travaliul muscular este alimentat direct cu energie de fosfaţii macroergici formaţi în muşchi prin glicoliză sau alte procese exergonice. Depozitul major de energie este fosfocreatina macroergică formată printr-o reacţie reversibilă.

Argininofosfatul apare în muşchii nevertebratelor având o funcţie asemănătoare creatinfosfatului la mamifere.

482

Page 47: Catabolismul proteinelor

O schemă ce redă relaţia dintre arginină, ornitină şi proteină poate fi prezentată astfel:

Cisteina este utilizată pentru sinteza coenzimei A, ea servind ca precursor al tioetanolaminei. Cisteina este, de asemenea, precursor al taurinei, utilate pentru conjugarea acizilor biliari.

Glicocolul sau glicina nu este un -aminoacid esenţial deoarece poate fi sintetizat de multe organisme animale.

Dezaminarea şi transaminarea glicocolului. Ficatul şi rinichii prezintă o flavoproteină specifică, glicinoxidaza care dezaminează oxidativ glicocolul transformându-l în acid glioxalic.

Dezaminarea glicocolului este uşor reversibilă. Acidul glioxalic rezultat poate urma două căi de metabolizare:

a. o cale normală, prin care are loc, mai întâi, o decarboxilare concomitent cu o oxidare rezultând acid formic, astfel format, are rol în biosinteză sub formă de C1 activ sau se poate decarboxila în prezenţă de biotină;

483

Page 48: Catabolismul proteinelor

b. o cale anormală, prin care acidul glioxilic este transformat în acid oxalic. În acest caz are loc numai procesul de oxidare nu şi de decarboxilare. Prezenţa acidului oxalic în cantitate mare determină o depăşire a nivelului său normal din sânge şi este apoi depus în ţesuturi şi în special în ţesutul renal sub formă de calcul.

Acidul glioxilic poate suferi şi un proces de transaminare folosind ca donori de grupă amino glutamina, acidul glutamic, asparagina sau ornitina, cu formare de glicocol.

Glicocolul este un aminoacid glicogenic şi anticetogenic.Conversia glicinei în serină. Studiile lui Tracer sugerează

mecanismul:

Produsul final de decarboxilare a serinei, etanolamina poate fi convertită în glicină.

Sinteze de purine. Molecula de glicină este folosită integral pentru a forma poziţiile 4,5 şi 7 din scheletul purinei.

484

Page 49: Catabolismul proteinelor

Glicina este un constituient al glutationului. Această tripeptidă este alcătuită din acid glutamic, cisteină şi glicocol. Azotul aminic din glicocol nu este disponibil pentru transaminare. Legătura peptidică se face cu gruparea carboxilică din poziţia a acidului glutamic. Glutationul are un rol important în protejarea grupărilor SH. De asemenea, joacă un rol important la nivelul eritrocitelor pentru îndepărtarea apei oxigenate care poate oxida hemoglobina la methemoglobină.

Glicina participă la reacţii de conjugare. Acizii biliari se conjugă cu glicocolul pentru a forma produşi de condensare uşor eliminaţi prin bilă. Cu acidul colic glicocolul formează acidul glicocolic.

Glicocolul se poate conjuga şi cu acidul benzoic, formând acid hipuric. Abilitatea ficatului de a transforma o doză măsurată de acid benzoic în acid hipuric, este utilizată ca test al funcţiilor hepatice. Totodată acidul hipuric este calea de eliminare din organism a derivaţilor organici care apar ca produşi de metabolizare a unor medicamente sau ai unor metaboliţi normali. Reacţia de formare a acidului hipuric este:

485

Page 50: Catabolismul proteinelor

Glicocolul participă la sinteza creatinei, creatininei şi a creatin fosfatului. Creatinogeneza prezintă două etape importante şi anume transamidarea şi transmetilarea.

Ao. Etapa de transamidare are loc la nivelul rinichilor sub acţiunea arginin-glicin-transamidazei cu formare de acid guanidinacetic sau glicocianină, conform reacţiilor:

Bo. Etapa de transmetilare are loc la nivelul ficatului cu participarea S-adenozil metioninei şi a guanidoacetat metil transferazei. Are loc formarea creatinei care se poate transforma, apoi la nivelul muşchilor, în creatinfosfat sau în creatinină. Trecerea creatinei în creatinină depinde de vârstă. Până la pubertate se formează creatina, iar în perioada adultă aceasta se transformă în creatinină.

În unele afecţiuni musculare dozarea creatinkinazei cât şi a creatininei din sânge şi urină ne poate da informaţii importante asupra bolii.

Glicocolul ia parte la ciclul succinat-glicină. Din acest ciclu rezultă metaboliţi importanţi necesari sintezei hemoglobinei ca: succinil-CoA şi acidul -aminolevulinic.

.Acidul -cetoglutaric (-KG) format intră, din nou, în ciclul acidului tricarboxilic. Această schemă reprezintă legătura dintre ciclul citric şi unii produşi de metabolizare a glicinei, cel mai important fiind acidul -aminolevulinic.

Rolul important a glicinei în sinteza porfirinelor şi în sinteza purinei, a sugerat lui Shemin şi Russel (1955) o relaţie a metabolismului glicolic cu ciclul citric. Această cale a fost sintetizată în ciclul succinat-glicină, numit

486

arginin-glicintransamidazã

NH2NH

NH2NH

HN-C-NH-CH 2-COOH + H 2N-(CH 2)3-CH-COOH

HOOC-CH 2-NH2 + H 2N-C-NH-(CH 2)3-CH-COOH

Page 51: Catabolismul proteinelor

şi ciclul lui Shemin. După cum se observă succinil-CoA se condensează cu carbonul al glicinei formând acidul -amino--ceto adipic.

În acest punct metabolismul glicinei se leagă de ciclul acidului tricarboxilic care furnizează succinil-CoA. Acidul -amino--ceto adipic este convertit apoi în acid -aminolevulinic prin pierdere de dioxid de carbon. Acest compus serveşte ca precursor la sinteza porfirinei după dezaminare.

Glicocolul participă la biosinteza hemului. Prin folosirea de glicină marcată s-a putut stabili că atomul de carbon metilenic şi atomul de azot sunt utilizaţi pentru sinteza nucleului porfirinic din hem. Practic glicocolul participă atât la biosinteza hemului cât şi a globinei. Azotul din nucleele pirolice derivă din azotul glicinic, iar carbonul din poziţia este sursa carbonilor din ciclul pirolic, dar în acelaşi timp şi din punţile metilenice. Reacţiile care au loc sunt următoarele:

487

+

CoASH

H2N-CH 2-COOH+

COOH

H2O

GT P

GDP+P

COOH

(CH2)2

COOH

NAD+

NADH+H+

H2O

CH=O

(CH2)2

COOH -H2O

alfa-KG

NADH+H+

NAD+

CHO

COOH

(CH2)2

C=O

PORFIRINE

NH3

[O]

acid delta-amino levulinic

C=O

(CH2)2

COOH

CH-NH2

CO2

acid alfa-amino-betacetoadipic

COOH

CH-NH2

COOH

(CH2)2

C=O

CICLUL CITRIC

succinil-CoAS-CoA

C=O

(CH2)2

Page 52: Catabolismul proteinelor

Două molecule de acid -aminolevulinic se condensează apoi, cu formare de porfibilinogenv (PBG) sub acţiunea aminolevulinic sintetazei (AL LEV sintetază). AM LEV sintetaza este o enzimă mitocondrială, în timp de AM LEV dehidraza este prezentă în citosol. În fază citoplasmatică patru molecule de porfibilinogen, printr-o serie de reacţii condiţionate enzimatic, formează compuişi tetrahidropirolici substituiţi.

