diagnostico y evaluación de progreso de amiloidosis de ... · paciente al-ex11-hombre de 66 años....
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Aportes del laboratorio al
diagnostico y evaluación de
progreso de amiloidosis de cadena
liviana
Marina Ramírez Alvarado
Clínica Mayo
Rochester, MN, EEUU
23 de agosto del 2017
• Avances de la ultima década en el diagnostico de
amiloidosis sistémica
• Contribuciones del laboratorio de investigación en
el diagnostico y seguimiento de amiloidosis
sistémica
• Exosomas urinarios
• Uso de espectrometría de masas en el estudio de
exosomas urinarios para definir tratamiento
Amiloidosis
de cadena
liviana
• Micro disección de depósitos amiloide (Congo rojo positivos)-tres micro disecciones de 60,000 mm2
• Desnaturalización de proteínas y eliminación de los enlaces de reticulacion
• Reducción de puentes disulfuro
• Digestión de Proteinas usando tripsina
• Péptidos trípticos son inyectados en un cromatógrafo de líquidos.
• Ionización de electro espray seguida de espectrometría de masas de alta resolución
• Los espectros de masas son compilados y comparados con bases de datos
• Identificación de proteínas
• Identificación del tipo de amiloide
Identificación del tipo de amiloide a partir de especímenes
fijados con formalina en parafina
Muchtar et al., Acta Hematol 2016
Mills et al., Methods 2015
Espectrometría de masas de cadenas livianas intactas usando el método
miRAMM (monoclonal immunoglobulin rapid accurate molecular mass)
Mills et al., Methods 2015
El método miRAMM aumenta la sensibilidad del
diagnostico al poder detectar bajas concentraciones
Mills et al., Methods 2015
Barnidge et al., J Proteome Research 2014
Las cadenas livianas intactas kappa y lambda
presentan distribuciones de masas distintas
Barnidge et al., J Proteome Research 2014
El método miRAMM permite distinguir entre muestras de
suero de pacientes con enfermedades asociadas con
producción de inmunoglobulinas e individuos sanos
clonas
Suero de paciente
con mieloma múltiple
Dilución 1/1000
Suero de paciente
con mieloma multiple
miRAMM aumenta la sensibilidad del ensayo clínico
en pacientes con trastornos asociados con cadena
liviana
Mills et al., Methods 2015
Exosomas son vesículas con
membrana que se originan en el
cuerpo multivesicular (MVB)
formando parte de los
mecanismos de exocitosis en las
celulas
diámetro: 50-150 nm
CD63, CD81 +
Microvesiculas son vesículas
que forman parte de las zonas de
balsas lipídicas (lipid raft)
Diametro:100-1000 nm
Annexin V +
Cuerpos apoptoticos son
vesículas provenientes de la
desintegración de células
apoptóticas. Contienen material
genetico rodeado de pedazos de
membrana celular
500-2000 nm
Thrombospondin, C3b +
Los exosomas son miembros de una
familia de vesículas extracelulares (EVs).
Los EVs son caracterizados por su tamaño
y su origen celular. Su función es la de
comunicar señales entre células y
transferir información entre células.
Adipocitos
Fluido Amniótico
Humor acuoso
Ascitos
Astrocitos
Células limfoblastoides B
Células B
Células basofílicas leucémicas
Células cancerígenas de la vejiga
Células cancerígenas del cerebro
Células cancerígenas de mama
Leche materna
Fluido broncoalveolar
Células cancerígenas del colon
Neuronas corticales
Células dendríticas
Fibroblastos embriónicos
Células del endotelio
Células epiteliales
fibroblastos
Fluido folicular
Células de glioblastoma
Células del glioma
Células de carcinoma hepatocelular
Hepatocitos
Células epiteliales del intestino
Queratinocitos
Células cancerígenas del hígado
Células cancerígenas del pulmón
Macrófagos
Ascitos malignos
Efusiones pleurales malignas
adenocarcinoma mamario
mastocitos
Células de meduloblastoma
Células de melanoma
Células madre mesénquimas
Células de mesotelioma
Microglia
Leche
Células de neuroglia
Células cancerosas nasofaríngeas
Células de carcinoma
Células del tallo neural
Células de neuroblastoma
Células neuronales
Oligodendrocitos
Células de cáncer de ovario
Células de cancer pancreático
Células de páncreas
Plasma
Plaquetas
Efusiones pleurales
Células de cáncer de próstata
Reticulocitos
Saliva
suero
Células de carcinoma escamoso
Células de cáncer de estomago
Fluido sinovial
Células de carcinoma sinovial
Células T
Células de tabernaculo.
Timo
Células Traqueobronquiales
trofoblastos
Mastitos cancerigenos
Orina
Fluidos y
células
humanos
que
contienen
o
producen
exosomas
Datos provenientes de Exocarta
Exosomas urinarios La función de los exosomas urinarios no
es muy clara. La orina es un fluido que se
descarta. Es por eso que se propone que
los exosomas urinarios son instrumentos
de descartado de las células epiteliales de
la nefrona.
