BASES MOLECULARES BASES MOLECULARES DEL CÁNCERDEL CÁNCER

APLICACIÓN A LA APLICACIÓN A LA PATOLOGÍA TUMORALPATOLOGÍA TUMORAL

BASES MOLECULARES BASES MOLECULARES DEL CÁNCERDEL CÁNCER

APLICACIÓN A LA APLICACIÓN A LA PATOLOGÍA TUMORALPATOLOGÍA TUMORAL

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LOS LINFOMAS NO

HODGKIN

Jerónimo Forteza Vila

Jefe de Servicio y Catedrático de Anatomía Patológica

Hospital Clínico Universitario de Santiago

12 de Enero de 2009

Xátiva (Valencia)

LINFOMAS

1832183218321832AcuarelaAcuarela

Robert CarswellRobert CarswellAcuarelaAcuarela

Robert CarswellRobert Carswell

Classification of lymphoid neoplasms: the microscope as a tool for disease discovery.

Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Isaacson PG.

Blood (2008) 112: 4384-4499

Elaine Jaffe Nancy Harris Harald Stein Peter G. Isaacson

• Datos Clínicos

• Estudio Morfológico

• Estudio Inmunohistoquímico

• Estudio Molecular

DIAGNÓSTICO

Características moleculares de los linfomas

• Diagnóstico

• Pronóstico

• Terapéutica

Técnicas moleculares en el diagnóstico de linfomas

• ¿Es realmente esencial para el diagnóstico?– En el 90-95% de los casos, la morfología y el fenotipo

son suficientes

– Es esencial para el diagnóstico en el 5-10% de los casos

Bcl2Bcl2Bcl2Bcl2HEHEHEHE

Linfoma folicularLinfoma folicularLinfoma folicularLinfoma folicular

Técnicas moleculares y diagnóstico de linfomas

• ¿Qué cuestiones puede resolver?– Benignidad vs Malignidad (clonalidad)

• Proliferaciones de células B ambiguas• Linfomas de células T• Síndromes linfoproliferativos en pacientes

inmunocomprometidos

– Recaídas vs segundo linfoma (identidad clonal)– Tipos específicos de linfomas (translocaciones)

Técnicas moleculares en linfomas

• Estudios de clonalidad: reordenamientos de genes codificantes de receptores de antígenos

• Translocaciones (“clonality markers”)

Reordenamiento de genes codificantes de receptores de antígenos

• Proceso inmunológico

• Generación de variabilidad genética para obtener receptores diversos y específicos

• Proceso similar en células B y en T (Ig y TCR)

Reordenamiento específico de V(D)J para cada clon

• Policlonal • Monoclonal

Estudios de clonalidad: Métodos

• Southern blot: “gold standard”– Necesita buena calidad de ADN (Tejido

congelado)– Muy laborioso– Necesidad de material reactivo

• PCR: más práctico– Permite el uso de material fijado en formol e

incluido en parafina– Resultados en dos días– Más sensible

FR3FR3

mwmwMMPP C-C-

Electroforesis en gel de poliacrilamidaElectroforesis en gel de poliacrilamida

MonoclonalMonoclonal PoliclonalPoliclonal

Análisis de fragmentosAnálisis de fragmentos(Electroforesis por capilar)(Electroforesis por capilar)

FR3FR3

““Patrón de puercoespín”Patrón de puercoespín”

MonoclonalMonoclonal PoliclonalPoliclonal

FR3FR3

Análisis de fragmentosAnálisis de fragmentos(Electroforesis por capilar)(Electroforesis por capilar)

Reordenamiento en TCR por PCR

• Cadena TCR gamma

• Cadena TCR beta

PP MM C (-)C (-) PMPM

Electroforesis en gel de poliacrilamidaElectroforesis en gel de poliacrilamida

TCR1TCR1

Reordenamiento monoclonal

TCR2TCR2

Reordenamiento policlonal

Reordenamiento monoclonal

Reordenamiento policlonal

Análisis de fragmentosAnálisis de fragmentos

Recidiva vs. Segundo tumor

Linfoma de la zona marginal Linfoma de la zona marginal esplénicoesplénico

Tres años despuésTres años despuésAdenopatía cervical: LBCG con translocación en MYCAdenopatía cervical: LBCG con translocación en MYC

¿Transformación o segundo linfoma?