Dintre bolile metabolice ale glicocolului amintim.Glicinuria este asociată cu tendinţa de a forma calculi renali pe bază

de oxalaţi, în timp ce cantitatea de oxalaţi eliminată prin urină este normală. De asemenea, excreţia urinară de glicină atinge valori de până la 600-1000 mg în 24 de ore, în timp ce nivelul glicinei din plasmă este normal. De

488

Page 53: Catabolismul proteinelor

aceea, glicinuria este considerată ca datorându-se unui deficit de transport tubular renal al glicinei, deoarece creşte reabsorbţia glicinei de către tubii contorţi renali, permite aminoacidului să scape în urină în cantităţi mari.

Hiperoxaluria este boala metabolică caracterizată printr-o excreţie urinară crescută de acid oxalic, care nu este legat de aportul alimentar de acid oxalic şi de oxalaţi. Istoricul bolii este legat de urolitiaza bilaterală progresivă de oxalat de calciu, nefrocalcinoză şi unei infecţii repetate a travtului urinar. Deficitul gliciltransaminazei, împreună cu oxidarea acidului glioxilic format la acid oxalic şi nu la acid formic, poate prezenta explicaţia biochimică a hiperoxaluriei primare. În orice caz acidul oxalic eliminat este de origine endogenă. Se poate presupune, de asemenea, că deficitul în vitamina B6 determină o excreţie crescută de acid oxalic, deoarece glutamic sau alanin-glioxil transaminaza sunt enzime dependente de vitamina B6. În ficat activitatea AGA (alanin-glioxil transaminază) este de cca 20 de ori mai mare decât a GGA (glutamic-glioxil transaminază). Un deficit de AGA împreună cu oxidarea acidului glioxilic la acid oxalic, ar putea constitui o explicaţie pentru hiperoxalurie primară.

XVIII.3. BIOSINTEZA AMINOACIZILOR

Dintre aminoacizii cunoscuţi numai un număr de 20 prezintă importanţă pentru biosinteza proteinelor. Unele forme de viaţă (plante, bacterii) sunt capabile să sintetizeze toţi 20 de aminoacizi din intermediari amfibolici. Altele, inclusiv mamiferele şi în special omul, pot sintetiza numai o parte din ei, care au fost numiţi aminoacizi neesenţiali. Cei ce nu pot fi sintetizaţi şi care trebuie suplimentaţi prin dietă sunt numiţi aminoacizi esenţiali.

Aminoacizi esenţiali aminoacizi neesenţialiarginina (Arg) alanină (Ala)histidină (His) asparagină (Asn)izoleicină (Ile) acid aspartic (Asp)leucină (Leu) cisteină (Cys)lizină (Lys) acid glutamic (Glu)

metionină (Met) glutamină (Gln)fenilalanină (Phe) glicină (Gly)

treonină (Thr) hidroxiprolină (Hip)triptofan (Trp) prolină (Pro)

valină (Val) serină (Ser)

489

Page 54: Catabolismul proteinelor

Tirozină (Tyr)

XVIII.3.1. Aminoacizi neesenţiali care se sintetizează din intermediari amfibolici

Alanina se formează din acid piruvic printr-o reacţie de transaminare.

Acidul glutamic se formează din -cetoglutarat printr-o reacţie catalizată de L-glutamat dehidrogenază.

Acidul aspartic se sintetizează din oxalilacetat prin transaminare.

Glutamina se sintetizează printr-o reacţie catalizată de către glutaminsintetază, plecând de la acid L-glutamic. Reacţia necesită ATP ca şi donor de energie.

490

Page 55: Catabolismul proteinelor

Asparagina se sintetizează printr-o reacţie similară plecând de la acid L-aspartic sub acţiunea asparaginsintetazei. ATP trece, în acest caz, la AMP şi PP.

În cazul serinei, în ţesutul mamiferelor coexistă două căi de biosinteză. În ambele cazuri punctul de plecare în sinteză este acidul 3-fosfogliceric, intermediar din glicoliză.

Calea prin intermediul derivaţilor fosforilaţi necesită în prima etapă o dehidrogenază, apoi o transaminază şi o fosforilază. Calea prin intermediari nefosforilaţi, necesită o fosfatază şi o transaminază.

491

Page 56: Catabolismul proteinelor

Sinteza glicinei în ţesutul mamiferelor poate să se facă pe mai multe căi. În citosolul hepatic se găseşte glicintransaminaza care transformă acidul glioxilic şi acizii glutamic şi aspartic în glicină.

La mamifere există două căi importante de sinteză a glicinei, una plecând de la colină şi alta de la serină.

În cea de a doua cale serina suferă o reacţie de hidroximetilare în prezenţa tetrahidrofolatului.

XVIII.3.2. Aminoacizi neesenţiali care se sintetizează din alţi aminoacizi neesenţiali

Prolina se sintetizează la mamifere plecând de la glutamat printr-o serie de reacţii reversibile care sunt utilizate şi la catabolismul prolinei.

492

Page 57: Catabolismul proteinelor

Hidroxiprolina se sintetizează din prolină prin acţiunea prolin hidroxilazei. Reacţia necesită prezenţa de oxigen molecular, Fe+2 şi de vitamina C.

XVIII.3.3. Aminoacizi neesenţiali care iau naştere din aminoacizi esenţiali

Cisteina se sintetizează din L-serină şi homocisteină, care provin ca intermediari în metabolizarea metioninei.

Tirozina se sintetizează din fenilalanină sub acţiunea fenilalanin hidroxilazei. Reacţia este ireversibilă şi necesită prezenţă de NADPH, oxigen molecular şi tetrahidrobiopterină.

493

Page 58: Catabolismul proteinelor

Complexul fenilalanin hidroxilazei prezintă două activităţi distincte; activitatea I reprezintă reducerea oxigenului molecular la apă şi fenilalaninei la tirozină, iar activitatea II, reprezintă reducerea dihidrobiopterinei la tetrahidrobiopterină pe socoteala NADPH.

Hidroxilizina la fel ca şi prolina este prezentă în fibra de colagen. Hidroxilizina este, însă, absentă din aproape toate proteinele mamiferelor, provine din lizina alimentară prin hidroxilare, dar numai după incorporarea lizinei în legătura peptidică, analog formării hidroxiprolinei din prolină. Enzima care catalizează această reacţie este lizinhidroxilaza.

