die membranverdauung der stärke. i. mitt. per einfluß von seiten der perfusionsgeschwindigkeit und...

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Die Nahrung Chemie, Biochemie, Mikrobiologie, Technologie 10. Jahrgang 1966 Heft 8 Aus dem Rega-Institute for hledical Research in Leuven (Belgien) Die Membranverdauung der Starke. 1. Mitt. Der EinfluB von Seiten der Perfusionsgeschwindigkeit und der amylolytischen Aktivitat des Pankreassaftes auf die ,,in vivos6-Verdauung der Starke P. DE LAEY DIi 612.396.111 :612.332 Starke, Darmverdauung EinfluO des Pankreassaftes Bei Anwendung der Methode der St2rkeperfusion bei der Ratte ,.in vivo" ergab sich ein wesentlicher Unterschied zwischen der Amylaseaktivit5t im Perfusat (,,in Vitro") und der St2rkeverdauung im Danndarm ,,in vivo". Dieser Unterschied steht im Gegen- satz zur klassischen Auffassung der Lumenverdauung, sie deutet auf eine andere Art der Verdauung hin, die ein Zusammenwirken zwischen den sekretierenden pankrea- tischen Fermenten im DCinndarm und der Darmwandung einschliebt. Was die Struktur und die Zusammensetzung derselben betrifft, so hat die Darmwand die Fahig- keit, einige Bestandteile des Chymus oder pankreatische Fermente zu adsorbieren. Die umkehrbare Adsorption von pankreatischen Enzymen, auf welcher sich die Funktion der Verdauung grtindet, die von UGOLEV mit , ,Membranverdauung" bezeichnet Wird, fiihrt zu einer VergroOerung der spezifischen Aktivitit der Fermente und der Wirkung der Verdauung. Die Kesultate unserer Untersuchungen zeigen, daO die Wirksamkeit der Membranverdauung von der Geschwindigkeit der Perfusion abhingt (Korrelations- faktor bei erwachsenen Ratten: 0,87--0,g2) und sich exponentiell mit einer VergroBe- rung der Amylasemenge im pankreatischen Saft erniedrigt. Verschiedene Ergebnisse haben gezeigt , da13 Hydrolyse und Verdauung hy- drolysierbarer hochmolekularer Stoffe nicht allein im Dunndarmlumen statt- finden, sondern auch durch eine genau in allen Hydrolyseschritten gesteuerte Wechselwirkung zwischen Chymus und Oberflache des Diinndarmepithels regu- liert werden. Diese Wechselwirkungen sind auch von der physikalischen Seite her zu betrachten; denn der Chymus, der durch den Dunndarm geleitet wird, hat immer Kontakt mit den Wanden, die die iiberaus groDe Oberflache von 570 cm2 je I ml Darminhalt haben. Hierbei ist die Moglichkeit zur Adsorption der frei beweglichen enzymatischen Systeme aus dem Pankreas auf die Membran des Darmes gegeben. Durch diese Adsorption der Enzyme entsteht ein beson- 43 Die Nahrung, H. 8

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Die Nahrung Chemie, Biochemie, Mikrobiologie, Technologie

10. Jahrgang 1966 Heft 8

Aus dem Rega-Institute for hledical Research in Leuven (Belgien)

Die Membranverdauung der Starke. 1. Mitt. Der EinfluB von Seiten der Perfusionsgeschwindigkeit

und der amylolytischen Aktivitat des Pankreassaftes auf die ,,in vivos6-Verdauung der Starke

