dissertao andreza maria ribeiro

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Universidade do Porto Faculdade de Farmácia Mestrado em Tecnologia Farmacêutica PREPARAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO DE COMPLEXOS DE INCLUSÃO DE MICONAZOL COM METIL-β-CICLODEXTRINA: ADMINISTRAÇÃO BUCAL Andreza Maria Ribeiro Porto 2008

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Page 1: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Universidade do Porto Faculdade de Farmácia

Mestrado em Tecnologia Farmacêutica

PREPARAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO DE COMPLEXOS DE

INCLUSÃO DE MICONAZOL COM METIL-β-CICLODEXTRINA: ADMINISTRAÇÃO

BUCAL

Andreza Maria Ribeiro

Porto 2008

Page 2: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Andreza Maria Ribeiro

PREPARAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO DE COMPLEXOS DE

INCLUSÃO DE MICONAZOL COM METIL-β-CICLODEXTRINA: ADMINISTRAÇÃO

BUCAL

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Tecnologia Farmacêutica, sob orientação do Prof. Dr. Delfim Fernando Gonçalves dos Santos e co-orientação do Prof. Dr. Francisco Veiga.

Porto 2008

Page 3: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Aos meus pais, Jorge e Inês, por possibilitarem a realização de todos meus sonhos, pelo amor e apoio. As minhas irmãs Emileine e Georgia, e ao meu sobrinho Leonardo a meus grandes amigos, por todas as risadas, pelo carinho e pela paciência. Dedico.

Page 4: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

AGRADECIMENTOS

Agradeço à Deus pela presença constante; Ao Prof. Dr. Delfim Fernando Gonçalves Santos pelos conhecimentos, dedicação e amizade, transmitidos durante toda orientação deste trabalho; Ao Prof. Dr. Francisco Veiga, pela possível realização deste trabalho, pela sua orientação e exemplo profissional, pela confiança sempre depositada em mim, amizade e agradável convivência; Ao Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra por toda a estrutura que possibilitou a realização desse trabalho; Ao programa de pós-graduação do Curso de Mestrado em Tecnologia Farmacêutica em especial a Prof.ª Dr.ª Fernanda Bahia, prezada coordenadora, pela oportunidade proporcionada viabilizando este trabalho de pesquisa; Às amigas do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra, Rita, Claudia, Jucimara, Alexandra e Felipe, entre outros, em especial e com muito carinho a Camile e a Cristina por momentos de distracção entre um experimento e outro, pela amizade e orientações; À Rita Figueiras, com muito carinho, por toda a sua ajuda desde o início deste trabalho científico, pela amizade e sua sempre disposição à orientação; A Janssen Pharmaceutica (Beerse-Bélgica), pelo fornecimento do Miconazol e a Roquettte (Lestrem, France) pelas ciclodextrinas; A Profª. Dr.ª Maria Teresa Vieira do Instituto Pedro Nunes (IPN) pela assistência técnica para realização das técnicas de RX e SEM; Aos professores do mestrado em Tecnologia Farmacêutica da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto em especial a Profª. Drª Maria Helena Amaral pela sua sempre disposição e carinho; Aos meus queridos avós, meus tios e primos, que formam minha amada família, por todo carinho e apoio; Às minhas amigas de graduação pelos momentos mais felizes da faculdade, e a todos meus amigos pelos óptimos finais de semana; Aos meus amigos Eloiso e Lilian pelo apoio, confiança e carinho para que este sonho fosse realizado; A todos que directa ou indirectamente colaboraram na execução deste trabalho.

Page 5: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

SUMÁRIO

Agradecimentos iv

Resumo vi

Abstract ix

Abreviaturas xii

Índice de Figuras xiii

Índice de Tabelas xv

Índice Geral xvi

Page 6: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

RESUMO

As substâncias activas, na sua maioria, não possuem solubilidade suficiente

em água e as formulações tradicionais para fármacos insolúveis envolvem uma

combinação de solventes orgânicos, tensioactivos, e condições extremas de pH, que

frequentemente podem causar irritações ou outras reacções adversas. Sabe-se que

um fármaco tem que ter um determinado nível de solubilidade em água para ser

prontamente libertado na membrana celular, mas necessita ser bastante hidrofóbico

para atravessar a membrana.

Uma das propriedades das ciclodextrinas é a sua capacidade de promover a

libertação dos fármacos através das membranas biológicas. As moléculas de

ciclodextrinas são relativamente grandes e com uma superfície exterior hidratada. Em

condições normais as moléculas de ciclodextrinas permeiam as membranas biológicas

com considerável dificuldade.

As ciclodextrinas têm sido utilizadas em formulações semi-sólidas para

aumentar a solubilidade e a estabilidade das substâncias em água, bem como

promover a libertação de fármacos em membranas biológicas.

As membranas biológicas por serem relativamente lipofílicas, apresentam uma

baixa afinidade para as moléculas de ciclodextrinas hidrofílicas e, consequentemente

estas tendem a permanecer sob a membrana, por exemplo, em bases aquosas (tais

como cremes ou geles hidrófilos) saliva ou fluido lacrimal. Os promotores de

permeação convencionais, tais como os álcoois e os ácidos gordos, desorganizam as

camadas lipídicas da barreira biológica. As ciclodextrinas, por outro lado, agem como

promotores de absorção aumentando a disponibilidade do fármaco na superfície da

barreira biológica.

As leveduras são fungos oportunistas responsáveis pela maior parte das

infecções fúngicas nos seres humanos. A Candida albicans é considerada uma das

leveduras mais patogénicas para o ser humano, causando um grande número de

Page 7: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

infecções oportunistas. A candidiase oral é muito comum em pessoas idosas que

normalmente usam próteses dentárias e em imunodeprimidos. Os agentes

antifúngicos imidazólicos, como o Miconazol (MCZ) são usados nesta terapêutica, e

são activos contra todos os fungos causadores de infecções superficiais de pele e

mucosas. A acção principal de um fármaco imidazólico é localizada ao nível de

membrana celular. A via citocromo P-450, dependente de C14 lanosterol dimetilase, é

inibida, e esta é a responsável pela produção de ergosterol que é um componente

necessário á constituição da parede celular do fungo. A maioria das micoses

superficiais mucocutâneas pode ser tratada com medicamentos tópicos.

Numa primeira parte do trabalho, o objectivo foi complexar o antifúngico,

miconazol, que é insolúvel em água, com uma ciclodextrina modificada, Metil-β-

ciclodextrina (MBCD), e caracterizar os complexos obtidos.

Numa segunda parte, foi desenvolvida uma formulação semi-sólida hidrófila

com uma maior adesividade, usando como promotor de libertação, uma ciclodextrina,

A formulação final destina-se ao tratamento da candidiase oral, facilitando a

administração desse medicamento em pessoas utilizam proteses dentárias. Desta

forma avaliou-se a inclusão do MCZ na β-ciclodextrina modificada, as características

reológicas do gel e a difusão do fármaco bem como a influência da ciclodextrina como

promotora de absorção

Os complexos de inclusão no estado líquido foram preparados pelo método de

solubilidade de fases, segundo Higuchi & Connors, (1965). A estequiometria obtida

para o complexo de inclusão formados em solução foi de 1:1 e 1:2 e as constantes de

estabilidade calculadas foram de 124,84 M-1 e 11,47 M-1, demonstrando uma

adequada associação do fármaco com a ciclodextrina escolhida, tornando-se possível

promover a solubilização em água do MCZ pela inclusão na cavidade da ciclodextrina

seleccionada. As técnicas de malaxagem, co-evaporação, atomização e liofilização

foram utilizadas para a obtenção dos complexos sólidos e as técnicas de calorimetria

Page 8: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

diferencial de varrimento (DSC), difração de Raio-X (RX), microscopia electrónica de

varrimento e o espectroscopia de infravermelho, permitiram a caracterização físico-

química dos complexos formados por inclusão do MCZ em MBCD.

A cedência de formulações tópicas ou libertação in vitro pode ser determinada

por estudos em células de difusão equipadas com membranas sintéticas. O teste é

recomendado pela agência americana, Food and Drug Administration (FDA), para

determinação de equivalência entre duas formulações após mudanças específicas,

como fornecedor e equipamentos. A sua aplicação na determinação de uniformidade

entre lotes e no desenvolvimento de formulações também é amplamente aceite.

A quantidade de fármaco presente nas camadas da mucosa dependerá da

eficiência relativa dos processos de libertação do fármaco da formulação semi-sólida

que o contém e de penetração da substância activa.

A difusão do MCZ da formulação desenvolvida e de uma formulação existente

no mercado foi avaliada in vitro, utilizando células de difusão de Franz modificadas.

Dos resultados obtidos, é possível concluir que o hidrogele formulado com o

complexo MCZ/MβCD, através do método de liofilização, garante uma quantidade

semelhante de MCZ disponível no local de acção, quando comparado com a

formulação disponível no mercado Português.

Page 9: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

ABSTRACT

Most drugs do not have sufficient solubility in water and the traditional

formulations for insoluble drugs involve a combination of organic solvents, surfactants,

and extreme conditions of pH, which often can cause irritation or other adverse

reactions. It is known that a drug needs to have a certain level of solubility in water to

be promptly released in the cell membrane and yet hydrophobic enough to cross the

membrane.

One of the most interesting properties of the cyclodextrins is their ability to

promote the release of drugs through biological membranes. The molecules of

cyclodextrins are relatively large and with an outer surface hydrated. Hence, under

normal conditions the molecules of cyclodextrins permeate the biological membranes

with considerable difficulty.

The lipophilic membrane has a relatively low affinity for the molecules of

hydrophilic cyclodextrins and therefore they are outside the membrane, for example, in

aqueous bases (such as creams or gels hydrophilics) saliva or fluid tear. Promoters of

conventional penetration, such as alcohols and fatty acids, disrupt the lipid layers of

biological barrier.

The cyclodextrins, on the other hand, act as promoters to the absorption, by

increasing the availability of the drug on the surface of the biological barrier. The

cyclodextrins have been used in semi-solid formulations to increase the solubility and

stability of the substances in water, as well as promote the release of drugs through

biological membranes.

The yeasts are opportunistic fungi responsible for most of fungal infections in

humans. A Candida albicans is considered one of the most pathogenic yeasts to

humans, causing a large number of opportunistic infections.

Page 10: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

The oral candidiase is very common in elderly people who often use dental

prostheses and in immuno-compromised. The imidazolic antifungal agents such as

Miconazole (MCZ) are active against all fungi that cause infections of the skin and

mucosal surface. The main action of these imidazolic agents is located at the cell

membrane. Route cytochrome P-450, dependent on C14 lanosterol dimetilase is

inhibited, and this is responsible for the production of ergostero, an essential

component of the fungus cell wall. Most mycoses mucocutaneous surface can be

treated with topical medications.

In the first part of the present work, the water insoluble and antifungal drug,

miconazole was complex with a modified cyclodextrin; methyl-β-cyclodextrin (MBCD),

followed by the characterisation ofthe attained complex.

In the second part, a hydrophilic semi-solid formulation with a greater

adhesiveness was prepared, which incorporated the cyclodextrin as promoter.

This formulation was intended for the treatment of oral candidiase, facilitating

the administration of the miconazole to people who make use of dental prostheses.

Thus evaluate the inclusion of MCZ in β-cyclodextrin modified to methyl-β-cyclodextrin

(MBCD), the rheological characteristics of the gel and the spread of the drug as well as

the influence of cyclodextrin as a promoter of absorption

The complexes of inclusion of MCZ in cyclodextrins were prepared by the

method of solubility of phases, according Higuchi & Connors, (1965). The stechiometry

obtained for the complex was 1:1 and 1:2 and stability constant was calculated from

124.84 M-1 and 11.47 M-1, demonstrating an appropriate combination of the drug with

the chosen cyclodextrin, allowing the water solubilization of the MCZ.

The techniques of kneaded, co-evaporation, atomization and lyophilization were used

to produce the complex solid and the techniques of differential scanning calorimetry

(DSC), the X-ray diffraction (RX), and scanning electron microscopy (SEM) and fourier

transform infrared spectroscopy (FITR), allowed the characterization physic chemistry

of the inclusion complex MCZ / MBCD formed.

Page 11: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

The drug release from topical formulations or in vitro release can be determined

through studies in diffusion cells equipped with synthetic membranes. The test is

recommended by the American agency, Food and Drug Administration (FDA) for the

determination of the equivalence between two formulations after specific changes, Its

application in the determination of the uniformity between lots and in the development

of formulations is also widely accepted.

The total amount of drug present in the mucosa layers depends on the

efficiency with which the drug is released from the semi-solid formulation and of the

penetration of the active substance.

The aim of the in vitro evaluation here used was to evaluate the MCZ diffusion

from both formulations, optimized and commercially available, using modified Franz

cells.

The results obtained with this technique showed that the gel formulated with the

complex MCZ/MβCD by lyophilisation demonstrated a similar amount of available MCZ

at the target site, when compared to the commercially available formulation, containing

the non-complexed MCZ.

Page 12: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

ABREVIATURAS

Lista de Abreviaturas e Siglas Carb – Carbopol

CD – Ciclodextrina

CDs – Ciclodextrinas

CGTase – Ciclodextrina-α-glicosiltransferase

COE – Co-evaporado

DIMEB – Dimetil-β-ciclodextrina

DSC – Calorimetria Diferencial de Varrimento

EHL – Equilíbrio hidrófilo/lipófilo

FDA - Food and Drug Administration

FTIR - Espectroscopia de Infravermelho com transformadas de Fourier (“Fourier

transform infrared spectroscopy”)

HIV – Vírus da imunodeficiência

HPβCD - Hidroxipropil-β-ciclodextrina

KS – Constante de estabilidade

LF – Liofilização

MCZ – Miconazol

MLX – Malaxagem

MβCD - Metl-β-ciclodextrina

P407 – Polaxamero 407, (Pluronic F127®)

PBS – Tampão fosfato/salina

RDC – Grau relativo de cristalinidade

RMβCD - Randomil-β-ciclodextrina

RX – Difracção de Raio-X

SBEβCD – Sulfobutileter-β-ciclodextrina

SEM - Microscopia electrónica de varrimento (“scanning electron microscopy”)

SIDA – Síndrome da imunodeficiência adquirida

SP – Secagem por pulverização

TRIMEB –Trimetil-β-ciclodextrina

USP - United States Pharmacopoeia

Page 13: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

INDICE DE FIGURAS

Figura 01 Possíveis mecanismos através dos quais a quimioterapia agrava a candidiase

oral.

19

Figura 02 Factores locais de risco no desenvolvimento de candidiase orofaringea. 21

Figura 03 Factores sistémicos de risco no desenvolvimento de candidiase orofaringea. 21

Figura 04 Estrutura do Miconazol. 25

Figura 05 Início do artigo de Villier em Comptes Rendus da Academia de Ciências de

1891.

29

Figura 06 A capa do livro de Friedrich Cramer “Einschlussverbindungen” (compostos de

inclusão), publicado em Berlim em 1954, onde são descritos vários tipos de

compostos que podem formar complexos de inclusão, incluindo ciclodextrinas.

30

Figura 07 A primeira página das duas primeiras patentes de ciclodextrinas intitulada “

Métodos para preparação de compostos de inclusão de compostos orgânicos

fisiologicamente activos”. As patentes foram submetidas a 5 de Novembro de

1953 na Alemanha por Karl Freudenberg Friedrich Cramer and Hans Plieninger.

31

Figura 08 Estrutura química da β-Cyclodextrina. 33

Figura 09 Estrutura geral da ciclodextrinas. Os derivados alfa, beta e gama são definidos

por n - 1, 2 e 3, respectivamente.

37

Figura 10 Representação esquemática da estrutura tridimensional das CDs, mostrando as

características estruturais definidas pelo arranjo das unidades de glicose.

37

Figura 11 Diferentes dimensões da α-Cyclodextrina, β-Cyclodestrina e γ-Cyclodextrina. 38

Figura 12 Complexo de inclusão fármaco-α-ciclodextrina. 46

Figura 13 Representação esquemática da formação do complexo de inclusão. O ácido

salicílico é a molécula hóspede.

49

Figura 14 Permeação do fármaco através da membrana biológica em veículo aquoso da

ciclodextrina (C – Ciclodextrina; D – Fármaco).

59

Figura 15 Representação do Diagramas de Fases. 70

Figura 16 Modelos cinéticos que se estabelecem durante a formação, em solução, de

complexos de inclusão. S0 e Sc correspondem respectivamente a solubilidade

da molécula hóspede na ausência de CD e o limite de solubilidade do complexo

formado. Kc representa a constante de estabilidade do complexo formado.

71

Figura 17 Eficiência de complexação de um complexo fármaco-CD de estequiométrica

1:1.

72

Figura 18 Diagrama de solubilidade de fases do sistema MβC/MCZ em água destilada. 77

Figura 19 Diagrama de solubilidade de fases do sistema HPβCD/MCZ em água destilada. 78

Figura 20 Microscopia electrónica de varrimento: (a) MCZ; (b) MβCD; (c) MF; (d) MLX; (e)

COE; (f) SP e (g) LF.

92

Figura 21 Termograma de DSC: (a) MCZ; (b) MβCD; (c) MF; (d) MLX; (e) COE; (f) SP e

(g) LF.

94

Page 14: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

14

Figura 22 Perfil do espectro de FTIR do Miconazol. 98

Figura 23 Perfil dos espectros de FTIR da (a) MβCD, (b) MF; (c) MLX; (d) COE; (e) SP e

(f) LF.

99

Figura 24 Difractogramas de raio X: (a) MCZ; (b) MβCD; (c) MF; (d) MLX; (e) COE; (f) SP

e (g) LF.

100

Figura 25 Solubilidade aquosa do MCZ. 103

Figura 26 Solubilidade do MCZ em PBS 6.8. 103

Figura 27 Termograma de DSC dos polímeros (a) Carbopol; (b) Pluronic; (c)

Carb0,5%Plur20%; (d) Carb1%Plur20% e (e) Carb1,5%Plur20%.

119

Figura 28 Termograma de DSC dos polímeros (a) Liofilizado; (b) Carb1%Plur20% e (e)

Mistura Carb1,0%Plur20% e Complexo Liofilizado.

120

Figura 29 Gráfico da reologia dos hidrogéis de (a) Carbopol 1%; (b) Pluronic 20%; (c)

Pluronic 20%:Carbopol 0,5% e (d) Pluronic 20%:Carbopol 1,0%.

121

Figura 30 Viscosidade do Hidrogele de Carbopol 1%. 122

Figura 31 Viscosidade do Hidrogele de Pluronic 20%. 122

Figura 32 Viscosidade do Hidrogele de Pluronic 20%:Carbopol 0,5%. 123

Figura 33 Viscosidade do Hidrogele de Pluronic 20%:Carbopol 1%. 123

Figura 34 Gráfico da firmeza dos hidrogeles base a 25 ±2ºC. 126

Figura 35 Gráfico da adesividade dos hidrogeles base a 25 ±2ºC. 126

Figura 36 Gráfico da firmeza dos hidrogeles base a 37 ±2ºC. 127

Figura 37 Gráfico da adesividade dos hidrogeles base a 37 ±2ºC. 127

Figura 38 Gráfico da firmeza dos hidrogeles a 25 ±2ºC. 129

Figura 39 Gráfico da adesividade dos hidrogeles a 25 ±2ºC. 129

Figura 40 Gráfico da firmeza dos hidrogeles a 37 ±2ºC. 130

Figura 41 Gráfico da adesividade dos hidrogeles a 37 ±2ºC. 130

Figura 42 Aspectos dos hidrogeles. 131

Figura 43 (A)Ilustração esquemática da célula de Franz; (B) compartimento dador padrão,

(C) compartimento dador célula de Franz modificada.

138

Figura 44 Esquema do sistema fechado de retirada de amostra. 144

Figura 45 Perfil de Libertação in vitro dos hidrogeles em Membrana de Diálise. 148

Figura 46 Perfil de Libertação in vitro do hidrogele em Membrana de Polietersulfona 148

Figura 47 Curva de calibração “A”, de miconazol em etanol/água (1:1), a 272 nm. 156

Figura 48 Curva de calibração “B” de miconazol em PBS/etanol (1:1), a 273 nm. 156

Figura 49 Gráfico distribuição do erro residual, curva “A”. 160

Figura 50 Gráfico distribuição do erro residual, curva “B”. 160

Page 15: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

15

INDICE DE TABELAS

Tabela 01 Características das principais formas de candidiase. 22

Tabela 02 Especialidades farmacêuticas contendo complexos de inclusão fármaco -

CD.

36

Tabela 03 Características físico químicas da α-, β- e γ-ciclodextrina. 39

Tabela 04 Exemplos da utilização de ciclodextrinas em transdérmicos. 56

Tabela 05 Exemplos de utilização de derivados de ciclodextrinas em transdémicos. 59

Tabela 06 Solubilidade máxima do MCZ atingido nas soluções de CDs.Parâmetros

derivados dos respectivos diagramas de fases.

79

Tabela 07 Número de onda experimental e teórica (FTIR) do miconazol. 97

Tabela 08 Intensidade dos picos e valores de RDC para os sistemas MCZ/MβCD. 101

Tabela 09 Solubilidade aquosa dos complexos com MCZ a 25ºC ±1 após 48 horas. 103

Tabela 10 Solubilidade dos complexos, em PBS 6.8, a 25ºC ±1 após 48 horas. 103

Tabela 11 Formulação dos hidrogeles I. 116

Tabela 12 Formulação hidrogeles II. 117

Tabela 13 Valores comparativos de (f1) e (f2). 147

Tabela 14. Valores de Eficiência de Dissolução. 147

Tabela 15 Dados utilizados e obtidos para a verificação da precisão do método de UV

para análise do MCZ, para curva A, (Etanol/água).

158

Tabela 16 Dados utilizados e obtidos para a verificação da precisão do método de UV

para análise do MCZ para curva B (PBS/Etanol).

159

Page 16: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

16

INTRODUÇÃO ........................................................................................................................................ 18

PATOLOGIA ............................................................................................................................................ 18 ANTIFÚNGICOS ...................................................................................................................................... 23

Mecanismo de acção ......................................................................................................................... 24 MICONAZOL ........................................................................................................................................... 25 FARMACODINÂMICA .............................................................................................................................. 25

Farmacocinética do gel oral de miconazol ....................................................................................... 26 CICLODEXTRINAS ................................................................................................................................... 29

Generalidades ................................................................................................................................... 32 Propriedades das Ciclodextrinas ...................................................................................................... 37 Factores que influenciam a formação do complexo de inclusão ...................................................... 39 Considerações Toxicológicas ........................................................................................................... 42 Derivados das ciclodextrinas ............................................................................................................ 44 Derivados metilados ......................................................................................................................... 44 Formação de Complexos de Inclusão ............................................................................................... 45 Formação de complexos de inclusão em solução ............................................................................. 51 Degradação, Absorção e Metabolismo das Ciclodextrinas .............................................................. 52 Ciclodextrinas na administração dérmica ........................................................................................ 53 Ciclodextrinas como promotores de absorção.................................................................................. 55

OBJECTIVO GERAL ................................................................................................................................ 60 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................................... 61

FORMAÇÃO DOS COMPLEXOS DE INCLUSÃO EM SOLUÇÃO ................................................ 69

INTRODUÇÃO ........................................................................................................................................ 69

MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................................. 75 MATERIAL .............................................................................................................................................. 75 MÉTODOS .............................................................................................................................................. 75

Doseamento espectrofotométrico do MCZ ........................................................................................ 75 Diagrama de solubilidade de fases ................................................................................................... 76 Detecção no ultravioleta ................................................................................................................... 76

RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................................ 77 ESTUDO DE SOLUBILIDADE DE FASES................................................................................................... 77 CONCLUSÃO ..................................................................................................................................... 81 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................................ 82

PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS COMPLEXOS DE INCLUSÃO NO ESTADO SÓLIDO ...................................................................................................... 84

INTRODUÇÃO ........................................................................................................................................ 84

MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................................. 85 MATERIAL .............................................................................................................................................. 85 MÉTODOS .............................................................................................................................................. 85

Mistura física .................................................................................................................................... 85 Malaxagem........................................................................................................................................ 85 Co-evaporação .................................................................................................................................. 85 Secagem por pulverização ................................................................................................................ 86 Liofilização ....................................................................................................................................... 86 Solubilidade dos complexos de inclusão ........................................................................................... 87

MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUIMICA.............................................................. 87 Microscopia electrónica de varrimento (SEM) ................................................................................. 87 Calorimetria diferencial de varrimento (DSC) ................................................................................. 88 Difracção de raios X (RX) ................................................................................................................ 88 Espectroscopia de infravermelho com transformadas de Fourier (FTIR) ........................................ 89

RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................................ 89 Preparação dos complexos no estado sólido .................................................................................... 89 Microscopia electrónica de varrimento (SEM) ................................................................................. 90 Calorimetria diferencial de varrimento (DSC) ................................................................................. 93 Espectroscopia de infravermelho com transformadas de Fourier (FTIR) ........................................ 95 Difracção de raios X (RX) ................................................................................................................ 99 Solubilidade aquosa dos complexos de inclusão ............................................................................ 102

Page 17: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

17

CONCLUSÃO ................................................................................................................................... 104 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................................. 105

DESENVOLVIMENTO E ESTUDO REOLOGIA DE UMA FORMULAÇÃO PARA APLICAÇÃO BUCAL ........................................................................................................................... 109

INTRODUÇÃO ...................................................................................................................................... 109

GELES .................................................................................................................................................. 111 PLURONIC ............................................................................................................................................ 113 CARBOPOL .......................................................................................................................................... 114 OBJECTIVO ...................................................................................................................................... 115 MATERIA E MÉTODOS .................................................................................................................. 115

Material .......................................................................................................................................... 115 Métodos ........................................................................................................................................... 115 Preparação dos Hidrogeles ............................................................................................................ 115 Hidrogele de Carbopol (A) ............................................................................................................. 115 Hidrogele Pluronic (B) ................................................................................................................... 115 Hidrogele Pluronic-Carbopol (C1; C2; C3) ................................................................................... 116 Hidrogeles [MCZ 2% (D);MBCD (E), Mistura Física (F) e Complexo (G)] ................................. 116 Estudo da compatibilidade dos excipientes presentes nos hidrogeles ............................................ 117 Caracterização da Viscosidade ...................................................................................................... 117 Análise da Textura .......................................................................................................................... 118 Análise estatística ........................................................................................................................... 118

RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................................... 119 Calorimetria diferencial de varrimento (DSC) ............................................................................... 119 Viscosidade ..................................................................................................................................... 120 Análise da textura dos hidrogeles base ........................................................................................... 123 Textura dos hidrogeles .................................................................................................................... 127 Aspecto ............................................................................................................................................ 130

CONCLUSÃO ................................................................................................................................... 133 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................................. 134

ESTUDO DE LIBERTAÇÃO ............................................................................................................... 136

INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 136 OBJECTIVO ...................................................................................................................................... 141 MATERIAL ........................................................................................................................................ 141 MÉTODOS ......................................................................................................................................... 142 LIBERTAÇÃO IN VITRO ATRAVÉS DE MEMBRANA SINTÉTICA .............................................................. 142

Meio receptor .................................................................................................................................. 142 Curva de Calibração....................................................................................................................... 142 Preparação das membranas sintéticas ........................................................................................... 143 Membrana de diálise Visking ® ...................................................................................................... 143 Membrana de polieterssulfona........................................................................................................ 143 Montagem das células de difusão de Franz .................................................................................... 143 Análise dos dados da libertação ..................................................................................................... 144

RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................................... 145 CONCLUSÃO ................................................................................................................................... 149 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................................. 150

ANEXO I ................................................................................................................................................. 155

ANEXO II ............................................................................................................................................ 161

ANEXO III .............................................................................................................................................. 165

ANEXO IV .......................................................................................................................................... 168

Page 18: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

18

INTRODUÇÃO Patologia

As leveduras são fungos oportunistas, que se apresentam sob a forma unicelular,

responsáveis pela maior parte das infecções fúngicas nos seres humanos. Durante as

últimas décadas, emergiram gerando um aumento da incidência de mortes,

especialmente em doentes com o sistema imunitário comprometido como é o caso dos

doentes com SIDA, doentes à espera de um transplante e que estão passando por

algum tipo de quimioterapia com anti-tumorais (Chang, 2003).

Os factores de risco (Figuras 01, 02 e 03) que predispõem os doentes a este tipo

de infecções incluem a diabetes mellitus, o uso de antibióticos de largo espectro e os

fármacos psicotrópicos, os tratamentos de quimioterapia de duração prolongada, o uso

crónico de corticoterapia por inalação oral, a imunossupressão do sistema imunitário

seguido de um transplante de órgãos, os procedimentos cirúrgicos resultantes de

tratamentos hospitalares intensivos e prolongados, a hemodiálise e a diálise

interperitoneal em doentes imunocomprometidos.

A infecção por leveduras tem também estado associada à utilização de

dispositivos médicos tais como implantes, cateteres vasculares, próteses dentárias,

lentes de contacto, bypasses para o coração, ligações artificiais, discos intervertebrais,

entre outros (Brajtburg, 2003).

Autópsias efectuadas em doentes imunocomprometidos revelaram que pelo

menos metade, estavam infectados com espécies de Cândida sp. Das leveduras mais

patogénicas a Candida albicans é considerada a mais crítica para o ser humano,

causando um grande número de infecções oportunistas que em doentes

imunocomprometidos podem ser fatais. A candidíase oral é uma das mais comuns e

tratáveis das infecções da mucosa oral observadas em pessoas com infecções

humanas pelo Vírus da imunodeficiência (HIV) ou infecção da Síndrome de

Page 19: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

19

imunodeficiência adquirida (SIDA) e pode ser uma fonte significativa de frequente

desconforto oral, dor, perda do paladar, e aversão aos alimentos (Patton, 2001).

Esta levedura é um organismo comensal estando presente no ser humano sem

causar infecções, coexistindo com o hospedeiro. Normalmente atinge os extremos da

faixa etária (crianças e idosos). Pode colonizar o tracto intestinal, oral, vaginal,

respiratório, urinário, sanguíneo, entre outros. Contudo, num paciente

imunocomprometido, esta levedura pode causar sérias infecções nas mucosas, que

incluem candidiases vaginais e infecções orais ou sistémicas (O'Sullivan, 2000).

Figura 01. Possíveis mecanismos através das quais a quimioterapia agrava a candidiase oral (Adaptado: Samaranayake, 1990).