XVIII.4. METABOLISMUL HEMOGLOBINEI

XVIII.4.1. Biosinteza

Datorită pierderii permanente de hemoglobină prin catabolism şi prin îmbătrânirea hematiilor este evidentă necesitatea înlocuirii în mod permanent. Durata medie de viaţă a eritrocitelor umane este în jur de 120 de zile. Ele sunt apoi lizate şi hemoglobina conţinută în ele, este convertită în produşi de excreţie. S-a estimat că există aproximativ 30 de trilioane de eritrocite în sângele circulant a unui bărbat adult, dintre care în fiecare secundă se distrug aproximativ 3 milioane. Dacă, fiecare eritrocit se presupune că conţine aproximativ 300 de milioane de molecule de hemoglobină. În acest caz în fiecare secundă trebuie să se sintetizeze aproximativ 900 de trilioane de molecule de hemoglobină, pentru a menţine nivelul normal de hemoglobină din sânge. Deşi pare să fie o cantitate enormă, un individ sănătos poate sintetiza această cantitate ce corespunde la aproximativ 8 g hemoglobină în 24 de ore.

XVIII.4.1.1. BIOSINTEZA GLOBINEI

494

Page 59: Catabolismul proteinelor

Biosinteza globinei se realizează din aportul corporal de aminoacizi într-o cantitate de 8 g/zi. Aproximativ 14% din aminoacizii aparţinând proteinlor ingerate, sunt utilizaţi pentru obţinerea globinei. Din acest motiv biosinteza globinei este considerată prioritară. Procesul de sinteză a globinei survine, în primul rând, în eritrocitele nucleate (normoblaste) din măduva osoasă şi de asemenea, în reticulocite. Sinteza globinei are loc la nivelul ribozomilor într-o manieră foarte asemănătoare cu a celorlalte proteine. Studiile electronomicroscopice indică că sinteza hemoglobinei în reticulocite are loc pe structura multiribozomală care conţine cinci ribozomi. Aceşti ribozomi sunt înşiraţi pe un lanţ ARNm.

Nucleul eritrocitelor nucleate din măduva osoasă umană nu sintetizează cantităţi semnificative de hemoglobină. Formarea globinei nu pare să implice factori genetici sau mecanisme speciale. Cele două tipuri de lanţuri se formează independent sub controlul diferitelor gene şi de asemenea, cu viteze egale. Există unele dovezi evidente că hemina creşte viteza de sinteză a hemoglobinei în reticulocitele de iepure, în timp ce descreşte sinteza hemului. Astfel, poate servi ca o parte a unui mecanism de control al sintezei globinei şi probabil al lanţurilor şi la un raport molar de 1:1. Porfirina IX creşte, de asemenea, sinteza globinei.

XVIII.4.1.2. BIOSINTEZA PORFIRINEI ŞI A HEMULUI

Biosinteza porfirinelor şi a hemului constă din trei etape succesive:1o. biosinteza acidului -aminolevulinic din glicină şi succinil-CoA;2o. formarea porfibilinogenului din acid -aminolevulinic;3o. conversia porfibilinogenului într-un ciclu tetrahidropirol-porfirinic şi apoi a hemului.

Biosinteza acidului -aminolevulinic (ALA). Se pleacă de la glicină şi succinil-CoA (provenit din ciclul tricarboxilic). Se presupune că mecanismul de reacţie constă în formarea unei baze Schiff între glicină şi piridoxal fosfat. Este necesară, de asemenea, prezenţa ionilor de magneziu sau a altor ioni bivalenţi ca şi cofactori. Reacţia decurge cu formarea în faza intermediară a acidului -amino--cetoadipic, un compus labil, care prin decarboxilare trece în acid -aminolevulinic. Procesele se desfăşoară conform reacţiilor:

495

Page 60: Catabolismul proteinelor

496

Page 61: Catabolismul proteinelor

-Aminolevulinat acil sintetaza (ALAS), este o enzimă mitocondrială allosterică, limitantă de viteză, în sinteza porfirinelor la nivelul ficatului. Ea este inhibată de produsul final de reacţie hemul, hemoglobina şi alte proteine memice. Aparent inhibiţia survine în faza de post transcriere a sintezei ALAS. Enzima este metabolizată rapid, având un timp de înjumătăţire, la nivelul ficatului, de cca 1 oră.

Sunstanţele care induc sinteza hepatică a -aminolevulinat sintetazei includ unii metaboliţi şi hormoni steroizi şi alilizopropilacet-amida. Biosinteza acidului -aminolevulinic are loc la nivel mitocondrial.

Formarea porfirinogenului (PBG). Descoperirea în urina pacienţilor cu porfirie acută intermitentă a porfibilinogenului (PBG) şi determinarea structurii sale chimice, a condus la elucidarea etapelor implicate în biosinteza porfirinelor şi a hemului. S-a postulat imediat, că acest compus este intermediar (de fapt primul produs ciclic) din biosinteza porfirinelor.

Formarea porfibilinogenului are loc la nivelul citosolului prin condensarea a două molecule de acid -aminolevulinic, sub acţiunea a porfibilinogen sintetazei (PBGS) numită -aminolevulinat hidratază (enzimă localizată în citoplasmă).

497

Page 62: Catabolismul proteinelor

Porfirinogen sintetaza (PBGS), conţine 8 lanţuri polipeptidice identice. O subunitate are o greutate moleculară de aproximativ 35000. Centrul activ al enzimei conţine un rest de lizină şi două grupări sulfhidril, necesare activităţii sale. Acest lucru a fost demonstrat de Shemin şi colaboratorii. Se pare că, resturile SH participă în cataliza acido-bazică necesară secvenţei de protonare-deprotonare din sinteza PBG. Enzima din ficatul de bou conţine 4 ioni de Zn+2 per moleculă fiind absolut necesară activităţii sale. Recent s-a sugerat că ionii de zinc interacţionează cu grupările sulfhidril din centrul activ fiind şi ei implicaţi în procesul de protonare-deprotonare menţionată mai înainte. Se pare că ei acţionează ca un acid Lewis, polarizând o grupare carbonil a unei molecule de acid -aminolevulinic (ALA), făcând-o mai susceptibil pentru atacul nucleofil.

Aşa cum se vede din reacţiile de mai jos, mecanismul de acţiune al PBGS implică formarea, în primul rând, a unei baze Schiff între molecula de acid -aminolevulinic şi gruparea aminică a enzimei, probabil gruparea -aminică a lizinei din centrul activ al enzimei, formând un intermediar anionic.

498

Page 63: Catabolismul proteinelor

499

Page 64: Catabolismul proteinelor

În cursul acestei reacţii se eliberează o moleculă de apă şi un proton. Aceasta este urmată de un atac nucleofil asupra carbonului din gruparea carbonil a celei de a doua mileculă de acid aminolevulinic şi prin protonare leagă cele două molecule de ALA. Se presupune că secvenţele de protonare-deprotonare sunt mediate de grupa tiolică a cistinei şi probabil de o grupare imidazolică a histidinei de la centrul activ al enzimei. Are loc apoi protonarea bazei Schiff şi se elimină o moleculă de apă. Gruparea aminică liberă a celei de a doua molecule de ALA înlocuiesc gruparea aminică a PBGS printr-o reacţie trans-Schiff. Are loc o protonare şi apoi o rearanjare intramoleculară, formând astfel porfibilinogenul. Se elimină PBG liber şi PBGS liber pentru desăvârşirea ciclului. PBGS poate suferi inhibiţie de tip feed back prin hem, hemoglobină şi alte proteine hemice. Enzima este, de asemenea, inhibată de către concentraţii scăzute de plumb, care reacţionează cu grupările tiol, grupări esenţiale pentru activitatea enzimei. Acest lucru justifică excreţâia mare de acid levulinic la pacienţii intoxicaţi cu plumb.

