DOSAGGIO ACIDI NUCLEICI

II00

I0 I1

SorgenteSorgente

RivelatoreRivelatore

CuvettaCuvetta contenente il contenente il

campione di proteina campione di proteina

a concentrazione Ca concentrazione Cll

Quando si fa passare una luce di una particolare lunghezza dQuando si fa passare una luce di una particolare lunghezza d’’onda onda λλ attraverso un attraverso un

percorso l di una soluzione di concentrazione definita, una cerpercorso l di una soluzione di concentrazione definita, una certa proporzione della ta proporzione della

luce luce èè assorbita dalla soluzione.assorbita dalla soluzione.

Se lSe l’’energia della luce incidente energia della luce incidente èè II00 e le l’’energia della luce trasmessa (dopo essere energia della luce trasmessa (dopo essere

passata attraverso la soluzione) passata attraverso la soluzione) èè II11, allora la frazione di luce trasmessa , allora la frazione di luce trasmessa èè II11/I/I00, ,

nota come nota come trasmittanzatrasmittanza TT..

Se T = 100%, la sostanza Se T = 100%, la sostanza èè trasparente.trasparente.

Se T = 0%, la sostanza Se T = 0%, la sostanza èè opaca ed assorbe completamente la luce. opaca ed assorbe completamente la luce.

LL’’assorbanza di una soluzione assorbanza di una soluzione èè direttamente proporzionale alla concentrazione del direttamente proporzionale alla concentrazione del

materiale assorbente quando il percorso della luce materiale assorbente quando il percorso della luce èè mantenuto costante. mantenuto costante.

A = logA = log1010(I(I00/I/I11) = ) = εεclcl

coefficiente dicoefficiente di

estinzioneestinzione

LL’’assorbanza assorbanza èè adimensionale.adimensionale.

Quando la concentrazione Quando la concentrazione èè espressa in molaritespressa in molaritàà (M) ed il percorso della luce in centimetri(M) ed il percorso della luce in centimetri

(cm), (cm), εε èè noto come noto come coefficiente di estinzione molarecoefficiente di estinzione molare (M(M--11cmcm--11)) di un dato composto.di un dato composto.

εε0.1%0.1%280nm280nm èè ll’’assorbanza a 280 assorbanza a 280 nmnm di una soluzione allo 0.1% (1 mg/ml) della sostanza in di una soluzione allo 0.1% (1 mg/ml) della sostanza in

esame (ad es. una proteina) in una esame (ad es. una proteina) in una cuvettacuvetta lunga 1 cm. lunga 1 cm.

�� La concentrazione delle proteine può essere stimata misurandoLa concentrazione delle proteine può essere stimata misurando ll’’assorbanza assorbanza

delle soluzioni contenenti le proteine a 280 delle soluzioni contenenti le proteine a 280 nmnm (UV)(UV)

�� Il metodo Il metodo èè adoperato comunemente perchadoperato comunemente perchéé non distrugge il campione ed non distrugge il campione ed èè

molto rapidomolto rapido

�� La maggior parte delle proteine ha un massimo di assorbimento aLa maggior parte delle proteine ha un massimo di assorbimento a 280 280 nmnm per per

la presenza degli amminoacidi aromatici la presenza degli amminoacidi aromatici triptofanotriptofano (W), tirosina (Y) e (W), tirosina (Y) e

fenilalaninafenilalanina (F)(F)

�� PoichPoichéé la composizione in amminoacidi delle proteine varia notla composizione in amminoacidi delle proteine varia notevolmente, evolmente,

ll’’assorbimento molare varierassorbimento molare varieràà anchanch’’esso di molto, a seconda del contenuto esso di molto, a seconda del contenuto

di questi amminoacidi di questi amminoacidi

Proteine che non contengono W, Y e F non avranno un massimo dProteine che non contengono W, Y e F non avranno un massimo di assorbimento a 280 i assorbimento a 280

nmnm, mentre proteine che contengono molti residui di W, Y e F avra, mentre proteine che contengono molti residui di W, Y e F avranno elevati valori di nno elevati valori di

assorbimento molare, con un massimo di assorbimento a 280 assorbimento molare, con un massimo di assorbimento a 280 nmnm..

Il metodo non Il metodo non èè quindi molto accurato a meno che la proteina sia pura e nquindi molto accurato a meno che la proteina sia pura e ne sia noto e sia noto

ll’’assorbimento molare.assorbimento molare.