P. DE LAEY

DIi 612.396.111 :612.332 Starke, Darmverdauung EinfluO des Pankreassaftes

Bei Anwendung der Methode der St2rkeperfusion bei der Ratte ,.in vivo" ergab sich ein wesentlicher Unterschied zwischen der Amylaseaktivit5t im Perfusat (,,in Vitro") und der St2rkeverdauung im Danndarm ,,in vivo". Dieser Unterschied steht im Gegen- satz zur klassischen Auffassung der Lumenverdauung, sie deutet auf eine andere Art der Verdauung hin, die ein Zusammenwirken zwischen den sekretierenden pankrea- tischen Fermenten im DCinndarm und der Darmwandung einschliebt. Was die Struktur und die Zusammensetzung derselben betrifft, so hat die Darmwand die Fahig- keit, einige Bestandteile des Chymus oder pankreatische Fermente zu adsorbieren. Die umkehrbare Adsorption von pankreatischen Enzymen, auf welcher sich die Funktion der Verdauung grtindet, die von UGOLEV mit , ,Membranverdauung" bezeichnet Wird, fiihrt zu einer VergroOerung der spezifischen Aktivitit der Fermente und der Wirkung der Verdauung. Die Kesultate unserer Untersuchungen zeigen, daO die Wirksamkeit der Membranverdauung von der Geschwindigkeit der Perfusion abhingt (Korrelations- faktor bei erwachsenen Ratten: 0,87--0,g2) und sich exponentiell mit einer VergroBe- rung der Amylasemenge im pankreatischen Saft erniedrigt.

Verschiedene Ergebnisse haben gezeigt , da13 Hydrolyse und Verdauung hy- drolysierbarer hochmolekularer Stoffe nicht allein im Dunndarmlumen statt- finden, sondern auch durch eine genau in allen Hydrolyseschritten gesteuerte Wechselwirkung zwischen Chymus und Oberflache des Diinndarmepithels regu- liert werden. Diese Wechselwirkungen sind auch von der physikalischen Seite her zu betrachten; denn der Chymus, der durch den Dunndarm geleitet wird, hat immer Kontakt mit den Wanden, die die iiberaus groDe Oberflache von 570 cm2 je I ml Darminhalt haben. Hierbei ist die Moglichkeit zur Adsorption der frei beweglichen enzymatischen Systeme aus dem Pankreas auf die Membran des Darmes gegeben. Durch diese Adsorption der Enzyme entsteht ein beson- 43 Die Nahrung, H. 8

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derer Digestionsmechanismus, der eine intermediare Form zwischen extrazel- luliirer und intrazellularer Verdauung darstellt, d. h. eine Zweigestaltigkeit, basierend auf der Adsorptionskinetik mit ihrer Lokalisation bei gleichzeitiger Resorption der gespaltenen Produkte. Dieser Verda.uungsmechanismus ist erstmals von UGOLEV [I] beschrieben und von ihm Membranverdauung genannt worden.

Die Rolle dieser Membranverdauung bei den verschiedenen Tierspecies [z] und die Charakteristik ihrer Intensitat bei Ratten [3 -5 pragt die doppelte Funktion der Membran innerhalb des Verdauungssystems in signifikanter Weise aus.

Die Ergebnisse von JESUITOVA u. a. [5] haben die vollstandige Reversibilitat der Enzymadsorption sowie den prinzipiellen Wirkungsmechanismus einer derart gesteuerten Verdauung dargelegt. In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene Faktoren, die auf die Membranverdauung der Starke Einflul3 nehmen konnen, uberpruft und die Regulation des mit der Membran verkniipf- ten Verdauungssystems analysiert .

Metlode

Die Untersuchungen erfolgen an miinnlichen Ratten (Wistarzucht), die auf eine normale balanzierte D&t eingestellt sind.

I. Perfusiomsmetkode

Die Versuchstechnik entspricht derjenigen nach SOLS u. a. [6]. Zur Ermittlung der z Ver- dauungstypen, namlich der kavitalen und der Membranverdauung, werden die Amylase- Aktivitat und der Gehalt an nicht hydrolysierter Starke in der Perfusionsfliissigkeit bestimmt. Die Aktivitat der &lichen Amylase ist der Index der Verdauung im Diinndarmlumen (.,in vitro"-Aktivitat). Der Hydrolysegrad der Starke - die Differenz zwischen der initialen und der finalen Starke-Konzentration im Perfusat - stelIt den Index der totalen Starkeverdauung im Lumen sowie auf der Oberflache des Dunndarms dar (,,in vivo"-Aktivitat).