Conversia porfibilinogenului în porfirine şi HEM. Recţiile implicate sunt prezentate mai jos. Legandă: V-vinil, A- acid acetic, P-acid propionic, M-metil şi ALA acid -aminolevulinic.

Reacţiile prezentate nu cuprind şi mecanismele implicate. Practic patru molecule de PBG se combină cu pierderea a 4 grupări NH4

+, pentru a forma un ciclu tetrapirolic. Este introdus apoi ionul de Fe+2 pentru a forma molecula de hem.

Prima etapă este catalizată de uroporfilinogen I sintetază (porfirinogen deaminază). Gruparea aminină a unei molecule de PGB este îndepărtată cu un atom de hidrogen aparţinând unei alte molecule. Se elimină NH4

+ şi se formează o punte -CH2- între două molecule de PBG. De fapt, fiecare atom de carbon al unei molecule de glicină serveşte ca sursă de carbon metilenic. Rezultă în faza intermediară un dipirilmetan, iar apoi prin pierdere de NH4

+ se formează inelul porfirinotetrapirolic numit uroporfirinogen I. Grupările substituite ale celor patru nuclee sunt aranjate simetric. Uroporfirinogen I este un produs incolor neutilizat de organism. El fie că suferă un proces de autoxidare, cu formarea unui produs colorat în purpuriu, uroporfirina I, care este excretată, fie cele două grupări acetat sunt decarboxilate sub acţiunea uroporfirinogen decarboxilazei formând grupări metil (M) şi obţinându-se coproporfirina I, compus colorat în purpuriu şi care este excretat prin urină şi fecale.

Uroporfirinogen I sintetaza este larg răspândită în ţesuturile animale, plante şi microrganisme. Enzima din eritrocitele umane a fost separată prin tehnicile de gel-filtrare în trei fracţiuni proteice active, având

500

Page 65: Catabolismul proteinelor

greutatea moleculară cuprinsă între 38000 şi 40000. Se pare că cele trei enzime sunt izoenzime. Mecanismul implicat în conversia celor patru molecule de PBG în uroporfirinogen I, de către uroporfirinogen sintetază este şi rămâne încă neclarificat.

Majoritatea PBG nu este convertit în organismul animal în izomerul uroporfirinogen I, ci în izomerul uroporfirinogen III. Acesta diferă de tipul I prin inversarea ordinei substituienţilor la unul din nucleele pirolice (D). Astfel, în loc de A-P, apare P-A. Această reacţie de izomerizare apare datorită acţiunii catalitice a uroporfirinogen III cosintetază (sau izomerază). Enzima nu este activă în absenţa uroporfirinogen sintetaze. Izomerul de tip III se formează prin acţiunea combinată a celor două enzime şi este utilizat pentru formarea hemului. Celelalte două forme izomere de tip II şi de tip IV nu apar în mod natural.

Mecanismul prin care cele patru molecule de porfibilinogen sunt convertite în urobilinogen III prin efectul combinat a celor două enzime (uroporfirinogen I sintetaza şi uroporfirinogen III cosintetaza) a rămas încă o enigmă.

Uroporfirinogenul de tip III format este convertit rapid în coproporfirinogen III prin decarboxilarea celor patru acetaţi (A) pentru a forma grupări metil (M). Reacţia este aparent catalizată de uroporfirinogen decarboxilază. Gruparea (P) de la nucleele pirolice A şi B ale coproporfirinogenului III, sunt decarboxilate oxidativ cu formarea grupărilor vinil (V) sub acţiunea coproporfirinogen III oxidazei. În felul acesta rezultă protoporfirinogenul III, care la rândul său este oxidat la protoporfirina III sub acţiunea protoporfirinogen oxidazei.

501

Page 66: Catabolismul proteinelor

502

Page 67: Catabolismul proteinelor

În etapa finală, Fe+2 disponibil datorită transferinei plasmatice, este înserat în molecula protoporfirinei sub acţiunea ferochelatazei formând hemul, produs final de reacţie. Aproximativ 85% din hemul sintetizat este utilizat pentru formarea hemoglobinei, cca 10% este utilizat pentru formarea mioglobinei şi 5% pentru formarea citocromilor sau alte proteine hemice.

Porfirinele care iau naştere în cantităţi mici (uroporfirine de tip I şi II, coproporfirinele de tip I şi II etc), sunt compuşi colaterali care ies din calea biosintezei hemului. Nu pot fi utilizaţi şi se elimină ca atare prin urină, constituind aşa numitele “cadavre metabolice”.

503

Page 68: Catabolismul proteinelor

Formarea în cantitate mare a acestor porfirine, reprezintă o perturbare în secvenţa biosintezei hemului. Această perturbare reprezintă boli genetice, prin deficit enzimatic, cu sau fără manifestări clinice cunoscute sub numele de “porfirii” şi caracterizate printr-o eliminare crescută de porfirine prin urină, fotosensibilitate etc.

Reglarea biosintezei hemului. Reacţia limitantă de viteză în biosinteza hemului este reacţia catalizată de ALAS. Nivelul acestei enzime

504

Page 69: Catabolismul proteinelor

în ţesuturile capabile să sintetizeze hemul este semnificativ mai scăzut decât a altor enzime. ALAS este enzima reglatoare. Hemul acţionând prin intermediul unei molecule apopresoare, acţionează ca un efect negativ asupra acumulării de ALAS. Se pare că în această etapă acţionează un fenomen de retroinhibiţie semnificativ. Mecanismul este ilustrat mai sus. Efectul reglator major al hemului constă în faptul că viteza de acumulare a ALAS creşte foarte mult în absenţa hemului şi descreşte foarte mult în prezenţa lui. Mulţi compuşi cu structuri foarte diferite incluzând insecticidele, carcinogenele, produsele farmaceutice etc, când sunt administrate la om, pot avea ca rezultat creşterea nivelului ALA sintetazei. Majoritatea acestor substanţe sunt metabolizate printr-un sistem din ficat care utilizează o hemoproteină specifică citocrom P450. În timpul procesului de metabolizare a acestor substanţe, consumul hemului de către citocrom P450 este foarte crescut, ceea ce determină ă scădere intracelulară a hemului, care la rândul său determină o depresie de ALA-sintetază şi o creştere a biosintezei hemului.

Există şi alţi factori care afectează introducerea de ALAS la nivelul ficatului. Un astfel de exemplu îl constituie glucoza. Fierul sub formă de chelat prezintă un efect sinergic asupra inducţiei ALAS hepatice.

Steroizii, de asemenea, joacă un rol important în depresia indusă de droguri ALAS. În ţesuturile extrahepatice, hipoxia creşte activitatea ALAS, fără a avea activitate care să poată fi demonstrată la nivelul ficatului.