El proteoma y genoma de los exosomas
urinarios han sido compilados y
organizados en la siguiente base de datos:
http://exocarta.org/browse
Los exosomas de orina pueden ser separados de acuerdo a su región de origen
Hogan et al., JASN 2009
Túbulos
renales
Ducto de
colección
renal
glomérulos
Exosomas renales extraídos de orina de pacientes con
amiloidosis presentan características únicas en pacientes con
síntomas patológicos
Ramirez-Alvarado, et al., 2012 PLoS ONE
Observamos cambios en la densidad para los exosomas glomerulares
que contienen las especies oligoméricas de cadena liviana
Ramirez-Alvarado et al., 2012 PLoS ONE
Los exosomas glomerulares presentan oligómeros de
cadena liviana en la superficie
Anticuerpo primario:
Anti cadena liviana
lambda
Anticuerpo
secundario contiene
una partícula de oro
Los oligómeros de
cadena liviana
explican
El cambio de
densidad en los
exosomas:
d=m/V,
Si aumenta el
volumen, se
reduce la densidad
Enfermedad mínima
residual y
exosomas:
Mas allá de los
métodos
establecidos
Paciente AL-ex11-Hombre de 66 años. Amiloidosis renal
Creatinina 1.7 mg/dL, Proteinuria 8.6 g/d, Inmuno fijación en suero negativa.
Proteína lambda positiva en orina durante el diagnostico inicial.
Cadena liviana libre en suero:
Lambda10.2 mg/dL
Kappa 2.35 mg/dL
Kappa:lambda=0.23 (intervalo normal: 0.26–1.65)
Después de la primera ronda de tratamiento:
Cadena liviana libre en suero:
Lambda 9.53 mg/dL
Kappa 6.38 mg/dL
Kappa:lambda=0.67
Proteinuria aumentó a 14.4 g/d y la creatinina a 3.0 mg/dL
Inmuno fijación negativa de orina.
Después del tercer tratamiento que fue suspendido por neuropatía, el paciente
presentó kappa:lambda 0.6992 y creatinina en el suero 6.3 mg/d
Paciente inicio diálisis con kappa:lambda 0.7245. La orina fue colectada para
análisis. El paciente murió después de 4 años en diálisis.
Ramirez-Alvarado et al., 2017 AJH
Paciente Proteína
monoclonal
Electroforesis
inmuno
fijación
Cadena
liviana
involucrada
Kappa :
lambda Creatinina
(mg/dL)
Proteinuria
(g/d)
Cambio en
proteinuria
AL-ex1 1.3 IgGλ 13 0.7245 1.0 3370 n/a
C-ex5 n/a negativo n/a n/a 0.9 53 n/a
AL-ex11 negativo negativo 26.5 0.7245 7.3 3384 -61.20%
AL-ex13 negativo negativo 0.756 1.47 1.1 670 -91.60%
AL-ex11:
Respuesta
hematológica
Progresión de la
enfermedad en los
riñones Oligómeros de
cadena liviana en
los exosomas
glomerulares
MW 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Ramirez-Alvarado et al., 2017 AJH
Ramirez-Alvarado et al., 2017 AJH
Encontramos dos cadenas livianas en suero y en exosomas glomerulares
Ramirez-Alvarado et al., 2017 AJH
La secuencia del cDNA y los péptidos de la reacción con
tripsina del deposito amiloide muestran una secuencia de
proteína con la masa molecular encontrada en suero y
exosomas en paciente AL-ex11
Agradecimientos
El grupo de interés en
amiloide de la clínica Mayo
Angela Dispenzieri
Morie Gertz
Bob Kyle
Martha Grogan
Nelson Leung
Eli Muchtar
Tax Kourelis
Samih Nasr
Bob Bergen
David Murray
David Barnidge-TBS
Ben Madden
Surendra Dasari
Julie Vrana
Jason Theis
Carrie Schinstock
Fernando Cosio
Grupo de investigación
Shawna Cooper
Rebecca Rasmussen
Chris Dick
Marta Marin Argany
Victor Jiménez-Zepeda
Calgary
Chris Ward-KUMC
Barnidge et al., J Proteome Research 2014
Algunas enfermedades inmunológicas presentan
una distribución alterada de las cadenas livianas
en miRAMM
El método miRAMM ayuda a la evaluación de la
respuesta de los pacientes con enfermedades
asociadas con cadenas livianas
Barnidge et al., J Proteome Research 2014
AL-ex13 Heme and
Organ response
No light chains were found on AL-ex13 EVs
AL-ex11 behavior has been replicated with other AL amyloidosis urinary EVs
Ramirez-Alvarado, et al., 2017 AJH
Ramirez-Alvarado, et al., 2012 PLoS ONE
Isolation and fractionation of urinary EVs