a) Versuche in uiuo. Eine gepufferte 0,15%ige Starkelosungl in Ringer-Pufferlosung (pH 7.0) wird durch das Lumen eines isolierten proximalen Teils des Dtinndarms der Katten unter Nembutalnarkose (4 m g / ~ o o g) perfundiert. Die Perfusionsgeschwindigkeit wird bei 6 bzw. I Z ml/min konstant gehalten. Nach verschiedenen Zeiten wird das Perfusat innerhalb I min quantitativ in einem gekiihlten (0 "C) graduierten Proberohrchen gesammelt.

Die Reaktion wird durch Zugabe von I ml I n-Salzsaure gestoppt und das AusinaB der Hydrolyse in I ml Perfusat aus der Differenz zwischen dem Ein- und dem AuslaD der Perfusion ermittelt (modifizierte Reaktion nach SMITH und ROY). Die Verdauung in yo ergibt sich aus folgender Gleichung :

Perfusionsgeschwindigkeit (mllmin) Volumen des perfundierten Darms [rnl]

- ... - -. yo Verdauung je min = IOO

b) Vcrsuche in uitro. Gleichzeitig mit den Versuchen gemal3 a) wird in I oder z ml Perfusat die luminale Hydrolyse ermittelt. Nach Inkubation bei 38 OC bis zur Vollendung der Hydro- lyse der Starke (Jod-Farbung negativ) werden 0,5 ml des Perfusats mit 0.5 ml einer Starke- losung (gleiche Endkonzentration wie unter a)) wahrend 5 bzw. 10 min bei Korpertemperatur der Ratteninkubiert; der Umsatz wird durch Zugabe von I ml I n-Salzsaure beendet und das Substrat nach SMITH-ROY untersucht. Die Resultate sind in yo Verdauung je ml Perfusat/min oder in mg gespaltene Starke je ml Perfusionlmin ausgedriickt.

1 Amylum solubile nach ZULKOWSKI (E. Merck-Darmstadt).

Membranverdauung der Starke I. 643

Vorversuche haben gezeigt, daO :

a) wiederholte Inkubationen des Perfusats einen EinfluB auf die reine restierende amylolytische Aktivitat nicht haben; B) nach 30 min der Inkubation bei 38 O C ein Verlust an Amylase-Aktivitiit nicht beobachtet wird; y ) die amylolytische Aktivitat des Perfusats nach totaler Hydrolyse eines Oberschusses an StPrke unveriindert bleibt.

2 . Quaiztitatiue I'ersuche

a) Perfusat. Die restierende Starke wird nach der modifizierten Reaktion von SMITH-ROY be- stimmt, der reduzierende Zucker nach SOMOGYI u. NELSON, die alkalische Phosphatasc nach der Methode von KING u. ARMSTRONG, automatisiert mittels des Technicon-Auto-Analysers. b) Gewebehomogenat. Nach Beendigung der Perfusion und der Bestimmung des Darminhaltes wird der Diinndarm von Mesenterium befreit und der Lange nach aufgeschnitten. Nach dem Trocknen rnit Filterpapier wird die Mucosa rnit einem Objekttrager abgeschabt, auf einer Tor- sionswaage gewogen und homogenisiert in rxiger (g/v) Losung von 0 , 2 5 m-Mannit.

Das Homogenat wird bei zoo g zentrifugiert und im opalescenten Oberstand die Invertase- Aktivitat nach der kolorimetrischen Methode von BLAIR u. a. [7] bzw. wie die Maltase-Aktivi- t a t durch spektrophotometrische Analyse der enzymatisch freigesetzten Glucose (mit Glucose- -6-Phosphat-Dehydrogenase) bestimmt.