1ª biopsia (bazo)

2ª biopsia (ganglio)

Estudios de clonalidad por PCR: Limitaciones

• Resultados falso negativos

– Degradación del ADN

• Incluir un gen de control interno

– Hipermutación somática del gen IgH

• Linfoma folicular, células plasmáticas neoplásicas

– Abundante población acompañante policlonal

– Reordenamientos inusuales, interferencia con

segmentos translocados,…

• Resultados falso positivos

– Exceso de sensibilidad

– “Pseudo-clones”: Pobreza de células diana

– Baja resolución en electroforesis (gel de

agarosa)

• Usar poliacrilamida o electroforesis capilar

Estudios de clonalidad por PCR: Limitaciones

• Reordenamientos clonales tanto de los

genes Ig o TCR no es equivalente a

línea B o T.

• Infidelidad de linaje (Linfoma linfoblástico)

• Explansión clonal de células B en linfomas T

(LAI) o viceversa

Estudios de clonalidad por PCR: Limitaciones

¡Monoclonalidad no es ¡Monoclonalidad no es sinónimo de sinónimo de malignidad!malignidad!

- Inmunodepresión- Inmunodepresión

- Reacciones hiperinmunes - Reacciones hiperinmunes

(infecciones virales)(infecciones virales)

- Enfermedades autoinmunes- Enfermedades autoinmunes

- Enfermedad de Castleman- Enfermedad de Castleman

• BIOMED-2– PCR Multiplex (estudio de varias regiones en

la misma reacción de PCR)– Realizable y reproducible

– Linfomas B: 99% monoclonales– Linfomas T: 94% monoclonales– Lesiones reactivas: policlonalidad en la

gran mayoríavan Krieken et al. Leukemia (2007) 21: 201-206van Krieken et al. Leukemia (2007) 21: 201-206

Estudios de clonalidad por PCR: Estandarización

Técnicas inmunohistoquímicas características de alteraciones

citogenéticas

ALK1ALK1ALK1ALK1Cyclin D1Cyclin D1Cyclin D1Cyclin D1

Inmunohistoquímica como técnica molecular diagnóstica

Técnicas moleculares en linfomas

Características de las alteraciones citogenéticas

Anormalidades citogenéticas por FISH

• ¿Porqué es mejor el FISH?

• Aplicaciones en el diagnóstico de los linfomas

• No necesita células en cultivo

• Puede aplicarse a extensiones citológicas y tejido fijado en formol e incluido en parafina

Ventajas del FISH

Diagn Mol Pathol (2008) 17:59-63

Sondas “Dual-fusion”Patrón normal

Núcleo en Núcleo en interfaseinterfase

Cromosomas en metafaseCromosomas en metafase

Sondas “Dual-fusion”Patrón normal

Núcleo en Núcleo en interfaseinterfase

Cromosomas en metafaseCromosomas en metafase

Sondas “Dual-fusion”Translocación recíproca

Núcleo en Núcleo en interfaseinterfase

Cromosomas en metafaseCromosomas en metafase

Sondas “Dual-fusion”Translocación recíproca

Núcleo en Núcleo en interfaseinterfase

Cromosomas en metafaseCromosomas en metafase

Sondas “Break-appart”Patrón normal

Núcleo en Núcleo en interfaseinterfase

Cromosomas en metafaseCromosomas en metafase

Sondas “Break-appart”Translocación recíproca

Núcleo en Núcleo en interfaseinterfase

Cromosomas en metafaseCromosomas en metafase

Ventajas del FISH “split”

• Genes implicados en translocaciones con diferentes ‘partners’ (MYC, ALK, BCL6)

• No hay falsos positivos virtualmente– En contraste, señales de fusión falsas son

posibles debido a solapamiento nuclear

• Fácil evaluación

Linfoma folicular con translocación en BCL2 (sonda ‘break-apart’)Linfoma folicular con translocación en BCL2 (sonda ‘break-apart’)

Linfoma folicular Bcl2 positivoLinfoma folicular Bcl2 positivo

Ausencia de translocación en Bcl2 – Sonda ‘break-apart’Ausencia de translocación en Bcl2 – Sonda ‘break-apart’