H2N CH C

CH2

OH

O

HN

Trp (Triptofano)

H2N CH C

CH2

OH

O

OH

Tyr (Tirosina)

H2N CH C

CH2

OH

O

Phe (Fenilalanina)

Determinazione della concentrazione proteica Determinazione della concentrazione proteica

mediante spettrofotometriamediante spettrofotometria

Ass

orb

imen

toA

ssorb

imen

to

Lunghezza dLunghezza d’’onda onda ““λλ”” ((nmnm))

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

Spettro di assorbimento UVSpettro di assorbimento UV--VIS di una proteinaVIS di una proteina

Picco di assorbimento diPicco di assorbimento di

Tirosine, Tirosine,

TriptofaniTriptofani e e

FenilalanineFenilalanine

UV = 200 UV = 200 nmnm –– 350 nm350 nm

NecessitNecessitàà di utilizzare di utilizzare cuvettecuvette di quarzodi quarzo

A meno che la proteina non sia libera da altri composti che assA meno che la proteina non sia libera da altri composti che assorbono luce a orbono luce a

280 280 nmnm, i risultati saranno poco accurati, i risultati saranno poco accurati

Gli acidi nucleici sono particolarmente fastidiosi perchGli acidi nucleici sono particolarmente fastidiosi perchéé gli anelli purinici e gli anelli purinici e

pirimidinici hanno massimi di assorbimento vicini pirimidinici hanno massimi di assorbimento vicini a 260 a 260 nmnm, con un , con un

assorbimento considerevole che si estende fino a 280 assorbimento considerevole che si estende fino a 280 nmnm

Se gli acidi nucleici sono gli unici contaminanti, la concentraSe gli acidi nucleici sono gli unici contaminanti, la concentrazione zione

della proteina può essere stimata adoperando una formula della proteina può essere stimata adoperando una formula che che

corregge ragionevolmente bene per il contenuto in acidi nuclecorregge ragionevolmente bene per il contenuto in acidi nucleici: ici:

[proteina] (mg/ml) = 1,55 A[proteina] (mg/ml) = 1,55 A280280 –– 0,76 A0,76 A260260

�� Non Non èè distruttivodistruttivo

�� Consente misure in continuo, ad esempio su un eluente di una coConsente misure in continuo, ad esempio su un eluente di una colonna lonna

cromatograficacromatografica

�� Il limite di sensibilitIl limite di sensibilitàà può essere aumentato in maniera significativa può essere aumentato in maniera significativa

misurando i massimi di assorbimento a lunghezza dmisurando i massimi di assorbimento a lunghezza d’’onda comprese traonda comprese tra

190 e 220 190 e 220 nmnm

Il reattivo del Il reattivo del biuretobiureto èè costituito da una soluzione di solfato di rame costituito da una soluzione di solfato di rame

alcalino contenente potassio tartrato di sodioalcalino contenente potassio tartrato di sodio

In condizioni alcaline gli ioni rameici CuIn condizioni alcaline gli ioni rameici Cu2+2+ formano un complesso formano un complesso

di coordinazione con quattro gruppi di coordinazione con quattro gruppi ––NH presenti in altrettanti NH presenti in altrettanti

legami peptidicilegami peptidici

Il complesso che si forma assorbe luce nel visibile, conIl complesso che si forma assorbe luce nel visibile, con un picco a un picco a

550 550 nmnm

N

CU+2

NR

O

N

N R

O

CuCu2+2+

Scarsa sensibilitScarsa sensibilitàà: il metodo non si dimostra infatti adatto alla determinazione : il metodo non si dimostra infatti adatto alla determinazione

di concentrazioni inferiori ad 1 mg/mldi concentrazioni inferiori ad 1 mg/ml

Interferenza da parte dei sali ammonici: inutilizzabile su Interferenza da parte dei sali ammonici: inutilizzabile su campioni proteici campioni proteici

ottenuti per precipitazione con ammonio solfato peottenuti per precipitazione con ammonio solfato perchrchéé questi campioni questi campioni

contengono alte concentrazioni di ammonio contengono alte concentrazioni di ammonio

Essendo basato sullEssendo basato sull’’interazione degli ioni rameici con i legami peptidici, il metodointerazione degli ioni rameici con i legami peptidici, il metodo

èè universabileuniversabile e molto riproducibile e molto riproducibile

Consiste nella reazione del Consiste nella reazione del biuretobiureto, seguita dalla riduzione in condizioni alcaline , seguita dalla riduzione in condizioni alcaline

del reagente di Folindel reagente di Folin--Ciocalteu (acidi misti di Ciocalteu (acidi misti di fosfomolibdotungstatofosfomolibdotungstato))