Doença maligna

Quimioterapia

Medula óssea

Mucosa Oral

Antibioterapia

Neutropenia

↓ Proliferação celular

Redução da flora normal

Atrofia celular

↑ Candidiase

Inflamação e ou ulceração da mucosa

↑ Susceptilidade à Candidiase

Page 20: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

20

A candidiase representa a condição patológica mais frequente, dentro do grupo de

lesões brancas da mucosa oral (Goodman e Gilman, 1996). A candidiase oral é muito

comum também em pessoas idosas que normalmente usam próteses dentárias. Num

estudo realizado na Dinamarca demonstrou-se que, cerca de 60% dos indivíduos com

mais de 60 anos portadores de placas dentárias sofriam de estomatites dentárias

associadas a candidiase oral (Ellepola, 1998). Estas lesões brancas na orofaringe e

esofaringe, conhecidas popularmente como “sapinho”, podem ser acompanhadas da

queilite angular e glossite oral (Budtz-Jorgensen, 1990a).

A queilite angular é uma variante da candidíase que atinge as comissuras

labiais. É frequente em pacientes idosos que fazem uso de prótese dentária por perda

da dimensão vertical dos lábios. Caracteriza-se clinicamente por presença de áreas de

atrofia e hiperemia das comissuras labiais, às vezes acompanhadas de dor ardor e

sangramento local. O tratamento é feito com antifúngicos de uso tópico, como o

miconazol em gel, e pela correcção da dimensão vertical bucal com melhor adaptação

da prótese dentária (Epstein, 1990).

Os recém nascidos são mais susceptíveis a candidiase orofaríngea em virtude do

seu sistema imunitário ser ainda imaturo. A infecção geralmente é adquirida durante o

parto pela mãe que pode estar com candidíase vaginal, manifestando-se na primeira

semana após o nascimento. A exposição à Candida albicans pelos recém nascidos

pode também ocorrer devido a biberons infectados pela pele das enfermeiras ou da

mãe levando assim a obtenção da candidiase orofaringea. Essa infecção geralmente é

benigna e, em geral, pode ser tratada de forma eficaz com agentes tópicos (Epstein,

1998).

Clinicamente pode apresentar-se nas formas pseudomembranosa, forma mais

comum, atrófica aguda e crónica e hiperplásica. A candidíase mucocutânea manifesta-

se como a forma pseudomembranosa com característica familiar autossômica

recessiva. A tabela 1 caracteriza as principais formas de candidíase.

Page 21: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

21

Figura 02. Factores locais de risco no desenvolvimento de candidiase orofaringea (Adaptado Budtz-Jorgensen, 1990b)

Figura 03. Factores sistémicos de risco no desenvolvimento de candidiase orofaringea (Adaptado Budtz-Jorgensen, 1990b)

FACTORES LOCAIS

Xerostomia por:Radioterapia; Quimioterapia e Síndrome de Sjogren’s

Antibioterapia de largo espectro e esteróides

Dieta com alto teores de hidratos de carbono

LeucoplasiaCancro oral

Próteses dentárias

Tabagismo

FACTORES SISTÉMICOS

Recém nascidos Idade avançada

Leucemia Agranulocitose

Imunosupressão (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, uso de esteróides)

Deficiência nutricional (vitamina B12, folato, ferro)

Diabetes

Page 22: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

22

Diversos agentes sistémicos e não-sistémicos (tópicos) estão disponíveis para

tratar candidíase orofarígea. Agentes tópicos são o principal elemento da terapia,

especialmente em casos simples. Sempre que possível as preparações tópicas devem

ser utilizadas antes dos fármacos antifungicos sistémicos (Datry, 1993).

Tabela 01: Características das principais formas de candidiase (Adaptado: Goodman e Gilman, 1996).

Tipo de Lesão Aspectos clínicos Factores associados

Pseudomembranosa Placas brancas e aderentes sobre a

mucosa, destacáveis, deixando o leito

com sangue. Ocorrem principalmente

em mucosa de cavidade oral, orofaringe

e porção lateral do dorso da língua.

Raramente dolorosa.

Factores locais e

sistémicos

Atrófica aguda Eritema local ou difuso, doloroso. Áreas

de despapilação e desqueratinização

em dorso da língua, deixando-a

dolorosa, edemaciada e eritematosa.

Antibioterapia

Atrófica crónica Eritema difuso com superfície

aveludada, associada à forma

pseudomembranosa, ou como queilite

angular.

Afecta 65% da população

geriátrica com prótese

dentária.

Hiperplásica Infecção crónica, aspecto leucoplásico,

espessado, não destacável em mucosa

oral, palato e língua (principalmente)

Não apresentam factores

associados

Page 23: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

23

Antifúngicos

Os agentes antifúngicos eram pouco conhecidos até 1970, e apresentavam

muitas restrições relativamente ao seu uso, devido à toxicidade, estreito espectro de

actividade, baixa actividade farmacológica e dificuldades na administração parenteral.

Os imidazólicos, uma nova classe de agentes antifúngicos, foi introduzida na

terapêutica, pela sua versatilidade de administração, baixa toxicidade e abrangente

espectro de actividade, sendo pouco frequente, a resistência desenvolvida pelos

fungos a estes agentes (Fitzpatrick et al., 1997).

Os agentes imidazólicos possuem actividade e espectro similar, são activos

contra todos os fungos causadores de infecções superficiais de pele e mucosas. São

muito eficazes, poucos tóxicos e com baixos níveis de resistência (Fuchs, 1998).

A acção principal de um fármaco imidazólico é localizada ao nível de

membrana celular. A via citocromo P-450, dependente de C14 lanosterol dimetilase, é

inibida, e esta é a responsável pela produção de ergosterol que é componente

necessário na constituição da parede celular do fungo (Vanden, 1985).

A terapia com fármacos imidazólicos está comercialmente disponível para uma

variedade de vias de administração: parenteral, intravenosa, oral ou tópica.

Os vários imidazóis e vias de administração, apresentam no entanto diferentes

indicações e toxicidades, dependendo da severidade e do tipo de dermatófito. A

maioria das micoses superficiais mucocutâneas pode ser tratadas com medicamentos

tópicos, sendo necessários produtos sistémicos, apenas em algumas situações

(Pershing, 1994).

Actualmente existem vários tipos de imidazóis tais como o tiabendazol,

miconazol, clotrimazol, econazol, sulconazol e o cetoconazol (Martindale, 1993).

O antifúngico miconazol mostrou-se ser eficaz em pacientes com candidiases

orofaríngea e esofaríngea (Goldstein, 1993). Quando os agentes tópicos não podem

controlar eficazmente a candidíase orofaríngea, combina-se a terapia tópica com um

Page 24: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

24

agente sistémico, assegurando uma dose mais baixa e menor tempo de tratamento

(Epstein, 1990).

Os compostos imidazólicos, são os mais preferidos nas micoses cutâneas e de

mucosas, mas, uma efectiva terapia requer que a substância activa seja libertada no

sítio de infecção numa adequada concentração para produzir um efeito farmacológico

eficaz (Fuchs, 1998).

Mecanismo de acção

Os azóis têm como alvo a membrana celular dos fungos. Os polienos ligam-se a

uma porção esterol, basicamente o ergosterol, presente na membrana de fungos

sensíveis, formando poros ou canais. O resultado é um aumento na permeabilidade da

membrana que permite o extravasamento de diversas moléculas pequenas, levando à

morte celular. Os azóis são compostos totalmente sintéticos. O mecanismo de acção

destes fármacos baseia-se na inibição da esterol-14-α-desmetilase, um sistema

enzimático microssomal dependente do citocromo P450, prejudicando a síntese do

ergosterol na membrana citoplasmática e levando a uma acumulação de 14-α-

metilesteróis. Esses metilesteróis não possuem a mesma forma e propriedades físicas

que o ergosterol e levam à formação da membrana com propriedades alteradas, que

não desempenha as funções básicas necessárias ao desenvolvimento do fungo. Os

azóis causam menos reacções adversas que a anfotericina B, mas são menos

potentes que esta. Podem ter acção fungistática ou fungicida. O uso excessivo dos

azóis levou ao aparecimento de resistência em espécies susceptíveis. Além disso, os

azóis ainda apresentam a desvantagem da resistência cruzada (Goodman e Gilman,

1996; Williams e Lemke, 2002).

Page 25: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

25

Miconazol

O Miconazol (MCZ) apresenta-se como um pó branco cristalino, muito pouco

solúvel na água e muito solúvel no clorofórmio, com ponto de fusão entre 83º a 87º

(British Pharmacopoeia, 1998). Possui forma molecular C18H14Cl4N20 e peso molecular

de 416,13 g/mol (Merck Index, 2001). O grupo imidazólico presente na sua estrutura

está sujeito a protonação, com pka de aproximadamente 6,7. A sua estrutura está

representada na Figura 04.

Figura 04.Estrutura do Miconazol

A designação comum do miconazol é 1-[2-(2,4-Diclorofenil)-2-[(2,4-diclorofenil)-

metoxi]-etil]-1H-imidazol (Merck índex, 2001).

Farmacodinâmica

O Miconazol possui atividade antifúngica contra os dermatófitos e leveduras

comuns assim como actividade antibacteriana contra certos bacilos e cocos gram-

positivos.

Page 26: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

26

A sua actividade é traduzida pel inibição da biossíntese de ergosterol nos

fungos e na mudança da composição dos componentes lipídicos das membranas,

resultando em necrose da célula fúngica.

Farmacocinética do gel oral de miconazol

Absorção

O miconazol possui absorção sistémica após administração sob a forma de gel

oral. A administração da dose de 60 mg de miconazol em gel oral resulta em pico de

concentração plasmática de 31 a 49 ng/mL, ocorrendo aproximadamente duas horas

após a aplicação.

Distribuição

O miconazol absorvido liga-se às proteínas plasmáticas (88,2%),

principalmente à albumina sérica e células vermelhas (10,6%).

Metabolismo e eliminação

A porção absorvida de miconazol é extensivamente metabolizada; menos de

1% da dose administrada é excretada na urina inalterada. A semi-vida final de

miconazol no plasma é de 20 - 25 horas na maioria dos pacientes. A semi-vida de

eliminação é similar nos pacientes com insuficiência renal. A concentração plasmática

de miconazol é reduzida moderadamente (aproximadamente 50%) durante a

hemodiálise.

Interacções medicamentosas

O Miconazol pode inibir o metabolismo de fármacos metabolizados pelo

sistema de enzimas CYP3A4 e CYP2C9 podendo resultar num aumento e/ou

prolongamento dos seus efeitos, incluindo efeitos adversos.

Page 27: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

27

O Miconazol utilizado por via oral é contra-indicado em co-administração com as

seguintes drogas que são metabolizadas pelo CYP3A4:

- Substâncias que prolongam o intervalo QT: astemizol, bepridil, cisaprida, dofetilida,

halofantrina, mizolastina, pimozida, quinidina, sertindola e terfenadina;

- Alcalóides de ergot; - inibidores de HMG-CoA redutase como sinvastatina e

lovastatina; - triazolam e midazolam oral.

Quando o Miconazol por via oral é co-administrado com os seguintes medicamentos,

deve-se ter cuidado com um possível aumento ou prolongamento dos efeitos

terapêuticos e/ou efeitos adversos. Se necessário, as doses devem ser reduzidas e,

se apropriado, os níveis plasmáticos monitorados:

- Produtos sujeitos ao metabolismo do CYP2C9

- Anticoagulantes orais, como varfarina;

- Hipoglicemiantes orais, como sulfoniluréias;

- Fenitoína.

- Outros medicamentos sujeitos ao metabolismo pelo CYP3A4:

- Inibidores da protease do HIV, como saquinavir,

- Certos agentes antineoplásicos, como alcalóides da vinca, busulfan e docetaxel;

- Certos bloqueadores de canal de cálcio, como diidropiridinas e verapamil;

- Certos agentes imunossupressores: ciclosporina, tacrolimus e sirolimus (rapamicina);

Page 28: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

28

- Outros: alfentanila, alprazolam, brotizolam, buspirona, carbamazepina, cilostasol,

disopiramida, ebastina, metilprednisolona, midazolam IV, reboxetina, rifabutina,

sildenafil e trimetrexato (Bulário E. Anvisa, 2008)

O miconazol é administrado também por via vaginal, sistémica, dérmica e

quando oral para tratamento das infecções do tracto gastrintestinal. Possui semi-vida

plasmática curta e deve ser administrado de oito em oito horas. Atinge concentrações

terapêuticas nos ossos, nas articulações e no tecido pulmonar, mas não no sistema

nervoso central. É inactivado pelo fígado. Os efeitos adversos são relativamente raros,

e os mais comuns consistem em distúrbios gastrintestinais.

Page 29: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

29

Ciclodextrinas

A primeira descrição relacionada com o isolamento de substâncias hoje

conhecidas por ciclodextrinas (CDs) de que há memória data de 1891, tendo sido

realizada por Villiers (Villiers, 1891), (Figura 05. Este investigador francês isolou uma

pequena quantidade de um composto cristalino, a partir de um meio de cultura de

Bacillus amylobacter contendo amido, o qual designou por “cellullosine” devido a forte

semelhança desta substância isolada com a celulose.

Figura 05. Início do artigo de Villier em Comptes Rendus da Academia de Ciências de 1891 (Fonte: Loftsson e Duchêne, 2007)

Quinze anos mais tarde, um microbiologista austríaco, Franz Schardinger,

(Schardinger, 1903) deu um impulso no desenvolvimento das ciclodextrinas, ao

caracterizar a substância cristalina isolada por Villier como sendo uma mistura de dois

oligossacarídeos cíclicos, os quais designou por α-dextrina cristalina e β-dextrina

cristalina, e foi ainda responsável pela primeira descrição detalhada da preparação e

isolamento destes oligossacarídeos cíclicos. Por essa mesma razão, as CDs são

também conhecidas por dextrinas de Schardinger, cicloamiloses ou cicloglucanos

(Bekers et al., 1991;Mosher e Thompson, 2002).

Havia que esperar pela metade da década de trinta para que Freudenberg e

seus colaboradores descrevessem a estrutura cíclica das ciclodextrinas isoladas por

Schardinger (Freudenberg e Cramer, 1948).

Page 30: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

30

No início da década de 50 dois grupos liderados por French e Cramer

começam a trabalhar intensamente na produção enzimática das ciclodextrinas, no

fraccionamento e na caracterização das suas propriedades físicas e químicas.

French (French, 1957) descobriu a existência de ciclodextrinas compostas por

um maior número de oligossacarídeos, enquanto o grupo de Cramer (Cramer, 1954)

se centrou nos estudos da capacidade de complexação.

No livro “Einschlussverbindungen” (Figura 06), Cramer descreve a estrutura

básica e as características físico-químicas da α-, β-, e γ- ciclodextrina, incluindo a

estrutura química, tamanho da cavidade, solubilidade, reactividade, capacidade de

complexação e o efeito da estabilidade química da molécula hóspede (Loftsson,

Duchene, 2007).

Figura 06. A capa do livro de Friedrich Cramer “Einschlussverbindungen” (compostos de inclusão), publicado em Berlim em 1954, onde são descritos vários tipos de compostos que podem formar complexos de inclusão, incluindo ciclodextrinas (Fonte: Loftsson e Duchêne, 2007).

Freudenberg, Cramer e Plininger apresentam o composto em 1953. Esta

patente (Figura 07) engloba praticamente os aspectos mais importantes da aplicação

Page 31: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

31

das ciclodextrinas na formulação de medicamentos (Freudenberg et al, 1953). Através

de vários exemplos, mostraram que mediante a complexação era possível proteger

substâncias da oxidação, aumentar a solubilidade de fármacos insolúveis e reduzir o

peso de substâncias voláteis.

Figura 07. A primeira pagina das duas primeiras patentes de ciclodextrinas intitulada “ Métodos para a preparação de compostos de inclusão de compostos orgânicos fisiologicamente activos”. As patentes foram submetidas a 5 de Novembro de 1953 na Alemanha por Karl Freudenberg Friedrich Cramer and Hans Plieninger (Fonte: Loftsson e Duchêne, 2007).

Contudo, até 1970 as CDs apenas eram produzidas, com um baixo grau de

pureza, em quantidades muito reduzidas e os elevados custos de produção destas

moléculas inibiam a sua aplicação generalizada ao nível industrial. Porém, os avanços

biotecnológicos das últimas décadas resultaram numa melhoria significativa na

obtenção de CDs naturais e dos seus derivados, em larga escala, com um elevado

Page 32: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

32

grau de pureza e a preços competitivos, fomentando uma forte expansão da sua

utilização no sector farmacêutico (Szejtli, 1998).

No final da década de 70 os métodos de preparação das ciclodextrinas em

escala de laboratorial, a sua estrutura, as propriedades físicas e químicas, assim como

as características da complexação já haviam sido elucidados.

Depois dos estudos toxicológicos adequados provou-se que a toxicidade

atribuída às ciclodextrinas deriva das impurezas arrastadas durante o processo de

elaboração, de uma inadequa forma de administração e do emprego de doses

extremamente altas. Desde então o número de publicações relativas as ciclodextrinas

teve um aumento acentuado.

Depois de mais de um século após a sua descoberta e de toda a pesquisa

científica que lhes é inerente, as ciclodextrinas existem em formulações farmacêuticas

nos mercados dos mais diversos países, tais como o Japão, os Estados Unidos, o

Brasil, a Argentina, a Alemanha, a Itália, a França, a Bélgica, a Holanda, a Suiça, a

Suécia, a Dinamarca, a Islândia, a Espanha, Portugal, entre outros (Mosher e

Thompson, 2002). As CDs apresentam actualmente uma boa aceitação e grandes

potencialidades como excipientes nas mais variadas formas farmacêuticas (Loftsson,

1998a).

Generalidades

As ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos (Figura 08), constituídos

por um número variável de unidades de glucose e que se obtêm por acção da enzima

ciclodextrina-α-glicosiltransferase (CGTase) sobre o amido (Szejtli, 1994). As

ciclodextrinas são conhecidas por permitirem a encapsulação molecular de fármacos

com características hidrofóbicas, alterando-lhes a solubilidade, aumentando a

estabilidade e, em alguns casos, melhorando a biodisponibilidade.

Page 33: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

33

Figura 08. Estrutura química da β-Cyclodextrina (Adaptado de Szejtli, 1994).

A encapsulação molecular de fármacos pelas ciclodextrinas apresenta-se muito

vantajosa sob o ponto de vista tecnológico e biológico na medida em que modifica as

propriedades físicas, químicas e biofarmacêuticas dos fármacos, sendo facilmente

conseguida e menos dispendiosa do que a encapsulação de fármacos por outros

métodos. Apesar das variadas aplicações das ciclodextrinas, aqui serão revistas as

suas aplicações e as vantagens da sua utilização em tecnologia farmacêutica, em

cosmética, na indústria química e alimentar.

As ciclodextrinas têm sido reconhecidas como um novo grupo de excipientes

farmacêuticos úteis (Loftsson e Brewster, 1996). As ciclodextrinas e os seus

complexos de inclusão podem ser utilizados na preparação de formas farmacêuticas

sólidas, líquidas e semi-sólidas com aplicação nas vias de administração oral,

parentérica, pulmonar, nasal, bucal, sublingual, rectal, ocular e dérmica (Mosher e

Thompson, 2002).

Page 34: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

34

Formas farmacêuticas sólidas

• Aumento da velocidade e extensão de dissolução dos fármacos quando

complexados com CDs hidrófilas em consequência do aumento da sua

solubilidade, molhabilidade e alteração do seu estado cristalino.

• Atenuação de sabores e odores desagradáveis dos fármacos.

Formas farmacêuticas líquidas

• Aumento da estabilidade física das emulsões e suspensões. As CDs presentes

em sistemas termodinamicamente instáveis como as suspensões permitem a

diminuição da velocidade de sedimentação das partículas e inibem a

recristalização de fármacos em cristais polimórficos de menor solubilidade.

Estão, portanto, na origem de um aumento da estabilidade termodinâmica

destes sistemas e exercem também efeitos positivos na deliquescência de

substâncias higroscópicas, fotólise, volatilidade, etc.

• Controlo da natureza tixotrópica de suspensões.

Formas farmacêuticas semi-sólidas

• Modificação das propriedades reológicas, tais como a consistência das

pomadas.

• Aumento da biodisponibilidade tópica através do aumento da libertação do

fármaco a partir da formulação.

• Aumento da capacidade absorvente de água das bases oleosas e emulsões do

tipo A/O por CDs hidrófilas.

• Modificação da capacidade de intumescimento dos geles.

Formas farmacêuticas injectáveis

Page 35: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

35

• Redução da irritação muscular e hemólise induzida por determinados

fármacos.

• Obtenção de produtos solúveis pela preparação de complexos de inclusão por

liofilização. O aumento de solubilidade dos fármacos é induzido directamente

pelo aumento da sua solubilidade intrínseca, por consequência da sua

complexação bem como pela alteração do seu estado cristalino.

• Preparação de suspensões para utilização parentérica com redução do

tamanho de partícula dos fármacos no complexo de inclusão, nomeadamente

pela utilização de técnicas de preparação dos complexos como por exemplo a

secagem por pulverização.

A viabilidade comercial das formulações farmacêuticas é de facto inegável.

Existem numerosas especialidades farmacêuticas contendo complexos fármaco-

ciclodextrina nos mercados dos Estados Unidos, Japão e Europa (Tabela 02). Para

além disso, muitos estudos clínicos estão presentemente em curso, envolvendo

produtos farmacêuticos que contêm complexos fármaco-ciclodextrina, pelo que se

espera num futuro próximo que o número de formulações farmacêuticas contendo CDs

seja ainda francamente superior (Mosher e Thompson, 2002).

Apesar da complexação com CDs resultar geralmente num aumento da

estabilidade física e química dos fármacos complexados, existem situações

particulares em que as CDs potenciam a degradação dos fármacos complexados.

Assim, alguns autores demonstraram que as CDs podem potenciar reacções de

hidrólise de determinados fármacos se os grupos sensíveis da molécula hóspede

sofrerem ataque nucleofílico pelos grupos hidroxílicos da CD (Loftsson e Brewster,

1996).

Page 36: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

36

Tabela 02. Especialidades farmacêuticas contendo complexos de inclusão fármaco-CD. (Adaptada de Brewster e Thompson, 2007; Brewster e Loftsson, 2007).

Complexo fármaco/CD Nome comercial Forma farmacêutica Laboratório/País

Alprostadil/αCD Caverject Dual® Solução I.V. Pfsier, Europa

PGE1/αCD Prostavastin® Solução I.V. Ono, Japão

PG2/βCD Prostamon E® Comprimido sublingual Ono, Japão

OP-1206/γCD Opalmon® Comprimido Schwartz, Alemanha

Piroxicam/βCD Brexin®, Flogene®,

Cicladon®,..

Comprimido, solução,

granulado, supositório

Chiesi, Itália; Ache, Brasil

Benexate/βCD Ulgut® Cápsula Teikoky, Japão

Meloxicam/ βCD Mobitil® Comprimido, supositório Union Medical

Pharmaceuticals, Egito

Omeprazol/ βCD Omebeta® Comprimido Betafarm, Europa

Iodine/βCD Mena-Gargle® Solução Teikoky, Japão

Dexametasona/βCD Glymesason® Pomada Fulinaga, Japão

Nitroglicerina/βCD Nitropen® Comprimido sublingual Nihon kayaku, Japão

Cefotrima-hexetil/βCD Pansporin T® Comprimido Takeda, Japão

Cefalosporina/βCD Meiact® Comprimido Meiji, Seika, Japão

Ácido tiaprofénico/βCD Surgamyl® Comprimido Roussel-maestrelli, Itália

Difenidramina/βCD Stada-Travel® Comprimido Stada, Alemanha

Cloro-diazepóxido/βCD Trasillium® Comprimido Gador, Argentina

Hidrocortisona/HPβCD Dexocort® Solução Delta, Islândia

Itraconazol/βHPβCD Sporanox® Solução Janssen, Bélgica

Omeprazol/βCD Omebeta® Comprimido Betapharm, Alemanha

Indometacina/HPβCD Indocollyre® Solução oftálmica Chauvin, França

Nimesulide/βCD Mesulid Fast®,

Aulin Beta®, …

Supositório, granulado,

comprimido

Italfarmaco, Boehringer

Mannheim, Itália, …

Aprostadil/αCD Rigidur® Solução I.V. Ferring, Dinamarca

Nicotina/βCD Nicorette® Comprimido sublingual Pharmacia&Upjohn, Suécia

Óleo gárlico/βCD Xund®, Tegra® Drageia Biphax, Hermes, Alemanha

Dextrometorfano/βCD Rynathisol® Xarope Synthelabo, Itália

Cetirizina/βCD Cetirizin® Comprimido LosanPharma, Alemanha

Mitomicina/HPβCD MitoExtra® Solução I.V. Novartis, Suiça

Cloranfenicol/RMβCD Clorocil® Solução oftálmica Oftalder, Portugal

Tc-99 Teobroximeo Cardio Tec® Solução I.V. Bracco (USA)

Diclofenac/HPγCD Voltaren Ophatalmic® Solução oftálmica Ciba Vision, Suiça

17β-estradiol/RMβCD Aerodiol® Spray nasal Servier, França

Cisapride/HPβCD Prepulsid® Supositório Janssen, Bélgica

Aripiprazol/SBEβC Abilitify® Solução Bristol-Myers Squibb (USA);

Otsuka Pharm. (USA)

Maropitant Cerenia® Solução I.V. Pfiser Animal Health (USA)

Ziprasidone/SBEβCD Geodon® Solução I.M. Pfizer, (USA)

Voriconazole/SBEβCD VFend® Solução I.V. Pfizer, (USA)

Page 37: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

37

Propriedades das Ciclodextrinas

As ciclodextrinas são um grupo de sacarídeos estruturalmente relacionados,

que são produzidos pela ciclização enzimática do amido, catalizada pela enzima

ciclodextrina-glicosil-transferase, formando uma espiral helicoidal de unidades de

glicose unidas por ligações α(1,4) (Szejtli, 1988a). Devido à falta de rotação livre à

volta das pontes de ligação das unidades de glicose, as CDs não são moléculas

cilíndricas, adquirindo a forma tronco-cónica (Figura 09 e 10).

Em consequência da conformação em cadeira das unidades de glicopiranose,

todos os grupos hidroxílicos estão orientados para o exterior da molécula, com os

grupos hidroxilo primários localizados no lado mais estreito e os secundários no lado

mais largo da estrutura, conferindo-lhe hidrofilia (Loftsson e Brewster, 1996; Saltão e

Veiga, 2001).

A cavidade apresenta características hidrofóbas devido ao carácter apolar

determinado pelos dois anéis dos grupos C-H e pelo anel de átomos de oxigénio

incluídos nas ligações glicosídicas. Esta estrutura molecular invulgar confere as

ciclodextrinas propriedades únicas.

Figura 09. Estrutura geral da ciclodextrinas. Os derivados alfa, beta e gama são definidos por n - 1, 2 e 3, respectivamente. Figura 10. Representação esquemática da estrutura tridimensional das ciclodextrinas, mostrando as características estruturais definidas pelo arranjo das unidades de glicose. (Adaptado de Gerbras, 2007).

Page 38: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

38

As ciclodextrinas naturais mais comuns são a α-ciclodextrina (ciclomato-

hexanose), a β-ciclodextrina (ciclomato-heptanose), a γ-ciclodextrina (ciclomalto-

octanose), contendo respectivamente 6, 7 e 8 unidades de ligações glicopiranose α-

1,4 (Figura 11). Destes três derivados, a β-ciclodextrina (β-CD) parece ser a mais

vantajosa para utilização farmacêutica como agente complexante, devido, entre outras

propriedades, ao tamanho da sua cavidade, disponibilidade e baixo custo (Thompson,

1997).

A complexação ocorre quando uma molécula hóspede preenche totalmente ou

em parte a cavidade interna da ciclodextrina. O interior da cavidade das ciclodextrinas

é relativamente apolar quando comparado com a água, o que propicia às

ciclodextrinas a facilidade em formar complexos de inclusão com compostos orgânicos

(Hodi, 1991).

Segundo Pszczola (1988), devido à sua estrutura, as ciclodextrinas facilmente

formam complexos com compostos sólidos, líquidos e gasosos. Um dos critérios para

complexação é o tamanho da molécula a ser encapsulada, que deve ser compatível

com a cavidade da ciclodextrina. Outro critério é a polaridade da molécula

encapsulada e a sua competição com os restantes compostos presentes no meio. Os

complexos de inclusão são relativamente estáveis e facilmente separados das

soluções devido à sua cristalinidade (Pszczola, 1988).

Figura 11. Diferentes dimensões da α-Cyclodextrina, β-Cyclodestrina e γ-Cyclodextrina. (Adaptado de Uyar, 2005)

Page 39: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

39

Os três tipos de ciclodextrinas são produzidos industrialmente como

substâncias cristalinas homogéneas (Rendleman Jr., 1992). De entre as ciclodextrinas,

a γ-ciclodextrina é a que apresenta menor solubilidade em água. A solubilidade das

ciclodextrinas varia com a adição das mais diversas misturas de água e solventes

orgânicos (Delbourg, 1991). Os solventes orgânicos foram a primeira alternativa usada

para aumentar a solubilidade das ciclodextrinas, mas não podem ser empregues na

indústria alimentar ou farmacêutica (Saenger, 1980).

Tabela 03: Características físico químicas da α, β e γ-ciclodextrina. (Adaptado de Mosher e Thompson, 2002).