Ergebnisse

I . Der Einflus vonseiten de7 Perfusionsgeschwindigkeit auf die Membranverdauung der Stiirke

Gleiche Darmschlingen der anasthesierten Wistarratten werden mit 0,15%- iger Starkelosung in Ringer-Pufferlosung mit verschiedener Geschwindigkeit durchstromt ; diese unterschiedlichen Perfusionsgeschwindigkeiten werden mittels einer proportionalen Technikonpumpe rnit kalibrierten Darmen kon- kretisiert.

Diese Untersuchungsergebnisse unterstiitzen die Annahme einer direkten Korrelation zwischen dem Verhaltnis in vivo/in vitro und dem Perfusionsge- schwindigkeitskoeffizienten ( F ) (Abb. I)

Perfusionsgeschwindigkeit (mllmin) Volumen des perfundierten Darms (ml) F =

Da die Amylase-Aktivitat im pankreatischen Saft und die totale Oberflache des Intestinalepithels der Ratte sich mit dem Alter andern [8] und dadurch die Zweigestaltigkeit der Membranverdauung fluktuiert [9]. haben wir den Korre- lationskoeffizienten (R) zwischen der Starke-Verdauung in vivolin vitro in Be- ziehung zum Perfusionskoeffizienten ( F ) fur 3 Altersgruppen bestimmt, und zwar bedeuten in Tab. I :

Gruppe Gruppe I1 : Ratten, zwischen 88 und 150 g schwer; Gruppe 111: erwachsene Ratten, uber 150 g schwer.

I : junge Ratten, unter 88 g schwer;

43'

644 DE LAEY

Tiergruppe

T a b e l l e I

Korrelationskoeffizient (R) : Starke-Verdauung in vivolin vitro in Beziehung zum Perfusions- koeffizienten F ; partieller Korrelationskoeffizient R' : Starke-Verdauung in vivo in Beziehung Zuni Perfusionskoeffizienten ( F ) bei konstant gehaltener in vitro-Aktivitat; die Signifikanz ( P )

dieser Koeffizienten ist nach tnP2 = ~ Rvn--a berechnet __ 1-R'

Zahl der Perfusionen i R*-

. Perfusionsgescbwind~&eit/Yo/umen

des perfindierten Darmes

Abb. I . Die Zweigestaltigkeit der Starke-L'erdauung in1 Dunndarm (Kdrpergewicht der Ratten 88 bis 1 5 0 ~ )

nach der Perfusionsgeschwindigkeit

Es wird eine Korrelation zwischen dem Amylasegehalt im Perfusat (,,in vitro"-Aktivitat) und der Perfusionsgeschwindigkeit in diesen Altersgruppen der Tiere nicht festgestellt (Tab. 2).

Die erhohte Perfusionsgeschwindigkeit veranlal3t keine Abschuppung des Dunndarmepithels. Invertase und alkalische Phosphatase des Mucosahomo- genates zeigen gleiche Aktivitaten nach schneller wie nach langsamer Durch- stromungsgeschwindigkeit (Abb. 2 ) .

2 . Der Einflufi der anaylolytischen Akt iv i tat des Punkrenssa ftes auf die Meiiabranverdauung der Starke

Die Doppelrolle der Membranverdauung, ausgedriickt durch das Verhliltnis in vivo/in vitro, nimmt deutlich ab, wenn sich der Gehalt des Perfusats an Jreier

Membranverdauung der Stiirke I. 645

7.0 2.0 3.0 4.0 Peffusionsges~wind~keit/Ya/umen

des perfindierten Dames

b'ewichf der ,?often

0.5 1 1.5 2 3.5 in v h -Amylase -4kfivjfit

.I\bb. 1. lnvertase und alkalische Phosphatase des 3lucosahomogenates nach 20 min

der Perfusion mit 0,15%iger Stlrke-Idsung als Funktion der Perfusionsgeschwindigkeit

Abb. 3. Der Einflul3 der amylolytischen Xktivitat des Perfusats (in vitro) auf die

Zweigestaltigkeit der Membranverdanung (in vivo/in vitro).