XVIII.4.1.2. PORFIRII

Porfiriile constutuie un grup heterogen de boli caracterizate prin excreţie crescută de porfirine şi precursori ai porfirinelor. Tipurile mai importante de porfirii sunt.

Porfiria hepatică acută intermitentă, se datorează unui deficit congenital de uroporfirinogen I sintetază. Nu se exprimă înainte de pubertate. În urină se secretă cantităţi crescute de porfirinogen (PBG) şi acid aminolevulinic (ALA), stând la aer şi lumină urina se închide la culoare. În urină apare coproporfirina III şi uroporfirina III.

Principalele manifestări clinice sunt dureri abdominale, spasme ale musculaturii netede, anomalii neurologice, confuzii, hipertensiune şi hipercolesterolemie.

Porfiria eritropoetică congenitală, se datorează deficitului de uroporfirinogen III cosintetazei. De fapt există un dezechilibru între cele două sintetaze. Se observă o creştere marcantă de uroporfirină I în sânge,

505

Page 70: Catabolismul proteinelor

fecale şi urină. Raportul între cegenii I şi III este de 100/1. Ca şi manifestare clinică prezintă fotosensibilitate, leziuni cutanate, oasele şi dinţii devin roz, prezintă anemie hemolitică etc. eritrocitele circulante şi măduva osoasă conţin cantităţi crescute de ogeni I dar nu şi hepatocitele.

Coproporfiria ereditară se datorează deficitului parţial de coproporfirinogen III oxidază. Prin fecale se elimină coproporfirina de tip III. În urină se elimină ALA şi PBG. Este o porfirie caracteristică condiţiilor de stres. Are loc şi depresia ALA-sintetazei cu producţie de ALA şi PBG. Manifestările clinice sunt asemănătoare cu cele din porfiria acută intermitentă.

Protoporfiria se datorează deficitului ferochelatazei din toate mitocondriile şi toate ţesuturile. Eritrocitele, plasma şi fecalele conţin protoporfirina de tip IX, iar reticulocitele prezintă fluorescenţă roşie. Ca manifestări clinice, bolnavii prezintă fotosensibilitate, ciroză şi urticarie prin expunere la soare.

Porfiria cutanată tardivă, se datorează deficitului de uroporfirinogen decarboxilază. Se manifestă prin creşterea excreţiei ALA şi PBG, de asemenea, coproporfirină III în urină şi fecale. Ca şi principale manifestări clinice prezintă fotosensibilitate cutanată şi leziuni cutanate; este asociată bolilor hepatice, alcoolismului şi supraîncărcării cu fier.

Porfiria “toxică” se datorează creşterii ALA sintetazei. În perioada acută se elimină ALA şi PBG prin urină, de asemenea, coproporfirina III în urină şi fecale. Ca şi principală manifestare clinică este reacţia la unele droguri (barbiturice, alcool, unii steroizi, pesticide, anticonceptive orale, apronalide etc).

Porfiria dobândită poate rezulta în urma expunerii la compuşi toxici ca hexaclorbenzen, plumb şi săruri ale metalelor grele, deoarece metalele grele inhibă necompetitiv ALA-dehidraza, porfibilinogen sintetaza, uroporfirinogen sintetaza şi ferochelataza. De asemenea droguri ca griseofulvina, apronalida, etc.

Porfirii variate se datoresc descreşterii protoporfirinogen III oxidazei.În fecale se elimina coproporfirina I şi III şi protoporfirină, iar în urină ALA şi PBG. Ca manifestări clinice apar leziuni cutanate, simptome abdominale şi neurologice. Declanşarea bolii este grăbită de alcool şi droguri.

XVIII.4.2. Catabolismul hemoglobinei

506

Page 71: Catabolismul proteinelor

În condiţii fiziologice la un om adult se distrug 1-2. 108 eritrocite pe zi. Un adult de 70 de kg prezintă un turnover al hemoglobinei de 6 g Hb/zi. Din eritrocitele îmbătrânite hemoglobina este eliberată prin fagocitoză în celulele reticuloendoteliale, în special în splină. Hemoglobina eliberată în sânge este captată de către o glicoproteină specifică numită heptaglobină (Hp), care prezintă proprietăţi peroxidice.

Formarea complexului 2Hb/Hp facilitează descompunerea hemoglobinei. Când eliberarea de hemoglobină în sânge depăşeşte captarea sa de către heptoglobină, apare hemoglobinuria. Complexul 2Hb/Hp este transportat prin sânge la celulele reticulo-endoteliale hepatice (celulele Kupffer) unde hemoglobina este scindată. Globina este reutilizată ca aminoacizi, în timp ce nucleul heminic este convertit prin mai multe etape în pigmenţi biliari (biliverdină şi bilirubină) şi excretaţi în bilă. Atomul de fier din hem este îndepărtat prin legarea de o transferină plasmatică fiind fie reciclat, fie depozitat în ficat ca şi feritină. Hemul altor proteine este transportat în plasmă legat de proteină, hemopexină şi convertit în mod similar în biliverdină şi în bilirubină.

Degradarea hemului are loc la nivelul microzomilor hepatici şi implică o oxidare unică a atomului de carbon din puntea metilenică cu formare de monoxid de carbon. Reacţia este catalizată de către hem-oxigenază, o enzimă microzomală, în prezenţă de oxigen molecular, citocrom c reductază şi NADH.

Inelul tetrapirolic al hemului se deschide şi atomul de fier este eliberat. Se formează, probabil ca şi intermediar, verdohemină. Se ajunge apoi la biliverdină care sub acţiunea biliverdin oxidazei şi NADPH, este transformată în bilirubină.

O parte din bilirubină se formează şi la nivelul altor ţesuturi din diferite hemoproteine şi este transportată la ficat şi legată de o albumină plasmatică. Bilirubina este insolubilă în mediu apos.

În ficat bilirubina este conjugată cu acid glucuronic formând acid bilirubin diglucuronic care este solubilă în apă şi este rapid excretat prin intermediul bilei în intestin. Formarea bilirubin diglucuronidului implică reacţia celor două grupări carboxil ale sale cu gruparea hidroxil de la C1 a doua moleculă de acid UDP-glucuronic. Reacţia este catalizată de bilirubin-UDP-glucuronil transferază, enzimă microzomală hepatică.

507

Page 72: Catabolismul proteinelor

Bilirubin diglucuronidul este hidrolizat la nivelul intestinelor de către -glucuronidază. Bilirubina este redusă de flora bacteriană, trecând în D- sau L-urobilinogen incolor. O parte din el este reabsorbit şi exctretat în urină sub forma unui compus de oxidare colorat în galben oranj, L-urobilină. Partea rămasă de urobilinogen este redus în intestin la L-stercobilinogen, care este excretat în fecale sub forma unui produs de oxidare de culoare brună L-stercobilină.