Gli ioni di rame facilitano il processo di riduzioneGli ioni di rame facilitano il processo di riduzione

I gruppi cromogeni principali sono i legami peptidici coI gruppi cromogeni principali sono i legami peptidici complessati con rame mplessati con rame

((biuretobiureto) ed i ) ed i molibdotungstatimolibdotungstati ridotti blu, che sono ridotti in gran parte da ridotti blu, che sono ridotti in gran parte da

tirosina, triptofano ed amminoacidi polaritirosina, triptofano ed amminoacidi polari

Il prodotto della reazione, Il prodotto della reazione, eteropolimolibdenoeteropolimolibdeno, ha una forte colorazione blu, , ha una forte colorazione blu,

con un massimo di assorbimento a circa 750 con un massimo di assorbimento a circa 750 nmnm

Poco costosoPoco costoso

Di facile esecuzioneDi facile esecuzione

Altamente riproducibileAltamente riproducibile

Molto sensibile: Molto sensibile: èè possibile determinare concentrazioni fino a 10 possibile determinare concentrazioni fino a 10 µµg/mlg/ml

EE’’ soggetto ad interferenze da parte di una varietsoggetto ad interferenze da parte di una varietàà di sostanze, quali Tris, di sostanze, quali Tris,

HEPES ed EDTAHEPES ed EDTA

Le curve Le curve standardstandard sono lineari solo a basse concentrazioni proteichesono lineari solo a basse concentrazioni proteiche

Sono necessari tempi di incubazione precisi per ottenere dati riSono necessari tempi di incubazione precisi per ottenere dati riproducibiliproducibili

La reazione dipende dal pH ed La reazione dipende dal pH ed èè necessario avere un pH compreso tra 10 necessario avere un pH compreso tra 10

e 10.5 e 10.5

Recentemente sono stati introdotti un certo numeroRecentemente sono stati introdotti un certo numero

di reagenti alternativi per la determinazionedi reagenti alternativi per la determinazione

degli ioni rameici, i quali consentono di effettuaredegli ioni rameici, i quali consentono di effettuare

un saggio un saggio pipiùù conveniente e riproducibileconveniente e riproducibile ……

La reazione del BCA (acido La reazione del BCA (acido bicinconinicobicinconinico) ) èè simile a quella del reattivo simile a quella del reattivo

di di LowryLowry

CuCu+2+2 èè ridotto a Curidotto a Cu+1+1 dalle molecole proteiche in soluzione alcalinadalle molecole proteiche in soluzione alcalina

Due molecole di BCA Due molecole di BCA chelanochelano uno ione rameoso (Cuuno ione rameoso (Cu+1+1))

Tale evento determina la formazione di un intenso colore violetTale evento determina la formazione di un intenso colore violetto con to con

un massimo di assorbimento a 562 un massimo di assorbimento a 562 nmnm

N- OOC

N- OOC

Cu+1Cu+1 2BCA+

N COO-

N COO-

Cu+1

OH-

Proteina + Cu+2

SensibilitSensibilitàà simile a quella del metodo di simile a quella del metodo di LowryLowry (10 (10 µµg/ml)g/ml)

RidottaRidotta suscettibilitsuscettibilitàà allaalla presenzapresenza didi detergentidetergenti

DopoDopo unun’’incubazioneincubazione didi 30 30 minutiminuti a 37a 37°°C C ilil colorecolore èè sufficientementesufficientemente stabilestabile

per per misurazionimisurazioni attendibiliattendibili ((spostamentospostamento del 2,5% in 10 del 2,5% in 10 minutiminuti))

Il colore continua a svilupparsi lentamente nel tempoIl colore continua a svilupparsi lentamente nel tempo

InterferenzaInterferenza dada parte parte didi carboidraticarboidrati

EccoEcco un un elencoelenco didi unauna parte parte delledelle sostanzesostanze cheche interferisconointerferiscono con con

ilil metodometodo BCA: BCA: catecolaminecatecolamine, , triptofanotriptofano, , lipidilipidi, , rossorosso fenolofenolo, , cisteinacisteina,,

tirosinatirosina, , saccarosiosaccarosio, , glicerologlicerolo non non puropuro, H, H22OO22, , acidoacido uricourico e e ferroferro. .