Factores que influenciam a formação do complexo de inclusão A formação dos complexos de inclusão fármaco-ciclodextrina está

condicionada em grande parte com a estrutura e propriedades físico-químicas do

α β γ

Número de unidades de glicose 6 7 8

Peso molecular 972 1135 1297

Diâmetro da cavidade, Å 4,7 – 5,3 6,0 – 6,5 7,5 – 8,3

Solubilidade a 25ºC (g/100mL):

Água 14,5 1,85 23,2

Metanol i I >0,1

Metanol solução à 50% 0,3 0,3 208

Etanol I i >0,1

Etanol solução à 50% >0,1 1,3 2,1

2-Propanol i I >0,1

Dimetilsulfoxide 2 35

Propilenoglicol 1 2

Glicerina I 4,3

Solubilidade em água (g/100g):

20ºC 0,90 1,64 1,85

25ºC 1,27 1,88 2,56

30ºC 1,65 2,28 3,20

35ºC 2,04 2,83 3,20

40ºC 2,42 3,49 3,90

45ºC 2,85 4,40 4,60

50ºC 3,47 5,27 5,85

55ºC 6,05

Page 40: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

40

fármaco e da própria ciclodextrina (Loftsson e Brewster, 1997). Para que um complexo

de inclusão se forme, a molécula de fármaco tem que se ajustar total ou parcialmente

ao interior hidrofóbico da cavidade da ciclodextrina. Alguns factores podem intervir no

processo de complexação, como o tamanho da cavidade da ciclodextrina. Para que

ocorra a complexação, o tamanho da cavidade da CD deve ser apropriado para

acomodar uma molécula de fármaco de tamanho particular. A α-CD apresenta uma

cavidade demasiado pequena para a inclusão de moléculas com anéis aromáticos

como o naftaleno, enquanto que a γ-CD pode acomodar moléculas com estruturas de

tamanho comparável à do antraceno. Logo, a α-CD pode ter aplicação para complexar

moléculas de tamanho reduzido ou cadeias laterais de moléculas volumosas, como é

o caso das prostaglandinas. Por sua vez, a β-CD é muito útil na complexação de

moléculas que possuam pelo menos um anel aromático. As CDs formadas por mais de

oito unidades glucopiranósidicas, têm menor capacidade complexante que a β-CD e,

portanto, menor interesse do ponto de vista farmacêutico. (Loftsson e Brewster, 1997).

Nos últimos anos foram desenvolvidos diferentes derivados químicos de

ciclodextrinas naturais, mediante a substituição de algumas ligações de hidrogénio que

formam os grupos hidroxílicos, melhorando assim as propriedades das ciclodextrinas

naturais como a solubilidade, a actividade hemolítica e a nefrotoxicidade.

Entre os derivados hidrofílicos das ciclodextrinas naturais podemos distinguir

dois grupos: as ciclodextrinas neutras (como a HPβCD) e as ionizadas (como a

SBEβCD). De uma forma geral, a eficácia de complexação é maior para as

ciclodextrinas derivadas, relativamente às naturais. As derivadas com menor grau de

substituição apresentam um maior efeito solubilizante e os derivados ionizados podem

ser bons agentes solubilizantes se a carga da molécula estiver na posição mais

afastada da cavidade hidrofóbica (Loftsson e Brewster, 1996).

Comparando com as CDs neutras, a complexação pode ser melhor quando a

CD e o fármaco carregam cargas opostas, mas pode diminuir quando carregam a

mesma carga. Para muitos fármacos ácidos que dão origem a aniões, (2-hidroxi-3-

Page 41: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

41

[trimetilamônio] propil) -β-CD catiónica agiu como um excelente solubilizante (Loftsson

e Brewster, 1996). No caso de fármacos ionizáveis, a presença da carga pode ter um

papel significativo na complexação de fármacos/CD e uma mudança de pH na solução

pode variar a constante de complexação. Em geral, os fármacos na forma iónica

formam complexos mais fracos do que na forma não-iónica.

As mudanças de temperatura podem afectar a complexação do fármaco/CD.

Na maioria dos casos, aumentar a temperatura diminui o valor da constante aparente

de estabilidade do complexo, e este efeito foi relatado como sendo um possível

resultado da redução das forças de interacção fármaco/CD, tais como as Van der

Waals e as forças hidrofóbicas provocada pelo aumento da temperatura. Entretanto,

mudanças de temperatura podem ter um efeito insignificante quando a interacção

fármaco/CD está predominantemente associada a uma entropia dirigida. O método de

preparação, pode afectar a complexação do fármaco/CD. A eficácia de um método

depende da natureza do fármaco e em muitos casos, a secagem por pulverização, e a

liofilização demonstraram ser os mais eficazes para o complexação de fármacos.

Os polímeros ou os agentes iónicos emparelhados devido à sua participação

directa na complexação do fármaco melhoram as propriedades farmacêuticas e

biológicas dos complexos fármaco/CD, independente das propriedades físico-químicas

do fármaco. Determinados aditivos podem competir com as moléculas do fármaco para

cavidades da CD e assim diminuir a constante de estabilidade aparente do complexo.

Com relação ao grau de substituição sabe-se que as propriedades físico-

químicas das CDs, incluindo a sua habilidade de complexação, podem ser

extremamente afectadas pelo tipo, pelo número e pela posição dos substituintes na

molécula de CD. O “grau de substituição” por si mesmo não caracteriza

excepcionalmente um derivado da β-CD tal como a HP-β-CD. Quando produzidas sob

diferentes condições, as propriedades físico-químicas de amostras de HP-β-CD com o

mesmo grau de substituição também são distintas devido à ocupação possível de

grupos hidroxipropil em diferentes posições na molécula da CD (Rajeswari, 2005).

Page 42: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

42

Considerações Toxicológicas

O perfil de segurança das três mais comuns ciclodextrinas naturais e alguns

dos seus derivados tem sido recentemente revisto. Em geral, as ciclodextrinas naturais

e os seus derivados hidrofílicos, podem somente permear membranas biológicas

lipofílicas, tais como a córnea do olho, com considerável dificuldade. Mesmo tendo um

carácter lipofílico a β-ciclodextrina metilada aleatoriamente não permeia membranas

lipofílicas embora interaja mais prontamente com membranas do que os outros

derivados de ciclodextrinas hidrofílicas. Todos os estudos de toxicidade têm

demonstrado que as ciclodextrinas administradas oralmente são praticamente atóxicas

devido a não absorção pelo trato gastrintestinal. Além disso, um número de avaliações

de segurança têm demostrado que a γ-ciclodextrina, a 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina, a

sulfobutileter β-ciclodextrina, o sulfato β-ciclodextrina e a maltosil β-ciclodextrina

apresentam segurança mesmo quando administradas pela via parenteral. Entretanto,

os estudos toxicológicos têm mostrado que a α e a β-ciclodextrina e β-ciclodextrina

metilada não são apropriadas para administração parenteral (Del Valle, 2004).

α – Ciclodextrina

Trata-se de uma ciclodextrina relativamente irritante por administração

intramuscular. Liga-se a alguns lípidos e origina uma ligeira irritação ocular. Foi

absorvida entre 2 – 3 % de uma dose oral administrada em ratos, não sofrendo

metabolização no tracto intestinal superior, sofrendo hidrólise somente pela flora

intestinal do ceco e cólon. A excreção depois da administração oral em ratos foi de:

60% como CO2 (não se determinou o CO2 exalado em animais criados em ambientes

estéreis), 26 – 33% como metabólitos incorporados e 7 -14% como metabólitos em

fezes e urina. Após administração intravenosa excreta-se principalmente por via renal

Page 43: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

43

inalterada com t1/2 ratos =25min, DL50 oral ratos> 10.000mg/Kg, DL50 iv,ratos = 500-700 mg/Kg

(Del Valle, 2004).

β–Ciclodextrina

É menos irritante que as α-ciclodextrinas por administração intramuscular. Liga-

se ao colesterol e apresenta uma absorção muito reduzida (1-2%) no tracto intestinal

superior após administração oral. Não sofre metabolismo no tracto intestinal superior,

e é metabolizada por bactérias do ceco e do cólon. Actualmente, é a ciclodextrina mais

empregada em formulações farmacêuticas assim como a mais estudada em humanos.

O emprego de doses altas pode ser tóxico e não é aconselhável. A degradação

bacteriana e a fermentação que sofrem ao nível intestinal pode originar a produção de

gases e diarreia, DL50 oral,ratos > 5000mg/Kg; DL50 iv,ratos = 450-790 mg/Kg (Del

Valle,2004).

γ–Ciclodextrina

Não apresenta irritação após administração intramuscular. A glucose degrada-

se rapida e completamente pelas enzimas do tracto intestinal superior (mesmo quando

se administram doses diárias altas, por exemplo, 10-20g/Kg); a absorção oral situa-se

em torno de 0,1% da dose administrada. Praticamente não sofre metabolização após

administração intravenosa. É provavelmente a menos tóxica das três ciclodextrinas

naturais. É usada em aditivos alimentares. A sua capacidade complexante é, no

entanto, geralmente inferior a da β-ciclodextrina e seus derivados solúveis em água.

Os seus complexos apresentam normalmente solubilidade limitada em solução aquosa

e tendem a formar agregados, o que origina soluções opacas. DL50 oral, ratos>> 8000

mg/Kg; DL50 iv, ratos = 4000 mg/kg (Del Valle, 2004)

Page 44: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

44

Derivados das ciclodextrinas

As características das ciclodextrinas naturais tem limitado a sua aplicação

enquanto veículos de fármacos, quer devido à sua baixa solubilidade aquosa e em

solventes orgânicos, quer devido à toxicidade que apresentam quando utilizadas em

preparações parenterais (Fernandes, 1999).

As modificações além de aumentarem a segurança para aplicação das CDs no

consumo humano, podem melhorar ou alterar as características de aplicação, como

ocorre para qualquer amido modificado. As potenciais modificações são semelhantes

àquelas realizadas com amidos tradicionais, embora na prática poucas delas sejam

usadas comercialmente. As modificações ocorrem mais frequentemente nos hidroxilos

internos e externos das ciclodextrinas.

Algumas CDs têm sido modificadas com o objectivo de aumentar a sua

hidrofobicidade, a solubilidade ou o reconhecimento e o modo de complexação com as

moléculas encapsuladas. As CDs podem ser modificadas quimicamente através da

substituição dos seus grupos hidroxilo. Muitas CDs modificadas já são produzidas

industrialmente, outras foram desenvolvidas apenas em laboratório. O preço das CDs

modificadas é mais alto que o das CDs naturais, dificultando o uso desses derivados

(Cereda, 2003).

Uekama e Irie, (Uekama e Irie, 1990) classificaram os derivados das

ciclodextrinas em hidrófilos, hidrófobos e ionizáveis, classificação que também foi

utilizada para descrever as suas propriedades físico químicas.

Derivados metilados

As CDs metiladas são as mais comuns e a sua solubilidade aumenta com o

grau de metilação, sendo consideravelmente elevada quando comparada com a das

CDs não modificadas. As principais β-CDs metiladas são a DIMEB e a TRIMEB

(dimetil-β-CD e trimetil-β-CD), sendo também conhecidas por heptakis – (2,6-di-O-

Page 45: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

45

metil) e heptakis – (2,3,6, -tri-O-metil), respectivamente. São obtidas através da

metilação selectiva de todos os C2 secundários e de todos os hidroxilos dos C6

primários, enquanto os hidroxilos dos C3 permanecem inalterados. A primeira patente

dedicada ao uso de CDs modificadas em fármacos descreve a preparação de um

componente de baixa solubilidade com DIMEB. A DIMEB pode aumentar a

solubilização de esteróis, da progesterona, da hidrocortisona, da vitamina D3, da fenil

atropina, da prostaglandina e do diazepam, entre outros compostos largamente

empregados na indústria farmacêutica, além de estabilizar compostos instáveis em

soluções aquosas. Neste caso, a metilação com a β-CD é mais efectiva para se obter

um derivado solubilizante que com a α ou a γ-CD. A estabilidade de complexos

formados com derivados de CDs, como a DIMEB, é geralmente maior que a dos

complexos formados com CDs não modificadas. Os estudos efectuados com TRIMEB

são mais escassos (Bertolini, 1995).

As CDs metiladas, carboximetiladas e modificadas com epicloridrina dão

origem a derivados adequados para a solubilização de compostos lipofílicos presentes

em sistemas biológicos, eliminando assim o inconveniente da toxicidade causada

pelos solventes orgânicos (Saenger, 1980).

A Metil-β-ciclodextrina é um ciclodextrina modificada, com carácter lipofílico,

tem uma solubilidade em solução aquosa (> 2000 mg / mL), à temperatura ambiente o

que é significativamente mais elevado do que a natural β-ciclodextrina (18,5 mg / ML)

(Charoenchaitrakool, 2002).

Formação de Complexos de Inclusão

As CDs são capazes de formar complexos de inclusão (Figura 12) com muitos

fármacos, com tamanho e forma apropriados, encapsulando total ou parcialmente as

moléculas hóspedes. A cavidade das CDs tem afinidade preferencial para a forma

neutra de um determinado substrato, sendo capazes de complexar e solubilizar

compostos não polares. A complexação pode ser condicionada, entre outros factores,

Page 46: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

46

pela composição do esqueleto do composto, pela fraca solubilidade em água (inferior

a 10 mg/mL), pelo estado de ionização, pela temperatura e solventes utilizados, pelo

ponto de fusão inferior a 250 ºC (ponto de fusão superior significa que as forças

coesivas entre as moléculas são muito fortes) e pela massa molecular compreendida

entre 100 e 400 Daltons. Contudo, pode ocorrer a formação de complexos com

moléculas muito grandes, desde que contenham cadeias laterais apropriadas para a

inclusão parcial, originando compostos com solubilidade e estabilidade modificadas

(Szejtli, 1991; Thompson, 1997).

Figura 12. Complexo de inclusão fármaco-α-ciclodextrina (Adaptado de Nakagava, 2000).

A formação dos complexos fármaco-CD é altamente condicionada pela

estrutura e propriedades físico-químicas dos fármacos e CDs. (Loftsson e Brewster,

1997). Para um complexo de inclusão ser formado, a molécula do fármaco tem que

ajustar-se total ou parcialmente no interior hidrofóbico da cavidade da CD. Os factores

que influenciam todo o processo de formação dos complexos de inclusão fármaco-CD

são:

• Tamanho da cavidade da CD: A α-CD apresenta uma cavidade demasiado

pequena, que permita a inclusão de moléculas com estrutura semelhante ao

Page 47: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

47

naftaleno enquanto que a γ-CD pode acomodar moléculas com estrutura

comparável ao antraceno. Logo, a α-CD pode ter aplicações para a inclusão de

moléculas de tamanho reduzido ou cadeias laterais de moléculas volumosas,

como é o caso das prostaglandinas. Por sua vez, a β-CD é muito útil na

complexação de moléculas que possuam pelo menos um anel aromático e a γ-CD

para moléculas de tamanho considerável, como e o caso dos antibióticos

macrólidos. (Loftsson e Brewster, 1997).

• Derivados das CDs naturais: As propriedades das CDs naturais são fortemente

alteradas pela sua derivatização. Por exemplo, no caso de algumas CDs metiladas

e do derivado sulfobutilo-éter da βCD (DMβCD e SBEβCD), as efici-

ências de complexação são em regra superiores às da βCD devido ao

prolongamento do espaço hidrofóbico da cavidade da CD promovida pela

introdução dos substituintes (Mosher e Thompson, 2002).

• Substituição molar dos derivados das CDs: O número médio de grupos

substituintes existentes por unidade de glucose condiciona as propriedades

complexantes das CDs. Geralmente, os derivados que apresentam menor grau de

substituição molar são melhores agentes complexantes (Szente e Szejtli, 1999).

• Solubilidade intrínseca dos fármacos – Quanto menor a solubilidade intrínseca

de uma fármaco, maior será o aumento relativo de solubilidade promovido pela

complexação com CDs. Assim, os fármacos que apresentem valores de

solubilidade na ordem dos µg/ml terão um aumento de solubilidade muito superior

aos fármacos cuja solubilidade é na ordem dos mg/ml (Loftsson e O’ Fee, 2003).

• Fármacos hidrofílicos com solubilidade aquosa limitada: os fármacos de

carácter anfotérico e outros fármacos polares com solubilidade aquosa limitada,

podem apresentar boas propriedades complexantes. Neste caso, a origem da

reduzida solubilidade destes fármacos relaciona-se com a elevada energia dos

seus cristais e não com a sua lipofilia. Uma vez em solução, as moléculas de

fármaco hidratadas têm uma reduzida tendência para serem incluídas na cavidade

Page 48: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

48

das CDs. Contudo, estes fármacos, quando ionizados, poderão formar complexos

de inclusão, sendo desta forma possível aumentar a sua solubilidade por um

correcto ajuste do pH associado à complexação com CDs (Loftsson e Petersen,

1998).

Os mecanismos pelos quais se processa a formação de complexos de inclusão

são diversos, contudo, todos têm em comum o fato de não ocorrer formação nem

quebra de ligações covalentes. Considera-se que a principal força de ligação para a

formação de complexo é a libertação de entalpia das moléculas de água da cavidade

das CDs, uma vez que estas não conseguem satisfazer a sua necessidade de ligação

aos potenciais de hidrogénio, tendo, portanto, elevada entalpia. A energia do sistema

diminui quando estas moléculas são substituídas por moléculas-hóspedes, que são

menos polares do que a água. O fato de não se formarem ligações covalentes entre a

CD e as moléculas-hóspedes faz com que os complexos em condições fisiológicas

sejam facilmente dissociáveis (Cabral-Marques, 1994a). Na formação do complexo

podem também participar a libertação de forças do anel, interacções Van der Waals,

ligações de hidrogénio, interacções hidrofóbicas e alterações na tensão superficial do

solvente (Loftsson e Olafsson, 1998).

Em solução aquosa, (Figura 13) os complexos dissociam-se, encontrando-se

em equilíbrio as moléculas livres com as moléculas ligadas na cavidade da CD. Este é

um processo dinâmico, no qual a molécula-hóspede se associa e dissocia

constantemente da molécula-hospedeira. Nesta conformidade, o complexo será

constituído por uma família de espécies em proporções médias variáveis, sendo a

espécie de complexo a que apresenta maior tempo de existência (Loftsson e Brewster,

1996; Stella et al., 1999; Szejtli, 1991).

Page 49: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

49

Figura 13: Representação esquemática da formação do complexo de inclusão. O ácido salicílico é a molécula hóspede (Fonte: Uyar, 2005).

Os principais factores que afectam a extensão e o grau de complexação

incluem o tamanho e a geometria da molécula-hóspede, a energia conformacional, a

força das interacções Van der Waals e outras forças electrostáticas. Adicionalmente, a

solubilidade relativa da molécula-hóspede no ambiente circundante e a solubilidade do

complexo contribuem para definir o equilíbrio final. A temperatura, o pH e outras

moléculas-hóspedes competidoras podem, também, afectar o equilíbrio (Cabral

Marques, 1994b).

A extensão da complexação em meio aquoso, ou seja, a estabilidade do

complexo formado, é caracterizada pela constante de estabilidade, também chamada

de associação (Ka) ou dissociação (KD), e depende de como a molécula-hóspede (F)

se encaixa na cavidade da CD. A razão entre a constante de velocidade de

recombinação (KR) e a constante de velocidade de dissociação (KD) traduz a

magnitude da estabilidade do complexo, Ke = Ka:b = KR / KD =FaCDb / [F]a x [CD]b,

em que a:b representa a razão molar de F incluído na CD. Quanto maior esta razão,

maior é a estabilidade do complexo (Cabral Marques, 1994a; Stella et al, 1999; Veiga,

1996).

A dissociação de moléculas da cavidade das ciclodextrinas ocorre

rapidamente, com um tempo de semi-vida das moléculas na cavidade da ciclodextrina

Page 50: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

50

em torno de mili a micro segundos ou menor, independentemente da molécula e da

sua constante de estabilidade. A libertação de moléculas da cavidade da ciclodextrina

não deve ser um factor limitante (Stella et al, 1999).

Cramer e colaboladores (Cramer, 1967), descreveram o mecanismo de

formação dos complexos de inclusão entre um corante e a α-ciclodextrina em solução

aquosa, segundo várias etapas:

1. Aproximação da molécula hóspede à molécula de CD.

2. Quebra da estrutura da água existente no interior da cavidade da CD e

remoção de algumas das moléculas de água da cavidade.

3. Quebra da estrutura da água em volta da parte da molécula hóspede que vai

ser incluída na CD e transporte de algumas moléculas de água para a solução.

4. Interacções dos grupos substituintes da molécula hóspede com os grupos

existentes na superfície ou no interior das CDs.

5.Possível formação de ligações de hidrogénio entre a molécula hóspede e a

CD (a formação de ligações de hidrogénio é um processo extremamente rápido, e

como tal, não pode ser considerado como uma fase determinante para a reacção de

inclusão).

6. Reconstituição da estrutura da água em volta das partes expostas da

molécula hóspede, após o processo de inclusão.

As etapas 2, 3 e 6 estão relacionadas com a estrutura da água que envolve os

componentes da reacção de complexação.

Nas etapas 1, 4 e 5 estão envolvidos factores estereoquímicos: a estabilidade

ou a velocidade de formação dos complexos poderá estar dependente da geometria

das moléculas, ou seja, poderá ser observada inibição estereoquímica. Dentro da

mesma classe de moléculas hóspede, as etapas 1, 2 e 6 poderão não ser a fase

determinante da velocidade de reacção; no entanto, quando existe uma especificidade

cinética dos substituintes, as etapas 3 e 4 e possivelmente a 5 podem ser

determinantes no processo.

Page 51: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

51

Não existe um modelo único de mecanismo de complexação, nem tão pouco

uma completa definição sobre qual o passo determinante da velocidade de

complexação (Veiga, 2006).

Formação de complexos de inclusão em solução

A formação de complexos de inclusão em solução define-se como um equilíbrio

termodinâmico ou cinético entre o complexo formado e os respectivos componentes

no estado livre, representado por:

mS + nCD --- SCD

(a-mx) (b-nx) x

em que S,CD, SCD, representam respectivamente, a molécula hóspede (substrato), a

ciclodextrina e o complexo de inclusão, x é a concentração molar do complexo e a e b

são as concentrações iniciais da molécula hospede e da ciclodextrina,

respectivamente, m representa a quantidade hospede e n a quantidade de

ciclodextrina.

Estes parâmetros são significativamente afectados pelas condições do meio,

tais como a diluição, a concentração, as alterações de temperatura, o pH e a

polaridade do solvente.

Este equilíbrio pode ser quantitativamente descrito através da constante de

estabilidade (Km:n), definida pela seguinte equação:

Km:n = x/(a-mx)m . (b-nx)n

Todos os métodos utilizados para calcular as constantes de estabilidade de um

complexo baseiam-se na determinação da variação de certas propriedades físicas e

químicas da molécula-hóspede quando se encontra na presença de diferentes

Page 52: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

52

concentrações de ciclodextrinas (Uekama e Otagiri, 1987; Hirayama e Uekama, 1987).

Degradação, Absorção e Metabolismo das Ciclodextrinas

As ciclodextrinas têm a particularidade de serem bastante resistentes às

enzimas que hidrolisam o amido. São totalmente resistentes às β-amilases, uma vez

que não possuem grupos terminais livres susceptíveis de serem atacados por esta

enzima. No entanto, as β-amilases, que não necessitam de grupos terminais livres,

são capazes de as hidrolisar, provocando a clivagem das moléculas.

A velocidade de degradação das ciclodextrinas é variável, sendo a mais lenta a

da β-ciclodextrina e a mais rápida a da γ-ciclodextrina, uma vez que, quanto maior for

o tamanho da cavidade da ciclodextrina, mais fácil é o ataque da enzima às ligações

glicosídicas (Szejtli, 1987).

Contrariamente às moléculas hóspede que são rápida e extensamente

absorvidas, as moléculas de ciclodextrina, devido ao seu elevado tamanho, e a sua

superfície externa fortemente hidrofílica, são absorvidas na forma intacta numa

quantidade insignificante (Szejtli, 1984).

As ciclodextrinas são metabolizadas principalmente pela flora do cólon e os

seus produtos de degradação (maltodextrinas lineares, maltose e glicose) são

posteriormente metabolizados e absorvidos, como os do amido, e, finalmente

excretados sob a forma de dióxido de carbono e água. A principal diferença entre o

metabolismo do amido e o das ciclodextrinas é que o amido é degradado no intestino

delgado, enquanto que as ciclodextrinas são degradadas no cólon;

consequentemente, os máximos de intensidade da degradação são verificados,

respectivamente a cerca de 1 a 2 horas (amido) e de 6 a 8 horas (ciclodextrinas), após

sua ingestão (Gerloczy, 1986).

As ciclodextrinas metiladas apresentam a particularidade de serem resistentes

às amilases bacterianas do tracto gastrintestinal, sendo eliminadas, sob a forma não

degradada, pelas fezes (Duchêne, 1990b).

Page 53: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

53

Estes factos foram concluídos após a realização de vários estudos.

Experiências realizadas com ratos alimentados com β-ciclodextrina, amido ou glicose

marcadas com 14C, mostraram que quantidades máximas de 14CO2 libertadas pelos

animais que ingeriram amido ou glicose foram detectadas ao fim de 2 horas, enquanto

o máximo obtido para o grupo que ingeriu β-ciclodextrina foi conseguido no fim de

cerca de 9 horas. Após a administração de glicose, ceca de 8% da radioactividade

absorvida foi detectada no sangue ao fim de 10 minutos. Quando a β-ciclodextrina foi

administrada, menos de 2% da radioactividade absorvida foi determinada no sangue

ao fim de 6 a 12 horas (Gerloczy, 1982). Como a absorção das ciclodextrinas não

degradadas é muito limitada, a origem da radioactividade é atribuída à glicose que se

forma a partir das ciclodextrinas, por acção das amilases da microflora bacteriana do

cólon. As amilases pancreáticas e salivares são também capazes de hidrolisar as

ciclodextrinas (Marshall, 1981).

A absorção e o metabolismo da dimetil β-ciclodextrina em ratos foram

igualmente estudados após a administração de ciclodextrina marcada com 14C. Na

dose de 1g/kg, menos de 10% de radioactividade foi absorvida, o nível de

radioactividade no sangue foi muito baixo e também não se detectou, sob a forma de

14CO2, no ar expelido pelos animais (Szejtli, 1987).

Muitas das estirpes bacterianas (24 de 30) isoladas do cólon humano foram

capazes de degradar as ciclodextrinas, o que indica que as bactérias do cólon podem

ter um papel importante na sua hidrólise. Os produtos da hidrólise das ciclodextrinas

incluem glicose e malto-oligassacarídeos que, como é sabido, são fermentáveis pelos

anaeróbios do cólon originando, entre outros produtos, ácidos gordos e gases

flatulentos (Szejtli, 1990).

Ciclodextrinas na administração dérmica

A principal barreira cutânea na administração de fármacos é o estrato córneo.

Os promotores de absorção clássicos usados em administração dérmica, tais como os

Page 54: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

54

ácidos gordos e os álcoois, permeam o estrato córneo e reduzem temporariamente as

propriedades de barreira do mesmo. No entanto, as ciclodextrinas conseguem chegar

ao estrato córneo apenas em quantidades insignificantes (Rajewski e Stella, 1996).

Como as ciclodextrinas aumentam a permeação de fármacos, aumentando a

quantidade dos mesmos disponíveis no estrato córneo, e os promotores de absorção

clássicos reduzem a função de barreira do estrato córneo, ambos podiam empregar-se

para obter um efeito sinérgico.

Estudou-se em ratos o efeito sobre a administração transdérmica de

testosterona que proporcionava o emprego conjunto de ciclodextrinas e de um

promotor clássico de absorção (extracto de glicerol monoéster). Observou-se um

aumento do fluxo de testosterona de 60% quando se adicionou ao creme O/A a

ciclodextrina e um aumento de 40% quando se adicionou o extracto. O emprego

conjunto de ambos, extracto e ciclodextrina, permitiu obter um aumento de 80% no

fluxo de testosterona (Adachi et al, 1993).

Em geral, as ciclodextrinas não aumentam a velocidade de libertação de

fármacos incorporados em veículos não aquosos. Por exemplo, foi comprovado que

tanto a β-CD como a 2-HPβCD reduzem a quantidade de hidrocortisona libertada de

emulsões hidrófobas, mas aumentam a libertação das mesmas em emulsões hidrófilas

e geles hidrófilos (Preiss, 1995).

As ciclodextrinas também são empregues para reduzir a permeação de

componentes através da pele. Por exemplo, a adição de um excesso de 2-HPβCD a

veículos que incorporam oxibenzona (um filtro solar) reduz significativamente a

permeação transdérmica do filtro solar, melhorando o efeito fotoprotector da

formulação (Felton et al, 2002).

No entanto, apesar das CDs apresentarem a capacidade de, sob determinadas

condições específicas, extraírem componentes lipófilos das membranas biológicas, é

improvável que a ruptura da barreira biológica constitua o principal mecanismo

responsável pelo aumento da libertação transdérmica (Loftsson e Masson, 2001).

Page 55: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

55

Ciclodextrinas como promotores de absorção

As ciclodextrinas têm sido utilizadas para optimizar a libertação transdérmica

de fármacos, por via local ou sistémica.

Exemplos representativos de ciclodextrinas e seus derivados utilizados em

transdérmicos estão apresentados nas Tabelas 07 e 08.

As ciclodextrinas e os seus derivados hidrofílicos aumentam a solubilidade e a

estabilidade de fármacos em preparações dérmicas tais como soluções aquosas e

emulsões. Além disso, as ciclodextrinas e especialmente os seus derivados

hidrofóbicos podem modificar a permeabilidade dos fármacos através da pele, a

bioconversão de fármacos nos tecidos alvo e a irritação tópica causada por alguns

fármacos (Martins, 2002).

Existem diversos trabalhos que referem que a libertação de fármacos pelo

veículo é melhorada com a complexação destes com ciclodextrinas. Os exemplos

mais representativos são os corticóides dérmicos e anti-inflamatórios não-esteróides.

(Otagiri et al, 1984). Assim, é de prever que os efeitos de solubilização das

ciclodextrinas possam estar relacionados com estas na libertação de fármacos pelo

veículo. Por isso, é provável que os efeitos promotores de absorção de fármaco na

pele pelas ciclodextrinas possam ser atribuídos ao incremento de libertação de

fármacos pelo veículo (Martins, 2002).

Contudo, não é simplesmente uma adição de ciclodextrinas à formulação

farmacêutica que irá automaticamente resultar em promoção da permeação do

fármaco através da membrana. Frequentemente, surgem trabalhos em que os

complexos fármacos-ciclodextrinas resultam num decréscimo da biodisponibilidade do

fármaco. É importante usar apenas a quantidade de ciclodextrinas suficiente para

solubilizar o fármaco no veículo aquoso. Uma pequena quantidade de ciclodextrinas

em excesso resulta em decréscimo da biodisponibilidade óptima do fármaco (Loftsson

et al, 1998c).

Page 56: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

56

Tabela 04: Exemplos da utilização de ciclodextrinas em transdérmicos (Adaptado de Matsuda e Arima, 1999).