Schema catabolizării hemoglobinei

1. incorporarea bilirubinei în celulele parenchinului hepatic; Hemoglobină formează 35 mg bilirubină. La om se formează zilnic 250-300 mg. Metabolismul bilirubinei la nivelul ficatului este divizat în trei procese:

2. conjugarea bilirubinei la nivelul reticulului endoplasmatic3. secreţia bilirubinei conjugate în bilă printr-un proces de transport

activ limitant de viteză.Fiecare dintre aceste procese trebuiesc privite separat.

508

Page 73: Catabolismul proteinelor

Schema conjugării bilirubinei la nivelul microzomilor hepatici

XVII.5. TEHNICI DE ANALIZÃ

XVIII.5.1.Tehnici de separare a aminoacizilor

XVIII.5.1.1. CROMATOGRAFIA

În toate sistemele de cromatografie moleculele sunt repartizate între o fază staţionară şi o fază mobilă. Separarea depinde de tendinţa relativă a moleculelor din amestec să se asocieze mai mult sau mai puţin de o singură fază. Aceste tehnici de separare sunt discutate în principiu cu exemplificare pe aminoacizi.

Cromatografia pe hârtie. În timp ce au apărut tehnici tot mai sofisticate, cromatografia pe hârtie are aplicaţii fundamentale în separarea aminoacizilor. Proba este aplicată la un punct marcat la aproximativ 2 cm de capătul unei fâşii de hârtie de filtru. Fâşia este astfel suspendată într-un vas care conţine solventul cromatografic. (Figura XVIII.1.)

Pentru separarea aminoacizilor, solventul polar este un amestec binar, ternar sau un amestec mai complex de apă, alcool, acizi şi baze. Componenta mai polară a solventului se asociază cu celuloza şi formează faza staţionară. Componenta mai puţin polară formează faza mobilă. Aceasta este repartiţia cromatografică normală. Pentru cromatografia de reapartiţie cu fază inversă, polarităţile fazei mobile şi a fazei staţionare sunt inversate. Acest tip de cromatografie este folosit pentru separarea peptidelor

509

Page 74: Catabolismul proteinelor

nepolare sau a lipidelor, nu şi pentru compuşi polari cum ar fi aminoacizii. Solventul poate migra pe hârtie în sus în jos sau de jos în sus (cromatografie ascendentă sau descendentă). Când migrarea solventului a ajuns la capătul final fâşia de hârtie este uscată şi tratată pentru vizualizarea moleculelor interesate (de exemplu, pentru aminoacizi cu soluţie de ninhidrină 0,5% în acetonă urmată de o încălzire la 90-110o pentru câteva minute).

Figura XVIII.1. Aparat descendent pentru cromatografie pe hârtie

Aminoacizii cu o polaritate nepolari (cum ar fi leucina, izoleucina, fenilalanina, triptofanul, valina, metionina şi tirozina) migrează cu mult mai mult decât aminoacizii puţin nepolari (prolina, alanina şi glicocolul) şi evident decât aminoacizii polari (treonina, acidul glutamic, serina, arginina, acidul aspartic, histidina, lizina şi cisteina). (Figura XVIII.2.) Acest lucru reflectă solubilitatea relativă a moleculelor polare în faza staţionară hidrofilă şi a moleculelor nepolare în solventul organic. De notat că pentru seria nepolară de aminoacizi (glicină, alanină, valină, leucină) creşte distanţa de migrare în mediu nepolar, cu creşterea caracterului nepolar, rezultatul este o creştere a mobilităţii.

Raportul dintre distanţa la care a migrat aminoacidul şi linia de migrare a solventului (frontului) se poate măsura de la punctul de aplicare (punctul de start) a amestecului de aminoacizi este exprimată prin valoare Rf (mobilitatea relativă faţă de frontul solventului). Valorile Rf pentru

510

Page 75: Catabolismul proteinelor

aminoacizi variază în funcţie de condiţiile experimentale, de exemplu solventul utilizat. În acest caz mobilitatea poate fi o expresie relativă faţă de standard (de exemplu, valoarea Rala faţă de Rf).

În cromatografia bidimensională, proba este aplicată la unul din colţurile pătratului format din hârtia cromatografică. De regulă, se utilizează amestecuri diferite de solvenţi pe cele două direcţii de migrare (figura nr. XVIII.3.).

Cromatografia pe strat subţire. Se disting două metode de cromatografie în strat subţire, TLC (thin-layer chromatography). Cromatografia de repartiţie în strat subţire, PTLC (partition thin-layer chromatography) seamănă foarte mult cu cromatografie de repartiţie pe hârtie. Aici se utililizează suport relativ inert, sistemul de solvenţi şi reacţiile de identificare a aminoacizilor este similară cromatografiei pe hârtie. Cromatografia de absorbţie pe strat subţire (ATLC), care nu este similar cu cromatografia pe hârtie, depinde de abilitatea solventului (care este un sistem binar sau unul mult mai complex) şi ca substrat se utilizează site moleculare sau silicagel activat.

Cromatografia pe schimbători de ioni. Principiul repartiţiei a fost perfecţionat în continuare în cromatografia de schimb ionic, dezvoltată

511

Figura nr. XVIII.2.Identificarea aminoacizilor prezenþi în proteine dupã vizualizare cu ninhidrinã.

.

.........

.......

...

..

direcþia demigrare a solventului

originea

LysAspGly

T hr

Pro

ValT rp

PheLeu

Cys

HisArgSer

GluAla

T yr

Met

Ile

.

..

. ..

.

.

..

.

..

.

. ..

..originea

Asp

GluCysSer

Asp-NH2 GlyThr

AlaGlu-NH2

Lys Tyr

His

Arg ..Val

MetIle

Leu

Trp

Pro

Phe

butanol-acid acetic-apă (4:5:1)

m-crezol-fenol (1:1) pH=9,3 în tampon borat

Figura nr. XVIII.3.Cromatografie bidimensionalã a aminoacizilor din proteine

Page 76: Catabolismul proteinelor

pentru prima dată de W. Cohn. În această metodă, moleculele substanţelor din amestec sunt separate pe baza deosebirilor în proprietăţile acido bazice. Pentru acest proces se umple o coloană cu granulele unei răşini sintetice care conţine grupări încărcate fixe. Există două clase mari de răşini schimbătoare de ioni: schimbători de ioni cationici şi schimbători de ioni anionici. Aminoacizii sunt separaţi, de obicei, pe o coloană cu schimbător de ioni cationic, umplută cu granule solide de polistiren sulfonat, echilibrată cu o soluţie de hidroxid de sodiu pentru a încărca grupările sulfonice cu ioni de sodiu. Această formă a răşinii se numeşte formă sodiu; răşina poate fi preparată şi în formă protonată, spălând coloana cu un acid.