Far ein in vivolin vitro-Verhaltnis = 1

kann die Membranverdauung nicht rnchr festgestellt nerden

.Amylase erhoht (Abb. 3). Die Regression der Koeffizienten in vivo/in vitro wird durch folgende mathematische Cleichung ausgedruckt :

in vivo in vitro

. - - e - k - in vitro

Die orientierenden kinetischen Versuche zeigen, daB k (der Regressionskoeffi- zient) zeitabhangig ist. Nach 2, 5 bzw. 10 min der Perfusion ist eine lineare Korrelation zwischen k und Perfusionszeit zu finden, errechnet aus einer Sene von 33 Perfusionen :

k = 2 3 If 0,2 min-l/mg/ml Perfusat.

Eine deutliche Korrelation zwischen der ,,in vivo"- und ,,in vitro"St5rkc- Verdauung fur eine konstante Perfusionsgeschwindigkeit wird indessen nicht gefunden (Tab. 3).

Tabelle 3 Die Korrelationskoeffizienten (R)

zwischen der ,,in vivo"- und ,,in vitro"-SGrke- Verdauung fur einen konstanten

Perfusionsgeschwindigkeitskoeffizienten (F)

I Zahl der R in vivo/in vitro- 1 Perfusion Verdauung Tiergruppe

646 DE LAEY

Dis kussiom

Die statistisch signifikante Korrelation zwischen der ,,in vivo"-Verdauung und dem Perfusionskoeffizienten F in der zweiten und dritten Altersgruppe der Ratten (Gewicht 88 bis 250 g) bestatigt die Beobachtungen von JESUITOVA u. a. [4, 51, wonach die ,,in viva"-Verdauung der Starke von der Perfusionsgeschwin- digkeit abhangig ist (Tab. I). Nach einer turbulenten Perfusion, deren Ge- schwindigkeit mehrfach groBer ist als die des Darminhaltes unter normalen Bedingungen, zeigt der Amylasegehalt des Perfusats keine Schwankungen (Tab. 2), und die mucosale Membran bleibt unverletzt (Abb. 2) .

Die nicht signifikante Korrelation zwischen der ,,in vivo"-Verdauung und der Perfusionsgeschwindigkeit in der jungeren Altersgruppe (R = 0,36 gemail3 Tab. I) konnte die Folge einer groJ3eren individuellen Variabilitat im Amylase- gehalt sein oder auch durch strukturelle Resonderheiten des Dunndarmepithels in diesem Alter verursacht werden.

Der Anstieg der ,,in vivo"-Verdauung im Aktivitat-Perfusionsgeschwindig- keitsdiagramm (Abb. I) ist ein wichtiges Argument hinsichtlich der Membran- gebundenheit dieses hydrolytischen Prozesses. Obgleich der Korrelationskoeffi- zient zwischen der ,,in vivo"- und ,,in vitro"-Verdauung (fur eine konstante Perfusionsgeschwindigkeit) auf einen voneinander unabhangigen Verlauf der 2 Verdauungsmechanismen hindeuten konnte (Tab. 3), bleibt die Zweigestaltig- keit der Membranverdauung durch das Ansteigen der ,,in vitro"-Verdauung deutlich beeinflu& (Abb. 3).

Die Regression des AusmaBes der Membranverdauung bei steigender ,,in vitro"-Aktivitat und die Zeitabhangigkeit dieser Regression entsprechen der Hemmung von katalytischen Prozessen durch die gebildeten Hydrolyseprodukte.

GemaB diesen Umstanden haben wir eine Interferenz der nicht resorbierten Hydrolyseprodukte entweder mit der amylolytischen Aktivitat oder mit: der Amylase-Adsorption auf das Diinndarmepithel beobachtet, in der Annahme, daB die Membran-Hydrolyse der Starke nicht der limitierende Schritt dieser Verdauung ist; dies konnte das Thema einer spateren Mitteilung sein. 2 Kenn- zeichen der Membranverdauung haben wir bei den vorliegeriden Versuchen beob- achtet : a) Die Membranverdauung der Starke steigt durch Erhohung der Perfusions-

b) die Membranverdauung wird in Abhangigkeit von der Zeit und durch das geschwindigkeit ;

Ansteigen der amylolytischen Aktivitat im Perfusat vermindert.