CDs Abreviatura Promoção Fármaco

Α-Ciclodextrina α-CD Libertação ou permeação Miconazol

Β-Ciclodextrina β-CD Estabilidade Tixoxortol 17-butirato 21-

propionato

Libertação ou permeação Betametasona

Libertação ou permeação Ácido 4-bifenilacético

Libertação ou permeação Cloranfenicol

Libertação ou permeação Ciprofloxacina

Libertação ou permeação Acetato de etil 4-bifenilil

Libertação ou permeação Flurbiprofeno

Libertação ou permeação Hidrocortisona

Libertação ou permeação Indometacina

Libertação ou permeação Nitroglicerina

Libertação ou permeação Norfloxacino

Libertação ou permeação Piroxicam

Libertação ou permeação Prednisolona

Libertação ou permeação Prostaglandina EI

Libertação ou permeação Ácido sulfanílico

Irritação local Cloreto de cloropromazina

Irritação local Tretinoína

γ-Ciclodextrina γ-CD Libertação ou permeação Dipropionato de

beclometazona

Libertação ou permeação Betametasona

Libertação ou permeação Menadiona

Libertação ou permeação Prednisolona

Há autores que defendem que os diferentes resultados obtidos indicam que o

tipo de veículo afecta significativamente os efeitos promotores das ciclodextrinas na

libertação dos fármacos. Assim, poder-se-á afirmar que, por exemplo, as ciclodextrinas

hidrofílicas podem aumentar significativamente a liberação de corticóides e anti-

inflamatórios não-esteróides, apenas quando um veículo hidrofílico é usado. É

importante por isso referir o tipo de veículo utilizado (Matsuda e Arima, 1999).

O efeito das ciclodextrinas na velocidade de permeação de fármacos através

da pele pode ser determinado pela actividade termodinâmica do fármaco no veículo e

pelo coeficiente de partilha entre a membrana e o veículo. O conceito de actividade

termodinâmica representa a tendência que o fármaco tem em “libertar-se” do veículo.

Page 57: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

57

Supõe-se que o aumento dessa actividade leva a um aumento da velocidade de

permeação do fármaco através da pele. A actividade termodinâmica é directamente

proporcional à solubilidade do fármaco no veículo e é máxima quando se tem uma

solução saturada (Martins, 2002).

Os resultados encontrados por Loftsson sustentam estas hipóteses (Loftsson et

al, 1998c). Quando a concentração de hidrocortisona foi mantida constante e a

concentração de randomil-β-ciclodextrina (RM-β-CD) foi gradualmente aumentada, o

fluxo através da pele de ratos depilada foi incrementado até um certo ponto, enquanto

todas as moléculas de hidrocortisona estavam em solução. Depois o fluxo começou a

decrescer com o incremento de concentração de ciclodextrina. O fluxo máximo foi

obtido quando apenas a quantidade suficiente de RM-β-CD foi adicionada para

dissolver todo o fármaco no veículo aquoso.

Estes resultados estão de acordo com o conceito de actividade termodinâmica

em suspensão (Matsuda e Arima, 1999). Apesar da actividade termodinâmica do

fármaco em solução ser constante acima da concentração de saturação, uma

concentração de RM-β-CD acima da concentração ideal faz decrescer a libertação de

hidrocortisona. Este facto pode ser explicado pela formação no veículo de maior

quantidade de complexo não absorvível.

As ciclodextrinas promovem a permeação de fármacos lipofílicos, tais como

corticóides e antiflamatórios não-esteroides através da membrana, por incremento da

actividade termodinâmica do fármaco nos veículos aquosos. No entanto, uma

quantidade adicional de ciclodextrina faz diminuir a velocidade de permeação de

fármacos lipofílicos, devido à formação de uma quantidade adicional de complexos

que não são absorvidos. Além disso, deve-se ter em consideração a possibilidade de

outros compostos adicionados em simultâneo poderem afectar os efeitos de promoção

das ciclodextrinas no desenvolvimento de fármacos transdérmicos (Martins, 2002).

As ciclodextrinas podem, ainda, desempenhar papel de co-promotores em

transdérmicos. Legendre e colaboladores, (Legendre et al, 1995) verificaram que a

Page 58: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

58

combinação entre o ácido oléico, um promotor de permeação e a RM-β-CD aumenta

significativamente, para cerca de 30 vezes, o fluxo de cloreto de S-9977, talvez devido

a um incremento da difusão do ácido oleico no estrato córneo. Assim, a combinação

de ciclodextrinas e promotores de permeação pode ser muito útil no desenvolvimento

de fármacos hidrófilos por via transdérmica (Matsuda e Arima, 1999).

O promotor de permeação “convencional” (que aumenta a permeação de

fármaco por redução da função de barreira da pele) e a CD operando por diferentes

mecanismos promovem o aumento da permeabilidade (Martins, 2002).

Em relação ao mecanismo de libertação do fármaco pelo complexo na

membrana, sabe-se que as ciclodextrinas são moléculas relativamente volumosas

(com massa molecular de 1000 até 1500Da) pelo que, em condições normais,

permeam as membranas biológicas com considerável dificuldade (Loftsson et al,

1998c).

Sugere-se que as ciclodextrinas actuem como transportadores, captando as

moléculas de fármaco hidrofóbico em solução e distribuindo-o à superfície das

membranas biológicas, como a pele, mucosas ou córnea, onde o fármaco é partilhado

com a membrana. A membrana relativamente lipofílica tem baixa afinidade pelas

moléculas de ciclodextrinas hidrofílicas (Krzysztof, 2007).

Por esta razão, elas permanecem na fase hidrofílica da membrana, isto é, no

veículo aquoso (creme óleo/água ou hidrogele) (Loftsson, 1998b).

Assim, as ciclodextrinas hidrofílicas e os seus complexos dificilmente são

absorvidos através da pele, isto é, apenas a fracção livre de fármaco vai sendo

absorvida. Existe equilíbrio dinâmico entre o fármaco ligado e o fármaco em solução,

tal como esquematizado na Figura 14 (Martins et al, 2002).

Page 59: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

59

Tabela 05: Exemplos de utilização de derivados de ciclodextrinas em transdémicos (Adaptado de Matsuda, e Arima, 1999).

CDs Abreviatura Promoção Fármaco

Dimetil-β-

ciclodextrina

DM-β-CD

Libertação e ou permeação Ácido 4-bifenilacético

Libertação e ou permeação Acetato de etil 4 bifenilil

Libertação e ou permeação Indometacina

Libertação e ou permeação Prednisolona

Libertação e ou permeação Ácido sulfanílico

Irritação local Clorpromazina

Randomil metil -

β-ciclodextrina

RM-β-CD

Libertação e ou permeação Acitretina

Libertação e ou permeação Hidrocortisona

Libertação e ou permeação Piribedila S-9977

Hidroxipropil - β-

ciclodextrina

HP-β-CD

Libertação e ou permeação Ácido 4-bifenilacético

Libertação e ou permeação Dexametasona

Libertação e ou permeação 17 β-estradiol

Libertação e ou permeação Acetato de etil 4-bifenilil

Libertação e ou permeação Hidrocortisona

Libertação e ou permeação Liarosol

Libertação e ou permeação Miconazol

Maltosil-β-

ciclodextrina

G2-β-CD Libertação e ou permeação Hidrocortisona

Polímero

β-ciclodextrina

Polímero

β-CD

Libertação e ou permeação Tolmaftato

Libertação e ou permeação Indometacina

Dietil-β-CD DE-β-CD Libertação e ou permeação Nitroglicerina

Carboximeti l- β-

ciclodextrina

CM-β-CD Libertação e ou permeação Hidrocortisona

Carboximetil-etil-

β-ciclodextrina

CME-β-CD Libertação e ou permeação Prostaglandina EI

Figura 14. Permeação do fármaco através da membrana biológica em veículo aquoso da ciclodextrina (C – Ciclodextrina; D – Fármaco) (Rajeswari, 2005).

Page 60: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

60

Objectivo geral

Este estudo teve como objectivo a formação de complexos de inclusão entre

um antifúngico, o miconazol, fármaco insolúvel em água e uma ciclodextrina

modificada, metil-β-ciclodextrina.

Em primeiro lugar foram realizados estudos de solubilidade de fases para

estabelecer a estequiometria dos complexos com duas ciclodextrinas modificadas. A

formação dos complexos foi realizada no estado sólido utilizando os métodos de

malaxagem, co-evaporação, secagem por pulverização e liofilização.

Posteriormente, os complexos formados foram caracterizados por diversas

técnicas tais como a análise térmica, difracção de raios X, espectroscopia de

Infravermelho de Fourier e ainda pela microscopia electrónica de varrimento.

De seguida, procedeu-se ao desenvolvimento de uma forma farmacêutica

semi-sólida, um hidrogele, o qual deveria apresentar as seguintes características:

maior adesividade e aumento da disponibilidade do fármaco, pelo aumento da sua

solubilidade. Foi igualmente elaborado um estudo reológico da formulação base

desenvolvida.

Por último, foi avaliada e comparada a libertação in vitro do fármaco, da

formulação desenvolvida contendo o fármaco e, contendo o complexo, com a

formulação disponível no mercado Português, bem como a influência da ciclodextrina

em termos de promoção da absorção

Page 61: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Introdução

61

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Page 69: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo I

69

FORMAÇÃO DOS COMPLEXOS DE INCLUSÃO EM SOLUÇÃO

INTRODUÇÃO

O método de solubilidade de fases, descrito em 1965 por Higushi e Connors é

habitualmente utilizado como primeira verificação da formação de complexos de

inclusão em solução (Higushi e Connors, 1965). Este método fundamenta-se na

monitorização das alterações de solubilidade das moléculas hóspedes induzidas pela

adição de ciclodextrinas. A molécula hóspede é adicionada, em excesso, a várias

soluções de ciclodextrina de concentrações crescentes. As diferentes amostras são

submetidas à agitação e, após ter sido alcançado o equilíbrio, são filtradas de modo a

determinar a concentração da molécula-hóspede em solução (Higushi e Connors,

1965). A capacidade de solubilização das ciclodextrinas é então quantativamente

avaliada por intermédio de diagramas de solubilidade de fases, que não são mais do

que representações gráficas das variações de solubilidade das moléculas hóspedes

em função do aumento da concentração das ciclodextrinas. Os diagramas de

solubilidade de fases são dependentes do modelo de equilíbrio que se estabelece

durante a formação dos complexos de inclusão, estando classificados basicamente em

dois tipos, A e B, que apresentam por sua vez diferentes subtipos (Higushi e Connors,

1965) tal como se encontra representado nas Figuras 15 e 16.

Aos diagramas de tipo A corresponde a formação de complexos solúveis e,

portanto, um aumento da solubilidade da molécula hóspede em função do aumento da

concentração de ciclodextrina. Dependendo da natureza dos complexos formados, os

diagramas poderão ser lineares AL, ou apresentarem uma curvatura positiva, AP, ou

negativa, AN. Os diagramas lineares resultam da formação de complexos de primeira

ordem relativamente à ciclodextrina e de ordem 1 ou maior que 1 relativamente à

molécula hóspede. Se o declive destes diagramas for superior a um, significa que

ocorreu a formação de complexos de ordem superior relativamente à molécula

Page 70: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo I

70

hóspede. No caso do declive ser inferior a 1, apesar de não se excluir a possível

presença de complexos de ordem superior, é geralmente assumida uma

estequiometria 1:1.

Quando mais de uma molécula de CD intervém para a formação do complexo

de inclusão, resulta um diagrama do tipo AP, ou seja o complexo é de ordem 2 ou

superior a 2 no que diz respeito à CD, e de ordem 1 em relação à molécula hóspede.

Os diagramas do tipo AN não são muito comuns mas podem resultar da auto-

agregação dos complexos em solução ou do facto de estarem presentes no meio de

complexação elevadas concentrações dos agentes complexantes que podem causar

alterações na natureza do solvente (Fromming e Szejtli, 1994; Mosher e Thompson,

2002).

Figura 15. Representação do Diagramas de Fases (Adaptado de Fromming e Szejtli, 1994)

Em oposição, os diagramas do tipo B correspondem a formação de complexos

insolúveis ou de solubilidade limitada e inferior à da ciclodextrina. Na figura 15, o

segmento S0-A da curva BS demonstra a formação de um complexo que é responsável

pelo aumento da solubilidade da molécula hóspede, a que corresponde um fenómeno

semelhante ao que ocorre no diagrama AL. Porém, a partir do ponto A, atinge-se o

Page 71: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo I

71

valor limite de solubilidade da molécula hóspede. A adição de mais CD resulta na

formação de mais complexo com consequente precipitação e a concentração do

hóspede não complexado é mantida constante pela solubilização de hóspede sólido.

No ponto B, todo o fármaco sólido foi consumido e a adição de mais fármaco resulta

na depleção deste para a solução por formação de complexo e pela concomitante

precipitação do complexo insolúvel. Este fenómeno origina uma diminuição da

solubilidade da molécula hóspede para um valor constante correspondente à

solubilidade do composto de inclusão (SC). No caso do composto de inclusão

responsável pelo aumento inicial da solubilidade ser o mesmo que posteriormente

precipita, o aumento da solubilidade da molécula hóspede de S0 até ao ponto A deverá

ser idêntico a SC. Nem sempre esta situação é verificada devido à formação de

compostos de inclusão de ordem molecular superior na presença de elevadas

concentrações de ciclodextrina.

O diagrama de solubilidade de tipo Bi é interpretado de uma forma similar ao

do tipo BS, com a diferença do complexo formado ser de tal forma insolúvel que o

aumento inicial da concentração de fármaco não é detectável (Mosher e Thompson,

2002).

Figura 16. Modelos cinéticos que se estabelecem durante a formação, em solução, de complexos de inclusão. S0 e Sc correspondem respectivamente a solubilidade da molécula hóspede na ausência de CD e o limite de solubilidade do complexo formado. Kc representa a constante de estabilidade do complexo formado. (Adaptado de Fromming e Szejtli, 1994).

Page 72: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo I

72

Tendo por base a informação resultante dos diagramas de solubilidade de

fases, podem ser determinados dois parâmetros de elevado interesse, associados à

formação dos complexos de inclusão e que caracterizam o grau de interacção

molecular entre os diversos componentes do complexo: estequiometria dos complexos

e respectivo valor da constante de estabilidade (Kc).

A estequiometria, o valor de KC dos complexos formados e a consequente

eficiência de complexação podem ser facilmente determinados a partir do segmento

ascendente linear dos diagramas de solubilidade de fases, caso estes sejam do tipo

AL, AP ou BS. Perante um segmento linear obtido nestes diagramas é assumida a

formação de complexos de estequiometria 1:1 (Figura 17).

Figura 17. Eficiência de complexação de um complexo fármaco-CD de estequiométrica 1:1 (Adaptado de Loftsson et al., 1999).

Se a este segmento corresponder um declive equivalente a 1, teremos uma

situação em que uma mole de moléculas de hóspede é complexada por uma mole de

moléculas de ciclodextrina e portanto uma eficiência de complexação será igual a

100%. Porém, esta situação raramente acontece. Na grande maioria dos casos, o

declive observado para o fragmento linear dos diagramas de solubilidade de fases

apresenta um valor inferior a 1 e a eficiência de complexação resultante é inferior a

100%. Assumindo a formação de um complexo de estequiometria 1:1, ou seja, de

primeira ordem relativamente à ciclodextrina (n=1) e de ordem 1 relativamente à

molécula hóspede (m=1), ter-se-á a situação representada pelo seguinte equilíbrio:

KC M Hóspede +n CD ↔ Hóspedem-CD

Page 73: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo I

73

Sendo o valor de KC determinado pela seguinte equação:

Kc= [Hospedem-CDn ]/[hóspede ]m [CD]n (Eq. 1)

Nesta situação a solubilidade total da molécula hóspede poderá ser calculada a

partir das seguintes expressões (Loftsson et al, 2004):

St = S0 +m x [Hóspedem-CDn ] (Eq. 2)

onde St corresponde à solubilidade da molécula hóspede livre e sob forma

complexada, S0 à solubilidade intrínseca da molécula hóspede, [Hóspedem-CDn ] ao

complexo de estequiometria 1:1 (m e n são iguais a 1) e KC ao valor da constante de

estabilidade do complexo hóspede-CD.

Uma vez que a representação gráfica de St em função da concentração de

ciclodextrina é uma recta cuja ordenada na origem é igual a S0 e o declive é igual a

(KC x S0)/(1 +KC x S0), a constante de estabilidade pode ser facilmente deduzia a partir

do declive e da ordenada na origem do segmento linear ascendente a partir da

seguinte equação, vulgarmente conhecida por equação de Higushi e Connors (Higushi

e Connors, 1965):

KC = declive/ S0 x (1- declive) (Eq. 3)

No caso do complexo formado ser de ordem 2 ou superior a 2 no que diz

respeito a CD (n≥2), e de ordem 1 em relação à molécula hóspede (m=1), situação

correspondente a um diagrama de solubilidade do tipo AP, a solubilidade total da

molécula hóspede poderá ser calculada a partir das seguintes expressões, assumindo

a formação de complexos de estequiometria 1:1 e 1:2 (Loftsson et al, 2004):

Page 74: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo I

74

St= S0 + [Hospede-CD ] + 2 x [Hospede-CD2 ] (Eq.4)

= S0 + (Kc(1:1) x S0 x [CD]) + (Kc(1:1) x K(1: 2) x S0 x [CD]2) (Eq. 5)

Onde KC(1:1) e KC(1:2) correspondem respectivamente às constantes de

estabilidade dos complexos de estequiometria 1:1 e 1:2, e [Hospede-CD] e [Hóspede-

CD2] aos complexos de estequiometria 1:1 e 1:2. O valor de KC (1:1) é determinado a

partir da equação 5, sendo então possível a determinação de KC (1:2).

No caso dos diagramas do tipo AN, o valor de KC não pode ser calculado

devido às interacções complicadas estabelecidas entre soluto/soluto e soluto/solvente

(Veiga et al, 1996;Uekama et al, 1998).

A determinação da constante de estabilidade do diagrama do tipo Bs pode

ainda ser efectuada recorrendo à parte descendente da curva, segundo a equação:

K1:2 = SB/(SX-SB)(CDX-2SB)2 (Eq. 6)

em que SB é a solubilidade molar do complexo e SX e CDX as concentrações molares

totais da molécula hóspede e da ciclodextrina, respectivamente, para um determinado

ponto descendente da curva de solubilidade.

Num sistema tipo Bs é possível determinar a estequiometria do complexo

precipitado a partir da fração da curva de solubilidade em forma de platô, segundo a

equação:

Razão molar = (MT - MA)/CD(A-B) (Eq. 7)

onde MT representa a quantidade total de molécula-hóspede adicionada, MA a

quantidade da molécula-hópede dissolvida no início do platô (ponto A) e CD(A-B) a

quantidade de ciclodextrina correspondente à fração da curva em platô (entre o ponto

Page 75: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo I

75

A e B). A estequiometria calculada por esta técnica pode ser confirmada através da

análise química do complexo de inclusão isolado.

Muitos outros métodos utilizados nos estudos de complexação em solução têm

sido utilizados, como o método de espectroscopia de ultravioleta, a ressonância

magnética nuclear, a modelagem molecular e ainda, o dicroismo circular, a

fluorescência, a potenciometria, a cromatografia em gel, a cromatografia líquida de alta

eficiência, o coeficiente de partilha e o método cinético (Fernandes, 1999).

MATERIAL E MÉTODOS

Material

Miconazol (Lote: 00478343; Massa Molar = 416,13 g/mol) foi gentilmente cedido pela

Janssen Pharmaceutica (Beerse-Belgica) a Metil-β-ciclodextrina (Lote: 781144; Massa

Molar = 1190 g/mol, com grau médio de substituição de 0,5) e a HPBCD (Lote:

E812M; Massa Molar = 1480 g/mol, com grau de substituição de 0,63) = pela

Roquettte (Lestrem, France). As soluções foram preparadas com água destilada.

Todos os reagentes usados foram de grau analítico.

Métodos

Doseamento espectrofotométrico do MCZ

Pesaram-se rigorosamente 100 mg de MCZ o qual foi dissolvido em 100ml de

uma solução hidroalcóolica (1:1) etanol: água, num balão volumétrico graduado. A

partir da solução anterior (1mg/ml) preparam-se 8 soluções padrão com concentrações

de 0,1 a 0,8 mg/ml numa mistura etanol/água (1:1). Estas soluções foram preparadas

3 vezes de igual modo em 3 dias diferentes. A curva de calibração foi construída com

absorvâncias lidas a 272 nm (Cavrini, 1989) versus concentrações e validada

conforme em anexo.

Page 76: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo I

76

Diagrama de solubilidade de fases

O estudo de solubilidade de fases foi realizado de acordo com o descrito por

Higuchi e Connors (1965). Pesaram-se quantidades de MCZ em excesso em frascos

âmbar, de 50ml, aos quais se adicionaram 30mL de soluções de ciclodextrinas de

concentrações crescentes (0 – 0,12M e 0 – 0,2M de Metil-β-CD e HP-β-CD,

respectivamente). Os frascos foram fechados e sujeitos a agitação à temperatura

ambiente (cerca 25 ±2ºC) durante 6 dias. Este período de tempo foi estabelecido com

base em estudos preliminares, cujos resultados indicaram que ao fim daquele período,

a solubilidade do MCZ se mantinha constante.

Após ter sido alcançado o equilíbrio, o conteúdo de cada frasco foi filtrado

através de um filtro de 0,45 µm (Millipore). As soluções filtradas foram diluídas

adequadamente com etanol e o teor de MCZ dissolvido foi determinado

espectrofotometricamente a 272 nm (Shimadzu UV 160). As leituras foram feitas 3

vezes para cada solução.

Detecção no ultravioleta

As leituras espectrofotométricas foram realizadas, recorrendo a um

espectrofotómetro (Shimadzu UV-Visible 1603). A absorção máxima do miconazol é

de 272 nm no solvente escolhido, etanol/água (1:1), sendo este valor confirmado

através aquisição de um espectro percorrendo toda a região espectral

electromagnética. As leituras das absorvâncias foram feitas 3 vezes para cada

solução.

Page 77: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo I

77

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Estudo de solubilidade de fases

Segundo a classificação de Higuchi e Connors (1965) os diagramas de

solubilidade de fases da formação de complexos entre o MCZ e as ciclodextrinas em

solução aquosa, são diagramas do tipo Ap para a Metil-β-CD e a HP-β-CD (Figuras 18

e 19), indicando que não há precipitação do complexo (Pedersen, 1993). Este tipo de

diagrama demonstra a formação de complexos solúveis na gama de concentrações

das ciclodextrinas estudadas.

A estequiometria do complexo de inclusão foi analisada com base no gráfico de

solubilidade de fases. As constantes de estabilidade (Kc) foram determinadas a partir

das rectas iniciais e lineares dos diagramas de solubilidade de fases, considerando

que se formam complexos de inclusão com estequiometria (1:1) e (1:2), (sendo o

declive da recta menor que 1 para ambas ciclodextrinas).

-0.02 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14

0.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025

0.0030

Con

c. M

CZ

(M

)

Conc. MBCD (M)

Figura 18: Diagrama de solubilidade de fases do sistema MBC/MCZ em água destilada. Valores de desvio padrão para n=3.

Page 78: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo I

78

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

0.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025

0.0030

Con

c. M

CZ

(M

)

Conc.HPBCD (M)

Figura 19: O cálculo de Kc foi obtido de acordo com a equação desenvolvida por Higuchi e Connors (1965):

Kc = Declive/[S0 (1- Declive)] (Eq.8)

onde S0 representa a intersecção da curva, e para a Kc (1:2) pela equação:

= S0 + (Kc(1:1) x S0 x [CD]) + (Kc(1:1) x K(1: 2) x S0 x [CD]2) (Eq. 9)

Os resultados de eficiência de solubilização e os valores das constantes de

estabilidade dos complexos MCZ/Metil-β-CD e MCZ/HP-β-CD estão indicados na

tabela 6.

Page 79: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo I

79

Tabela 06: Solubilidade máxima do MCZ atingido nas soluções de CDs.Parâmetros derivados dos respectivos diagramas de fases.

Complexo

binário

[MCZ] máxima

(10-3M)a

Tipo do

diagrama

Eficiência de

solubilizaçãob

Kc (1:1) Kc (1:2)

MCZ-HPβCD 2,94 ± 0,008 AP 45,18 126,94±4,4M-1 2,20 ± 0,4M-1

MCZ-MβCD 2,94 ± 0,02 AP 45,10 145,69± 4,1M-1 11,11±0,5M-1

Valores de Desvio Padrão para n=3 a Solubilidade do MCZ na concentração máxima de CD testada; b Parâmetro calculado pelo coeficiente dos valores de solubilidade máxima do MCZ nas soluções de CDs e o valor da sua solubilidade intrínsica (27,10µg/ml).

Como se pode constatar, as constantes de estabilidade (Kc) dos complexos de

MCZ com HP-β-CD têm valores muito próximo das obtidas com a MβCD. No entanto o

dobro de concentrações de HPβCD foi utilizado para se obter valores muito próximos

aos obtidos com a MβCD.

Os valores relativamente baixos das constantes de estabilidade indicam que as

interacções existentes entre o fármaco e ciclodextrina não são muito fortes, embora

aqueles valores estejam dentro ou próximo dos limites considerados por Pitha (Pitha et

al., 1983), ao estabelecer que os complexos de inclusão com aplicação prática

deverão apresentar valores Ks entre 200 e 5000 M-1. Com Ks inferiores, o fármaco é

rapidamente libertado, reduzindo o efeito que a complexação tem na dissolução,

enquanto que com Ks superiores, os complexos libertam muito lentamente a

substância activa.

Contudo, se atendermos aos resultados obtidos com complexos de inclusão de

outros fármacos e que apresentavam constantes de estabilidade mais baixas do que

as obtidas neste trabalho, podem os complexos MCZ/MβCD e MCZ/HPβCD contribuir

para o aumento da solubilidade e consequentemente para a melhoria da

biodisponibilidade do miconazol.

Já foi demonstrado na literatura que αCD, βCD, HPβCD e SBE7-βCD foram

capazes de formar complexos de inclusão com o miconazol e de aumentar a sua

solubilidade aquosa (Van Doorne, 1988; Mura, 1992; Pedersen, 1993a,b; Pedersen,

1994; Bononi 1995, Piel, 1998).

Page 80: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo I

80

Piel e colaboladores concluíram que com a mesma concentração de

ciclodextrina (10mM), o aumento da solubilidade do miconazol foi de 9, 29 e 68 vezes

com a HPβCD, βCD e SBE7-βCD (Piel, 1998).

A adição das CDs permitiu um aumento de solubilidade do MCZ cerca de 45

vezes superior à sua solubilidade intrínseca. Este resultado foi o mesmo para as duas

CDs testadas. No entanto, a escolha da MβCD para a sequência do estudo dos

complexos no estado sólido, levou-se em consideração que, o uso de uma menor

concentração da MβCD proporciona melhores resultados.

Page 81: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo I

81

CONCLUSÃO Os estudos de solubilidade de fases demonstraram serem diagramas do tipo

AP. Nestes foi observado um desvio positivo da linearidade, indicando a formação de

complexos de inclusão com uma maior ordem molecular igual ou superior a um, ou

seja, mais do que uma molécula de ciclodextrina é complexada com a molécula do

miconazol.

A estequiometria dos complexos de inclusão calculados para as duas

ciclodextrinas, HPβCD e MβCD, são de 1:1 e 1:2.

Com o valor estabelecidos das constantes de estabilidade (Kc) dos complexos

com o MCZ, considerou-se que a MβCD seria mais aplicável para a continuação dos

estudos, visto que a mesma também está relacionada com estudos de promoção de

absorção.

Page 82: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo I

82

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Page 84: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

84

PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS COMPLEXOS DE INCLUSÃO NO ESTADO SÓLIDO

INTRODUÇÃO

Na tecnologia farmacêutica a formação de complexos de inclusão com

ciclodextrinas, tem vindo a evidenciar uma grande aplicabilidade na solubilização e

estabilização de fármacos, constituindo hoje uma das técnicas muito utilizadas. Os

complexos sólidos são espécies químicas estáticas, com uma estequiometria

constante (Uekama e Otagiri, 1987). Além disso, a existência de um complexo de

inclusão em solução não garante a existência do mesmo complexo no estado sólido

(Szejtli, 1985).

É importante salientar que não existe um método universal de preparação de

complexos de inclusão. Cada molécula a complexar é um caso particular, sendo a

metodologia de preparação seleccionada em função de vários parâmetros como: o

tamanho, a geometria e a solubilidade da substância-hóspede. São considerados

critérios, tecnicamente complementares, mas determinantes na escolha do método de

preparação: o rendimento, a simplicidade, a rapidez, os custos e a facilidade de

transposição de escala (Mura et al, 1999). O método de preparação de complexos de

inclusão pode influenciar algumas características do produto final.

Atendendo a que o tipo de diagrama de solubilidade de fases do complexo

formado entre o MCZ e a MβCD é do tipo AP e, desprezando os pequenos valores de

K (1:2), foram preparados complexos com estequiometria 1:1, utilizando os métodos de

malaxagem, co-evaporação, secagem por pulverização e liofilização.

A escolha do método mais adequado para preparação do complexo de inclusão

atendeu as características físico-químicas do MCZ. A caracterização físico-química

dos complexos de inclusão no estado sólido foi efectuada por calorimetria diferencial

de varrimento difracção de raios X, espectroscopia de infravermelho com

transformadas de Fourier e ainda pela microscopia electrónica de varrimento.

Page 85: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

85

MATERIAL E MÉTODOS

Material

Miconazol (Lote: 00478343;Massa Molar = 416,13 g/mol) foi gentilmente cedido pela

Janssen Pharmaceutica (Beerse- Belgica) e Metil-β-ciclodextrina (Lote: 781144; Massa

Molar = 1190 g/mol, com grau médio de substituição de 0,5) pela Roquettte (Lestrem,

France). Os outros reagentes usados foram de grau analítico.

Métodos

Mistura física

A mistura física de MCZ/MβCD (1:1) foi preparada por mistura simples,

utilizando a técnica de diluição geométrica. Os pós foram previamente tamisados e a

seguir a mistura final em tamis (Retsch®) de 125 µm. Esta mistura serviu de referência

para comparação nos estudos de caracterização dos complexos de inclusão.

Malaxagem

Quantidades estequiométricas de MCZ e MBCD (1:1) foram malaxadas com

uma mistura de etanol/água (1:3) equivalente a 60% das massas total dos pós.