Figura nr. XVIII.4. Analiza cromatografică automată a aminoacizilor pe o răşină schimbătoare de ioni

Pe coloana cu răşină în formă sodiu se aplică amestecul de aminoacizi într-o soluţie acidă (pH=3,0); la pH=3 aminoacizii sunt cationi cu sarcină net pozitivă. Aminoacizii cationici tind să deplaseze ionii de sodiu legaţi de răşină; cantitatea deplasată variază puţin de la un aminoacid la altul, datorită diferenţei mici în gradul de ionizare. La pH=3, cei mai bazici aminoacizi (lizina, arginina, histidina) sunt cel mai puternic legaţi de răşină prin forţe electrostatice şi cei mai acizi aminoacizi (acidul glutamic şi acidul aspartic) sunt cel mai slab legaţi. Prin creşterea treptată a pH-ului şi concentraţiei de NaCl în soluţia apoasă de eluare, aminoacizii migrează în coloană cu viteze diferite şi eluatul este colectat în numeroase fracţii mici. Fracţiile sunt analizate cantitativ cu ajutorul reacţiei cu ninhidrină. Aminoacidul cel mai anionic, de exemplu acidul glutamic, apare primul şi cel mai cationic, de exemplu, lizina, apare ultimul. Din datele obţinute se trasează o curbă de eluţie (figura nr. XVIII.4.). Procedura analitică a fost complet automatizată, astfel încât eluţia, colectarea de fracţiuni, analiza fiecărei fracţii şi datele

512

Page 77: Catabolismul proteinelor

înregistrate sunt realizate automat într-un aparat numit analizor de aminoacizi.

Pentru reducerea timpului necesar măsurătorilor cromatografice exacte a aminoacizilor, în special a hidrolizatelor proteice, se folosesc coloane cu schimbători de ioni foarte scurte şi tampoanele de eluţie sunt trecute pe coloană sub presiune. Aceste perfecţionări, împreună cu altele, fac posibilă determinarea tipului şi cantităţilor tuturor aminoacizilor dintr-un amestec în mai puţin de 2 ore; pentru această analiză este necesară numai o fracţie de un miligram de probă.

XVIII.5.1.2. ELECTROFOREZĂ LA TENSIUNE RIDICATĂ PE UN SUPORT INERT (HVE)

Separarea aminoacizilor, polipeptidelor şi a altor amfoliţi (molecule ale căror sarcini nete depinde de pH-ul mediului înconjurător) impune utilizarea directă a curentului care are aplicaţii largi în biochimie. Pentru aminoacizi foaia de hârtie sau stratul subţire de praf de celuloză este folosit foarte des ca şi suport. Separări la 2000 la 3000 de volţi într-un câmp de curent continuu în timp de 0,5-2 ore depinde de sarcina amfolitului şi de masa sa moleculară. Pentru molecule cu sarcini identice, migrarea acestora va fi în funcţie da masa moleculară. Sarcina netă este, de asemenea, un factor important în determinarea separării. Aplicaţiile includ aminoacizi, polipeptide cu mase moleculare mici, anumite proteine, nucleotide şi fosfoglucide. Probele sunt aplicate pe suportul, care este imersat într-o soluţie tampon apropiat pH şi conectat la rezervorul de tampon. Când curentul este aplicat, moleculele cu sarcină netă negativă la pH-ul ales migrează către anod şi cele cu sarcină netă pozitivă vot migra spre catod. Vizualizarea electroforeogramei după uscare se realizează cu ninhidrină (aminoacizi şi peptide) sau expuse la lumină ultravioletă pentru nucleotide.

XVIII.5.2. Tehnici de separare pentru peptide

Separarea peptidelor în urma hidrolizei parţiale a proteinelor este mult mai dificilă decât separarea şi identificarea aminoacizilor. Acset fenomen se datorează faptului că numărul de polipeptidede este mult mai mare şi mult mai heterogen decât numărul de aminoacizi. Pentru separarea polipeptidelor se folosesc mai multe tehnici.

513

Page 78: Catabolismul proteinelor

Harta peptidică bidimensională se obţine prin tehnica prin combinarea a două metode şi anume o elecroforeză pe o anumită direcţie, apoi cromatografia în unghi drept faţă de direcţia electroforezei. Peptidele pot fi localizate pe hârtia uscată după stropire cu ninhidrină şi uscare la cald.

Figura nr. XVIII.5. Cromatogramă bidimensională pe hârtie.

O altă cale foarte eficientă de separare a peptidelor este cromatografia de excludere sau gel filtrarea, în coloane care conţin derivaţi de hidraţi de carbon polimerizaţi, numiţi Sephadex. Acest tip de cromatografie separă peptidele după masele lor moleculare. O combinaţie între cromatografia pe schimbători de ioni şi de excludere este foarte eficientă.

XVIII.5.3. Determinarea compoziţiei în aminoacizi a peptidelor.

După ce au fost separate toate fragmentele peptidice rezultate din hidroliza parţială a lanţului polipeptidic, câte o probă din fiecare fragment este hidrolizată complet şi I se determină compoziţia în aminoacizi. Apoi, se determină, pe alte probe, secvenţa de aminoacizi a fiecărei peptide prin degradarea segmenţială Edman. Dacă peptida este prea lungă pentru a putea fi segmentată pe această metodă, resturile N-terminale şi C-terminale sunt identificate prin metodele prezentate. Peptidele mici se pot determina după metodele descrise.

XVIII.5.4. Determinarea structurii primare a polipeptidelor

514

cromatogramã bidimensionalã

..

..

..

. ..

.o

Hârt ie rot itã cu 90 ºiintrodusã în solventul B

Hârt ia dupã cromatografiaîn sistemul de solvent A

. .. ..... ............

Cromatografie sauelectorforeza în primulsistem de solvent (sistem de solvent A)

spot care conþine amestecul de peptide

direcþia de migrarea solventului

Page 79: Catabolismul proteinelor

Ordonarea fragmentelor peptidice. O dată obţinute cele două fragmente de peptide prin două procedee diferite de scindare a lanţului polipeptidic iniţial şi stabilită secvenţa de aminoacizi a tuturor fragmentelor, se poate deduce secvenţa completă de aminoacizi prin suprapunerea secvenţelor peptidice. Principiul este prezentat în figura XVIII.6. Evident că în multe cazuri nu se pot trage concluzii echivoce prin aplicarea acestei metode. În acest caz este necesar al treilea sau chiar al patrulea tip de hidroliză parţială a polipeptidei iniţiale pentru a se obţine suprapunerile necesare.

Figura nr. XVIII.6. Determinarea secvenţei de aminoacizi de aminoacizi din suprapunerea peptidelor

Stabilirea poziţiei legăturilor disulfurice. O dată dedusă complet secvenţa de aminoacizi a catenelor polipeptidice ale unei proteine, următorul pas este stabilirea resturilor de cisteină pereche, care formează legături disulfurice intra şi intercatenare, în caz că există. Aceasta se realizează, în general, prin fragmentarea unei probe de proteină cu legături disulfurice încă intacte, de obicei prin hidroliză parţială cu tripsină. Se izolează peptidele care conţin puntea disulfurică, legăturile lor disulfurice sunt reduse şi grupările lor sulfhidril sunt alchilate. Din fiecare fragment care conţine o legătură disulfurică derivă câte două peptide, care sunt identificate prin comparaţie cu peptidele triptice obţinute din lanţul polipeptidic iniţial redus.