Il legame del colorante Il legame del colorante CoomassieCoomassie BrilliantBrilliant BlueBlue GG--250 alle proteine 250 alle proteine

determina uno spostamento del massimo di assorbimento del cdetermina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante olorante

da 465 da 465 nmnm (rosso) a 595 (rosso) a 595 nmnm (blu) in soluzioni acide ((blu) in soluzioni acide (BradfordBradford, 1976), 1976)

Tale colorante forma forti complessi non covalenti con leTale colorante forma forti complessi non covalenti con le proteine proteine

tramite interazioni elettrostatiche con gruppi tramite interazioni elettrostatiche con gruppi aminiciaminici e carbossilici e e carbossilici e

tramite forze di tramite forze di vanvan derder WaalsWaals

Il colorante Il colorante èè preparato come soluzione preparato come soluzione stockstock in acido fosforicoin acido fosforico

Il metodo Il metodo èè un semplice procedimento costituito da un unico passaggio un semplice procedimento costituito da un unico passaggio

in cui il colorante in cui il colorante èè aggiunto ai campioni e si determina laggiunto ai campioni e si determina l’’assorbanza a assorbanza a

595 595 nmnm

N+

N

Coomassie Brilliant Blu R

HN

OCH2CH3

SO3Na

SO3Na

La quantitLa quantitàà di colorante che si lega di colorante che si lega èè proporzionale alla quantitproporzionale alla quantitàà di proteina di proteina

presente in soluzione.presente in soluzione.

Pertanto lPertanto l’’intensitintensitàà del colore blu (e dunque ldel colore blu (e dunque l’’assorbimento) assorbimento) èè proporzionaleproporzionale

alla concentrazione proteica.alla concentrazione proteica.

In genere quantitIn genere quantitàà uguali di proteine differenti legano la stessa quantituguali di proteine differenti legano la stessa quantitàà di di

colorante colorante →→ il saggio il saggio èè indipendente dal tipo di proteinaindipendente dal tipo di proteina

1 mg/ml1 mg/ml 2 mg/ml2 mg/ml 4 mg/ml4 mg/ml 8 mg/ml8 mg/ml 16 mg/ml16 mg/ml

X mg/mlX mg/ml

PoichPoichéé ll’’intensitintensitàà della colorazione non della colorazione non èè lineare in una vasta gamma di lineare in una vasta gamma di

concentrazioni di proteine, si raccomanda fortemente di preparaconcentrazioni di proteine, si raccomanda fortemente di preparare una re una

curva curva standardstandard per ogni saggio. per ogni saggio.

µµµµµµµµg di proteinag di proteina

Inte

nsi

tIn

ten

sit àà

del

colo

re b

lud

el c

olo

re b

lu

Ass

orb

an

zaA

ssorb

an

zaa 5

95

a 5

95 n

mn

m

1 2 4 8 16

�� SemplicitSemplicitàà di preparazione del reattivodi preparazione del reattivo

�� SviluppoSviluppo del del colorecolore immediatoimmediato

�� StabilitStabilitàà del del complessocomplesso

�� ElevataElevata sensibilitsensibilitàà ((finofino a 22 a 22 µµg/ml)g/ml)

�� Il Il saggiosaggio èè compatibilecompatibile con la con la maggiormaggior parte parte deidei tamponitamponi comunicomuni,,

deglidegli agentiagenti denaturantidenaturanti come come guanidinaguanidina··HClHCl 6M e urea 8 M e 6M e urea 8 M e deidei

preservantipreservanti come come sodiosodio azideazide

�� Il reagente colora le Il reagente colora le cuvettecuvette ed ed èè piuttosto difficile da rimuoverepiuttosto difficile da rimuovere

�� La La quantitquantitàà didi colorantecolorante cheche sisi legalega allaalla proteinaproteina dipendedipende daldal

contenutocontenuto in in aminoacidiaminoacidi basicibasici →→ ciòciò renderende difficiledifficile la la sceltascelta didi

unouno standardstandard

�� MolteMolte proteineproteine non non sonosono solubilisolubili nellanella miscelamiscela didi reazionereazione acidaacida

Kjeldahl Method --- Nitrogen Determination

(1) Digestion

+ conc. H2SO4

+ a catalyst

nitrogen converted into an ammonium ion.

(2) Neutralize to get NH3 with NaOH

(3) Steam distillation of NH3 and trap in boric acid.

(4) Titrate with hydrochloric acid.

Calculation:

Gram nitrogen/ gram of sample =

*(ml of sample - ml of blank) × N standard acid × 0.014g/meq

weight of sample

* ml of hydrochloric acid required to titrate sample solution.

Disadvantages: not all N is protein.

Purine

Pyrimidine DNA, RNA, etc.

Urea

Many plant tissues have > 50% non-protein N.

% N × 6.25 = % Protein