A pasta obtida foi malaxada durante 45 minutos, adicionando-se, durante o

processo, pequenas porções da mistura etanol/água de forma a manter-se a

consistência inicial. Posteriormente, a pasta foi deixada em estufa à 25ºC durante 48

horas, pulverizada a pó fino e tamisada.

Co-evaporação

Quantidades estequiométricas de MCZ e MBCD (1:1) correspondentes a 1,25g

de fármaco foram dissolvidos respectivamente em 250 ml de etanol e em uma solução

Page 86: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

86

250 ml de etanol/água (1:5). Uma vez obtidas as soluções anteriores, foram

misturadas (solução alcoólica na aquosa) sob agitação enérgica durante 24 horas.

Posteriormente, procedeu-se à eliminação dos solventes da solução límpida

por evaporação sob vácuo a 50ºC em evaporador rotativo (Heidolph, Laborota 4001).

Os resultantes resíduos sólidos foram secos até peso constante em estufa a

40ºC, e convenientemente pulverizados e tamisados.

Secagem por pulverização

Pesaram-se 2 g de MCZ e 5,72 g de MBCD e dissolveram-se em 500mL de

etanol e em 500mL de água destilada, respectivamente. Uma vez obtidas as soluções

anteriores, foram misturadas (solução alcoólica na aquosa) sob agitação enérgica

durante 24 horas.

Posteriormente, procedeu-se à eliminação dos solventes, pulverizando a

solução num spray-dryer (Labplant SD05), sob as seguintes condições: velocidade de

fluxo da solução variável 450 – 600 ml/h; temperatura de entrada entre 150-160ºC;

temperatura de saída variável entre 77 - 85ºC; pressão de ar de pulverização: 1,2 bar

e velocidade de fluxo de ar: 60 m3/hora.

Os resultantes produtos sólidos recuperados foram calibrados por tamisação,

recolhendo-se a fracção granulométria de 125 µm.

Liofilização

Quantidades estequiométricas de MCZ e MBCD (1:1) correspondentes a 2g de

fármaco foram dissolvidos em 1000 mL de água destilada e acidificado com uma

solução 0,1M de ácido clorídrico, até obter uma mistura límpida. A mistura manteve-se

sob agitação durante 24 horas, a solução foi filtrada por filtros (Millipore) de 0,45µm. A

solução obtida foi distribuída em volume de 200 ml em frascos de capacidade de 1 L, e

submetida a congelação por imersão em banho de etanol (Freezone ® modelo 79490,

Page 87: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

87

Labconco) a -40ºC durante 1 hora até completa congelação. A solução congelada foi

liofilizada em liofilizador (Lyph-lock 6, Labconco) durante 48 horas.

Os resultantes produtos sólidos recuperados foram calibrados por tamisação,

recolhendo-se a fracção granulométria de 125 µm.

O acondicionamento e a conservação de todos os sistemas binários descritos

foram realizados em frascos de vidro com tampas de borracha em excicador à

temperatura ambiente e ao abrigo da luz.

Solubilidade dos complexos de inclusão

A solubilidade aquosa de MCZ e seus complexos de inclusão foi determinada a

25 ±1 ºC. Uma quantidade em excesso correspondente a 15mg de fármaco foi

adicionada a 10 ml de água, e em 10 ml de PBS (pH 6.8) agitadas em vórtex e

deixados em ultra-som por 30 min (Jun, 2007). Posteriormente as soluções foram

colocadas sob agitação com ajuda de uma barra magnética, para cada frasco, durante

48 horas. Após este período as amostras foram filtradas por membrana de 0,45 µm

(Millipore) e adequadamente diluídas em etanol. A quantificação do MCZ nos filtrados

foi efectuada por espectroscopia de UV a 272 nm

MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUIMICA

Microscopia electrónica de varrimento (SEM)

A morfologia do MCZ, MBCD e os sistemas binários foram examinados através

de um microscópio electrónico de varrimento (Jeol, modelo JSM 5310. Tokio, Japão).

Para a observação ser exequível, as amostras, sob forma de pós, foram

fixadas numa dupla fita adesiva e revestidas, sob vácuo, com uma fina película de

ouro, de aproximadamente 300 Å de espessura, de modo a torná-las electricamente

condutoras. As amostras foram observadas com um potencial eléctrico de excitação

Page 88: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

88

de 20 kV, com ampliações de 500 a 3500 vezes, tendo o registo das mesmas sido

feito por uma máquina fotográfica Pentax, modelo MZ-10.

Calorimetria diferencial de varrimento (DSC)

As determinações de análise térmica dos vários compostos foram realizadas,

utilizando a técnica de calorimetria diferencial de varrimento (DSC- “differential

scanning calorimetry”) num calorímetro Shimadzu, modelo 50, associada a um

analisador térmico, com ligação a um sistema informático TA-50WS/PC.

As amostras de massas compreendidas entre 1 -2 mg, colocadas em cápsulas

de alumínio abertas, foram aquecidas à velocidade de 10ºC/min de 30 a 250ºC sob um

fluxo de azoto de20 ml/min. Como referência, utilizaram-se cápsulas de alumínio

vazias.

A calibração da temperatura do aparelho foi periodicamente avaliada no

decorrer destes ensaios, utilizando-se como padrão o índio (99,98%, ponto de fusão

de 156,65ºC, Aldrich®).

Difracção de raios X (RX)

Os perfis de difracção, do MCZ, MBCD e os sistemas binários foram realizadas

através de um difractómetro automatizado Philips X'Pert modelo PW 3040/00, com

geometria Bragg - Brentano e uma fonte de raios – X de Colbalto, utilizando um

potencial eléctrico de 40 kV e uma intensidade de corrente de 35 mA. Os

difractogramas foram obtidos no intervalo de ângulo 2θ de 5 a 60º, nas seguintes

condições: amplitude do intervalo de varrimento de 0,025º (2θ), velocidade angular de

varrimento de 0.5s e tempo total de 30 min.

O grau relativo de cristalinidade (RDC) foi determinado utilizando-se a seguinte

equação:

REF

SA

I

IRDC =)( Eq.10

Page 89: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

89

onde o ISA é o pico encontrado da amostra, no mesmo ângulo da referência e o IREF é a

altura do pico de maior intensidade da referência. O MCZ foi utilizado como referência

(Ribeiro 2000 e Veiga e Diaz 1998).

Espectroscopia de infravermelho com transformadas de Fourier (FTIR)

Os espectros de FTIR dos componentes singulares e dos sistemas binários

foram obtidos num espectrómetro Nicolet Magna IR-750. A obtenção dos espectros foi

realizada directamente nas amostras em pó, através do programa adaptado ao

espectrofotometro Ominic E.S.P., aplicando transformação de Fourier de 64

varrimentos, na região espectral de 4000 a 600 cm-1.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Preparação dos complexos no estado sólido

São muitos os processos pelos quais se obtêm complexos de inclusão no

estado sólido. No entanto não se pode eleger um método de preparação como sendo

o melhor, uma vez que cada processo tem de ser desenvolvido em função do fármaco

a complexar, CDs e outros agentes co-complexantes utilizados. A selecção dos

métodos de preparação dos complexos em estado sólido é muitas vezes feita em

função do equipamento disponível para o efeito, da simplicidade do método, do

rendimento final do produto obtido e ainda da facilidade de transposição de escala

laboratorial para industrial. Outros factores intrínsecos relacionados com os métodos

de preparação, que deverão ser optimizados para garantir a produção de complexos

de inclusão sólidos de elevada qualidade e com maior rendimento possível, são a

temperatura e volumes de água, o tempo de mistura e as condições e tempos de

secagem utilizados (Hedges, 1998).

Após os estudos em solução pelo método de solubilidade de fases,

evidenciaram-se diagramas de solubilidade de fases do tipo AP e, portanto, estes

Page 90: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

90

complexos apresentaram-se solúveis. Com estes dados e com a disponibilidade dos

equipamentos, seleccionaram-se diferentes métodos de preparação, nomeadamente

malaxagem, co-evaporação, liofilização e secagem por pulverização para a produção

e estudo dos complexos no estado sólido.

Microscopia electrónica de varrimento (SEM)

A microscopia electrónica de varrimento (SEM) é frequentemente utilizada para

a observação dos aspectos morfológicos microscópicos dos componentes singulares,

isto é, fármaco, CD, bem como dos produtos resultantes da sua manipulação

(Duchene, 1987), neste caso MF e complexos binários por MLX, COE, SP e LF.

O estado cristalino dos complexos, por ser diferente do obtido pela simples

mistura da molécula hóspede com a ciclodextrina, permite conhecer o estado cristalino

resultante do processo de complexação. As alterações do estado cristalino verificadas

servem de suporte para um melhor conhecimento do fenómeno de complexação

(Moyano, 1995).

As fotografias de microscopia electrónica de varrimento obtidas estão

apresentadas na Figura 20.

A observação destas fotografias revelou a presença de cristais de MCZ com

tamanho variável e partículas em forma de paralelogramas. As partículas de MβCD

são compostas por partículas esféricas com carácter amorfo (Charoenchaitrakool,

2002).

Por sua vez, a observação microscópica da MF evidenciou a presença de cada

um dos constituintes, com manutenção da sua morfologia original, sendo facilmente

observada a presença de cristais de MCZ à superfície das partículas de CD, mas não

revelou, aparentemente, interacções entre os constituintes.

Na microscopia do complexo MLX observou-se alteração da morfologia original

das partículas de MCZ e CD. Apresentam uma forma irregular com tendência a formar

agregados. No entanto, observou-se que existem partículas de fármaco há superfície

Page 91: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

91

da CD e mesmo partículas de CD na sua forma original, sugerindo apenas uma

complexação parcial.

Pelo contrário, observou-se uma drástica alteração da morfologia original das

partículas de MCZ e MβCD em todos os complexos COE, SP e LF. No processo de

COE, apenas há um tipo de partículas indiferenciadas, com tendência para formação

de agregados, manifestamente distintas das partículas originais de MCZ e MβCD. O

processo de secagem por pulverização mostra partículas homogeneamente amorfas e

esféricas, tendo um aspecto característico deste tipo de processo (Sinha, 2005). Por

fim, o processo de liofilização deu origem a agregados amorfos, de aspecto lamelar e

irregular.

Apesar dos estudos de SEM serem insuficientes para a confirmação de

complexos de inclusão, as alterações drásticas na forma das partículas, no seu

aspecto e tamanho apontam para a existência de novas fases sólidas nos produtos de

COE, SP e LF. Estas novas fases sólidas poderão estar simplesmente relacionadas

com alterações no estado cristalino destes produtos, ou ainda constituírem uma forte

indicação para a formação de complexos de inclusão (Fernandes et al., 2002). Porém,

estes resultados precisam de posterior confirmação por meio de técnicas físico-

químicas de caracterização mais específicas, como é o caso da calorimetria de

diferencial de varrimento e difracção de raios X.

Page 92: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

92

Figura 20. Microscopia electrónica de varrimento: (a) MCZ; (b) MβCD; (c) MF; (d) MLX; (e) COE; (f) SP e (g) LF.

g)

a) b)

c) d)

e) f)

g)

Page 93: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

93

Calorimetria diferencial de varrimento (DSC)

A calorimetria diferencial de varrimento (DSC) representa o método analítico de

primeira escolha para a caracterização físico-química dos sistemas fármaco-CD no

estado sólido. Por esse facto, o DSC é utilizado como um método de rotina para

investigações qualitativas preliminares e rápidas, por avaliação do comportamento

térmico dos componentes isolados, MF e respectivos complexos preparados pelos

mais variados métodos de preparação (Giordano et al., 2001).

A calorimetria diferencial de varrimento (DSC) permite determinar o calor

absorvido ou libertado pela amostra a uma temperatura programada. Estas variações

de calor resultam das alterações que se produzem num composto e que desaparecem

quando está incluído numa ciclodextrina.

A inclusão de uma molécula hóspede na cavidade da ciclodextrina ou na rede

cristalina, leva a que os seus pontos de fusão, de ebulição, de sublimação ou de

degradação sejam deslocados para uma temperatura mais elevada ou não se

observem até à temperatura limite de decomposição da ciclodextrina (250-300ºC)

(Szejtli, 1988a).

A finalidade da utilização desta metodologia analítica consiste na comparação

dos perfis térmicos resultantes das misturas físicas de fármaco e CD com perfis

resultantes dos respectivos complexos, para que seja evidenciada ou não a ocorrência

de inclusão do fármaco na cavidade da CD. Na ausência de qualquer tipo de

interacção entre o fármaco e CD, as curvas de DSC resultantes deverão corresponder

ao somatório das curvas de DSC dos componentes individuais. Na eventualidade da

ocorrência de interacções entre o fármaco e a CD nos produtos obtidos pelas várias

manipulações, as curvas de DSC deverão apresentar um perfil não coincidente com o

somatório dos efeitos observados nos termogramas dos componentes isolados. Isto

porque quando uma molécula hóspede é incluída na cavidade de uma CD, os seus

pontos de fusão, ebulição ou sublimação sofrem um deslocamento para temperaturas

Page 94: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

94

diferentes ou desaparecerem do intervalo de temperaturas anterior à decomposição da

respectiva CD (Cabral Marques, 1990).

Os termogramas dos componentes singulares e sistemas binários estão

representados na Figura 21.

50 100 150 200 250

Temperature (ºC)

(a)(b)

(c)

(d)(e)

(f)

(g)

Figura 21: Termograma de DSC: (a) MCZ; (b) MβCD; (c) MF; (d) MLX; (e) COE; (f) SP e (g) LF.

O termograma do MCZ observado pela técnica de DSC mostrou-se anidro e

cristalino, e apresentando seu pico endotérmico intenso e bem definido a 85,2ºC, o

que corresponde à temperatura de fusão do fármaco (Pederson, 1993). A curva de

DSC da MβCD apresenta um efeito endotérmico mais alargado por volta dos 40 a

100ºC que se deve à libertação de água de cristalização da CD (Figueiras et al, 2007).

Visualiza-se na MF ambos os picos endotérmicos do MCZ (pico de fusão) e da

MβCD (desidratação), sendo o termograma resultante da sobreposição dos

termogramas dos componentes individuais, sem qualquer desvio de temperatura de

fusão do MCZ. É possível portanto considerar a ausência de interacção entre fármaco

Page 95: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

95

e a CD

No sistema MLX, observou-se um pico de pequena intensidade alargado,

sobreposto na região do pico endotérmico de desidratação da MβCD. Apesar de sua

ténue intensidade e do desvio para uma temperatura mais baixa 83,35ºC, este pico

corresponde ao efeito endotérmico resultante da fusão do MCZ, e sugere que neste

sistema, existe a formação de complexos de inclusão parcial. Porém, tendo em

consideração os resultados obtidos com as fotografias de SEM para estes produtos,

onde parece perceptível a presença de moléculas de CD e a presença de cristais de

MCZ, pode-se pressupor ter ocorrido um rearranjo molecular do fármaco, a possível

dispersão dos cristais de MCZ no produto sólido.

Com os resultados obtidos por DSC e SEM e a sua interpretação, evidencia-se

a não formação de um verdadeiro complexo de inclusão pelo método de malaxagem.

As curvas de DSC dos produtos COE, LF e SP indicaram o desaparecimento

completo do pico endotérmico correspondente à transição sólido-líquido do MCZ,

sendo a única diferença visível respeitante ao fenómeno de desidratação manifestado

no termograma destes sistemas. A pequena expressão das bandas endotérmicas

destes complexos de inclusão, respeitantes à desidratação das ciclodextrinas está

relacionada com o tipo de métodos utilizados (COE, LF e SP) que utilizam técnicas

muito eficazes de extracção dos solventes, originando produtos finais com um teor de

humidade muito baixo. O desaparecimento do pico endotérmico do MCZ é atribuído ao

estado amorfo ou à formação de complexos de inclusão ou ainda a ambas as

situações (Cabral et al., 1990). Estes resultados sugerem que estes sistemas podem

ser considerados como verdadeiros complexos de inclusão. Porém, estes resultados

necessitam de confirmação através da aplicação de outros métodos analíticos de

caracterização físico-química no estado sólido.

Espectroscopia de infravermelho com transformadas de Fourier (FTIR)

A espectroscopia de Infravermelho com transformadas de Fourier (FTIR) é

Page 96: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

96

usada para avaliar as interacções que se estabelecem entre a molécula hóspede e a

ciclodextrina no estado sólido (Fernandes, 1999).

Esta técnica nem sempre é a mais adequada para a detecção da formação do

complexo de inclusão. Esta situação acontece quando, por um lado, a formação do

complexo origina apenas um pequeno deslocamento das bandas da ciclodextrina e,

por outro, quando a fracção da molécula hóspede pode ser camuflada pelas das

ciclodextrinas, bem como pela presença da água de cristalização (Szejtli, 1988). As

bandas de absorção características da CD, que representam a maioria das bandas de

absorção dos complexos, são muito pouco influenciadas pela complexação. Por sua

vez as bandas de absorção dos fármacos apresentam desvios para maiores ou

menores valores, acompanhadas de uma diminuição de intensidade, mas a proporção

de fármaco raramente excede os 15% da massa dos complexos, pelo que estas

alterações são frequentemente pouco perceptíveis (Szejtli, 1994). Por isso, as

alterações verificadas nos espectros de FTIR requerem uma interpretação cuidadosa

(Hedges, 1998).

No entanto, esta técnica pode ser aplicada com bons resultados, quando as

moléculas hóspedes têm algumas bandas de absorção características, como sejam as

dos grupos carbonilo (Uekama e Otagiri, 1987), que geralmente se apresentam

separadas das bandas características das CDs e sofrem facilmente desvios devido à

complexação (Szejtli, 1994).

O perfil do espectro de FTIR do Miconazol está representado na Figura 22. As

bandas de espectroscopia de infravermelho do MCZ não são muito citadas. O

Miconazol é formado por 39 atomos que podem originar 111 estados vibracionais.

Numa faixa de comprimento de onda pode observar-se algumas bandas

características do MCZ (Barillaro, 2007) que podem ser verificadas na Tabela 07.

Page 97: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

97

Tabela 07. Número de onda experimental e teórica (FTIR) do miconazol. (Adaptado: *Barillaro, 2007) Banda Miconazol Experimental Miconazol Teórico* Descrição aproximada

1 1589 cm-1 1589 cm-1 Elongação CC

2 1561 cm-1 1562 cm-1 Elongação CC

3 1510 cm-1 1510 cm-1 Elongação CC + torção CH (anel

imidazólico) e C6

4 1468 cm-1 1470 cm-1 Torção CH e C17 e C6

Relativamente ao fármaco, o espectro, exibiu bandas intensas e bem definidas.

A banda, com maior intensidade, aparece na região 1091 cm-1.

O perfil do espectro de FTIR dos sistemas binários está representado na Figura

23. Verifica-se que a MβCD possui uma banda que é muito expressiva entre 1021 e

1155 cm-1, e pode sobrepor-se a banda mais expressiva do MCZ. Observa-se que nos

espectros (Figura 23) dos sistemas estudados, não apareceram novas bandas de

absorção, o que indica não se ter estabelecido ligações químicas do tipo covalente,

entre o MCZ e CD, nos novos produtos formados (Ammar et al., 1999). Observou-se

ainda uma forte diminuição das principais bandas nos sistemas binários MLX, COE,

SP e LF. Os espectros nas regiões de 600 – 900 cm-1 e 1400 – 1600 cm-1 do MCZ e

das respectivas misturas binárias, no estado sólido, foram registados e estudados.

Verificou-se que as bandas com frequência de 657, 732, 816, 861, 962, 1232, 1468,

1510, 1562 e 1589 cm-1 estão presentes na MF e no MLX.

O espectro da MF corresponde ao simples resultado da adição do espectro do

fármaco e da ciclodextrina. O espectro do MLX, apresenta alguns picos característicos

do MCZ, com uma diminuição da intensidade das bandas. Tal situação aponta para a

não ocorrência de uma nova estrutura.

O espectro por FTIR dos produtos obtidos por COE, SP e LF, por outro lado,

demonstram forte redução ou completo desaparecimento da bandas características do

MCZ, sendo indicativo de uma forte interacção fármaco-ciclodextrina e, possivelmente,

a inclusão por complexação do fármaco, confirmando os resultados obtidos

Page 98: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

98

anteriormente pelas técnicas de DSC e SEM. No LF pode observar-se uma

amorfização dos picos tornando a estrutura muito similar a MβCD. O pico em 1589 cm-

1 referente ao MCZ parece visível, embora com uma pequena intensidade.

As alterações observadas nos espectros FTIR das várias amostras, tais como

os desvios de picos, ou a sua redução na intensidade até ao desaparecimento quase

total, mostrou-se dependente do método de preparação, sugerindo diferentes graus de

interação e amorfização nos diferentes produtos.

2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600

Wavenumbers (cm-1)

1091

1468

15101589

1232

816

861

732

962

6571053

1340

12771562

Figura 22. Perfil do espectro de FTIR do Miconazol.

Page 99: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

99

2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600

W avernumbers (cm -1)

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

15101469

1081

1021

964756

702

852

1155

1589

1232

657733816

8611589

Figura 23: Perfil dos espectros de FTIR da (a) MβCD, (b) MF; (c) MLX; (d) COE; (e) SP e (f) LF.

Difracção de raios X (RX)

A análise de difracção de raio-X constitui um dos melhores métodos para

investigação dos complexos no estado sólido: permite não só detectar a formação do

complexo, como também conhecer a sua estrutura, as interacções que se

estabelecem entre a molécula hóspede e a ciclodextrina. No entanto, esta técnica é

por vezes complicada e de difícil aplicação como método de rotina (Saenger, 1980).

A análise de difracção de raio-X de pós é frequentemente usada nos estudos

de complexação dos compostos em pó (amorfos ou no estado microcristalino). Se

ocorrer a formação de complexo, o difractograma do complexo de inclusão é

completamente diferente da sobreposição dos difractogramas dos componentes

isolados (Uekama et al, 1982).

Os difractogramas dos componentes singulares e dos sistemas binários

encontram-se representados na Figura 24.

Page 100: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

100

10 20 30 40 50 60

(a)

(c)

(d)

(f)

(g)

(e)

(b)

Figura 24: Difractogramas de raio X: (a) MCZ; (b) MβCD; (c) MF; (d) MLX; (e) COE; (f) SP e (g) LF.

O perfil de difracção do MCZ evidencia o seu carácter cristalino, demonstrando

numerosos picos de difracção de elevada intensidade cujas posições encontradas

foram 13.2, 14.7, 22.3, 24.4, 29.5, 30.0, 30.5 e 31.6 para os picos mais

representativos. O difractograma da MβCD mostrou-se totalmente difuso indicando a

natureza amorfa deste composto (Figueiras, 2006).

No perfil de difracção da MF, podemos observar que este sistema possui os

principais picos de difracção do MCZ e corresponde apenas à sobreposição de cada

um dos componentes presentes, com uma significativa diminuição da intensidade dos

picos do MCZ por efeito de diluição nos componentes amorfos. No produto obtido por

MLX o perfil de difracção é semelhante ao da MF e no produto COE o perfil de

difracção observado demonstra menor grau de cristalinidade, mas no entanto alguns

picos característicos do MCZ são detectáveis, sugerindo a formação de complexo de

inclusão parcial.

Atendendo ao facto da amorfização do MCZ poder ser consequente ao

Page 101: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

101

processo de secagem por pulverização e liofilização, os resultados de difracção de

raios X não podem descriminar se os produtos são ou não verdadeiros complexos de

inclusão ou somente misturas homogéneas dispersas de componentes amorfos

(Redenti et al., 1996). Contudo, tendo presentes os resultados de SEM e DSC

previamente analisados, bem como o desaparecimento de alguns dos mais

representativos picos de difracção no sistema COE e a perda de cristalinidade pode-se

invocar a formação de novas fases sólidas que podem ser imputadas à formação de

complexos de inclusão, no qual o MCZ se encontra pelo menos parcialmente

incorporado na cavidade da CD (Charoenchaitrakool et al., 2002).

A total amorfização do fármaco foi induzida pela SP e LF, sendo detectado nos

difractogramas dos produtos a redução integral da cristalinidade, sendo visível apenas

um perfil difuso. A magnitude do grau de amorfização foi claramente dependente do

método de preparação dos complexos.

A Tabela 08 mostra o grau relativo de cristalinidade (RDC) para os vários

sistemas binários. A diminuição da relação de cristalinidade de todos os sistemas foi

observada. A diminuição da RDC, na maioria dos casos, segue o mesmo padrão: PM>

MLX> COE> SP> LF. Estas observações estão de acordo com o resultado dos

difractogramas. Os resultados obtidos por DSC, FTIR e SEM, e o desaparecimento

dos picos de difração do MCZ nos sistemas de SP e LF indicam novamente a possível

formação de complexos inclusão entre MCZ e a CD nestes sistemas.

Tabela 08. Intensidade dos picos e valores de RDC para os sistemas MCZ:MβCD.

MCZ

MF

MLX

COE

SP

LF

IPa IP RDC IP RDC IP RDC IP RDC IP RDC

14.738 146 126 0.863 88 0.602 91 0.623 79 0.541 60 0.410

24.438 276 128 0.463 139 0.503 83 0.300 71 0.257 68 0.246

29.537 159 145 0.911 109 0.685 81 0.509 77 0.484 59 0.371

30.563 151 106 0.701 102 0.675 63 0.417 49 0.324 56 0.370

31.662 137 95 0.693 72 0.525 71 0.518 53 0.386 41 0.299 a IP Intensidade dos Picos

Page 102: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

102

Em conclusão, os estudos de difracção de raios X e o cálculo de RDC

permitiram avaliar a cristalinidade dos diferentes produtos formados por diferentes

métodos e obter evidências adicionais acerca da formação de complexos de inclusão

MCZ-MBCD, uma vez que foi confirmada a formação de novas fases sólidas muito

provavelmente associadas à formação de verdadeiros complexos de inclusão no

estado sólido.

Solubilidade aquosa dos complexos de inclusão

A solubilidade de uma molécula hóspede pode ser alterada por complexação

com CDs. Muitos autores têm citado o aumento da solubilidade aquosa do MCZ com o

uso das ciclodextrinas. Van Doorne e colaboladores concluíram que a presença da β-

ciclodextrina (18mg/ml) aumentou em 5 vezes a solubilidade aquosa do nitrato de

miconazol (Van Doorne, 1988). Os resultados, em percentagem, do ensaio de

solubilidade do fármaco isolado e dos sistemas binários, obtidos após 48h de agitação

à 25ºC±1, estão indicados nas Tabela 09 e 10. As Figuras 25 e 26 demonstram os

valores calculados em função da concentração do fármaco solubilizado. A solubilidade

aquosa do MCZ em água e PBS pH 6.8, calculada, por este método, foi de 15,13

µg/mL e 7,2 µg/ml respectivamente.

A MF induziu um aumento da solubilidade do MCZ, o que pode ser explicado

pela provável inclusão formada em solução. Isto pode ser atribuído ao processo de

mistura entre os componentes e a uma certa perda de cristalinidade e pureza dos

mesmos (Holgado, 1995). O aumento de solubilidade induzido pelo MLX foi pouco

superior a MF.

O maior aumento de solubilidade, em meio aquoso, foi verificado no complexo

liofilizado, quando comparado com os outros sistemas binários. Entretanto Verifica-se

que a nova fase sólida preparada por secagem por pulverização, tem aspecto muito

fofo e com pouca molhabilidade, ficando o pó muitas vezes agarrado ao vidro.

Fazendo com que a percentagem de solubilização realizada por esta técnica, seja

Page 103: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

103

menor.

Tabela 09. Solubilidade aquosa dos complexos com MCZ a 25ºC±1 após 48 horas.

Sistemas binários Solubilidade aquosa (µg/ml)

Solubilidade aquosa (%)

MCZ (Mistura Física) 29,01 1,93% MCZ (Malaxado) 35,08 2,38% MCZ (Coevaporado) 69,30 4,62% MCZ (Secagem por pulverização) 37,92 2,52% MCZ (Liofilização) 1,504(103) 10,26%

Solubilidade aquosa MCZ

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Mic MF MLX COE SP LF Série7

Figura 25. Solubilidade aquosa do MCZ. (Desvio Padrão n=3)

Tabela 10. Solubilidade dos complexos, em PBS 6.8, a 25ºC±1 após 48 horas.

Sistemas binários Solubilidade em PBS 6.8 (µg/ml)

Solubilidade em PBS 6.8 (%)

MCZ (Mistura Física) 24,38 0,162% MCZ (Malaxado) 31,52 0,210% MCZ (Coevaporado) 117,29 0,781% MCZ (Secagem por pulverização) 35,15 0,234% MCZ (Liofilização) 127,93 0,852%

Solubilidade do MCZ em PBS 6.8

0

20

40

60

80

100

120

140

Co

nce

ntr

ação

do M

CZ

(m

cg/m

l)

MCZ MF MLX COE SP LF

Figura 26. Solubilidade do MCZ em PBS 6.8. (Desvio Padrão n=3)

Page 104: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

104

CONCLUSÃO

A aplicação de diferentes metodologias analíticas permitiu caracterizar os

sistemas obtidos no estado sólido. Todos os complexos demonstraram diferenças

morfológicas, térmicas, estruturais e perfis espectroscópicos distintos das moléculas

livres de MCZ e CD e da MF, resultante da simples combinação destes componentes.

Assim, com base na caracterização físico-química efectuada, confirmou-se a formação

de complexos binários no estado sólido entre o MCZ e MβCD.

A utilização da microscopia electrónica de varrimento, da calorimetria

diferencial de varrimento, da difracção de raios X e da espectroscopia de

infravermelho com transformadas de Fourier possibilitou a elucidação das interacções

ocorridas no estado sólido entre os diferentes sistemas binários de complexação

preparados por diferentes técnicas e sugeriu a formação de novas fases sólidas

amorfas. Estas observações apontam para uma forte evidência da formação de

verdadeiros complexos de inclusão MCZ/MβCD preparados no estado sólido por SP e

LF.

Verificou-se também a influência do método de preparação utilizado na

formação dos respectivos complexos de inclusão.

O maior aumento de solubilidade aquosa e em PBS do MCZ foi manifestado

pelo complexo preparado pela técnica de liofilização.