Stabilirea poziţiei amidice. Gruparea amidă ale resturilor de asparagină şi glutamină sunt eliberate sub formă de amoniac în timpul

515

Page 80: Catabolismul proteinelor

hidrolizei acide sau bazice, formându-se resturile acidului aspartic şi, respectiv, glutamic. Deşi numărul moleculelor de amoniac format pe mol de proteină în timpul hidrolizei acide poate da suma resturilor de asparagină şi glutamină, poziţiile grupărilor amidă, îndeosebi în proteinele care conţin atât acizii glutamici şi aspartic cât şi amidele lor, nu pot fi deduse din fragmentele peptidice obţinute prin hidroliză acidă; acţiunea proteazelor specifice, care nu hidrolizează grupările amidă.

Secvenţa de aminoacizi a unor peptide şi proteine. Figura XVIII.7. prezintă secvenţa completă de aminoacizi a insulinei bovine, prima proteină a cărei secvenţă de aminoacizi a fost stabilită. Insulina este formată din două catene polipeptidice: catena A, cu 21 de resturi de aminoacizi şi catena B, cu 30 resturi. Cele două catene polipeptidice ale insulinei sunt legate prin două punţi disulfurice; în plus mai există şi o legătură disulfurică intracatenară. Sanger a scindat atât legăturile disulfurice inter- cât şi intracatenare şi a separat catena A de catena B. după stabilirea secvenţei de aminoacizi a fiecărei catene, el a localizat poziţiile legăturilor intra- şi intercatenare, urmând strategia prezentată mai sus.

Lucrarea lui Sanger, terminată în anul 1953, a deschis drumul pentru analiza secvenţei lanţurilor polipeptidice lungi. Curând, două grupuri de cercetare diferite au raportat secvenţa de aminoacizi din hormonul adrenocorticotrop, un hormon al hipofizei anterioare, care stimulează cortexul suprarenal (figura nr. XVIII.8.). Acest hormon este constituit dintr-un lanţ de 39 de aminoacizi, cu masa moleculară în jur de 4600. Ribonucleaza are 124 de resturi de aminoacizi, prezentate într-un singur lanţ (figura XVIII.9).

Următoarea piatră de hotar importantă, identificarea secvenţei de aminoacizi a celor două tipuri de catene ale hemoglobinei (figura nr. XVIII.10), prima analiză secvenţială a unei catene oligomere mari, a fost realizată de două grupuri, unul în Statele Unite şi altul în Germania. Hemoglobina conţine patru catene polipeptidice, două catene identice şi două catene identice (146 de resturi). Catenele şi conţin resturi de

516

Page 81: Catabolismul proteinelor

Figura XVIII.7. Secvenţa de aminoacizi ai insulinei.

517

Page 82: Catabolismul proteinelor

aminoacizi identice în multe poziţii; deci cele două catene posedă o secvenţă omologă. Singura catenă polipeptidică a mioglobinei, o proteină musculară, care conţine, de asemenea, o grupare Fe-porfirină şi se aseamănă cu hemoglobina prin capacitatea de a lega oxigen, prezintă, de asemenea, secvenţe omoloage cu catenele hemoglobinei. Semnificaţia secvenţelor omoloage ale proteinelor similare ca funcţie sau ale proteinelor omoloage cu catenele hemoglobinei. Semnificaţia secvenţelor omoloage ale proteinelor similare ca funcţie sau ale proteinelor omoloage de la diferite specii va fi discutată în altă parte. Din cele mai lungi catene polipeptidice pentru care s-au dedus până azi secvenţele complete de aminoacizi sunt cele ale alcool dehidrogenazei de cal (374 de resturi) şi ale glutamat dehidrogenazei bovine (500 de resturi).

Figura XVIII.8. Secvenţa de aminoacizi din hormonul adrenocorticotrop uman

Figura XVIII.9. Secvenţa de aminoacizi a ribonucleazei bovine.

Din analiza secvenţelor de aminoacizi ale multor proteine globulare se pot face, cu prudenţă, câteva generalizări. Până azi s-au găsit în

518

Page 83: Catabolismul proteinelor

proteinele globulare secvenţe ca ABABABABAB… sau ABCDABCDABCD… care se repetă frecvent şi neperiodic. Numai rareori, un singur aminoacid poate să apară mai mult de trei ori într-un şir, cu excepţia protaminelor care conţine secvenţa 4,5 şi 6 resturi de arginină consecutiv. De aceea în secvenţa aminoacizilor există o periodicitate destul de mică. Examinarea secvenţelor cunoscute ale proteinelor globuare arată că se întâlnesc toate sau aprope toate secvenţele scurte posibile de 2 sau 3 aminoaci, dar fără o structură periodică aparentă. Nici în ceea ce priveşte prezenţa sau poziţia legăturilor intracatenare -S-S- nu există o regularitate aparentă; unele proteine nu posedă nici o legătură de acest gen, iar altele pot avea numeroase.

Pe de altă parte, în unele proteine fibrilare, anumiţi aminoacizi apar în secvenţe periodoce. În colagen sunt preponderente resturile de glicocol, prolină şi hidroxiprolină, care se găsesc în secvenţa periodică -Gly-X-Y, unde Y este frecvent prolină sau hidroxiprolină. Aprope 80% din resturile de aminoacizi ale fibroinei din mătase sunt reprezentate de alanină, glicocol şi serină. Proteinele “anti-freeze” ale unor peşti antartici au secvenţa repetată -Ala-Ala-Thr-, cu undizaharid esterificat la restul de treonină.

XVIII.5.5. Variaţii ale secvenţei proteinelor omoloage în funcţie de specie

Corelarea informaţiilor despre secvenţele de aminoacizi în proteinele omoloage din specii diferite a arătat că unele resturi de aminoacizi din poziţii specifice ale proteinelor omoloage sunt relativ invariabile; adică sunt identice în toate speciile sau sunt înlocuie rareori. Proteinele omoloage conţin şi resturi variabile, de obicei majoritatea resturilor din lanţ, care variază mult mai mult de la o specie la alta şi în care mai mulţi aminoacizi diferiţi se pot înlocui unii pe alţii.

Secvenţele complete de aminoacizi ale insulinei izolate de la diferite specii de vertebrate nu sunt cunoscute. Aceste insuline au în mod virtual aceeaşi activitate specific hormonală şi aceeaşi masă moleculară. Catenele A a insulinei de om, porc, câine, iepure şi caşalot sunt identice şi catenele B ale insulinei izolate din vacă, porc, câine, caşalot, oaie, ţap şi cal sunt identice.

Catena B a insulinei de om este identică cu catena B a insulinei de elefant. În catena A, înlocuirea unor aminoacizi de la o specie la alta are loc de obicei în poziţiile 8, 9 şi 10, adică poziţiile dintre cele două resturi de jumătăţi de cistină care formează legătura intracatenară. Totuşi, înlocuiri s-

519

Page 84: Catabolismul proteinelor

au observat în poziţiile 4, 13, 14, 15 şi 18. Studiile ulterioare asupra secvenţei insulinei în diferite specii au arătat că, în poziţia A8, alanina, histidina şi treonina se pot înlocui unele pe altele; în A9, serina, arginina, lizina, asparagina şi glicocolul se înlocuiesc unele pe altele; şi la A10, valina, izoleucina, prolina şi treonina se înlocuiesc unele pe altele.

520


Top Related