Erganzung

Berechnung der Korrelationskoeffizienten x = ,,in vivo" Verdauung. y = ,,in vitro" Verdauung. F = Perf usionsgeschwindigkei tsf akt or.

Membranverdauung der Starke I. 647

X a) Direkte Korrelation: -in F Funktion.

Man berechnet fur n Bestimmungen : Y

Die Mittelwerte : Y

- EF und I; = -

Man bexechnet - analog zu Abweichungsquadraten - die Summe der -4b- weichungsprodukte :

b) Partielle Korrelation : Berechnung des Korrelationsfaktor x nach F ausschlieBend den Korrelations-

Man berechnet fur n Bestimmungen : koeffizient von F nach y .

Ex, Zy, ZF, Zxs, Zy2, ZFB, Zxy, ExF, ZyF Z = Zx/n, j = Zyln, F = ZF/n

Man berechnet die Summe der Abweichungsprodukte :

SX’ - X Z X n- - I ebenso fur: Sy, S F , Sxy, SxF und SyF

izus den Standardabweichungen berechnet man die Korrelationsfaktoren riach I Variablen, z. R.

Der- totale Korrelationskoeffizient von drei Veranderlichen ist dann : Rx, F - (RyF 3 RXy)

( I - RyFs) . (I - RXY*) RxFY, =

Summary

P. DE LAEY: Membrane digestion of starch. Part I. The influence of the perfusion velocity and the amylolytic activity of the pancreatic juice on the membrane digestionof starch

Using perfusion “in vivo” of starch in a ratgut, important differences were observed be- tween the amylase content of the perfusate (in vitro) and the digestion of starch which occurs in vivo in the gut. This discrepancy is a t variance with the classical concept of cavital diges- tion of starch, but suggests the existence of another type of digestion involving an interaction between the pancreatic enzymes secreted in the gut and the intestinal membrane. On behalf of its architecture and composition, the intestinal membrane can easily adsorb any chyme constituents or pancreatic enzymes.

648 DE LAEY

The reversible adsorption of pancreas enzymes, on which is based a functional concept of the digestion, called by Ugolev "membrane digestion", induces an increase of the specific enzyme activity and the efficiency of digestion.

Our results suggest that the efficiency of the membrane digestion depends upon the velocity of perfusion (factor of correlation: 0.87-0.92 for adult rats) but diminish exponentially for increasing amounts of amylase in the pancreatic juice.

L i t e r a t u r

[I] UGOLOV, .4. M., Bull. Exp. Biol. Rfed. 49, 12 (1960). [z] UGOLEV, A. M., Nature [London] 188, 588 (1960). [3] DE LAEY, P., u. N. N. JESUITOVA, Dokl. Akad. Nauk SSSR 146, 731 (1962). [4] JESUITOVA, N. N., A.M. UGOLEV u. I. N. FEDYUSHINA, Dokl. Akad. Nauk SSSR, 149,

[5] JESUITOVA, N. N., P. DE LAEY u. A. M. UGOLEV, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam]

[6] SOLS, A., u. F. PONZ, Rev. espafi. Fisiol. 3, 207 (1947). [7] BLAIR, D. G. R., u. J. TUBA, Can. J. Biochem. Physiol. 41. go5 (1963). [8] BAKER, S. J., V. 1. MATHAN u. V. CHERIAN, Lancet I, 860 (1963). [g] DE LAEY, P., Nature [London], 212, 78 (1966).

746 (1936).

86, 205 (1964).

Dr. P. DELAEY, Rega-Institute for Medical Research in Leuven (Belgien).

Eingegangen 8.6. 1966.