Page 105: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo II

105

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Page 109: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

109

DESENVOLVIMENTO E ESTUDO REOLOGIA DE UMA FORMULAÇÃO PARA APLICAÇÃO BUCAL

INTRODUÇÃO

A administração bucal apresenta algumas vantagens em relação aos métodos

tradicionais. A entrada directa do medicamento para a circulação sistémica faz com

que o efeito de primeira passagem hepática seja evitado. Além disso, o fármaco pode

ser facilmente administrado e, se necessário, removido do local da aplicação. Em

contrapartida, algumas desvantagens devem ser tidas em conta quando uma forma

farmacêutica é proposta para administração bucal. Entre elas, está a necessidade da

formulação se manter na sua posição por horas, mesmo com o movimento bucal e

fluxo salivar. Registe-se ainda, o facto do fluxo salivar ser responsável por uma

eventual dissolução parte relevante do fármaco e, portanto, reduzir a absorção pela

mucosa. Consequentemente, uma boa formulação requer propriedades adesivas e

deve evidenciar um controlo eficiente do fármaco libertado. Isto pode ser feito usando

excipientes com características adequadas. Numerosos polímeros bio-adesivos foram

investigados para fins de administração bucal (Cafaggi, 2004)

É muito difícil aplicar pomadas, soluções, cremes e loções sobre a mucosa

bucal, e esperar que os seus efeitos persistam por um período significativo de tempo,

já que são muito facilmente removidos pela salivação, temperatura, os movimentos da

língua e a deglutição. Portanto, será necessário que as novas formulações tenham

aderência adequada ou maior tempo de adesão e mostram libertação sustentada por

um certo período de tempo. Mas, a principal limitação para cedência bucal é a baixa

permeação através do tecido, resultando em uma baixa biodisponibilidade. A utilização

de potenciadores de penetração é utilizada para aumentar a permeação dos fármacos

em todo o epitélio (SHIN, 2000).

Os hidrogeles são redes poliméricas tridimensionais, hidrofílicas, capazes de

absorver grandes quantidades de água ou fluidos biológicos (Gupta et al, 2002). As

Page 110: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

110

redes são compostas por homopolímeros ou copolímeros, e são insolúveis devido à

presença de produtos químicos ou físicos. Os hidrogeles exibem uma termodinâmica

compativel com a água que lhes permite inchar em meio aquoso. Existem inúmeras

aplicações, em particular na área da saúde (Peppas, 2000). Mais especificamente, os

hidrogeles têm sido usados com sucesso na cedência de agentes terapêuticos,

através da cavidade oral (Jones et al 2002).

Estudos recentes por Jones e colaboladores, (2002) sugerem que formulações

bioadesivas concebidas para aplicação bucal devem mostrar adequadas propriedades

reológicas e mecânicas, nomeadamente comportamento pseudoplástico ou plástico

com tixotropia, ser de fácil aplicação, apresentar boa espalhabilidade, dureza

adequada, e prolongada permanência de tempo na cavidade bucal. Estas

propriedades podem afectar o desempenho final das formulações e a sua aceitação

pelos pacientes.

P407, polâxamero também conhecido como Pluronic F127, é um tribloco de

copolímero, polioxietileno-polioxipropilene-polioxietileno, constituído por 70% de

unidades de polioxietileno. Tem a capacidade de formar um gel límpido em meio

aquoso numa concentração de aproximadamente 20% (w / w) ou mais, e exibe a

propriedade única de gelificação reversível térmica; que é atingido em temperaturas

como temperatura corporal e é reversível em baixas temperaturas como de um

frigorífico, produzindo assim uma solução de baixa viscosidade. Além disso, P407 tem

baixa toxicidade, alta capacidade de solubilização, e excelentes características na

libertação de fármacos (Cafaggi, 2005).

Sistemas contendo ambos, polâxamero 407 e ciclodextrinas têm grande

interesse devido à propriedade termosensível do polaxamero e a capacidade

promotora de absorção da ciclodextrina (Bonacucina, 2007). Torna-se necessário

desenvolver novas formulações com adequada bio-adesão ou maior tempo de adesão,

e proporcionar uma libertação bucal por um maior período de tempo (Shin, 2000).

Page 111: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

111

P407 também foi utilizado em associação com Carbopol para obter geles

mucoadesivos (Cafaggi, 2005). O Carbopol é um polímero hidrofílico preparado

através da polimerização dos monómeros, principalmente constituídos pelo ácido

acrílico e usados para preparar geles para formulações de administração tópica,

devido à sua viscosidade e boa bioadesividade em baixas concentrações. Em alguns

estudos, o Carbopol e o polaxamero foram usados como agentes formadores de geles

bioadesivos. Simovic e colaboradores, (1999) e Lin e Sung (2000) analisaram o

comportamento reológico de dispersões de Carbopol / Pluronic F-127 e demonstraram

que o Carbopol melhorou significativamente o comportamento reológico do Pluronic.

Geles

Segundo a Farmacopeia Portuguesa consideram-se geles ou pomadas-geléias

as que são constituídas por geles minerais ou orgânicos.

Os excipientes utilizados nestes veículos são de vários tipos, tendo como

característica comum as suas propriedades coloidais, originando, em contacto com a

água, geles mais ou menos espessos, de consistência pastosa, que permitem a

incorporação de substâncias nas suas malhas.

Os geles classificam-se em hidrófobos ou oleogeles e hidrófilos ou hidrogeles.

No primeiro caso os seus excipientes são gordurosos, como a parafina líquida e óleos

diversos. A geleificação destes produtos consegue-se por adição de polietileno,

anidrido, silícios, sabão de alumínio ou de zinco, etc. já os geles hidrófilos têm como

excipiente a água ou diversos glicóis, como a glicerina e o propilenoglicol. Estes

líquidos são geilificados por intermédio de várias substâncias, tais como a goma

adragante, a goma de caraia, o amido, derivados de celulose, silicatos de alumínio e

magnésio, pectinas, alginatos, carbopóis, álcool polivinílico, etc.

Os geles hidrófilos são os mais utilizados. Têm em geral um efeito emoliente e

refrescante, mas a sua rápida secagem transforma-os muitas vezes, numa película

Page 112: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

112

quebradiça quando aplicados na epiderme.

Não apresentam poder de penetração cutânea, já que seus excipientes,

formados por grandes moléculas coloidais, não podem atravessar a epiderme intacta

e, também, não mostram qualquer espécie de afinidade para as proteínas da pele, não

originando absorção bioquímica. Entretanto alguns geles, como os que contém

carbopol, são dotados de boa penetrabilidade cutânea. Por outro lado, pode-se

incrementar a penetração desde que se adicione substâncias como a trietanolamina,

álcool isopropílico, propilenoglicol e polietilenoglicol (Prista, 1995).

O tipo de polímero empregado na formulação de gele pode influenciar o

comportamento reológico e, a estabilidade física do produto e até mesmo, afectar a

aceitabilidade deste.

Geralmente, as substâncias formadoras de geles são polímeros que quando

dispersos em meio aquoso conferem viscosidade à preparação (Maia Campos et al,

1999). Logo, pode-se definir o gele como uma preparação semi-sólida composta por

partículas coloidais que não se sedimentam (ficam dispersas).

Polímero é uma palavra derivada do grego onde polys significa muitos e meros

significa partes. Portanto, os polímeros são basicamente substâncias de alto peso

molecular, também chamadas de macromoléculas. Estas substâncias são

provenientes do encadeamento de moléculas menores. Apesar do estudo científico

das macromoléculas se ter iniciado há pouco tempo (cerca de 50 anos), o seu

desenvolvimento tem sido vertiginoso. Vários polímeros vêm sendo usados nas

formulações de geles de aplicação farmacêutica (Martin, 1993).

De acordo com as características dos polímeros, os geles podem apresentar

natureza iónica ou não-iónica. Os geles de natureza não-iónica possuem estabilidade

numa ampla faixa de pH, tornando-se possível a veiculação de substâncias de

carácter ácido, como os alfa-hidroxiácidos. Já os de carácter aniónico são pH

dependentes, ou seja apresentam-se estáveis em pH neutro ou próximo do neutro

(Maia Campos et al, 1999).

Page 113: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

113

Pluronic

Trata-se de copolimeros de polioxietileno-polioxipropileno (POE-POP) que têm

tido larga utilização como excipientes de pomadas.

Possui um núcleo central hidrófobo (polioxipropileno) ligado ou envolvido por

cadeias hidrófilas (polioxitileno). Quimicamente são poliésteres e a sua fórmula geral

pode ser assim representada: HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH em que “a”(óxido de

etileno=OE) varia de 2 a 130 e “b” (óxido de propileno =OP) e varia de 15 a 67.

Alguns destes pluronics contêm etilenodiamina que, sendo hidrossolúvel,

exerce funções semelhantes ao etilenoglicol ou proplilenoglicol.

Os poloxameros são tensioactivos, classificando-se actualmente por meio de

números que, em regra, aumentam consoante o seu peso molecular. Assim, por

exemplo, o nº 101 (P.M.1100) apresenta um EHL (equilíbrio hidrófilo lipofílico) de 12-

18, o nº184 (P.M.2900) tem EHL de 12-18 e o 188 (P.M.8400) tem EHL maior que 24.

Muito pouco tóxicos e pouco irritantes para pele e olhos, podem originar geles,

com concentrações de água bem definidas: 184 e 188 formam geles com 50-60% de

água; 234 (P.M.4200) e 238 (P.M.11400) geleficam com 40 % de água; 333 a 338

(P.M.14000) formam geles com 25% de água. (Prista, 1995)

A preparação do gele de P 407 não apresenta dificuldade. A preparação de

uma formulação termosensível a frio mostra-se mais vantajosa. Este método facilita a

dissolução do poloxamero e limita possíveis alterações. O P 407 é misturado em 4-5ºC

com outros componentes (por exemplo um fármaco) e com a água, que deverá estar

previamente fria, até obter uma solução homogénea (Dumortier, 2006)

A esterilização em autoclave (120º.C, por 15 min, 1 bar) é compatível e não

altera significativamente as características da viscosidade da formulação. No entanto

nenhum estudo foi realizado para especificar a possível degradação deste polímero

durante a autoclavação. (Dumortier, 2006)

Page 114: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

114

Carbopol

O Carbopol é um polímero hidrofílico obtido através da polimerização dos

monómeros, principalmente constituídos pelo ácido acrílico. Este exerce uma função

de agente gelificante, devendo estar presente numa percentagem de 0,5-1,5%.

Excipiente inócuo para a pele, não provoca irritação, alergia e sensibilizações,

pelo que se podem utilizar na preparação de pomadas-geleias. Entretanto, não se

recomenda o seu emprego em pomadas oftálmicas, dado que se têm revelado

irritantes para a córnea. (Prista, 1995)

Uma vantagem de utilização do Carbopol resulta do facto de não sofrer

alterações significativas de viscosidade em função da temperatura. Em presença da

água os polímeros de Carbopol intumescem até cerca de 1000 vezes o seu volume

original, formando geles quando o pH do meio é adequado (Singla, 2000).

Quando dispersos em água formam soluções coloidais ácidas de baixa

viscosidade. A neutralização das soluções aquosas coloidais de Carbopol promove a

geleificação, conduzindo a obtenção de geles límpidos (Prista, 1995).

Durante a preparação do gele a agitação deve ser lenta de modo a evitar a

incorporação de bolhas de ar que podem promover a sua oxidação na presença de luz

As bolhas de ar eventualmente existentes nos geles devem ser removidas antes da

adição do agente neutralizante recorrendo a ultrassons ou simplesmente deixando a

preparação em repouso (Allen, 2007).

A viscosidade dos geles é reduzida quando o pH é inferior a 3 ou superior a 12

e na presença de electrólitos. Apresentam maior viscosidade a valores de pH entre 6 e

11. A necessidade de ajustar o pH a valores compreendidos entre 6,5 e 7,0 está

relacionada com a consistência e com a estabilidade dos hidrogeles (Allen, 2007).

Page 115: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

115

OBJECTIVO Formular um hidrogele, com características bioadesivas, para uso bucal.

Demonstrar a influência da ciclodextrina, no hidrogele, em relação às suas

características reológicas.

MATERIA E MÉTODOS

Material

Carbopol 71G foi fornecido pela Noveon, Inc (Cleveland, OH), Pluronic 127 foi

fornecido pela Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA). Miconazol (Lote: 00478343;Massa

Molar = 416,13 g/mol) foi gentilmente cedido pela Janssen Pharmaceutica (Bersee-

Belgica) e a Metil-β-ciclodextrina (Lote: 781144; Massa Molar = 1190 g/mol, com grau

médio de substituição de 0,5) doado pela Roquettte (Lestrem, France). Utilizou-se

água destilada, e os outros reagentes foram de grau analítico.

Métodos

Preparação dos Hidrogeles

Hidrogele de Carbopol (A)

Dispersou-se o polímero (Tabela 12) sobre a água destilada sob agitação, a 900 rpm,

utilizando agitador mecânico (Eurostar power control-visc IKa- Werke, Staufen,

Germany) provido de uma hélice marinha de 3 lâminas com 4,0 cm de diâmetro,

durante 120 minutos. O pH do hidrogele foi ajustado entre 5,5 e 6,5 utilizando-se uma

solução de NaOH á 10% (p:v).

Hidrogele Pluronic (B)

O hidrogele foi preparado pelo método a frio (Durmortier, 2006). O polímero foi

adicionado sobre a água previamente fria (3-5ºC), sob contínua agitação, 900 rpm,

Page 116: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

116

utilizando um agitador mecânico Eurostar, durante 120 minutos, até obter uma solução

homogénea. O hidrogel foi deixado sob refrigeração a 4ºC até se obter uma solução

límpida, aproximadamente 12 horas. Esta solução requer um tempo sob refrigeração

para total solubilização (Dumortier, 2006).

Hidrogele Pluronic-Carbopol (C1; C2; C3)

Os hidrogeles de Pluronic-Carbopol (Tabela 11) foram preparados pelo método a frio

(Durmortier, 2006). Os polímeros nas suas devidas proporções foram pesados e

adicionados em 70% de água, previamente arrefecida (3-5ºC). Primeiramente foi

adicionado o Carbopol e posteriormente o Pluronic e, mantidos sob agitação a 900

rpm, utilizando um agitador mecânico Eurostar, durante 60 minutos, obtendo-se uma

solução homogénea. Depois adicionou-se a água restante sob contínua agitação. O

hidrogele foi deixado sob arrefecimento a 4ºC até se obter uma solução límpida. No

dia seguinte as preparações foram neutralizadas a pH entre 5,5 e 6,5, utilizando-se

uma solução de NaOH á 10% (p:v).

Tabela 11. Formulação dos hidrogeles I.

Hidrogele Carbopol

1% (p:p)

(A)

Pluronic

20% (p:p)

(B)

Pluronic/Carb

20:0,5% (p:p)

(C1)

Pluronic/Carb

20:1,0%(p:p)

(C2)

Pluronic/Carb

20:1,5% (p:p)

(C3)

Carbopol 1g - 0,5g 1g 1,5g

Pluronic - 20g 20g 20g 20g

Água 99g 80g 79,5g 79g 78,5g

Hidrogeles [MCZ 2% (D);MBCD (E), Mistura Física (F) e Complexo (G)]

Os hidrogeles (Tabela 12) foram preparados pelo método a frio (Durmortier, 2006). Os

polímeros foram adicionados em 70% da água previamente arrefecida (3 - 5ºC) e

deixados sob contínua agitação a 900 rpm, utilizando um agitador mecânico Eurostar,

por 60 minutos, obtendo se uma solução homogénea. Adicionou-se então o fármaco,

MβCD, mistura física ou complexo, perfazendo uma concentração de 2% de fármaco,

excepto para o hidrogele com a MβCD. Em seguida adicionou-se a água restante, sob

Page 117: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

117

contínua agitação por mais 60 minutos O hidrogel foi deixado sob refrigeração á 4ºC

até se obter uma solução límpida, aproximadamente 12 horas. No dia seguinte as

preparações foram ajustadas a pH entre 5,5 e 6,5, utilizando-se uma solução de NaOH

á 10% (p:v).

Tabela 12. Formulação hidrogeles II.

Hidrogele

Miconazol

(2%, p/p)

(D)

MββββCD

(E)

Mistura Física

(2%miconazol)

(F)

Complexo

(2% miconazol)

(G)

Carbopol 1g 1g 1g 1g

Pluronic 20g 20g 20g 20g

Miconazol 2g - - -

Mistura Física - - 7,72g -

Complexo - - - 7,79g

MBCD - 5,72 - -

Água 77g 73,28 71,28g 71,20g

Estudo da compatibilidade dos excipientes presentes nos hidrogeles

Determinações de DSC foram realizadas num equipamento Shimadzu DSC-50

com um Sistema DSC provido de uma estação de dados informatizada TA-50WS/PC.

O comportamento térmico foi estudado pelo aquecimento, entre 25 º C a 250 º C, das

amostras numa cápsula de alumínio selada, a uma taxa de 10 º C / Min e sob um fluxo

de azoto, de 20 º C cm3/min.

A calibração da temperatura do aparelho foi periodicamente avaliada no

decorrer destes ensaios, utilizando-se como padrão o índio (99,98%, ponto de fusão

de 156,65ºC, Aldrich®).

Caracterização da Viscosidade

As determinações reológicas foram realizadas num viscosímetro (Viscotester

VT 550, Thermo Electron, Alemanha) equipado com cilindros com geometria coaxial

(SVDIN, Thermo Electron, Alemanha). O fluxo de medição foi realizado a 37 º C com

Page 118: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

118

taxas de corte no intervalo de 0,1 a 250 s-1, com períodos de 60s entre cada medição.

Os hidrogeles estiveram em repouso durante 30 minutos antes de iniciar as medições.

Análise da Textura

A análise da textura foi realizada por compressão num texturometro (Stable

Micro Systems TA-XT Plus, UK), através da realização de um teste de penetração

usando uma sonda cilíndrica de 10 mm de diâmetro, com uma penetração de

profundidade de 5 mm, a uma velocidade de 3 mm / s. Depois de penetrar a amostra,

a sonda retorna para uma posição 40 mm acima da superfície da plataforma. As

medições foram realizadas em temperaturas de 25 ±2ºC e 37±2ºC. O gráfico força vs

distância foi obtido, os parâmetros, força máxima (correlacionada com a firmeza) e

área negativa (correlacionada com a adesividade) foram calculadas.

Os hidrogeles foram mantidos durante 12 horas a 25ºC±2ºC e á 37±2ºC, e

realizando posteriormente as respectivas medições.

Todas as amostras foram analisadas num prazo de 72 h após preparação, e

centrifugadas a 3000 rpm durante 15 minutos, para garantir a remoção de bolhas de

ar, antes de todas as análises. As medições foram realizadas em triplicado.

Análise estatística

A análise estatísta dos resultados de textura foi feita utilizando o programa

informático SPSS (versão 14.0). A comparação entre duas variáveis foi realizada

através de Test T-Student e com grau de significância p <0.05. A comparação com

mais de duas variáveis fez-se com One-Way ANOVA. Quando os métodos de análises

anteriores dectectaram diferenças estatísticas com um grau de significância p <0.05,

foi realizado um Post-hoc test (Scheffe test) para identificar essas diferenças.

Page 119: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

119

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Calorimetria diferencial de varrimento (DSC)

O termograma dos polímeros e das misturas pode ser observado na Figura 27.

O termograma correspondente ao carbopol apresenta 2 picos: um a 100 – 105 ºC

referente à transição vítrea e outro a 250ºC devido ao processo de decomposição

térmica (Barreiro-Iglesias, 2002). A temperatura de transição vítrea do Carbopol em

cerca de 133ºC relatada por Kannis e colaboladores, (2000), não foi visualizada O

perfil de DSC do Pluronic mostra um ponto de fusão de 57,30 º C. Observa-se nos

termogramas das misturas que a presença de concentrações crescentes de Carbopol,

alteram a transição vitrea do Pluronic. Este resultado indica, uma provavel interacção

entre ambos os polímeros na mistura.

0 50 100 150 200 250

Temperature (ºC)

(a)

(d)

(b)(c)(e)

Figura 27. Termograma de DSC dos polímeros (a) Carbopol; (b) Pluronic; (c)

Carb0,5%Plur20%; (d) Carb1%Plur20% e (e) Carb1,5%Plur20%.

A Figura 28 demonstra o perfil do termograma de DSC dos polímeros. No perfil

de DSC da mistura física dos componentes do hidrogele formulado, nomeadamente,

Pluronic, Carbopol e Complexo liofilizado observa-se o pico característico do Pluronic.

A simples mistura física dos componentes, quando analisada pela técnica de DSC,

Page 120: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

120

teve uma pequena alteração na transição vitrea da mistura Pluronic/Carbopol,

influenciada pela presença do complexo MCZ/MβCD preparado pelo método de

liofilização.

50 100 150 200 250

Temperatura ºC

(c)

(b)

(a)

Figura 28. Termograma de DSC do: (a) Complexo Liofilizado; (b) Mistura Carb1%Plur20% e (e) Mistura Carb1,0%Plur20% e Complexo Liofilizado.

Viscosidade

A caracterização reológica de formulações semi-sólidas é importante uma vez

que fornece informações tão fundamentais quanto necessárias para a avaliação de

algumas das propriedades finais do produto como a consistência, qualidade e

estabilidade de armazenamento (Shawesh, 2002). O tipo de polímero empregado na

formulação do gele pode influenciar o comportamento reológico deste e portanto, pode

influenciar a estabilidade física do produto, assim como, no seu comportamento sobre

a pele (libertação da substância activa pelo veículo e formação de filme na pele).

Mediante os dados obtidos é possível traçar a curva de tensão de corte versus

velocidade de corte (curva do fluxo) e a curva de viscosidade versus velocidade de

Page 121: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

121

corte (curva da viscosidade), permitindo assim fazer uma análise comparativa entre as

amostras dos comportamentos dependente do tempo, assim como do comportamento

não dependente do tempo. Na curva do fluxo representado pela Figura 29, observou-

se o comportamento reológico dos hidrogeles demonstrando um fluido de

comportamento tipo pseudoplástico para o hidrogele de carbopol 1%, enquanto que os

outros hidrogeles demonstram um comportamento plástico, havendo uma tensão de

corte mínima para se iniciar o escoamento.

0 50 100 150 20010

100

1000

Ten

são

de c

orte

(P

a)

Velocidade de corte (s-1)

(a)

(b)

(d)(c)

Figura 29. Gráfico da reologia dos hidrogéis de (a) Carbopol 1%; (b) Pluronic 20%; (c) Pluronic 20%:Carbopol 0,5% e (d) Pluronic 20%:Carbopol 1,0%.

Viscosidade é uma expressão de resistência do fluido ao fluxo: quanto maior a

viscosidade, maior a resistência (Almeida, Bahia, 2003).

A viscosidade dos hidrogeles está demonstrada nas figuras 30 a 33. Observou-

se que todos hidrogeles, exibiram um comportamento não-Newtoniano, ocorrendo

uma diminuição da viscosidade com o aumento da velocidade de corte. O hidrogele da

mistura Pluronic 20% com Carbopol 0,5 e 1%, revela uma histerese entre a curva de

descida e subida mostrando um modesto comportamento tixotrópico.

Page 122: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

122

Considerando que o Pluronic foi escolhido devido a sua propriedade de

geleificação termo-sensível (Kim et al., 2002), e que a temperaturas baixas, se torna

menos viscoso podendo causar incovenientes durante a sua utilização, a adição de

alguns outros agentes gelificantes podem aumentar a sua viscosidade, não

comprometendo a capacidade de geilificação in situ (Hongyi, 2006). O Carbopol foi

utilizado com essa finalidade e demonstrou aumentar a viscosidade dos hidrogeles e,

ainda, que ao duplicar a concentração deste polímero a viscosidade aparente não

aumentou de forma proporcional.

Carbopol 1%

0,000

2,0004,000

6,0008,000

10,000

12,00014,000

16,000

0 50 100 150 200 250

Velocidade de corte(s -1)

Vis

cosi

dad

e (P

a.s)

Figura 30.Viscosidade do Hidrogele de Carbopol 1%.

Pluronic 20%

0,000

50,000

100,000

150,000

200,000

250,000

300,000

350,000

0 50 100 150 200 250

Velocidade de corte(s -1)

Vis

cosi

dad

e (P

a.s)

Figura 31.Viscosidade do Hidrogele de Pluronic 20%.

Page 123: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

123

Pluronic20%Carbopol0,5%

0,000100,000200,000300,000400,000500,000600,000700,000800,000

0 50 100 150 200 250

Velocidade de corte (s -1)

Vis

cosi

dad

e (P

a.s)

Figura 32.Viscosidade do Hidrogele de Pluronic 20%:Carbopol 0,5%.

Pluronic20%Carbopol1,0%

0,000

100,000

200,000

300,000

400,000

500,000

600,000

0 50 100 150 200 250

Velocidade de corte (s -1)

Vis

cosi

dad

e (P

a.s)

Figura 33.Viscosidade do Hidrogele de Pluronic 20%:Carbopol 1%.

Análise da textura dos hidrogeles base

A análise do perfil da textura tem sido usada para caracterizar as propriedades

mecânicas de sistemas farmacêuticos semi-sólidos como os hidrogeles. Esta simples

e rápida técnica pode fornecer informações relacionadas com parâmetros mecânicos

do hidrogele, tais como dureza, adesividade, compressibilidade, e coesividade.

Idealmente, formulações concebidas para a aplicação bucal de fármacos, deveriam ter

Page 124: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

124

baixa firmeza, e ainda, elevada adesividade. Um hidrogele com baixa firmeza irá

garantir que o trabalho necessário para ser retirado do recipiente de acondionamento

seja mínimo e simultaneamente uma maior facilidade de aplicação no epitélio da

mucosa oral. Valores de adesividade elevados asseguram uma prolongada adesão do

hidrogele na mucosa oral e uma completa recuperação estrutural do hidrogele após a

aplicação. Pelas razões expostas, uma adesividade adequada irá garantir uma melhor

eficácia clínica (TAN, 2000). As figuras 34 e 35 representam a firmeza e adesividade

dos hidrogeles de Pluronic e das Misturas Pluronic/Carbopol obtidas à temperatura de

25ºC. E as figuras 36 e 37 representam a firmeza e adesividade dos mesmos

hidrogeles a 37ºC.

Não foi possível avaliar a textura do hidrogele de Carbopol 1%, com os

mesmos parâmetros técnicos utilizados para o estudo dos restantes hidrogeles, já que

este apresenta uma consistência mais fluida, oferecendo menor resistência à

penetração da sonda com os parâmetros seleccionados, condicionando a

sensibilidade da sonda.

A adição de concentrações crescentes de Carbopol ao hidrogele de Pluronic

20% alterou significativamente o seu valor de firmeza. A análise estatística dos

resultados de firmeza revelou diferenças significativas entre a firmeza dos vários

hidrogeles (F= 173,273, p < 0,001).O hidrogele de Pluronic 20% apresentou o valor

mais baixo de firmeza relativamente aos hidrogeles de Pluronic/Carbopol.

Quando as concentrações de Carbopol são 0,5% ou 1,0% os valores de

firmeza são comparáveis. No entanto quando a concentração de Carbopol foi

aumentada para 1,5% o valor de firmeza foi maior, e significativamente diferente dos

valores de firmeza dos restantes hidrogeles (Ver anexo II, Test post-hoc).

Um aumento de temperatura traduziu-se num aumento significativo do valor de

firmeza de todos os hidrogeles (ver anexo III para resultados do T-test entre os valores

de firmeza dos hidrogeles a 25 e 37ºC).

Page 125: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

125

A 37ºC a firmeza dos hidrogeles contendo 1,0% e 1,5% de Carbopol é

comparável, sugerindo que uma quantidade de 1 % de Carbopol é suficiente para

obter um hidrogele com uma firmeza adequada.

Relativamente à adesividade dos vários hidrogeles a 25ºC foram detectadas

diferenças estatisticamente significantivas (F=35,823; p <0,001). Este efeito foi

igualmente observado quando a temperatura do teste foi de 37ºC (F= 101,42; p

<0,001). Independentemente da temperatura a que o teste foi realizado, a adição de

concentrações crescentes de Carbopol fez aumentar o valor de adesividade dos

hidrogeles. A adesividade do hidrogeles com 1,0% e 1,5% de Carbopol são

semelhantes, e por isso uma concentração superior a 1% não se traduz em resultados

melhores de adesividade.

Em suma, todos os hidrogeles mostraram uma forte adesividade em especial a

temperaturas mais elevadas. Por outro lado, a adição de Carbopol permitiu aumentar

consideravelmente o efeito adesivo e controlar a propriedade de geilificação térmica

reversível do Pluronic, tal como anteriormente descrito por Dumortier (Dumortier,

2006).

De acordo com os resultados obtidos, os hidrogeles com a mistura de Pluronic

20% e Carbopol 1% (p / p) apresentam o melhor compromisso entre firmeza e

adesividade.

Pelo motivo acima referido, escolheu-se este hidrogele para a continuação do

estudo.

Page 126: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

126

Firmeza a 25ºC

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Fo

rça

(N)

Pluronic 20% Plur/Carb (20/0,5%)

Plur/Carb (20/1%) Plu/Carb (20/1,5%)

Figura 34. Gráfico da firmeza dos hidrogeles base a 25 ±2ºC.

Adesividade a 25ºC

0

1

1

2

2

3

3

4

4

Ad

esiv

idad

e (m

J)

Pluronic 20% Plur/Carb (20/0,5%)

Plur/Carb (20/1,0%) Plur/Carb (20/1,5%)

Figura 35. Gráfico da adesividade dos hidrogeles base a 25 ±2ºC.

Page 127: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

127

Firmeza a 37ºC

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fo

rça

(N)

Pluronic 20% Plur/Carb (20/0,5%)

Plur/Carb (20/1,0%) Plur/Carb (20/1,5%)

Figura 36. Gráfico da firmeza dos hidrogeles base a 37 ±2ºC.

Adesividade a 37ªC

0

1

1

2

2

3

3

4

4

Ad

esiv

idad

e (m

J)

Pluronic 20% Plur/Carb (20/0,5%)

Plur/Carb (20/1,0%) Plur/Carb (20/1,5%)

Figura 37. Gráfico da adesividade dos hidrogeles base a 37 ±2ºC.

Textura dos hidrogeles

As Figuras 38 e 39 representam a firmeza e adesividade dos hidrogeles de

Pluronic/Carbopol 20/1,0%, e do mesmo contendo MCZ, MβCD, MF ou Complexo,

obtidas a temperatura de 25ºC. E as figuras 40 e 41 representam a firmeza e

adesividade dos mesmos hidrogeles a 37ºC.

Page 128: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

128

Os valores de firmeza dos vários hidrogeles são estatisticamente diferentes a

25ºC (F= 395,666; p <0,001) e a 37ºC (F= 186,416; p <0,001); (Ver anexo IV).

