11

DNR DNR sekoskaita sekoskaita

(sekvenavimas)(sekvenavimas)

J.J.WatsonWatson ir F. ir F. Crick Crick –– DNR struktūros modelisDNR struktūros modelis

1953 m. 1953 m.

�� DNR sekos ir jos funkcijų nustatymas DNR sekos ir jos funkcijų nustatymas ––

vienas svarbiausių molekulin÷s biologijos tikslųvienas svarbiausių molekulin÷s biologijos tikslų

22

Chemin÷s degradacijos (Chemin÷s degradacijos (MaxamMaxam –– GilbertGilbert)) metodasmetodas

DimetylDimetyl sulfate sulfate PiperidinePiperidine formate formate Hydrazine Hydrazine + Hydrazine Hydrazine + NaClNaCl

Chemin÷s degradacijos (Chemin÷s degradacijos (MaxamMaxam –– GilbertGilbert) metodas) metodas

+ + Piperidine Piperidine (90(90 °C°C))

33

Chemin÷s degradacijos (Chemin÷s degradacijos (MaxamMaxam –– GilbertGilbert) metodas) metodas

Chemin÷s degradacijos (Chemin÷s degradacijos (MaxamMaxam –– GilbertGilbert)) metodasmetodas

Metodo trūkumaiMetodo trūkumai

�� Nuskaitoma trumpa sekaNuskaitoma trumpa seka

�� Reakcijos l÷tos ir mažiau Reakcijos l÷tos ir mažiau

patikimospatikimos

�� Naudojamos pavojingos Naudojamos pavojingos

chemin÷s medžiagos chemin÷s medžiagos

Grandin÷s terminacijos (Sanger Grandin÷s terminacijos (Sanger DideoxyDideoxy) metodas ) metodas

-- dNTPdNTP irir ddNTPddNTP

44

Grandin÷s terminacijos (Sanger Grandin÷s terminacijos (Sanger DideoxyDideoxy) metodas) metodas

Sekvenavimo reakcijos komponentaiSekvenavimo reakcijos komponentai ::

�� DNRDNR

�� PradmuoPradmuo**

�� DNR DNR polimepolimerrazaz÷÷

�� dNTPdNTP ir ir ddNTPddNTP**

�� buferisbuferis

DNR DNR ciklinis sekvenavimas ciklinis sekvenavimas -- linijinlinijin÷ amplifikacija÷ amplifikacija

55

DNR DNR elektroforez÷s sistemaelektroforez÷s sistema

66

SkSkeenavimonavimo irir detekcijosdetekcijos sistemasistema

SkSkeenavimonavimo irir detekcijosdetekcijos sistemasistema

MomentinisMomentinis DNR fragmentDNR fragmentų detekcijos vaizdasų detekcijos vaizdas

77

DNR sekvenavimo rezultatas DNR sekvenavimo rezultatas -- elektroferogramaelektroferograma

PvzPvz. X . X –– genogeno sekvenavimassekvenavimas

SC sekvenatorius ABI Prism 377SC sekvenatorius ABI Prism 377

�� iki 96 m÷ginių vienu metuiki 96 m÷ginių vienu metu

�� 7070 tūkst. tūkst. bpbp per dienąper dieną

DNR

Elektroforez÷

Detekcija

Analiz÷

88

Kapiliariniai DNR analizatoriaiKapiliariniai DNR analizatoriai

�� 9696––384 m÷ginių analiz÷ vienu metu384 m÷ginių analiz÷ vienu metu

�� iki 2,8 mln bazių porų (iki 2,8 mln bazių porų (bpbp) per dieną) per dieną((19731973--1974 m. 1974 m. nustatytinustatyti 2020 bpbp sekseką reik÷jo 2 metų)ą reik÷jo 2 metų)

Sekvenavimas Sekvenavimas –– rankinis rankinis vsvs. automatinis. automatinis

DNR DNR mikrogardel÷smikrogardel÷s ( DNA ( DNA microarraysmicroarrays / DNA / DNA chipschips ))

�� 2x2 cm stiklelyje 102x2 cm stiklelyje 10--15 15

tūkst. 0,1 mm lašų su tūkst. 0,1 mm lašų su

žinomos sekos DNR žinomos sekos DNR

molekul÷mis (pvz. genais)molekul÷mis (pvz. genais)

�� ant jų dedama tiriamosios ant jų dedama tiriamosios

viengrand÷sviengrand÷s žym÷tos DNRžym÷tos DNR

�� Vyksta Vyksta komplementariųkomplementarių

sekų hibridizacijasekų hibridizacija

�� Kuo sekos labiau atitinka, Kuo sekos labiau atitinka,

tuo stipresnis hibridas ir tuo stipresnis hibridas ir

ryškesn÷ d÷mel÷ryškesn÷ d÷mel÷

�� Emisijos kiekybinis Emisijos kiekybinis

įvertinimas ir rezultatų įvertinimas ir rezultatų

analiz÷ atliekama PC su analiz÷ atliekama PC su

spec. programine įrangaspec. programine įranga

�� Genų raiškos (Genų raiškos (expressionexpression), ),

genomų giminingumų genomų giminingumų

tyrimas ir t.t.tyrimas ir t.t.

99

1010

PGR PGR -- eksponentineksponentin÷ amplifikacija÷ amplifikacija

PPGGR R produktproduktų patikrinimasų patikrinimas

GenGenų inžinerijos pvz.ų inžinerijos pvz.

�� Plazmid÷ (žiedin÷ DNR) izoliuojama iš Plazmid÷ (žiedin÷ DNR) izoliuojama iš bakterijosbakterijos

�� Fermentas (Fermentas (restriktaz÷restriktaz÷) kerpa DNR ) kerpa DNR specifin÷se vietosespecifin÷se vietose

�� Baltymą koduojantis genas iš kitos Baltymą koduojantis genas iš kitos ląstel÷s kerpamas tuo pačiu fermentuląstel÷s kerpamas tuo pačiu fermentu

�� Genas įstatomas į plazmidę, kur šis Genas įstatomas į plazmidę, kur šis tiksliai tinka tiksliai tinka –– tai tai rekombinantin÷rekombinantin÷ DNRDNR

�� Rekombinantin÷Rekombinantin÷ plazmid÷ įterpiama į plazmid÷ įterpiama į bakterijąbakteriją

�� Bakterija dalijasi ir replikuoja Bakterija dalijasi ir replikuoja ––kopijuoja save ir kopijuoja save ir rekombinantinęrekombinantinę DNRDNR

�� Naujasis genas nurodo bakterijai Naujasis genas nurodo bakterijai gaminti naują baltymą (pvz. gaminti naują baltymą (pvz. interferoną)interferoną)