Linfoma folicular Bcl2 negativoLinfoma folicular Bcl2 negativo

Translocación en BCL2

• 90 % de los linfomas foliculares

• 30% de los linfomas B difusos de célula grande

1 2 C+ C-

PCR Major Breakpoint Region

Crom 18

bcl-2Crom 14

IgH5’ 3’MBR

t(14;18) implicando al gen BCL2

PCR MBR PCRMBR+MCR

FISH

100%

50%

30-40%

FISH - BCL2: utilidad

• Hiperplasia folicular vs. Linfoma

• Linfoma folicular vs. Otros linfomas de patrón

nodular

• Linfoma B de células grandes: pronóstico (?)

t(11;14)• Linfoma del manto• Cr. 11: gen Ciclina D1• Cr. 14: gen IgH

PCR en región MTC (“Major Translocation Cluster”)

Sólo 50%!

C-C+

32

1

Linfoma del manto: Sonda ‘dual-fusion’ para t(11;14)Linfoma del manto: Sonda ‘dual-fusion’ para t(11;14)

Linfoma del manto Ciclina D1 positivoLinfoma del manto Ciclina D1 positivo

FISH – CCND1: utilidad

• Linfoma del manto

– Cuando hay problemas con la inmunotinción de la Ciclina

D1 (no debería de haberlos)

• Tricoleucemia

– Recordar que la Ciclina D1 puede ser positiva por

inmunohistoquímica pero negativa por FISH

(clinicopatológicamente es una enfermedad muy distinta)

Sangre periférica

CD22TRICOLEUCEMIA

- Pancitopenia- Aspirado seco- Marcada esplenomegalia- No hay adenopatías

B. Fallini (2007)

FISH – Translocaciones en MALT1

• Pronóstico (Linfoma MALT gástrico)– No respuesta a los antibióticos– Probable diseminación

• Detección: algunos RT-PCR; FISH (biopsias endoscópicas)

• Diagnóstico diferencial– Infiltrados reactivos– Otros LNH

Isaacson and Spencer Histopathology 1987

Linfoma MALT

“Discovery diseases. MALT lymphoma as a paradigm”

Jaffe ES, et al. Classification of lymphoid neoplasms: the microscope as a tool for disease discovery. Blood (2008) 112:4384-4399

Marshall BJ y Warren JR(Premios Nobel de Medicina en 2005)

Helicobacter Pilory (Warthin-Starry)

Reordenamientos de BCL6

• Gen en 3q27

• Sonda ‘Split’

• Utilidad:– Linfoma B de células grandes

(¿pronóstico?)

Linfoma B de células grandes Bcl6 positivoLinfoma B de células grandes Bcl6 positivo

Reordenamientos de MYC

• Característico del Linfoma de Burkitt

• Más frecuente: t(8;14)

• ‘Breakpoints’: alta variabilidad (PCR)

• FISH split: lo más útil

CD20

BCL6CD10

HE

MIB1EBER

MORFOLOGÍA Y PATRÓN INMUNOHISTOQUÍMICO EN EL LINFOMA DE BURKITT

FISH – Reordenamiento en MYC

• También útil:

– Como marcador de progresión (Aberración secundaria)

– Para la detección de LBCG con doble translocación (“double hit”): BCL2 + MYC

BCL-2 MYC

FISH

Linfoma B Difuso de Células Grandes con reordenamiento de BCL-2 y MYC

(Linfoma de la zona gris)

ALK split probeALK split probe

Translocación en ALK

• Usualmente los linfomas anaplásicos portan la t(2;5) – ALK/NPM

• Posibilidad de diversos patrones

ALK1ALK1

“INMUNOFISH”

• Estudios de clonalidad: PCR

• Translocaciones características: FISH

• Material de rutina (Fijado en formol e incluido en parafina)

• Técnicas útiles, pero deben ser interpretadas en el contexto clínicopatológico

Técnicas moleculares en el diagnóstico de linfomas no Hodgkin

Dave SS et al. Molecular diagnosis in Burkitt’s lymphoma.

N Engl J Med (2006) 354: 2431-2442

• Datos Clínicos

• Estudio Morfológico

• Estudio Inmunohistoquímico

• Estudio Molecular

DIAGNÓSTICO

Plasmocitoma (HE)

Linfoma de Burkitt

Facultad de Medicina (Universidad de Santiago

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