Uma diminuição da firmeza, em relação ao hidrogele de Pluronic/Carbopol 1%,

foi verificado quando se incorporou a ciclodextrina, a mistura física, o Miconazol e o

Complexo. O valor de firmeza dos vários hidrogeles, a 25ºC e 37ºC obedece à

seguinte ordem de grandeza: Pluronic/Carbopol 1% > Complexo> MCZ >MF >MBCD.

O maior efeito foi observado na presença da ciclodextrina isolada.

A adesividade dos hidrogeles foi estatisticamente diferente a 25ºC

(F=188,624;p <0,001) e a 37ºC (F=108,173; p < 0,001). Tal como anteriormente

discutido para os valores de força, a adesividade diminuiu significativamente quando

se incorporaram os vários constituintes, sobretudo aquando da adição da ciclodextrina.

Hongyi e colaboladores (2006), demonstraram que a adição de uma ciclodextrina,

hidroxipropil-β-ciclodextrina num hidrogele de Pluronic, aumentou o tempo de

geleificação, mas reduziu drasticamente a firmeza e a adesividade.

O hidrogele com o Complexo obteve o valor de adesividade e firmeza mais

próximo do hidrogele base de Pluronic/Carbopol. Pode pois concluir-se que um

hidrogele com propriedades adequadas se pode obter com um complexo MCZ/MβCD.

Como o Pluronic possui a propriedade de geleificação termo-sensível (Kim et

al., 2002) a temperatura vai constituir um importante parâmetro de observação.

Quando as condições são mais próximas possíveis das condições biológicas, os

resultados demonstrados nas Figuras 38 e 39 revelam maior firmeza e adesividade. A

análise leva à conclusão que existem faixas onde as respostas são maximizadas ou

minimizadas, conforme o interesse. Para optar por uma faixa ou outra, temos que

avaliar, portanto, as caracterísiticas do produto, ou seja, uma menor firmeza e

adesividade quando em contacto com o frasco de armazenamento e uma firmeza

Page 129: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

129

moderada para a aplicação (espalhar sobre a mucosa com facilidade) e maior

adesividade quando em contacto com a mucosa.

Firmeza a 25ºC

0,0000

0,0500

0,10000,1500

0,2000

0,2500

0,3000

0,35000,4000

0,4500

0,5000

Fo

rça

(N)

Plur/Carb1% Gel MCZ Gel MBCD Gel MF Gel Complexo

Figura 38. Gráfico da firmeza dos hidrogeles a 25 ±2ºC.

Adesividade a 25ºC

0,0000

0,2000

0,4000

0,6000

0,8000

1,0000

1,2000

1,4000

1,6000

1,8000

Ad

esiv

idad

e (m

J)

Plur/Carb1% Gel MCZ Gel MBCD Gel MF Gel Complexo

Figura 39. Gráfico da adesividade dos hidrogeles a 25 ±2ºC.

Page 130: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

130

Firmeza a 37ºC

0,0000

0,2000

0,4000

0,6000

0,8000

1,0000

1,2000

Fo

rça

(N)

Plur/Carb 1% Gel MCZ Gel MBCD Gel MF Gel Complexo

Figura 40. Gráfico da firmeza dos hidrogeles a 37 ±2ºC.

Adesividade a 37ºC

0,0000

0,5000

1,0000

1,5000

2,0000

2,5000

3,0000

3,5000

4,0000

Ad

esiv

idad

e (m

J)

Plur/Carb 1% Gel MCZ Gel MBCD Gel MF Gel Complexo

Figura 41. Gráfico da adesividade dos hidrogeles a 37 ±2ºC.

Aspecto

O Pluronic 127 em concentrações superiores a 20% tem um particular

interesse já que quando em baixas temperaturas apresenta-se como uma solução

transparente com baixa viscosidade e um hidrogele na forma semi-sólida quando à

temperatura do corpo (Chávez, 2006). O Carbopol permite controlar o processo de

Page 131: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

131

reversibilidade dos hidrogeles e manter um semi-sólido transparente como mostra a

Figura 42.

Page 132: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

132

Figura 42. Aspectos dos hidrogeles.

Page 133: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

133

CONCLUSÃO

A cedência de fármacos através da mucosa bucal é um assunto de grande

importância para o futuro das formulações farmacêuticas, e representa uma alternativa

à administração oral.

Com base nos dados obtidos, com relação a reologia e textura, os resultados

sugerem que o hidrogele com melhor perfil para administração bucal de fármacos

deve conter uma mistura de Pluronic 20% e Carbopol 1% (p / p).

A Metil-β-ciclodextrina demonstrou influenciar a reologia do hidrogele base.

É de registar, portanto a importancia da escolha do polímero, já que a partir

deste pode-se ajustar a viscosidade, força e adesividade a fim de se obter uma

formulação semi-sólida que seja fácil de se espalhar e apresente boa adesividade.

Page 134: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo III

134

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Capitulo III

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Page 136: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo IV

136

ESTUDO DE LIBERTAÇÃO INTRODUÇÃO

Os métodos para quantificar a libertação e absorção de fármacos através da

pele e mucosas podem ser divididos em duas categorias: in vivo e in vitro. Estudos in

vitro de libertação e absorção, são extremamente importantes na optimização das

técnicas de elaboração e da escolha adequada dos componentes das formas

farmacêuticas de libertação (Chien, 2005). Actualmente, este tipo de ensaios, constitui

uma das metodologias de suporte ao desenvolvimento galénico e tecnológico. São

muito utilizados e com certa frequência para se verificar o comportamento de

diferentes veículos nas mais variadas formulações (Pershing, 1993).

Algumas das vantagens dos métodos in vitro relativamente aos in vivo são que

podem ser controladas as condições de estudo, não havendo os interferentes

biológicos, além de não serem dispendiosos e facilmente realizáveis (Allen; Popovich;

Ansel, 2007, Chien, 2005).

Os estudos in vitro constituem uma ferramenta muito valiosa e determinante na

avaliação do comportamento de formulações semi-sólidas, diante das inúmeras

variáveis que comprometem o processo de produção. Através deles se obtêm dados

que possibilitam um maior entendimento dos factos ocorridos, desde a aplicação,

libertação do fármaco da forma farmacêutica, retenção e absorção (Campos, 1994,

Nokhodchil et al., 2003).

O uso do teste de dissolução in vitro para determinar a libertação de fármacos

de sólidos orais está descrito nas Farmacopeias e é utilizado rotineiramente no

controlo de qualidade desses produtos, principalmente para determinação da

uniformidade de lotes e na determinação de equivalência farmacêutica (USP 28, 2005,

Siewert et al., 2003). Para formulações não orais, como as dermatológicas e as

transdérmicas, o termo “libertação in vitro” é preferido. Os princípios de aplicação do

teste de dissolução para sólidos orais também podem ser aplicados em testes de

Page 137: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo IV

137

libertação in vitro, sendo o objectivo final de ambos a caracterização biofarmacêutica

do produto e o controle da sua qualidade (Siewert et al., 2003). O teste de libertação in

vitro para preparações transdérmicas pode ser realizado com os aparelhos 5, 6 e 7 da

Farmacopéia Americana (USP 28, 2005). No entanto, não existe método oficial para

determinação da libertação ou cedência de produtos semi-sólidos (Shah et al., 1989).

A existência de metodologias in vitro, relactivamente à caracterização da libertação da

substância activa de semi-sólidos funciona como um ensaio equiparável ao ensaio de

dissolução das formas farmacêuticas sólidas (Toscano, 2001).

Uma grande quantidade de artigos, assim como guidelines do FDA,

preconizam o uso de células de difusão como a célula de Franz, equipada com

membrana sintética para determinar a libertação in vitro de formulações semi-sólidas,

como cremes, geles e loções, e também de sistemas transdérmicos (Shah et al., 1989;

U.S.FDA/CDER, 1997; Shah et al., 1999). A célula de difusão de Franz tornou-se um

método popular de estudo da difusão e permeação de substâncias através da pele e

mucosas.

A “célula de difusão ou de Franz” (Franz, 1975, 1978), que segue um modelo

bicompartimental, esquematizado na Figura 43, possui dois compartimentos, um

contendo o fármaco (compartimento dador) e outro contendo uma solução onde o

fármaco é solúvel, separados por uma membrana natural ou sintética. O sistema de

difusão de Franz é bastante utilizado devido ao seu baixo custo, boa reprodutibilidade

dos resultados e realização em pequeno espaço de tempo, comparativamente a outras

técnicas (Leveque et al., 2003). Neste modelo de Franz, a disposição é vertical, mas

existem sistemas onde os dois compartimentos estão dispostos lado a lado (Friend,

1992).

Page 138: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo IV

138

Figura 43. (A)Ilustração esquemática da célula de Franz; (B) compartimento dador, (C) compartimento dador célula de Franz modificada (Adaptado: Bonferoni, 1998).

Conforme a Figura 43 a formulação é colocada na parte acima da membrana,

no compartimento dador e a passagem do fármaco pela membrana para o

compartimento receptor é monitorizada pela análise de amostras do líquido receptor

recolhidas em diferentes tempos. Os parâmetros que podem influenciar a taxa de

libertação in vitro são as características da membrana artificial de suporte empregada

e a composição da solução receptora adequada (Shah et al., 1999). O sistema deve

possibilitar agitação constante, temperatura controlada e facilidade de amostragens da

solução receptora (OECD, 2004).

O gráfico de quantidade de fármaco acumulado no meio receptor em função do

tempo fornece o perfil de libertação, e o fluxo de passagem do fármaco a partir da

formulação para a solução receptora é representado pela inclinação da parte recta da

curva (Shah et al., 1989).

Page 139: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo IV

139

O FDA recomenda o uso desse teste para comprovação de equivalência entre

produtos sob mudanças específicas, como mudança de equipamento, fornecedor da

matéria-prima e outros (U.S.FDA/CDER, 1997). A determinação da taxa de libertação

de diferentes formulações é útil durante o desenvolvimento galênico e tecnológico de

preparações semi-sólidas, sendo um recurso importante para a optimização de

formulações. E a taxa de libertação de um fármaco a partir de determinada formulação

depende directamente das características físico-químicas do veículo e do fármaco

(Santoyo et al., 1996).

A solubilidade do fármaco no veículo representa um papel importante na taxa

de libertação in vivo. Algumas considerações devem ser feitas em relação ao protocolo

de estudo. A solução receptora deve ser escolhida baseada na solubilidade do

fármaco, de forma que a condição sink seja sempre obedecida. Para fármacos

hidrofílicos, é comum o uso de soluções salinas, enquanto que para substâncias

lipofílicas, o uso de aditivos que aumentem a solubilidade pode ser necessário (Skelly

et al., 1987).

As partículas do fármaco inicialmente precisam ser solubilizadas para que

então possam sofrer partição e se difundir passivamente para a interface

veículo/membrana biológica (Allen; Popovich, Ansel, 2007).

O processo de difusão ocorre expontaneamente sendo acompanhado da perda

de energia livre (G) do sistema. A difusão pode ser definida como, a transferência

expontânea de um componente de uma região com alto potencial químico, para uma

região com potencial mais baixo, sendo o gradiente de concentração a força

conductora neste processo (Aulton, 2005).

As leis que descrevem o fenómeno de difusão, normalmente são expressas em

termos de gradientes de concentração como, por exemplo, a primeira Lei de Fick, que

indica que a taxa de difusão é proporcional ao gradiente de concentração, conforme a

equação11:

Page 140: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo IV

140

J = dm/ dt = - D dC /dx Eq. (11)

Onde:

O (J) é a velocidade de transporte ou a velocidade do fluxo do fármaco que é

expresso pela razão da quantidade de substância transportada (dm) em determinado

tempo (dt) através de um plano por unidade de área (dC/dx) e fornece o gradiente de

concentração (D) que é o coeficiente de difusão expresso em unidades de área por

unidade de tempo (Aulton, 2005).

A segunda Lei de Fick é geralmente empregada em experiências onde se

emprega uma membrana permeante separando dois compartimentos, tendo-se num

deles a maior concentração do fármaco (compartimento dador) e no outro

(compartimento receptor) a concentração zero (sink conditions) mantendo assim o

gradiente de concentração, a quantidade acumulada do fármaco (m) que passa

através da membrana, por unidade de área e em função do tempo até alcançar o

estado de equilíbrio (Equação12).

(dm/dt) = DC0K / h (2) (Eq.12)

Onde:

C0 é a concentração constante do fármaco na solução doadora,

K é o coeficiente de partição do soluto entre o veículo e a membrana,

h é a espessura da membrana.

Quando registados em gráfico, o tempo de absorção (t) e a quantidade

acumulada absorvida (m) por unidade de área de membrana em função do tempo, o

equilíbrio é verificado quando o gráfico se torna linear. Os dados desta porção linear,

extrapolados, de modo a obter a intercepção da curva quando m = 0, fornecem o lag

time (tempo que leva para começar a ocorrer a absorção) (Aulton, 2005).

Page 141: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo IV

141

Segundo a OECD (2004), a solução receptora deve ser compatível com a

metodologia de análise e elaborada com o conhecimento dos parâmetros de

solubilidade e estabilidade da substância a ser testada e no modelo estático de células

de difusão, o volume recomendado é entre 2-20mL. A OECD também preconiza para

substâncias lipofílicas, a utilização de solventes orgânicos como etanol (mistura etanol:

água, 1:1) e 6% de polietilenoglicol 20 oleíl éter em água para garantir a solubilidade

das mesmas na solução receptora.

Também temos que ter em consideração que o teste de libertação in vitro,

isoladamente, não deve ser aplicado na avaliação de

biodisponibilidade/bioequivalência de formulações semi-sólidas, como as

dermatológicas (U.S.FDA/CDER, 1997). Na verdade, o objectivo do teste não é

necessariamente mimetizar o comportamento in vivo, mas sim avaliar indicadores de

performance da formulação (Siewert et al., 2003).

OBJECTIVO Avaliar o uso da ciclodextrina como promotora de libertação em hidrogele.

Verificar se a escolha dos excipentes da formulação do hidrogele foi adequada.

Avaliar o método utilizado.

MATERIAL Hidrogele optimizado (complexo obtido por liofilização); Daktarin Lote:7CB5J00;

Membranas de Diálise de celulose com peso molecular de corte de 12000 a 14000

Daltons (Visking Tubing 18/32 Visking Co. Chicago, IL, USA), Membrana filtrante de

polietersulfona 0,45µm (Supor-450 Pall Corporation, Ann Arbor, Michigan) Solução

Tampão Salina de Fosfato pH 6,8 (Farmacopeia Portuguesa 4ed.), etanol.

Page 142: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo IV

142

MÉTODOS Libertação in vitro através de membrana sintética

Meio receptor

O meio utilizado foi uma mistura de PBS pH 6.8 e etanol nas proporções 1:1. Verificou-

se em estudos preliminares a solubilidade do miconazol em diferentes proporções

deste meio. Segundo recomendação do FDA (U.S. FDA/CDER, 1997), misturas

hidroalcóolicas podem ser utilizadas como meio receptor em estudos de libertação in

vitro, quando o fármaco for lipossolúvel. Com a verificação da solubilidade conseguiu-

se obter dados para que a concentração do miconazol utilizado obedeça às condições

sink, e assim não ocorra a proximidade da saturação na solução receptora do fármaco.

A solução receptora foi preparada, filtrada e desgaseificada por sonicação em

ultrason.

Curva de Calibração Pesou-se rigorosamente 100mg de miconazol e dissolveu-se para 100mL de uma

solução PBS/etanol (1:1). A partir da solução anterior (1mg/ml) preparou-se 8 soluções

padrão com concentrações de 0,1 á 0,8 mg/ml, numa mistura PBS/etanol. A curva de

calibração foi construída com as absorvâncias lidas a 273 nm versus concentrações. A

absorção máxima do miconazol é de 273 nm no solvente escolhido, PBS/etanol (1:1),

sendo este valor confirmado pela obtenção de um espectro percorrendo toda a região

espectral electromagnética. O método foi validado com os parâmetros de linearidade,

precisão (ensaios de repetibilidade e de reprodutibilidade) e exactidão assim como no

capitulo I (ANEXO I).

Page 143: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo IV

143

Preparação das membranas sintéticas

Membrana de diálise Visking ®

Cortaram-se segmentos de aproximadamente 3 cm da membrana de diálise,

(Fitzpatrick, 2006) e emergiram-se em alguns mililitros da solução receptora, por 30

minutos antes de iniciar o ensaio.

Membrana de polieterssulfona

Cortaram-se segmentos de aproximadamente 3 cm de diâmetro e emergiram-se em

alguns mililitros de solução receptora, por de 30 minutos antes de iniciar o ensaio.

Montagem das células de difusão de Franz

Os ensaios de libertação in vitro realizaram-se em células de Franz. Estas

células possuem uma área de difusão de 1,327 cm2 e um volume nominal do

compartimento receptor aproximadamente de 11 mL. Nas células de Franz, 6 no total

em cada ensaio, foram colocadas membranas de diálise e ou poliétersulfona entre os

compartimentos, receptor e dador. O compartimento receptor foi preenchido com o

meio previamente filtrado e desgaseificado. A membrana foi disposta na célula,

evitando a formação de bolhas. Em cima da membrana colocou-se o compartimento

dador, que teve sua abertura preenchida por 200mg da amostra, com o auxílio de

seringas, procurando manter uma maior uniformidade nas aplicações. O sistema foi

fechado com uma garra metálica e tapado com parafilme. A agitação foi mantida por

meio de uma pequena barra magnética. As células foram mantidas em banho, à

temperatura de 37ºC.

A retirada da amostra e a entrada da mesma foi feita a partir do braço lateral

das células de Franz por mangueiras ligadas ao espectofotômetro, conforme Figura

44. As leituras foram obtidas a cada 5 minutos num total de 3 horas.

Page 144: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo IV

144

Figura 44. Sistema de retirada de amostra.

A concentração do fármaco, foi calculada, considerando o volume total de cada

célula.

Análise dos dados da libertação Realizou-se uma comparação matemática, através da aplicação das equações de (f1),

factor de diferenciação (Equação 13) e (f2) factor de sememelhança, (Equação 14). De

acordo com a orientação do FDA os valores de f1 entre 0 e 15, e f2 entre 50 e 100

asseguram a equivalência do perfil de libertação. O fator de diferenciação (f1) calcula a

diferença percentual entre as duas curvas a cada tempo de leitura e é uma medida do

erro relativo entre as duas curvas onde n é o número de recolhas, R é a quantidade

dissolvida do produto de referência no tempo j e T é a quantidade dissolvida do

produto em estudo no mesmo tempo. O fator de semelhança (f2) como definido pela

FDA e pela EMEA é o logaritmo do recíproco da raiz quadrada de um mais o quadrado

médio da diferença da percentagem de fármaco dissolvida entre os produtos teste e

de referência:

1001 ×

=

=

=n

ij

j

n

ij

jj

R

TR

f Eq.(13)

( )

×

−+

×=

∑=

1001

1

1log502

1

2n

j

jj TRn

f Eq.(14)

Page 145: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo IV

145

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A cedência ou libertação in vitro é um parâmetro fundamental no

desenvolvimento das formulações (Franz, 1965). Na avaliação da libertação in vitro de

formas farmacêuticas contendo fármacos lipossolúveis, soluções receptoras contendo

tensoactivos ou solventes orgânicos podem ser necessários para garantir a

solubilidade adequada para manutenção das condições sink. Misturas hidroalcóolicas

são recomendadas pelo FDA como soluções receptoras em sistemas de células

bicompartimentais (U.S.FDA/CDER, 1997).

Ainda no desenvolvimento deste tipo de metodologia, um dos passos

fundamentais reside na selecção da membrana artificial de suporte à formulação. Esta

deve constituir um suporte inerte relativamente à fase receptora, ao fármaco e à

formulação, permitindo que a substância activa se difunda livremente para a fase

receptora, ou seja, que a velocidade de passagem através da membrana seja superior

à velocidade com que a substância é libertada pela matriz (Higuchi, 1960, 1963).

As Figuras 45 e 46 representam a quantidade, em percentagem, de MCZ

libertado ao longo do tempo de ensaio para cada formulação, tendo como suporte a

membrana de diálise e de polietersulfona, respectivamente.

Verificou-se que o tipo de membrana teve um papel significativo na difusão do

fármaco para o meio receptor. Como se pode observar, a membrana de diálise

apresentou-se como um factor limitante e influenciou o processo de difusão do

fármaco.

Os factores (f1) e (f2) foram calculados de acordo com a literatura e podem ser

consultados na Tabela 13. Os resultados obtidos indicaram semelhanças entre ambas

formulações, igualmente demonstrado através da análise estatística, utilizando o teste

T-student (p > 0.05).

A Eficiência de Dissolução foi calculada a partir dos valores obtidos de área

sob a curva (ASC) do perfil de libertação do MCZ no intervalo de tempo (t), através do

Page 146: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo IV

146

método dos trapezóides (Khan, Rhodes, 1975), e na Tabela 14 estão os valores

calculados da Eficiência de Dissolução do MCZ num tempo de 180 minutos.

O MCZ pertence à classe 2 na classificação biofarmacêutica (Loftsson e

Masson, 2004), e é de realçar o facto de que a dissolução in vivo é a etapa limitante

da absorção, podendo ser variável devido aos factores relacionados às formulações.

Pode-se considerar, entretanto, que as características dos excipientes da

formulação semi-sólida influenciam a libertação do fármaco. Sabe-se que os

excipientes, como os tensioactivos e promotores de absorção, são elementos da

fórmula que podem modificar significativamente a sua biodisponibilidade e velocidade

de penetração de um fármaco.

Tendo na formulação comercial, como excipientes, agentes solubilizantes

polissorbato (tensioactivo não-iónico) e álcool, e sabendo-se que o uso de solventes,

tais como o álcool e tensioactivos podem alterar o conteúdo lipídico da membrana, a

utilização de CDs pode ser uma alternativa em formulações semi-sólidas.

A MβCD é uma ciclodextrina modificada que pode ser usada em formulações

semi-sólidas como os hidrogeles, solubilizando fármacos lipofílicos, devido à formação

de um complexo e ao aumento da penetração, resultante da melhoria da

disponibilidade do fármaco no local de acção (Loftsson e Masson, 2001).

A libertação do hidrogele com o complexo MCZ/MβCD, segundo (f1) e (f2),

revelou ser semelhante ao produto comercial e se esse mesmo comportamento

ocorrer in vivo, pode-se extrapolar que uma maior quantidade de MCZ estará

disponível para a penetração na mucosa bucal em tempo reduzido. Ventura e

colaboladores, (2006a, 2006b) nos seus estudos de permeação utilizaram uma mistura

hidroalcólica (50/50 v/v), o que poderá ser testado em estudos futuros.

Procurou-se utilizar, na formulação desenvolvida, matérias-primas capazes de

aumentar a dissolução, como a ciclodextrina. Além da preocupação em usar

substâncias que à partida promovem a maior absorção, também a CD tem papel

importante na estabilidade da formulação, podendo vir a causar menor irritabilidade in

Page 147: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo IV

147

vivo. Daí poder considerar-se um excipiente alternativo para o aumento da dissolução

de fármacos pouco solúveis. O uso do complexo formado pelo MCZ/CD tem interesse

no tratamento especialmente da candidíase oral, já que os sais solúveis de nitratos

têm mau sabor (Pedersen, 1994). Todos estes factores foram considerados aquando

da seleção da ciclodextrina como um dos excipientes da formulação capazes de

promover a absorção.

Tabela 13. Valores de comparação de f1 e f2. Comparação f1

Membrana Diálise

f1

Membrana

Polietersulfona

f2

Membrana Diálise

f2

Membrana

Polietersulfona

R/Complexo 1,75 6,65 91,99 81,63

R/R 1,78 7,11 - -

R é a referência (Formulação farmacêutica comercial Daktarin ®)

Tabela 14. Valores de Eficiência de Dissolução. ED

Membrana Diálise

ED Membrana Polietersulfona

Hidrogele Complexo 49.97% 72,52%

Daktarin 49,07% 71,33%

Page 148: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo IV

148

Libertação in vitro em Membrana de Diálise

0

10

20

30

40

50

60

70

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Tempo (min)

Co

nce

ntr

ação

(%

)

Hidrogele Complexo Daktarin

Figura 45. Perfil de Libertação in vitro dos hidrogeles em Membrana de Diálise

Libertação in vitro em Membrana de Polietersulfona

0102030405060708090

100

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Tempo (min)

Co

nce

ntr

ação

(%

)

Hidrogele Complexo Daktarin

Figura 46. Perfil de Libertação in vitro dos hidrogeles em Membrana de Polietersulfona.

Page 149: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo IV

149

CONCLUSÃO

A metodologia in vitro contribui consideravelmente para a tecnologia farmacêutica,

porque representa um procedimento práctico, rápido e de baixo custo, que permite

antever o comportamento apresentado pela formulação como um todo.

A determinação do perfil de libertação in vitro utilizando células modificadas de Franz

equipada com membrana sintética mostrou constituir um método adequado para

avaliação das formulações.

O hidrogele com o complexo, apresentou semelhança no perfil de libertação do MCZ

quando comparado com a formulação comercial.

E a MβCD pode ser considerada uma alternativa para melhorar a biodisponibilidade do

miconazol, já que promotores como o álcool agem reduzindo a função barreira das

membranas.

Page 150: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo IV

150

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Page 153: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo IV

153

Perspectivas futuras

Estudo de sistemas ternários.

Estudo de estabilidade dos complexos

Estudo de estabilidade da formulação final.

Estudos de permeação in vitro e in vivo do hidrogele com o complexo.

Estudos da actividade antifúngica dos complexos.

Page 154: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Capitulo IV

154

Conclusões Gerais

Durante as várias fases da investigação sobre a influência das CDs nas

características físico – químicas e na disponibilidade do MCZ, pôde concluir-se que:

Nos estudos de solubilidade de fases, e a partir do diagrama de fases

conseguiu-se estabelecer o tipo do gráfico, como sendo do tipo AP, e a estequiometria

dos complexos de inclusão do MCZ/MβCD e MCZ/HPβC como sendo 1:1e 1:2.

Relativamente aos complexos de inclusão no estado sólido de MCZ estes

foram obtidos pelos métodos de liofilização e secagem por pulverização. O método de

malaxagem e de co-evaporação produziu complexos de inclusão parcial; e após

estudo da sua solubilidade aquosa, demonstraram ser superior à da simples mistura

física.

Se o interesse for uma maior escala de produção deve ter-se em consideração

que o método de secagem por pulverização tem baixos rendimentos, sendo mais

utilizado entretanto em escala laboratorial, ao contrário do método de liofilização que

tem interesse em escala industrial por ser um método eficaz, fácil e com alto

rendimento.

Pode verificar-se que o comportamento reológico e a textura das formulações,

foram influenciadas pelo tipo do polímero, pela concentração usada e pela

temperatura. Pôde observar-se ainda que o tipo de polímero, assim como a

concentração deste na formulação, teve influência na característica tixotrópica do

produto final.

Sabemos que uma substância lipossolúvel tem boa permeabilidade através das

membranas, mas a sua disponibilidade nos fluidos biológicos seria nula, visto que,

para que ela acontessesse seria nescessário que se dissolvesse, ou que pelo menos

se dispersasse completamente, no meio aquoso fisiológico, logo o uso das CDs se

mostra interessante para aumentar a promoção da absorção de fármacos pouco

solúveis.

Page 155: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

155

ANEXO I Validação da curva de calibração

Validar é estabelecer evidências documentadas que garantam que um

determinado procedimento irá reproduzir resultados de acordo com especificações

pré-determinadas (FDA, 2000). A validação é um processo necessário para justificar a

qualidade e a segurança dos resultados em todos os métodos analíticos. É o

“processo que fornece uma evidência documentada de que o método realiza aquilo

para o qual é indicado para fazer” segundo a Farmacopeia Americana (USP29/NF24,

2006). O método foi validado com os parâmetros de linearidade, precisão e exactidão.

A linearidade foi determinada a partir do coeficiente de correlação da curva de

calibração “A” (Etanol/água) (Figura 47) e curva de calibração “B” (PBS/Etanol) (Figura

48), cujo valor encontrado do r foi de 0,999, para ambas as curvas, o que indica uma

boa linearidade entre a absorvância e a concentração. A linearidade é avaliada não só

pelo coeficiente de correlação mas ainda pelo coeficiente de variação dos factores de

resposta. O cálculo deste parâmetro necessita do factor resposta, sendo este a

relação entre a absorvância medida e a concentração conhecida. A razão percentual

entre o seu desvio padrão e a sua média permitem calcular então o coeficiente de

variação dos factores resposta. O coeficiente de variação dos factores obtido foi de

1,754%, para “A” e 1,794% para “B”, o que é inferior ao valor máximo indicado de 2%.

Page 156: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

156

Curva Calibração Etanol/água (1:1)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

Conc.(mg/ml)

Ab

s.(n

m)

Figura 47. Curva de calibração “A”, de miconazol em etanol/água (1:1), a 272 nm.

Curva Calibração PBS/Etanol (1:1)

0,0

0,2

0,4

0,60,8

1,0

1,2

1,4

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

Conc.(mg/ml)

Ab

s. (

nm

)

Figura 48. Curva de calibração “B” de miconazol em PBS/etanol (1:1), a 273 nm.

A exactidão de um método analítico indica a capacidade do método analítico

proporcionar resultados o mais próximo possível do valor aceite como verdadeiro. A

exactidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo método

em estudo em relação ao valor verdadeiro ou um valor aceite como referência. Deve

Page 157: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

157

ser expressa como porcentagem de recuperação, sendo calculada a partir da equação

(15):

FR= (xm/µ)x100 (Eq.15)

em que xm é o valor experimental para a concentração, ou seja o valor calculado a

partir da curva de calibração obtida e o µ é o valor aceite como verdadeiro ou teórico.

Os valores obtidos para a percentagem de recuperação foram de 99,65% e

100,07% e estando dentro dos limites estabelecidos de 98 - 102 (USP/2006), prova a

exactidão do método experimental.

A comparação entre valores obtidos a partir de um conjunto de resultados com

um valor verdadeiro ou outro conjunto de dados, permite determinar se o método

analítico foi exacto (ICH, 1995). Um método que pode ser utilizado é o teste t de

student. Calcula-se o valor de t experimental e compara-se com um valor teórico

tabelado, como indicado na equação (16):

T exp = (100 – média )x n0,5/ CV%R (Eq.16)

nesta equação n é o número de valores experimentais que se utiliza no cálculo da

recta, aqui utilizou-se 8 concentrações para “A” e 8 concentrações para “B”. Os valores

calculados para o t experimental foram de 0,563 e de -0,1254. Pela tabela temos os

valores de t, com nível de confiança 95% para n=8 graus de liberdade, como sendo de

1,717. Como o t experimental é menor que o valor tabelado (Fisher, 1925), podemos

concluir que não há diferença significativa, entre os valores experimentais calculados a

partir da recta de calibração e os valores teóricos.

A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série

de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. Podendo ser

Page 158: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

158

expressa como desvio padrão ou desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de

variação (CV%) de uma série de medidas. Não admitisse valores superiores a 5 %.

A precisão é o grau de concordância entre os diferentes resultados obtidos em

várias determinações efectuadas sobre uma série repetida de ensaios analíticos numa

dada amostra homogénea sob condições definidas (ICH, 1995). Pode ser considerada

a partir da: repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade (ICH, 1995). A

repetibilidade diz respeito à precisão obtida quando todas as medidas são feitas pelo

mesmo analista durante um curto período de tempo, usando as mesmas soluções e

equipamento. Já a reprodutibilidade, é a precisão obtida por um conjunto de condições

incluindo diferentes analistas, diferentes laboratórios e diferentes soluções (ICH,

1995). E a precisão intermediária deve ser estabelecida de acordo com a aplicação do

método, podendo haver variações de analista, dias, equipamento entre outras.

Avaliou-se a precisão intermediária do método, onde as fontes de variabilidade foram

a análise de amostras em replicado e o intervalo de tempo em que foram medidas, 3

dias diferentes.

A precisão foi avaliada tendo em conta os valores de desvio padrão e do

coeficiente de variação das 9 leituras de absorvâncias medidas a parir das 8 soluções

padrão (Tabela 15 e 16).

Tabela 15. Dados utilizados e obtidos para a verificação da precisão do método de UV para análise do MCZ, para curva A, (Etanol/água)

Concentração

(mg/ml) Média de Abs. Desvio Padrão

Coeficiente de

Variação

0,1 0,1500 0,005341 3,561274

0,2 0,2984 0,002450 0,821011

0,3 0,4516 0,010856 2,403828

0,4 0,5989 0,005624 0,939064

0,5 0,7438 0,015515 2,085974

0,6 0,8958 0,018750 2,093026

0,7 1,0420 0,015093 1,448526

0,8 1,1862 0,016525 1,393034

Page 159: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

159

Tabela 16. Dados utilizados e obtidos para a verificação da precisão do método de UV para análise do MCZ para curva B (PBS/Etanol).

Concentração

(mg/ml) Média de Abs. Desvio Padrão

Coeficiente de

Variação

0,1 0,1665 0,00194 1,166609

0,2 0,3202 0,00728 2,273807

0,3 0,4805 0,00795 1,655363

0,4 0,6421 0,00098 0,153321

0,5 0,7947 0,00390 0,490369

0,6 0,9525 0,00187 0,196062

0,7 1,1175 0,00995 0,890625

0,8 1,2673 0,00770 0,607522

Os resultados apresentados para o coeficiente de variação encontram-se

abaixo do valor de 5,0%, provando assim a precisão do método.

O limite de detecção (LD) é a menor quantidade do analíto presente em uma

amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado. O limite de

quantificação (LQ) é a menor quantidade do analíto que pode ser determinada com

precisão e exactidão aceitáveis. Estes parâmetros foram calculados de acordo com as

seguintes equações 17 e 18:

LD = 3x3xσ/S (Eq.17) e LQ = 10xσ/S (Eq. 18)

onde σ é o desvio padrão residual da regressão linear (ICH, 1995) e S o

declive da curva de calibração. Obtendo valores de LD de 0,0149 mg/ml e de LQ de

0,016 mg/ml para a curva “A” e LD 0,017mg/ml e LQ 0,019mg/ml para a curva “B”,

para a detecção do miconazol pelo método utilizado.

Para avaliar a validade do modelo com o qual as medições foram feitas, terá de

se avaliar a regressão linear calculada. Para essa avaliação é preciso calcular e

representar graficamente o erro residual para cada valor de concentração. O erro

Page 160: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

160

residual é definido como, a diferença entre um valor experimental e um valor calculado

a partir da equação da regressão linear. Para cada solução padrão de calibração o

erro residual, ri = yi-yî, onde yi é a média das leituras obtidas experimentalmente para

uma dada concentração padrão e yî a média das leituras calculadas a partir da curva

de calibração (ICH, 1995).

Conclui-se que o modelo utilizado é válido, já que os gráficos representados

pelas Figuras 50 e 51 demonstram o erro residual distribuído ao acaso com valor

médio zero.

-0,004

-0,002

0

0,002

0,004

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Concentração (mg/ml)

Err

o r

esid

ual

Figura 50.:Gráfico distribuição do erro residual, curva “A”.

-0,004

-0,002

0

0,002

0,004

0,006

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Concentração (mg/ml)

Err

o r

esid

ual

Figura 51.: Gráfico distribuição do erro residual, curva “B”.

Page 161: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

161

ANEXO II Estudo estatístico da força e adesividade dos hidrogeles base.

TEMPERATURA=25ºC

FORÇA ANOVA Força

Soma dos quadrados df

Média ao quadrado F Sig.

Entre grupos ,271 3 ,090 173,273 ,000 Mesmo Grupo ,004 8 ,001 Total ,275 11

Comparações multiplas Variável dependente: Força Scheffe

(I) TIPO DO HIDROGELE (J) Tipo do hidrogele

Diferença Média (I-J)

Erro padão Sig.

95% Intervalo de Confiança

Limite Inferior

Limite Superior

PLURONIC PLURONIC/CARB0.5% -,2193667(*) ,0186467 ,000 -,284493 -,154240 PLURONIC/CARB1% -,2542667(*) ,0186467 ,000 -,319393 -,189140 PLURONIC/CARB1.5% -,4221333(*) ,0186467 ,000 -,487260 -,357007

PLURONIC/CARB0.5% PLURONIC ,2193667(*) ,0186467 ,000 ,154240 ,284493 PLURONIC/CARB1% -,0349000 ,0186467 ,381 -,100026 ,030226

PLURONIC/CARB1.5% -,2027667(*) ,0186467 ,000 -,267893 -,137640 PLURONIC/CARB1% PLURONIC ,2542667(*) ,0186467 ,000 ,189140 ,319393

PLURONIC/CARB0.5% ,0349000 ,0186467 ,381 -,030226 ,100026 PLURONIC/CARB1.5% -,1678667(*) ,0186467 ,000 -,232993 -,102740

PLURONIC/CARB1.5% PLURONIC ,4221333(*) ,0186467 ,000 ,357007 ,487260 PLURONIC/CARB0.5% ,2027667(*) ,0186467 ,000 ,137640 ,267893

PLURONIC/CARB1% ,1678667(*) ,0186467 ,000 ,102740 ,232993 * Diferença significativa para intervalo de confiança de 95%. Força Scheffe

TiIPO DO HIDROGELE N

Subset for alpha = .05

1 2 3 PLURONIC 3 ,167900 PLURONIC/CARB0.5% 3 ,387267

PLURONIC/CARB1% 3 ,422167 PLURONIC/CARB1.5% 3 ,590033

Sig. 1,000 ,381 1,000 Médias para grupos em subgrupos homogeneos são exibidos. a Média harmonica do tamanho da amostra = 3,000.

Page 162: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

162

TEMPERATURA =37ºC FORÇA ANOVA Força

Somas dos quadrados df

Média ao quadrado F Sig.

Entre grupos ,357 3 ,119 225,281 ,000 Mesmo Grupo ,004 8 ,001 Total ,362 11

Comparações multiplas Variável dependente: Força

* Diferença significativa para intervalo de confiança de 95% Força Scheffe

TIPO DE HIDROGELE N

Subgrupo para α = .05

1 2 3 PLURONIC 3 ,370233 PLURONIC/CARB0.5% 3 ,583467

PLURONIC/CARB1% 3 ,761567 PLURONIC/CARB1.5% 3 ,809400

Sig. 1,000 1,000 ,170 Médias para grupos em subgrupos homogeneos são exibidos. a Média harmonica do tamanho da amostra = 3,000.

(I) TIPO DO HIDROGELE (J) Tipo do hidrogele

Diferença Média (I-J)

Erro padão Sig.

95% Intervalo de Confiança

Limite Inferior

Limite Superior

PLURONIC PLURONIC/CARB0.5% -,2132333(*) ,0187762 ,000 -

,278812 -

,147655 PLURONIC/CARB1% -

,3913333(*) ,0187762 ,000 -,456912

-,325755

PLURONIC/CARB1.5% -,4391667(*) ,0187762 ,000 -

,504745 -

,373588 PLURONIC/CARB0.5% PLURONIC ,2132333(*) ,0187762 ,000 ,147655 ,278812 PLURONIC/CARB1% -

,1781000(*) ,0187762 ,000 -,243678

-,112522

PLURONIC/CARB1.5% -,2259333(*) ,0187762 ,000 -

,291512 -

,160355 PLURONIC/CARB1% PLURONIC ,3913333(*) ,0187762 ,000 ,325755 ,456912

PLURONIC/CARB0.5% ,1781000(*) ,0187762 ,000 ,112522 ,243678 PLURONIC/CARB1.5% -,0478333 ,0187762 ,170 -

,113412 ,017745

PLURONIC/CARB1.5% PLURONIC ,4391667(*) ,0187762 ,000 ,373588 ,504745 PLURONIC/CARB0.5% ,2259333(*) ,0187762 ,000 ,160355 ,291512

PLURONIC/CARB1% ,0478333 ,0187762 ,170 -,017745 ,113412

Page 163: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

163

ADESIVIDADE 25ºC

ANOVA ADESIVIDADE

Somas dos quadrados df Média ao quadrado F Sig.

Entre grupos 2,405 3 ,802 35,823 ,000 Mesmo Grupo ,179 8 ,022 Total 2,584 11

Comparações multiplas Variável dependente: ADESIVIDADE

Scheffe * Diferença significativa para intervalo de confiança de 95%. ADESIVIDADE Scheffe

TIPO DO HIDROGELE N

Subgrupo para α = .05

1 2 3 PLURONIC 3 ,708000 PLURONIC/CARB0.5% 3 1,217667

PLURONIC/CARB1% 3 1,585000 1,585000 PLURONIC/CARB1.5% 3 1,913000

Sig. 1,000 ,094 ,143 Médias para grupos em subgrupos homogeneos são exibidos. a Média harmonica do tamanho da amostra = 3,000.

(I) TIPO DO HIDROGELE

(J) TIPO DO HIDROGELE

Diferença Média (I-J)

Erro padão Sig.

95% Intervalo de Confiança

Limite inferior

Limite superior

PLURONIC PLURONIC/CARB0.5% -,5096667(*) ,1221484 ,021 -,936287 -,083046 PLURONIC/CARB1% -,8770000(*) ,1221484 ,001 -

1,303620 -,450380

PLURONIC/CARB1.5% -1,2050000(*) ,1221484 ,000 -

1,631620 -,778380

PLURONIC/CARB0.5% PLURONIC ,5096667(*) ,1221484 ,021 ,083046 ,936287 PLURONIC/CARB1% -,3673333 ,1221484 ,094 -,793954 ,059287

PLURONIC/CARB1.5% -,6953333(*) ,1221484 ,003 -1,121954 -,268713

PLURONIC/CARB1% PLURONIC ,8770000(*) ,1221484 ,001 ,450380 1,303620 PLURONIC/CARB0.5% ,3673333 ,1221484 ,094 -,059287 ,793954 PLURONIC/CARB1.5% -,3280000 ,1221484 ,143 -,754620 ,098620

PLURONIC/CARB1.5% PLURONIC 1,2050000(*) ,1221484 ,000 ,778380 1,631620 PLURONIC/CARB0.5% ,6953333(*) ,1221484 ,003 ,268713 1,121954

PLURONIC/CARB1% ,3280000 ,1221484 ,143 -,098620 ,754620

Page 164: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

164

ADESIVIDADE 37ºC

ANOVA ADESIVIDADE

Somas dos quadrados df

Média ao quadrado F Sig.

Entre grupos 6,042 3 2,014 101,042 ,000 Mesmo Grupo ,159 8 ,020 Total 6,201 11

Comparações multiplas Variável dependente: ADESIVIDADE

Scheffe * Diferença significativa para intervalo de confiança de 95%. ADESIVIDADE Scheffe

TIPO DO HIDROGELE N

Subgrupo para α = .05

1 2 3 PLURONIC 3 1,570667 PLURONIC/CARB0.5% 3 2,756000

PLURONIC/CARB1% 3 3,307333 PLURONIC/CARB1.5% 3 3,309667

Sig. 1,000 1,000 1,000 Médias para grupos em subgrupos homogeneos são exibidos. a Média harmonica do tamanho da amostra = 3,000.

(I) TIPO DO HIDROGELE

(J) TIPO DO HIDROGELE

Diferença Média (I-J)

Erro padão Sig.

95% Intervalo de Confiança

Lower Bound

Upper Bound

PLURONIC PLURONIC/CARB0.5% -1,1853333(*) ,1152721 ,000 -

1,587938 -,782729

PLURONIC/CARB1% -1,7366667(*) ,1152721 ,000 -

2,139271 -

1,334062 PLURONIC/CARB1.5% -

1,7390000(*) ,1152721 ,000 -2,141604

-1,336396

PLURONIC/CARB0.5% PLURONIC 1,1853333(*) ,1152721 ,000 ,782729 1,587938 PLURONIC/CARB1% -,5513333(*) ,1152721 ,010 -,953938 -,148729

PLURONIC/CARB1.5% -,5536667(*) ,1152721 ,010 -,956271 -,151062 PLURONIC/CARB1% PLURONIC 1,7366667(*) ,1152721 ,000 1,334062 2,139271

PLURONIC/CARB0.5% ,5513333(*) ,1152721 ,010 ,148729 ,953938 PLURONIC/CARB1.5% -,0023333 ,1152721 1,000 -,404938 ,400271

PLURONIC/CARB1.5% PLURONIC 1,7390000(*) ,1152721 ,000 1,336396 2,141604 PLURONIC/CARB0.5% ,5536667(*) ,1152721 ,010 ,151062 ,956271

PLURONIC/CARB1% ,0023333 ,1152721 1,000 -,400271 ,404938

Page 165: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

165

ANEXO III Teste “t-student” para estudo da firmeza dos hidrogeles base nas temperaturas de 25ºC e 37ºC.

T test hidrogele=Pluronic 20%

Teste para amostras independentes

Teste Levene para variâncias iguais T-test para igualdade das médias

F Sig. t df Sig. (2-calda)

Diferencia média

Erro Padrão

Intervalo de confiança 95%

Inferior Superior

For

ça

Assume Variâncias iguais

,534 ,506 -35,489 4 ,000 -,2023333 ,0057013

-,218162

6

-,186504

1 Não assume variâncias iguais

-35,489 3,744 ,000 -,2023333

,0057013 -

,2185985

-,186068

1

T test hidrogele= Pluronic/Carb.0,5%

Teste para amostras independentes

T test hidrogele= Pluronic/Carb.1,0%

Teste para amostras independentes

Teste Levene para variâncias iguais T-test para igualdade das médias

F Sig. t df Sig. (2-calda)

Diferença Média

Erro Padrão

Intervalo de confiança 95%

Inferior Superior

For

ça

Assume Variâncias iguais

2,847 ,167 -11,447 4 ,000 -,1962000

,0171393 -

,2437863

-,148613

7 Não assume variâncias iguais

-11,447 2,210 ,005 -,1962000 ,0171393

-,263629

2

-,128770

8

Teste Levene para variâncias iguais T-test para igualdade das médias

F Sig. t df Sig. (2-calda)

Diferença Média

Erro Padrão

Intervalo de confiança 95%

Inferior Superior

For

ça

Assume Variâncias iguais

2,429 ,194 -18,289 4 ,000 -,3394000

,0185574 -

,3909235

-,287876

5 Não assume variâncias iguais

-18,289 2,695 ,001 -,3394000 ,0185574

-,402425

1

-,276374

9

Page 166: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

166

T test hidrogele= Pluronic/Carb.1,5%

Teste para amostras independentes

Teste “t-student” para estudo da adesividade dos hidrogeles base para as temperaturas de 25ºC e 37ºC.

T test hidrogele= Pluronic 20%

Teste para amostras independentes

Teste Levene para variâncias iguais T-test para igualdade das médias

F Sig. t df Sig. (2-calda)

Diferença Média

Erro Padrão

Intervalo de confiança 95%

Inferior Superior

Ade

sivi

dade

Assume Variâncias iguais

2,168 ,215 -19,145 4 ,000 -,8626667 ,0450605

-,987774

5

-,737558

8 Não assume variâncias iguais

-19,145 3,095 ,000 -,8626667 ,0450605

-1,00360

52

-,721728

1

T test hidrogele= Pluronic/Carb.0,5%

Teste para amostras independentes

Teste Levene para variâncias iguais T-test para igualdade das médias

F Sig. t df Sig. (2-calda)

Diferença Média

Erro Padrão

Intervalo de confiança 95%

Inferior Superior

Ade

sivi

dade

Assume Variâncias iguais

,006 ,942 -11,158 4 ,000 -

1,5383333

,1378723 -

,1,9211283

-1,15553

84 Não assume variâncias iguais

-11,158 3,935 ,000 -

1,5383333

,1378723 -

,1,9211283

-1,15303

65

Teste Levene para variâncias iguais T-test para igualdade das médias

F Sig. t df Sig. (2-calda)

Diferença Média

Erro Padrão

Intervalo de confiança 95%

Inferior Superior

For

ça

Assume Variâncias iguais

1,012 ,371 -8,120 4 ,001 -,2193667 ,0270158

-,294374

6

-,144358

7 Não assume variâncias iguais

-8,120 2,712 ,006 -,2193667 ,0270158

-,310737

9

-,127995

4

Page 167: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

167

T test hidrogele= Pluronic/Carb.1,0%

Teste para amostras independentes

Teste Levene para variâncias iguais T-test para igualdade das médias

F Sig. t df Sig. (2-calda)

Diferença Média

Erro Padrão

Intervalo de confiança 95%

Inferior Superior

Ade

sivi

dade

Assume Variâncias iguais

1,467 ,293 -15,760 4 ,000 -

1,7223333

,1092876 -

2,0257643

-1,41890

23 Não assume variâncias iguais

-15,760 2,956 ,001 -

1,7223333

,1092876 -

2,0730980

-1,37156

87

T test hidrogele= Pluronic/Carb.1,5%

Teste para amostras independentes

Teste Levene para variâncias iguais T-test para igualdade das médias

F Sig. t df Sig. (2-calda)

Diferença Média

Erro Padrão

Intervalo de confiança 95%

Inferior Superior

Ade

sivi

dade

Assume Variâncias iguais

,252 ,642 -9,124 4 ,001 -

1,3966667

,1530777 -

1,8216785

-,971654

9 Não assume variâncias iguais

-9,124 3,484 ,001 -

1,3966667

,1530777 -

1,8477120

-,945621

3

Page 168: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

168

ANEXO IV Hidrogeles com Miconazol, MβCD e Sistemas binários.

FIRMEZA a 25ºC ANOVA Firmeza

Soma dos quadrados df

Média ao quadrado F Sig.

Entre grupos ,235 4 ,059 395,666 ,000 Mesmo Grupo ,001 10 ,000 Total ,236 14

Comparações Múltiplas Variável dependente: Força Scheffe

(I) TIPO DO HIDROGELE

(J) TIPO DO HIDROGELE

Diferença Média (I-J)

Erro padão Sig.

95% Intervalo de Confiança

Limite Inferior

Limite Superior

PLURONIC/CARB1% MCZ ,1918667(*) ,0099474 ,000 ,154764 ,228970 MβCD ,3663333(*) ,0099474 ,000 ,329230 ,403436 MF ,1922667(*) ,0099474 ,000 ,155164 ,229370 COMPLEXO ,0697000(*) ,0099474 ,001 ,032597 ,106803

MCZ PLURONIC/CARB1% -,1918667(*) ,0099474 ,000 -,228970 -,154764 MβCD ,1744667(*) ,0099474 ,000 ,137364 ,211570

MF ,0004000 ,0099474 1,000 -,036703 ,037503 COMPLEXO -,1221667(*) ,0099474 ,000 -,159270 -,085064

MβCD PLURONIC/CARB1% -,3663333(*) ,0099474 ,000 -,403436 -,329230 MCZ -,1744667(*) ,0099474 ,000 -,211570 -,137364 MF -,1740667(*) ,0099474 ,000 -,211170 -,136964 COMPLEXO -,2966333(*) ,0099474 ,000 -,333736 -,259530

MF PLURONIC/CARB1% -,1922667(*) ,0099474 ,000 -,229370 -,155164 MCZ -,0004000 ,0099474 1,000 -,037503 ,036703 MβCD ,1740667(*) ,0099474 ,000 ,136964 ,211170 COMPLEXO -,1225667(*) ,0099474 ,000 -,159670 -,085464

COMPLEXO PLURONIC/CARB1% -,0697000(*) ,0099474 ,001 -,106803 -,032597 MCZ ,1221667(*) ,0099474 ,000 ,085064 ,159270 MβCD ,2966333(*) ,0099474 ,000 ,259530 ,333736 MF ,1225667(*) ,0099474 ,000 ,085464 ,159670

* Diferença significativa para intervalo de confiança de 95%.

Page 169: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

169

Firmeza Scheffe

TIPO DO HIDROGELE N

Subgrupo para α = .05

1 2 3 4 MβCD 3 ,055833 MF 3 ,229900 MCZ 3 ,230300 COMPLEXO 3 ,352467 PLURONIC/CARB1% 3 ,422167

Sig. 1,000 1,000 1,000 1,000 Médias para grupos em subgrupos homogeneos são exibidos. a Média harmonica do tamanho da amostra = 3,000.

Page 170: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

170

FIRMEZA 37ºC ANOVA Força

Soma dos quadrados df

Média ao quadrado F Sig.

Entre grupos ,712 4 ,178 186,416 ,000 Mesmo Grupo ,010 10 ,001 Total ,722 14

Comparações Múltiplas Variável dependente: Força

Scheffe * Diferença significativa para intervalo de confiança de 95%.

(I) TIPO DO HIDROGELE

(J) TIPO DO HIDROGELE

Diferença Média (I-J)

Erro padão Sig.

95% Intervalo de Confiança

Limite Inferior

Limite Superior

PLURONIC/CARB1% MCZ -,2588000(*) ,0252327 ,000 -

,352915 -

,164685 MβCD ,3937000(*) ,0252327 ,000 ,299585 ,487815 MF ,1617667(*) ,0252327 ,001 ,067651 ,255882 COMPLEXO -,0443333 ,0252327 ,568 -

,138449 ,049782

MCZ PLURONIC/CARB1% ,2588000(*) ,0252327 ,000 ,164685 ,352915 MβCD ,6525000(*) ,0252327 ,000 ,558385 ,746615

MF ,4205667(*) ,0252327 ,000 ,326451 ,514682 COMPLEXO ,2144667(*) ,0252327 ,000 ,120351 ,308582

MBCD PLURONIC/CARB1% -,3937000(*) ,0252327 ,000 -

,487815 -

,299585 MCZ -

,6525000(*) ,0252327 ,000 -,746615

-,558385

MF -,2319333(*) ,0252327 ,000 -

,326049 -

,137818 COMPLEXO -

,4380333(*) ,0252327 ,000 -,532149

-,343918

MF PLURONIC/CARB1% -,1617667(*) ,0252327 ,001 -

,255882 -

,067651 MCZ -

,4205667(*) ,0252327 ,000 -,514682

-,326451

MβCD ,2319333(*) ,0252327 ,000 ,137818 ,326049 COMPLEXO -

,2061000(*) ,0252327 ,000 -,300215

-,111985

COMPLEXO PLURONIC/CARB1% ,0443333 ,0252327 ,568 -,049782 ,138449

MCZ -,2144667(*) ,0252327 ,000 -

,308582 -

,120351 MβCD ,4380333(*) ,0252327 ,000 ,343918 ,532149 MF ,2061000(*) ,0252327 ,000 ,111985 ,300215

Page 171: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

171

Firmeza Scheffe

TIPO DO HIDROGELE N

Subgrupo para α = .05

1 2 3 4 MβCD 3 ,367867 MF 3 ,599800 PLURONIC/CARB1% 3 ,761567

COMPLEXO 3 ,805900 MCZ 3 1,020367 Sig. 1,000 1,000 ,568 1,000

Médias para grupos em subgrupos homogeneos são exibidos. a Média harmonica do tamanho da amostra = 3,000.

Page 172: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

172

ADESIVIDADE 25ºC ANOVA ADESIVIDADE

Soma dos quadrados df

Média ao quadrado F Sig.

Entre grupos 4,064 4 1,016 188,624 ,000 Mesmo Grupo ,054 10 ,005 Total 4,117 14

Comparações Múltiplas Variável dependente: ADESIVIDADE Scheffe

(I) TIPO DO HIDROGELE

(J) TIPO DO HIDROGELE

Diferença Média (I-J)

Erro padão Sig.

95% Intervalo de Confiança

Limite Inferior

Limite Superior

PLURONIC/CARB1% MCZ 1,0983333(*) ,0599211 ,000 ,874833 1,321833 MβCD 1,3200000(*) ,0599211 ,000 1,096500 1,543500 MF 1,3126667(*) ,0599211 ,000 1,089167 1,536167 COMPLEXO ,4816667(*) ,0599211 ,000 ,258167 ,705167

MCZ PLURONIC/CARB1% -1,0983333(*) ,0599211 ,000 -

1,321833 -,874833

MβCD ,2216667 ,0599211 ,052 -,001833 ,445167 MF ,2143333 ,0599211 ,062 -,009167 ,437833 COMPLEXO -,6166667(*) ,0599211 ,000 -,840167 -,393167

MBCD PLURONIC/CARB1% -1,3200000(*) ,0599211 ,000 -

1,543500 -

1,096500 MCZ -,2216667 ,0599211 ,052 -,445167 ,001833 MF -,0073333 ,0599211 1,000 -,230833 ,216167 COMPLEXO -,8383333(*) ,0599211 ,000 -

1,061833 -,614833

MF PLURONIC/CARB1% -1,3126667(*) ,0599211 ,000 -

1,536167 -

1,089167 MCZ -,2143333 ,0599211 ,062 -,437833 ,009167 MβCD ,0073333 ,0599211 1,000 -,216167 ,230833 COMPLEXO -,8310000(*) ,0599211 ,000 -

1,054500 -,607500

COMPLEXO PLURONIC/CARB1% -,4816667(*) ,0599211 ,000 -,705167 -,258167 MCZ ,6166667(*) ,0599211 ,000 ,393167 ,840167 MβCD ,8383333(*) ,0599211 ,000 ,614833 1,061833 MF ,8310000(*) ,0599211 ,000 ,607500 1,054500

* Diferença significativa para intervalo de confiança de 95%.

Page 173: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

173

ADESIVIDADE Scheffe

TIPO DO HIDROGELE N

Subgrupo para α = .05

1 2 3 MβCD 3 ,265000 MF 3 ,272333 MCZ 3 ,486667 COMPLEXO 3 1,103333 PLURONIC/CARB1% 3 1,585000

Sig. ,052 1,000 1,000 Médias para grupos em subgrupos homogeneos são exibidos. a Média harmonica do tamanho da amostra = 3,000.

Page 174: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

174

ADESIVIDADE 37ºC

ANOVA ADESIVIDADE

Sum of Squares df

Média ao quadrado F Sig.

Entre grupos 8,108 4 2,027 108,173 ,000 Mesmo Grupo ,187 10 ,019 Total 8,295 14

Comparações Múltiplas Variável dependente: ADESIVIDADE Scheffe

(I) TIPO DO HIDROGELE

(J) TIPO DO HIDROGELE

Diferença Média (I-J)

Erro padão Sig.

95% Intervalo de Confiança

Limite Inferior

Limite Superior

PLURONIC/CARB1% MCZ 1,5623333(*) ,1117690 ,000 1,145445 1,979221 MβCD 2,0066667(*) ,1117690 ,000 1,589779 2,423555 MF 1,7206667(*) ,1117690 ,000 1,303779 2,137555 COMPLEXO ,7420000(*) ,1117690 ,001 ,325112 1,158888

MCZ PLURONIC/CARB1% -1,5623333(*) ,1117690 ,000 -1,979221

-1,145445

MβCD ,4443333(*) ,1117690 ,036 ,027445 ,861221 MF ,1583333 ,1117690 ,736 -,258555 ,575221 COMPLEXO -,8203333(*) ,1117690 ,000 -

1,237221 -,403445

MβCD PLURONIC/CARB1% -2,0066667(*) ,1117690 ,000 -2,423555

-1,589779

MCZ -,4443333(*) ,1117690 ,036 -,861221 -,027445 MF -,2860000 ,1117690 ,240 -,702888 ,130888 COMPLEXO -1,2646667(*) ,1117690 ,000 -

1,681555 -,847779

MF PLURONIC/CARB1% -1,7206667(*) ,1117690 ,000 -2,137555

-1,303779

MCZ -,1583333 ,1117690 ,736 -,575221 ,258555 MβCD ,2860000 ,1117690 ,240 -,130888 ,702888 COMPLEXO -,9786667(*) ,1117690 ,000 -

1,395555 -,561779

COMPLEXO PLURONIC/CARB1% -,7420000(*) ,1117690 ,001 -1,158888 -,325112

MCZ ,8203333(*) ,1117690 ,000 ,403445 1,237221 MβCD 1,2646667(*) ,1117690 ,000 ,847779 1,681555 MF ,9786667(*) ,1117690 ,000 ,561779 1,395555

* Diferença significativa para intervalo de confiança de 95%.

Page 175: Dissertao Andreza Maria Ribeiro

Anexo

175

ADESIVIDADE Scheffe TIPO DO HIDROGELE N Subgrupo para α = .05

1 2 3 4 MβCD 3 1,300667 MF 3 1,586667 1,586667 MCZ 3 1,745000 COMPLEXO 3 2,565333 PLURONIC/CARB1% 3 3,307333 Sig. ,240 ,736 1,000 1,000

Médias para grupos em subgrupos homogeneos são exibidos. a Média harmonica do tamanho da amostra = 3,000.